DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA

AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

PERFIL DE PROYECTO DE INVESTIGACIN

TTULO:
Caracterizacin molecular de poblaciones de Globisporangium spp.
obtenidas de invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014
utilizando microsatlites SSR.
AUTOR:
Christian Orlando Ayala Ortiz
DIRECTOR:
Alma Koch M. Sc.

SANGOLQU, JULIO DEL 2015.

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

NDICE
1

TTULO DEL PROYECTO.......................................................................................4

UNIDAD ACADMICA RESPONSABLE...............................................................4

RESPONSABLE DEL PROYECTO..........................................................................4

LNEA DE INVESTIGACIN..................................................................................4

SUBLNEA DE INVESTIGACIN...........................................................................4

GRUPO DE INVESTIGACIN.................................................................................4

COLABORADORES CIENTFICOS........................................................................4

LOCALIZACIN GEOGRFICA............................................................................5
Trabajo de Laboratorio........................................................................................5

8.2

Anlisis Bioestadstico........................................................................................5

8.1

REA DE INFLUENCIA...........................................................................................5

10

ANTECEDENTES..................................................................................................6

11

PROYECTOS RELACIONADOS O COMPLEMENTARIOS.............................7

11.1 Proyectos Realizados en el Exterior....................................................................7

12

JUSTIFICACIN O IMPORTANCIA DEL PROBLEMA A RESOLVER............8

13

OBJETIVO GENERAL DEL PROYECTO............................................................9

14

OBJETIVOS ESPECFICOS..................................................................................9

15

MARCO REFERENCIAL....................................................................................10
15.1 Globisporangium spp........................................................................................10
15.1.1

Taxonoma..................................................................................................10

15.1.2

Biologa......................................................................................................10

15.1.3

Enfermedad que causa................................................................................11

15.2 Marcadore Moleculares.....................................................................................11

15.2.1

Marcadores SSR.........................................................................................12
2

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

15.3 Anlisis filogentico..........................................................................................13

16

METODOLOGA....................................................................................................14
16.1 Participantes.......................................................................................................14
16.1.1

Instituciones...............................................................................................14

16.1.2

Colaboradores Cientficos..........................................................................14

16.2 Revisin Bibliogrfica.......................................................................................14

16.3 Trabajo de Laboratorio......................................................................................15
16.3.1

Extraccin de ADN....................................................................................15

16.3.2

Determinacin de la concentracin y pureza de los aislados.....................15

16.3.3

Dilucin del ADN.......................................................................................15

16.3.4

Anlisis gentico con marcadores SSR......................................................15

17

ANLISIS ESTADSTICO.....................................................................................16

18

HIPTESIS..............................................................................................................17

19

OPERATIVIDAD DE LAS VARIABLES...............................................................18

20

ACTIVIDAD PARA LA EJECUCIN....................................................................18

21

DURACIN DEL PROYECTO..............................................................................19

22

BIBLIOGRAFA......................................................................................................19

23

ANLISIS DE COSTOS DEL PROYECTO..........................................................22

24

FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO.................................................................23

25

CONTENIDO...........................................................................................................23

26

CRONOGRAMA.....................................................................................................24

27

FECHA DE PRESENTACIN DEL PROYECTO.................................................25

28

FIRMA DEL RESPONSABLE................................................................................25

29

FECHA DE APROBACIN DEL PROYECTO.....................................................25

30

FIRMA DE LA AUTORIDAD.................................................................................25
3

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

TTULO DEL PROYECTO

Caracterizacin molecular de poblaciones de Globisporangium spp. obtenidas de

invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014. mediante el uso de microsatlites
SSR.
2

UNIDAD ACADMICA RESPONSABLE

Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Departamento de Ciencias de la Vida y de

la Agricultura, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa en convenio con la Universidad
Estatal de Oklahoma (OSU), Estados Unidos, Departamento de Fitopatologa y
Entomologa.
3

RESPONSABLE DEL PROYECTO

El responsable del proyecto es el seor AYALA ORTIZ CHRISTIAN ORLANDO,

egresado de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa de la Universidad de las Fuerzas
Armadas (ESPE).
Telfonos: 0987640518/023441810
E-mail: coayala@espe.edu.ec
4

LNEA DE INVESTIGACIN

La Lnea de Investigacin de este proyecto es Ciencias Vegetales.

