UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

LABORATORIO 1 DETERMINACION DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE
Curso:

Alimentacin y Nutricin Humana

Profesor:

Ana Aguilar

Integrantes:
Gmez Castillo, Miguel Alejandro
Cussianovich Aguirre, Karlos
Carrillo Ravichagua, Jos

2012 - II
I.

INTRODUCCION

Los sustancias qumicas

orgnicas conocidas como antioxidantes son

fundamentales para el mantenimiento de nuestro organismo debido a que nos

pueden proteger contra el dao oxidativo.
Entre los ms conocidos estn los tocoferoles, el cido ascrbico, los flavonoides,
antocianinas, carotenoides, cidos fenlicos, etc. Varios de estos compuestos
estn presentes en diferentes vegetales y frutas que ingerimos en nuestra dieta.
La proporcin de compuestos antioxidantes vara de un alimento a otro.
La capacidad antioxidante de un alimento puede ser profundamente modificado
durante el procesamiento, almacenamiento por las prcticas de coccin a las
cuales son sometidos.
Los mtodos desarrollados para determinar actividad antioxidante se basa en la
capacidad que tienen para

atraer radicales libres generados ya sea en fase

acuosa o lipdica.
Objetivos:

Conocer una tcnica de determinacin de la capacidad antioxidante en la

manzana verde y roja.

II.

Comparar la capacidad antioxidante de las manzanas verde y roja .

REVISION LITERARIA
Numerosos estudios en nutricin humana, demuestran una estrecha correlacin
entre el consumo de frutas y verduras y la menor incidencia de enfermedades
crnico degenerativas, debido a su bajo contenido en colesterol y a la presencia

de vitaminas, fibras, antioxidantes naturales y minerales. As mismo, el estrs

oxidativo ha sido asociado a la patognesis de muchas enfermedades humanas,
como: arterioesclerosis, artritis, demencia, cncer, etc; es por ello que el uso de
antioxidantes, es estudiado de forma intensiva, en farmacologa; particularmente,
en

el

tratamiento

de

accidentes

cerebrovasculares

enfermedades

neurodegenerativas. Actualmente, se sabe que tanto por causas ambientales

(radiacin), as como por la ingesta de algn contaminante o incluso como
consecuencia de nuestro propio metabolismo, surgen algunas molculas que nos
pueden provocar dao. A estas se les conoce como especies oxgeno reactivas
(ROS), que se asocian a enfermedades como cncer, problemas cardiacos o al
natural envejecimiento humano. Entre los problemas que originan figuran:
destruccin de paredes celulares, inactivacin de enzimas, debilitamiento de la
capacidad defensiva, alteracin del sistema inmunolgico e incluso dao del
material gentico.
En nuestro organismo, la produccin de los radicales libres que se dan
constantemente in vivo, ha permitido desarrollar diversos mecanismos de
defensa antioxidante, como medios de proteccin. La enzima superxido
dismutasa remueve el O2 convirtindolo en H2O2, el cual es transformado por la
enzimas catalasa y Glutatin peroxidasa, en agua (H2O). Asimismo, existen
molculas que remueven los radicales libres por reaccin directa (no cataltica)
tales como: el glutatuion reducido, los tocoferoles (vitamina E) y el cido ascrbico
(Vitamina C). Cuando la defensa antioxidante, no es cien por ciento eficiente,
incrementa la formacin de radicales libres en el organismo; a esto se denomina
estrs oxidativo. Se cree que muchos de los efectos colaterales de los
medicamentos se relacionan con un aumento en el dao oxidativo, causado por el
exceso de radicales libres, los que produciran dao celular. Ante el estrs
oxidativo, el organismo debe responder con una defensa antioxidante extra, ya
que el estrs oxidativo severo puede causar la muerte de la clula. En las frutas,
las legumbres y algunos vegetales se encuentran muchas sustancias capaces de
atrapar radicales libres, mejorando nuestra defensa antioxidante, reportndose