5

SUBLNEA DE INVESTIGACIN

La Sublnea de Investigacin del proyecto es Fitopatgenos

6

GRUPO DE INVESTIGACIN

Grupo de Investigacin en Microbiologa y Ambiente

7

COLABORADORES CIENTFICOS

Posible Director del Proyecto: Alma Koch Kaiser M. Sc.

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

LOCALIZACIN GEOGRFICA

8.1 Trabajo de Laboratorio

La parte experimental y trabajo de laboratorio del proyecto se llevar a cabo en el

Laboratorio de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma
ubicada en la ciudad de Stillwater, Oklahoma en Estados Unidos de Norteamrica.
8.2 Anlisis Bioestadstico

El anlisis bioestadstico de los datos obtenidos se realizar una parte en el Laboratorio

de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma y se finalizar en
el Laboratorio de Microbiologa de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa de la
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE ubicado en Sangolqu, Pichincha en
Ecuador.
9

REA DE INFLUENCIA

El rea de influencia de este estudio sern los invernaderos ornamentales ubicados en

Nueva York, a partir de los cuales se obtuvieron las muestras; ya que mediante los
anlisis a realizar se podr conocer las especies de Globisporangium spp. se encuentran
contaminando sus suelos y las medidas a tomar a fin de evitar prdidas por la
contaminacin de este oomiceto.
Tambin los Laboratorios del Departamento de Fitopatologa y Entomologa de la
Universidad Estatal de Oklahoma, ya que en ellos se realizarn todos los anlisis
necesarios y se elaborarn colecciones de ADN a partir de las muestras obtenidas, las
que podrn ser utilizadas para cualquier estudio posterior que el Laboratorio requiera.
En el pas, la influencia de este proyecto sera principalmente para el sector florcola y
de viveros ornamentales, el cul es uno de los sectores econmicos ms importantes del
Ecuador y cuyo principal cliente son los Estados Unidos de Norteamrica. El conocer las
distintas poblaciones de Globisporangium spp. puede servir a la industria florcola para
llevar a cabo las prcticas de cultivo necesarias para prevenir su infeccin.
10 ANTECEDENTES

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

En 2004 Levesqu y de Cock propusieron la existencia de 11 clados (A-K), dentro del

gnero Pythium, el cual se volvi un estndar para los anlisis filogenticos de Pythium.
En el 2006 Villa, et al. Demostr que los miembros del clado K estaban ms cerca a
Pythoptora que a Pythium y por lo que Bala, et al. en 2006 propuso la creacin de un
nuevo gnero llamado Pythophytium (Kageyama, 2014).
En 2010 Uzuhashi, et al., mediante anlisis filogenticos basados en las secuencias de
ADNr LSU y el gen coxII propusieron que el gnero se dividiera en cinco gneros
nuevos: Pythium sensu stricto, Ovatisporangium, Globisporangium, Elongisporangium
y Pilasporangium.
En este mismo ao inicia el proyecto Rastreo y Manejo de las Enfermedades de
Cultivos Florcolas Causadas por Oomicetos y Hongos del Centro de Extensin Long
Island para a Investigacin en Horticultura perteneciente a la Universidad de Cornell el
cual cuenta con la colaboracin de la Universidad Estatal de Oklahoma (Agricultural
Research Service, 2015).
Este proyecto tiene como finalidad reducir la prdida de cultivos florcolas causados
tanto por las enfermedades ms comunes y conocidas as como por algunas de las
nuevas y ms inusuales. Para lograrlo, se propone el diseo de nuevas herramientas y
prcticas agrcolas que permitan un mejor manejo de las enfermedades (Agricultural
Research Service, 2015).
Como parte de este proyecto, en el 2012 cuatro negocios con invernadero en Long Island
fueron muestreados en busca de miembros del antiguo gnero Pythium, el cual ya para
aquel entonces inclua a Pythium y Globisporangium (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima,
2010). Se recolect un total de 389 muestras a partir de los cultivos, las estaciones de
llenado de macetas e incluso el suelo fuera de los invernaderos, obtenindose un total de
74 aislados de Pythium.
Las muestras fueron analizadas utilizando secuencias ITS y marcadores SSR por la
Doctora Carla Garzn en la Universidad Estatal de Oklahoma (OSU), encontrndose
nueve especies de Globisporangium y cinco especies de Pythium. Entre los aislados de
G. irregulare sensu lato se identificaron cuatro grupos provenientes de dos linajes
6

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

distintos: el primero conteniendo solo G. irregulare sensu stricto y el otro conteniendo a

G. cryptoirregulare, G. cylindrosporum y G. irregulare sensu lato.
11 PROYECTOS RELACIONADOS O COMPLEMENTARIOS
11.1 Proyectos Realizados en el Exterior

Molecular characterization of Phytium populations in ornamental greenhouse and

nursery crops (Garrido, 2014).

Molecular taxonomy and its application to ecological studies of Pythium species

(Kageyama, 2014).

First Report of Globisporangium ultimum Causing Pythium Damping-Off on

Aleppo Pine in Algeria, Africa, and the Mediterranean Region (Lazreg, et al.,
2013).

Molecular phylogeny and taxonomy of the genus Pythium (Lvesque & de Cock,
2004).

Phylogeny of the genus Pythium and description of new genera (Uzuhashi, Tojo,
& Kakishima, 2010).

Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis and Internal Transcribed

Spacer and coxII Sequences Reveal a Species Boundary Within Pythium
irregulare (Garzn, Geyser, & Moorman, 2005)

Pythium cryptoirregulare, a new species within the P. irregulare complex

(Garzn, Yanz, & Moorman, 2007).

Relacin filogentica de cepas de Pythium irregulare sensu lato de Long Island,

New York en base al anlisis de secuencias del gen -tubulina (Proao, 2014).

Identification and characterization of simple sequence repeat markers for

Pythium aphanidermatum , P . cryptoirregulare , and P . irregulare and the
potential use in Pythium population genetics (Lee & Moorman, 2008).

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

Genetic structure and distribution of Pythium aphanidermatum populations in

Pennsylvania greenhouses based on analysis of AFLP and SSR markers (Lee,
Garzn, & Moorman, 2010).

12 JUSTIFICACIN O IMPORTANCIA DEL PROBLEMA A RESOLVER

La horticultura ambiental, que incluye invernaderos y viveros ornamentales, es uno de

los segmentos agrcolas de ms rpido crecimiento y expansin en los Estados Unidos,
incluso durante las recesiones (Hall, 2006).
En la Tabla 1 se pueden observar el valor de las ventas al por menor de productos
provenientes de la Industria Florcola durante los ltimos aos.
EL aumento en la produccin de cultivos ornamentales en invernaderos y viveros ha
contribuido al aumento de varias enfermedades como el damping-off pre y postemergente de las plntulas y semillas, pudriciones de tallo o pudriciones de raz, lo que
se ha convertido en factores que afectan a la economa de los negocios (Garrido, 2014).
Para que la industria florcola pueda continuar con su crecimiento, los productores de
plantas ornamentales no pueden permitirse la presencia de plantas enfermas en sus
invernaderos y viveros, ya que siempre conllevan a prdidas econmicas. Por lo tanto
los tratamientos preventivos y el control de enfermedades deben ser eficientes para ser
econmicamente rentables, adems de ser seguros para las personas y el medio ambiente
(Daughtrey, 2004).

Tabla 1. Valor anual de las ventas al por menor de la Industria Florcola Estadounidense,
(U. S. Bureau of Economic Analysis, 2015).
Ao
2014
2013
2012

Valor de las ventas al por menor

(billones de USD)
26.6
25.7
26.3
8

PROYECTO DE INVESTIGACIN

2011
2010
2009
2008
2007
2006
2005
2004
2003
2002

JULIO/2015

25.8
25.9
25.7
28.9
30.3
29.8
27.8
25.4
24.2
24.3

13 OBJETIVO GENERAL DEL PROYECTO

Caracterizar molecularmente poblaciones de Globisporangium spp. obtenidas de

invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014. mediante el uso de microsatlites
SSR.
14 OBJETIVOS ESPECFICOS

Construir colecciones de ADN a partir de aislados de Globisporangium spp.

recolectados de cultivos ornamentales de Nueva York durante el 2014.

Caracterizar las poblaciones usando marcadores SSR.
Determinar la posicin filogentica de los aislados de Globisporangium spp.