que son capaces de detener o prevenir el desarrollo de tumores y los efectos

bioqumicos asociados con la progresin de los mismos; este potencial se
atribuye, principalmente, a sus propiedades antioxidantes. Se reporta que la
capacidad antioxidante de una copa de vino es igual a 7 jugos de Naranja 20
jugos de Manzana. Algunos de los antioxidantes, son vitaminas (aminas
indispensables para la vida, tales como la vitamina A, C y E; otros son Flavonoides
(quercetina, catequina), antocianinas, carotenoides o cidos fenlicos (cido
cafico y cido clorognico). Flavonoides como la catequina se encuentran en el
vino tinto y manzanas; quercetina en cebollas, uvas y manzanas (Castaeda et al,
2008).
En un proceso inflamatorio, el ADN constituye uno de los mayores blancos de los
radicales libres, generando mutaciones o prdidas en el control celular, siendo
sta una de las causas ms directas que se investigan en el mbito de la
carcinognesis inducida por oxidantes. A pesar de la existencia de un sistema de
defensas antioxidantes, el ADN sufre, permanentemente, daos por oxidacin,
razn por la cual es constantemente reparado por las enzimas glicosilasas,
especficas para las bases nitrogenadas que han sido modificadas por oxidacin
(Ames et al., 1993) Citado por Castaeda et al, 2008.
Fenema (2000), menciona que los antioxidantes son sustancias que pueden
retrasar el inicio o reducir la velocidad de oxidacin de las sustancias auto oxidables.
Existen diversos mtodos para evaluar la actividad antioxidante, ya sea in vitro o in
vivo. Una de las estrategias ms aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad
antioxidante total de un compuesto, mezcla o alimento, consiste en determinar la
actividad del antioxidante frente a sustancias cromgenas de naturaleza radical; la
prdida de color ocurre de forma proporcional con la concentracin. No obstante,
las determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro nos dan tan
slo una idea aproximada de lo que ocurre en situaciones complejas in vivo.

Alternativamente, diversos compuestos cromgenos (ABTS, DPPH, DMPD,

DMPO y FRAP) son utilizados para determinar la capacidad de los compuestos
fenlicos que contienen los frutos para captar los radicales libres generados,
operando as en contra los efectos perjudiciales de los procesos de oxidacin, que
implican a especies reactivas de oxgeno (EROS).
Los mtodos ms aplicados son ABTS y DPPH. Ambos presentan una excelente
estabilidad en ciertas condiciones, aunque tambin muestran diferencias. El DPPH
es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una preparacin previa,
mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una reaccin que puede ser
qumica

(dixido

de

manganeso,

persulfato

potasio,

ABAP),

enzimtica

(peroxidase, mioglobulina), o tambin eletroqumica. Con el ABTS se puede medir

la actividad de compuestos de naturaleza hidroflica y lipoflica, mientras que el
DPPH solo puede disolverse en medio orgnico, y el DMPD solo en medio
acuoso. El radical ABTS+ tiene, adems, la ventaja de que su espectro presenta
mximos de absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio alcohlico, mientras
que el DPPH presenta un pico de absorbancia a 515 nm, y el DMPD a 505 nm
(Kuskoski et al, 2005)
Las manzanas tienen composicin diversa, segn la variedad a la que pertenecen
y su grado de madurez. Contiene en general una notable cantidad de azcares
que oscila desde 6 a 12%. Contienen fructosa, dextrosa, levulosa y algo menos de
sacarosa. Contienen tambin pectina, protopectina, pentosanos, etc. La mayor
parte de las manzanas tienen cidos orgnicos en cantidades importantes (hasta
1.5%), entre ellos los cidos mlico, ctrico y pequeas cantidades de cido
succnico y lctico. El cido saliclico se encuentra combinado al parecer en forma
de ster metlico. Las manzanas asperiegas contienen notables cantidades de
materias tnicas. En las manzanas existen tambin vitamina C, a veces en
cantidades importantes (de 40 a 50 unidades por kilogramo), pero las oxidasas de
este fruto ponen amarillento o herrumbrososa su carne poco despus de cortadas,