15 MARCO REFERENCIAL
15.1 Globisporangium spp.
15.1.1 Taxonoma

Globisporangium spp. es una especie conocida de oomiceto que antiguamente formaba

parte del gnero Pythium, por lo tanto pertenece a la familia Pythiaceae, clase
Oomycete, phylum Oomycota (Buller, 2014).
El gnero Pythium

fue descrito por primera vez en 1858 por Pringsheim. Desde

entonces su taxonoma ha cambiado varias veces, generalmente en funcin de sus

caractersticas morfolgicas. Sin embargo debido a que estas pueden confundirse entre
especies, o no siempre se forman en el agar, el uso de mtodos moleculares ha sido
9

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

necesario para poder obtener una mejor identificacin y delimitacin de la taxonoma de

Pythium (Lvesque & de Cock, 2004).
Mediante el anlisis filogentico de genes de Pythium como: la subunidad larga de
ADNr D1/D2 (LSU rDNA D1/D2) y coxII, Se enmend el gnero Pythium y se dividi
de

las

especies

restantes

en

cuatro

gneros

diferentes:

Ovatisporangium,

Elongisporangium, Globisporangium y Pilasporangium (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima,

2010).
15.1.2 Biologa

Como parte del antiguo gnero al que pertenecan, estn bien distribuidos alrededor del
mundo y pueden ser hallados en diversos nichos ecolgicos. Pueden ser saprfitos o
patgenos facultativos de plantas tanto en ambientes terrestres como acuticos. En el
suelo poseen un amplio rango de plantas hospederas en las cuales causan las
enfermedades de damping-off y pudricin de la raz, entre otras (Garrido, 2014).
Como caractersticas morfolgicas poseen un micelio bien desarrollado que pueden
presentar apresorios. Las hifas son hialinas y raramente septadas. El esporangio puede
ser terminal, intercalar o lateral con forma globosa, de limn o de corazn. Las
zoosporas son biflageladas, el oogonio puede ser terminal o intercalar y los anteridios
pueden tener distintas formas y haber uno o varios (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima,
2010).
15.1.3 Enfermedad que causa

Algunas especies pertenecientes a Globisporangium spp. son conocidas por causar

marchitamiento fngico (damping-off) y pudricin de la raz (root rot) en gran variedad
de especies alrededor del mundo incluyendo conferas y cultivos florcolas (Lazreg, et
al., 2013).
El damping-off causado por diferentes especies de Pythium (y otros gneros
relacionados) comienza generalmente como pudricin de la raz. El hongo sobrevive en
el suelo como oospora y germina para atacar las raicillas de las plntulas causando el
deterioro progresivo de todo el sistema radical. La plntula muere antes de que se
10

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

puedan apreciar lesiones en las partes areas y por lo general ni siquiera llega a
germinar, damping-off pre-emergente, (Laemmlen, 2001).
En algunos hospederos, las lesiones en la raz pueden observarse como hmedas,
babosas, de color caf o marchitas y en ocasiones incluso se puede observar el micelio
(Daughtrey, Wick, & Peterson, 1995).
La fuente de los patgenos en cultivos florcolas puede ser restos de plantas, polvo,
herramientas, equipos, mezcla para macetas, tuberas de irrigacin, entre otras. Las
oosporas o el esporangio son los inculos primarios que tambin pueden ser movilizados
en material vegetal infectado como en el caso de semillas o plntulas que se mueven
entre invernaderos (Sutton, y otros, 2006).
15.2 Marcadores Moleculares

Los marcadores moleculares son sitios donde se pueden encontrar diferencias en las
secuencias de ADN entre miembros de la misma especie. Es decir representan
polimorfismos a nivel de ADN. Una gran cantidad de marcadores se han descubierto
desde 1980 y cada ao se desarrollan nuevos tipos (White, Adams, & Neale, 2007).
Los diferentes tipos de marcadores moleculares pueden clasificarse por su capacidad de
detectar polimorfismos en un nico loci o en varios; y por ser dominantes (AFLPs,
ISSRs, RAPDs) o codominantes (RFLPs, SSRs) (Alcantara, 2007). Tambin pueden
agruparse entre aquellos que se basan en la hibridacin ADN-ADN (como los RFLPs) y
aquellos que se basan en la amplificacin mediante PCR (como los SSRs). A diferencia
de los mtodos basados en hibridacin ADN-ADN, la tcnica de la PCR requiere de una
menor cantidad de material gentico para funcionar correctamente (White, Adams, &
Neale, 2007).
15.2.1 Marcadores SSR

Los marcadores de repeticin de secuencia simple (marcadores SSR), tambin llamados

microsatlites, son repeticiones se secuencias cortas de nucletidos de no ms de seis
bases de largo. Durante los ltimos aos ha aumentado de manera considerable la
utilidad de los marcadores para estudios de diversidad gentica, estudios ecolgico11

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

genticos, caracterizacin de flujo de genes, mapeo gentico entre otros (Stafne, Clark,
Weber, Graham, & Lewers, 2005)
La ventaja que ofrece el usar microsatlites es que son abundantes, estn distribuidos por
todo el genoma, son ms polimrficos que otro tipo de marcadores moleculares, son
especficos para cada especie y son codominantes. Sin embargo tambin existen sus
contras, pues presentan un alto costo de desarrollo y existen varios retos tcnicos al
momento de construir los primers especficos para cada especie (Miah, et al., 2013).
Como se mencion anteriormente, los marcadores SSR requieren del uso de una PCR
para funcionar. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en amplificar un
segmento del ADN mediante el uso de primers o cebadores. La reaccin consta de tres
pasos principales: 1) Desnaturalizacin de la doble cadena de ADN. 2) EL alineamiento
de los primers a la secuencia objetivo. 3) La sntesis de las nuevas cadenas de ADN
mediante el uso de una polimerasa termoresistente (Taq Polimerasa). Los tres pasos se
consideran un ciclo. Al final del primer ciclo se obtienen dos nuevas dobles cadenas de
ADN a partir de la original que servirn de molde para el siguiente ciclo, obtenindose
as una amplificacin geomtrica de las molculas (White, Adams, & Neale, 2007).
En el caso de la PCR para el anlisis de microsatlites, la secuencia objetivo es aquella
donde se encuentran las secuencias repetidas que interesa analizar. Por lo tanto los
primers que se utilizan son diseados a partir de las secuencias flanqueantes de los
microsatlites. Debido a los polimorfismos de los microsatlites entre individuos de la
misma especie, las secuencias obtenidas tendrn diferente peso molecular y por lo tanto
mediante una electroforesis podemos comparar la similitud gentica entre varios
individuos (Pico, 2014).
15.3 Anlisis filogentico

La filogenia es el estudio de las relaciones evolutivas. El anlisis filogentico es el

medio por el cual estimamos estas relaciones. Los datos obtenidos de la historia
evolutiva de un anlisis filogentico por lo general son presentados en forma de
diagramas de rbol que representan las relaciones entre molculas, organismos o ambos
(Brinkman & Leipe, 2001).
12

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

De manera tradicional, la filogenia trabaja con caractersticas fsicas o morfolgicas

(como tamao, color, nmero de patas, etc.). Sin embargo en la actualidad se utiliza
material gentico, principalmente secuencias de ADN y protenas. Las relaciones se
infieren por la presencia de bloques conservados encontrados a la hora de alinear las
secuencias analizadas (Stettiner & Gabor, 2001).
Un anlisis filogentico consiste de cuatro pasos principales (Brinkman & Leipe, 2001):
1) Alineamiento: Usualmente consiste en un alineamiento mltiple. Posterior al
cual es necesario extraer el set de datos filogenticos, que algunas veces puede
no corresponder exactamente al alineamiento en funcin de cuanta ambigedad e
inserciones y deleciones se van a permitir en el proceso de construccin del
rbol.
2) Determinacin del modelo de substitucin: Elegir el modelo de sustitucin de
bases adecuado de acuerdo al tipo de organismo y secuencia que se est
analizando.
3) Construccin del rbol filogentico: Se tiene que elegir entre mtodos basados en
distancias y mtodos basados en caractersticas de acuerdo a los datos que se
tienen.
4) Evaluacin del rbol filogentico.
16 METODOLOGA
16.1 Participantes
16.1.1 Instituciones

Esta investigacin se realizar con la colaboracin entre el Laboratorio del

Departamento de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma
ubicada en Stillwater, Estados Unidos y el Laboratorio de Microbiologa perteneciente a
la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa del Departamento de Ciencias de la Vida y de
la Agricultura de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE ubicada en Sangolqu,
Ecuador.
16.1.2 Colaboradores Cientficos

Dra. Carla Garzn Ph.D. (OSU)

Alma Koch M.Sc. (UFA-ESPE)
13

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

Francisco Flores Ph.D. (UFA-ESPE)

16.2 Revisin Bibliogrfica

Se comenzar este proyecto con una revisin detallada de la informacin existente hasta
la fecha del gnero Globisporangium as como del gnero Pythium del cual formaba
parte hasta hace unos cinco aos. De igual manera, se har una revisin bibliogrfica de
los mtodos moleculares y estadsticos necesarios para la elaboracin de anlisis
filogenticos.