destruyendo gran parte de dicha vitamina. El cido glutmico se encuentra en la

piel y el corazn de la manzana (Sintes, 1980).
En las manzanas se encuentra el cido mlico, en su forma libre conjuntamente
con el cido ctrico dando al fruto su caracterstica de acidez ms o menos
pronunciada segn la variedad y la fecha de recoleccin. Al alcanzar la completa
madurez la manzana manifiesta un perfume agradable, una esencia que se cree
est compuesta principalmente de steres amlicos y de los cidos frmico y
caproico, de pequeas cantidades de ster caprlico y de cantidades importantes
de

alcohol

etlico

acetaldehdo.

Por el efecto de la luz solar, en la manzana se forma antocianina o pigmentos

flavonas. El espectro de accin para la pigmentacin de las manzanas, indica la
intervencin de fitocromo. La acumulacin de azcares puede acentuar la
tendencia para formar pigmentos (Salhuana, 1999).
Los pigmentos carotenoides proliferan durante la maduracin y tienen un papel
equivalente al de la vitamina A al mismos tiempo de la vitamina C, se desarrolla
para alcanzar su mxima en el momento de acabada la coloracin del fruto (Lon
Kan, 1992).
Segn D`esclapon (1970), la riqueza de vitamina C en las manzanas es muy
desigual, segn las variedades; por ejemplo la variedad Delicious contiene 60ppm.
Ahora bien dentro de una misma variedad, estas cifras pueden ser muy diferentes:
de simple a dobles.
Herrero y Guardia (1992), reportan que la concentracin de vitamina C es muy
variable ya sea por especie o bien entre variedades. En manzanas el contenido de
vitamina C en la piel es superior que el de la pulpa. Su concentracin vara entre
0.5 y 40 mg de vitamina C por 100g de fruto. Las manzanas ms ricas en vitamina
C son las coloreadas y las expuestas al sol.

Agostini et al, 2004 reporta en sus resultados que Las manzanas frescas con y
sin cscaras no presentaron diferencias estadsticamente significativas entre las
muestras, siendo los valores de 0,259 y 0,267 uM Equivalente Trolox
respectivamente, observndose una disminucin de esta actividad en las tratadas
trmicamente, sobre todo por la aplicacin del calor seco (horno): 0,072 uM
Equivalente Trolox en la manzana pelada y 0,128 uM Equivalente Trolox, con
cscara.
Los resultados obtenidos por Ayala et al, 2006 sealan la capacidad antioxidante
en mmoles de Fe/100g de fruta, entre los cuales Manzana roja (Malus Domestica)
0.253 y con cscara 0.671.
Lon Kan (1992) en sus anlisis Fsico-Qumicos de los juegos frescos de e
variedades de manzana, reporta en acidez titulable (expresada como % de cido
mlico) 1.02, 0.37, 0.47 para las variedades San Antonio, Winter, Delicia Roja
respectivamente y de taninos en mg/100ml 45.8, 50.4, 41.1. La misma autora
menciona que los valores reportados en taninos para jugo fresco de manzana Mc
Intosh son de 32.5 mg/100ml.
Figueroa (1989) en la composicin del fruto de manzana reporta 0.6g de cidos
por 100g. 6mg de vitamina C/100g, 0.03mg vitamina B1/100g, 0.01mg vitamina
B2/100g. Por su parte Sequieros (1984) en el Anlisis proximal y fsico qumico de
la manzana variedad Delicious (en 100g de parte comestible de fruta fresca)
obtiene 0.4055g de acidez titulable y 1.970mg de vitamina C.
III.