16.3 Trabajo de Laboratorio

16.3.1 Extraccin de ADN

A partir de muestras liofilizadas se proceder a realizar la extraccin de ADN utilizando

el kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia CA) segn el protocolo descrito por el
fabricante.
16.3.2 Determinacin de la concentracin y pureza de los aislados

Se utilizar un espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies,

Wilmington, DE). Se configurar el equipo en modo ADN y con unidades de
concentracin en ng/L. Se colocar 1,5 L de buffer AE como blanco y luego se
analizar 1,5 L de cada una de las muestras. Para evaluar la calidad de las muestras se
utilizar la relacin de absorbancias 260/280 y se considerar la muestra como pura si
esta relacin se encuentra en el rango entre 1.8 y 2.1.
16.3.3 Dilucin del ADN

El ADN extrado se diluir a una concentracin final de 10 ng/L y un volumen final de

30 L de acuerdo con la Ecuacin 1.

14

PROYECTO DE INVESTIGACIN

V 1=

JULIO/2015

V 2 C 2
C1
Ecuacin 1. Clculo del volumen de muestra necesaria

Donde V2 es el volumen final deseado (30 L), C2 es la concentracin final deseada

(10ng/L), C1 es la concentracin obtenida del espectrofotmetro y V1 es la cantidad de
muestra que se necesita tomar.
16.3.4 Anlisis gentico con marcadores SSR

Se utilizar cuatro marcadores polimrficos SSR (P18GAA1-71, P18GAA1-72,

P18CAT1-74 and P18TCC3-25) desarrollados para el anlisis de poblaciones de
Pythium (Lee & Moorman, 2008).
La PCR se llevar a cabo en 20 L de mezcla de reaccin que contendr: 1X PCR
Buffer, 2.5 mM dNTP, 1U Taq Polimerasa y 3 M de cada primer (Lee, Garzn, &
Moorman, 2010). En la Tabla 2 se puede observar el programa de PCR
Tabla 2. Programa de la PCR (Lee, Garzn, & Moorman, 2010).
Ciclo
Desnaturalizacin inicial
Desnaturalizacin
Alineamiento

Temperatura
94 C
30-35 ciclos
94 C
55-60 C (Dependiendo del

Extensin
Extensin

set de primers)
72 C
72 C

Tiempo
5 min
30 s
30 s
30 s
10 min

Los productos de la PCR se analizarn mediante el uso de electroforesis capilar con un

equipo ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems).
17 ANLISIS ESTADSTICO

A fin de determinar el nmero de poblaciones entre los aislados obtenidos se utilizar el

software Structure versin 2.3.2 el cual mediante mtodos de Inferencia Bayesiana

15

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

determina el nmero de ancestros comunes (K) entre todas las muestras y asigna a cada
uno de los individuos a la poblacin correspondiente.
Los coeficientes estadsticos que se analizarn sern diversidad allica, nmero de alelos
por locus (Na), nmero efectivo de alelos (Ne), heterocigosidad observada (Ho) y
esperada (He) en el equilibrio de Hardy Weinberg (HWE) la cual se calcula mediante la
Ecuacin 2.

H E =1 pi2
1

Ecuacin 2. Heterocigosidad esperada para ms de dos alelos (Frankman, Ballou, &

Briscoe, 2010).
Donde:

n = nmero de los alelos

pi = frecuencia del alelo i

El contenido de informacin del polimorfismo (PIC), el cual es usado para medir el

polimorfismo de un locus determinado y usado principalmente en anlisis de parentesco
se calcular mediante lo demostrado por Bolstein y colaboradores en 1980 (Shete,
Tiwari, & Elston, 2000) como se indica en la Ecuacin 3.
PIC=1 p2i p 2i p2j
i

i,j

Ecuacin 3. Contenido de Informacin del Polimorfismo (Shete, Tiwari, & Elston,

2000).
Donde:

pi = frecuencia del alelo i

pj = frecuencia del alelo j

Tambin se realizar el clculo de la varianza molecular (AMOVA) mediante el software

GenAIEx.
16

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

18 HIPTESIS

El uso de marcadores SSR permite caracterizar poblaciones de Globisporangium spp.

entre los aislados obtenidos de invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014.

19 OPERATIVIDAD DE LAS VARIABLES

Tabla 3. Operatividad de las Variables.

Proceso
Extraccin y cuantificacin de ADN
Anlisis gentico con marcadores SSR

Anlisis estadstico

Variable a determinar
Concentracin de ADN
Nmero de poblaciones encontradas
Diversidad allica
Nmero de alelos por locus (Na)
Nmero efectivo de alelos (Ne)
Heterocigosidad observada (Ho)
Heterocigosidad observada (He)
Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE)
Contenido de informacin del
polimorfismo (PIC)
Varianza molecular

20 ACTIVIDAD PARA LA EJECUCIN

1) Revisin bibliogrfica de informacin existente sobre Globisporangium spp.