MATERIALES Y METODOS
3.1. Muestra alimenticia
Manzana verde (grany Smith), manzana roja (red delicious)
3.2. Materiales

Tubos de ensayo

Tubo falcon

Micropipeta de 20-200 l

Micropipeta de 100-1000 l

3.3. Reactivos

Metanol

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

3.4. Equipos

Agitador orbital

Balanza analtica

Centrfuga

Espectrofotmetro

Vortex

3.5. Procedimiento

Tomar 5 g de muestra y aadir 25 ml de metanol y a continuacin

homogenizar.

Colocar en un tubo falcon protegido de la luz y agitar por 15 minutos en

un agitador orbital.

Centrifugar el homogenizado por 10 min a 4000 RPM.

Ajustar el espectrofotmetro a cero con metanol y asegurar que la

absorbancia inicial de la solucin DPPH a 515 nm sea alrededor de 1.1.

Del sobrenadante se toma 3 alicuotas dos de 150 microlitros y una de

500 micro litros

A las de 150 l agregarles 2850 l de la solucin DPPH en viales

plstico y permitir que la muestra reaccione que serian T4 y T5
(tratamientos)

A la de 500 ul agregarle 1000 ul de metanol en un ependorf.

Agitar el ependorf y luego tomat 3 alicuotas T1 , T2 , T3(tratamientos )

de 150 ulitros al que se adicionara 2850 l de la solucin DPPH y se
agitara por 30 minutos

. Correr un blanco con 150 l de metanol puro para obtener un factor de

correccin.(debido a la dilucin)

Transferir los tratamientos de la solucin a las cubetas y realizar la

lectura en el espectrofotmetro a 515 nm.

IV.

RESULTADOS Y DISCUSION
A continuacin se presentan los resultados obtenidos en el Cuadro 1,

de la

actividad antioxidante de dos muestras de manzana roja Red Delicious y de

manzana verde Grany Smith cada una, con un peso de muestra de 5.0 0.1g,
expresada en micromol equivalentes de Trolox/g de alimento, el cual, segn el

Portalantioxidantes (2012), es un anlogo de la vitamina E, que por su fcil

solubilidad en agua, es empleado como estndar de comparacin.

MUESTR
A

Manzan
a Roja
"Red
Deliciou
s"

PESO
MUEST
RA (g)

4.9933

5.0983

5.0833
Manzan
a Verde
"Granny
Smith"
5.1

BLANCO

N
TRATA
M.

ABSORBAN
CIA A 515
nm

ACTIVIDAD
ANTIOXIDAN
TE EN LA
SOLUCION
(mol TE/
ml)

T1

0.787

0.2843

T2

0.789

0.2826

T4

0.000*

0.9684

T5

0.000

0.9684

T1

0.662

0.3930

T2

0.664

0.3913

T4

0.000*

0.9684

T5

0.000

0.9684

T1

0.804

0.2696

T2

0.793

0.2791

T4

0.453

0.5747

T5

0.466

0.5634

T1

0.791

0.2809

T2

0.838

0.2400

T4

0.48

0.5512

T5

0.495

0.5382

1.100

PROMED
IO

D.S

C.V

ACTIVIDAD
ANTIOXIDAN
TE EN
ALIMENTO
(mol TE/ g)