2) Elaboracin del perfil del proyecto de investigacin
3) Viaje a Stillwater, Oklahoma a la Universidad Estatal de Oklahoma donde este
proyecto se llevar a cabo.
4) Extraccin de ADN de las muestras y construccin de colecciones de ADN.
5) Obtencin de los fragmentos de ADN contiendo los SSR mediante una PCR.
6) Anlisis de los fragmentos mediante electroforesis capilar.
7) Anlisis filogentico de la informacin obtenida.
8) Determinacin de las posiciones filogenticas de cada uno de los aislados.
9) Anlisis de los resultados obtenidos
10) Redaccin del informe final del proyecto
17

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

21 DURACIN DEL PROYECTO

Este proyecto tiene una duracin de cuatro meses.

22 BIBLIOGRAFA

Agricultural Research Service. (1 de Julio de 2015). Research Project: Tracking and

Managing Diseases of Floriculture Crops Caused by Oomycetes and Fungi.
Obtenido de United States Deparment of Agriculture. Agricultural Research
Service:

http://www.ars.usda.gov/research/projects/projects.htm?

ACCN_NO=420346
Alcantara, M. (2007). Breve Revisin de los Marcadores Moleculares. En L. Eguiarte, V.
Souza, & X. Aguirre, Ecologa Molecular (pgs. 541-565). Mxico D.F.,
Mxico: SEMANART.
Arias, O. (2014). Caracterizacin de poblaciones de Fusarium spp. a partir de aislados
de Israel y Estados Unidos. Sangolqu, Ecuador.
Brinkman, F., & Leipe, D. (2001). Phylogenetic Analysis. En A. Baxevanis, & F.
Ouellete, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and
Proteins, Second Edition (pgs. 323-358). John Wiley & Sons, Inc.
Buller, N. (2014). Bacteria and Fungi from Fish and other Aquatic Animals, 2nd
Edition: A Practical Identification Manual. Boston, USA: CABI.
Daughtrey. (2004). Disease Management for Floral and Nursery Crops. Obtenido de
Long

Island

Horticultural

&

Extension

Center.

Cornell

University:

http://www.longislandhort.cornell.edu/staff/DaughtreyMargery2004.pdf
Daughtrey, M., Wick, R., & Peterson, J. (1995). Compendium of flowering potted plant
diseases. American Phytopathological Society (APS Press).
Frankman, R., Ballou, J., & Briscoe, D. (2010). Introduction to Conservation Genetics.
Nueva York: Cambridge University Press.
18

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

Garrido, P. (2014). Molecular characterization of Phytium populations in ornamental

greenhouse and nursery crops. Department of Entomology and Plant Pathology.
Oklahoma State University. Obtenido de Department of Plant Pathology and
Entomology. Oklahoma State University.
Garzn, C., & Y. (s.f.). Pythium cryptoirregulare, a new species within the P. irregulare
complex.
Garzn, C., Geyser, D., & Moorman, G. (2005). Amplified Fragment Length
Polymorphism Analysis and Internal Transcribed Spacer and coxII Sequences
Reveal a Species Boundary Within Pythium irregulare. Phytopathology 95,
1489-1498.
Garzn, C., Yanz, J., & Moorman, G. (2007). Pythium cryptoirregulare, a new species
within the P. irregulare complex. Mycologia 99, 291-301.
Hall, C. (2006). The U.S. Floriculture Industry: Structural changes, marketing
practices, and economic impact. Obtenido de Aggie-horticulture. Texas A&M
University: http://aggie-horticulture.tamu.edu/faculty/hall/Media/Hall-paper.pdf
Kageyama, K. (2014). Molecular taxonomy and its application to ecological studies of
Pythium species. J Gen Plant Pathol 80, 314-326.
Laemmlen, F. (2001). Damping-off Diseases. Obtenido de University of California.
Agriculture and Natural Resources: http://anrcatalog.ucdavis.edu/pdf/8041.pdf
Lazreg, F., Belabid, L., Sanchez, J., Gallego, E., Garrido, J., & Elhaitoum, A. (2013).
First Report of Globisporangium ultimum Causing Pythium Damping-Off on
Aleppo Pine in Algeria, Africa, and the Mediterranean Region. Plant Disease,
1111.
Lee, S., & Moorman, G. (2008). Identification and characterization of simple sequence
repeat markers for Pythium aphanidermatum , P . cryptoirregulare , and P .
irregulare and the potential use in Pythium population genetics. Current
Genetics 53, 81-93.
19