0.2835

0.00
12

0.00
43

26.68

0.9684

0.00
00

0.00
00

30.39

0.3921

0.00
12

0.00
31

35.38

0.9684

0.00
00

0.00
00

29.13

0.2743

0.00
68

0.02
46

24.83

0.5690

0.00
80

0.01
40

17.16

0.2604

0.02
89

0.11
09

24.00

0.5447

0.00
92

0.01
69

16.73

*Se coloc 0.000 ya que los valores de absorbancia ledos eran muy bajos (menores a 0.2).
Cuadro 1.- Valores obtenidos de la actividad antioxidante en Manzana roja Red
Delicious y verde Granny Smith, expresados en mol equivalentes de Trolox/ g
de alimento para cada muestra obtenida.
Durante la prctica, los tubos donde se coloc la muestra de manzana se
mantuvieron cubiertos por plstico negro, para evitar que los compuestos
antioxidantes se viesen afectados por la accin de la luz.
Agostini et al, 2004 reporta en sus resultados que Las manzanas frescas con y
sin cscaras no presentaron diferencias estadsticamente significativas entre las
muestras, siendo los valores de 0,259 y 0,267 uM Equivalente Trolox
respectivamente, observndose una disminucin de esta actividad en las tratadas

trmicamente, sobre todo por la aplicacin del calor seco (horno): 0,072 uM
Equivalente Trolox en la manzana pelada y 0,128 uM Equivalente Trolox, con
cscara. As mismo, la base de datos del Portalantioxidantes (2012) reporta que la
manzana Royal o Red Delicious con cscara presenta una cantidad mxima de
54.98 y mnima de 29.77 mol TE/g de peso fresco, siendo 41.80 mol TE/g de
peso fresco la cantidad promedio, lo cual contrasta con los resultados obtenidos
en la prctica, que fueron 26.68 y 30.39 mol TE/g, valores mnimo y mximo para
la primera muestra de manzana Red Delicious, y 35.38 y 29.83 mol TE/g los
valores mnimo y mximo para la segunda muestra, el valor mnimo se refiere al
tratamiento de la muestra ms diluido (T1 y T2), mientras q el mximo refiere al
menos diluido (T4 y T5), sin embargo en esta misma base de datos se reporta que
la manzana roja con cscara presenta una valor mximo de 50.16 y mnimo de
26.26 mol TE/g de peso fresco, lo cual contempla a todos los valores obtenidos
en la prctica, ya que stos se encuentran en el rango que se reporta, lo que
,adems, indicara que la manzana roja muestreada pertenecera a la clase
Delicious o tan solo a la clase Roja.
Por otro lado, el Portalantioxidantes (2012) reporta para la manzana Granny Smith
con cscara un valor mximo y mnimo de 58.81 y 19.62 mol TE/g de peso
fresco, incluyendo este rango slo a los valores que representan a los tratamientos
ms diluidos, los cuales fueron 24.83 y 24.00 mol TE/g, puesto q los menos
diluidos, es decir 17.16 y 16.73 mol TE/g, no se encuentran en este rango.
Finalmente, los compuestos responsables de la actividad antioxidante en las
manzanas en general son, segn Palomo et al. (2010), los fenoles y flavonoides
que contienen. Los primeros incluyen en cinco grupos principales como son los
cidos hidrocinmicos, flavanoles, flavonoles, dihidrochalconas y antocianinas, los
cuales se pueden apreciar en la Figura 1. Sin embargo, los flavonoides presentan
su actividad antioxidante gracias a los grupos hidroxifenlicos, dobles enlaces y
grupos cetnicos.

Fuente: Palomo et al. (2010)

Figura 1.- Compuestos fenlicos responsables en parte de la actividad
antioxidante de las manzanas.

V.

CONCLUSIONES
La luz es un factor muy importante a la hora de realizar la prctica ya que los
antioxidante son altamente sensibles a ella, es por ello se cubri previamente los
tuvo con bolsa negra.
La capacidad antioxidante de la manzana depende de la cantidad de compuestos
flavonoides y fenlicos que posea.
La capacidad antioxidante de la manzana roja Red Delicious es mayor que la
verde Granny Smith.

La capacidad antioxidante de un alimento depende de la naturaleza de la

concentracin de antioxidantes naturales presentes en l, y tambin de la
metodologa analtica utilizada para la determinacin de la misma.
El mtodo del DPPH aplicado es una buena alternativa para la determinacin de la
capacidad antioxidante en frutos.
VI.

BIBLIOGRAFIA
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