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

Lee, S., Garzn, C., & Moorman, G. (2010). Genetic structure and distribution of
Pythium aphanidermatum populations in Pennsylvania greenhouses based on
analysis of AFLP and SSR markers. Mycologia 102, 774-784.
Lvesque, A., & de Cock, A. (2004). Molecular phylogeny and taxonomy of the genus
Pythium. Mycol. Res. 108, 1363-1383.
Miah, G., Rafii, M., Ismail, M., Puteh, A., Rahim, H., Islam, N., & Latif, M. (2013). A
Review of Microsatellite Markers and Their Applications in Rice Breeding
Programs to Improve Blast Disease Resistance. Int. J. Mol. Sci 14, 22499-22528.
Pico, B. (6 de Noviembre de 2014). Marcadores moleculares basados en PCR:
Marcadores SSR. Microsatelites. Valencia, Espaa.
Proao, M. F. (2014). Relacin filogentica de cepas de Phytium irregulare sensu lato de
Long Island, New York en base al anlisis de secuencias del gen -tubulina.
Sangolqu, Ecuador.
Shete, S., Tiwari, H., & Elston, R. (2000). On Estimating the Heterozygosity and
Polymorphism Information Content Value. Theoretica Population Biology 57,
265-271.
Stafne, E., Clark, J., Weber, C., Graham, J., & Lewers, K. (2005). Simple Sequence
Repeat (SSR) Markers for Genetic Mapping of Raspberry and Blackberry. J.
Amer. Soc. Hort. Sci. 130.
Stettiner, O., & Gabor, R. (27 de Diciembre de 2001). Phylogenetics and Phylogenetics
Trees.

Obtenido

de

The

Blavatnik

School

of

Computer

Science:

http://www.cs.tau.ac.il/~rshamir/algmb/01/scribe08/lec08.pdf
Sutton, J., Sopher, C., Owen-Going, T., Liu, W., Grodzinski, B., Hall, J., & Benchimol,
R. (2006). Etiology and epidemiology of Pythium root rot in hydroponic crops:
current knowledge and perspectives. Summa Phytopathologica 32, 307-321.

20

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

U. S. Bureau of Economic Analysis. (2015). Flower Industry Overview. Obtenido de

About

Flowers:

http://www.aboutflowers.com/about-the-flower-

industry/industry-overview.html
Uzuhashi, S., Tojo, M., & Kakishima, M. (2010). Phylogeny of the genus Pythium and
description of new genera. Mycoscience 51, 337-365.
White, T., Adams, W., & Neale, D. (2007). Forest Genetics. Cambridge, USA: CABI.

21

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

23 ANLISIS DE COSTOS DEL PROYECTO

En la Tabla 4 que se encuentra a continuacin se encuentran los gastos personales y del

laboratorio en los que se incurrir durante el proyecto.
Tabla 4. Costos del Proyecto

tem
1
2
3
4
tem
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Detalle
Pasaje de avin

Costos Personales
Cantidad

V. Unitario

V. Total

1
$1100
$1100
(Ida y Vuelta)
Estada (mensual)
3
$350
$1050
Alimentacin (mensual)
3
$500
$1500
Gastos varios (mensual)
3
$350
$350
Total
$3900
Costos del Laboratorio
Detalle
Uso
Kit de Extraccin de ADN
Extraccin de ADN
Determinacin de concentracin y pureza
NanoDrop ND-1000
del ADN
Buffer PCR
Taq Polimerasa
dNTPs
PCR
Primers
Marcadores SSR
Termobloque
ABI 3730 DNA Analyzer
Electroforesis capilar
Micropipetas
Cmara de Flujo Laminar
Insumos Varios
Centrfuga

24 FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO

Los costos personales y del viaje sern financiados por el responsable del proyecto:
Christian Orlando Ayala Ortiz.
Todos los dems costos de ejecucin del proyecto incluyendo reactivos, materiales,
equipos y softwares necesarios para la realizacin del mismo sern financiados por el

22

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

Laboratorio del Departamento de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal

de Oklahoma a cargo de la Dra. Carla Garzn Ph.D.
25 CONTENIDO

PARTE INTRODUCTORIA

CAPTULO 1: INTRODUCCIN
o Formulacin del Problema
o Justificacin del Problema
o Objetivos de la Investigacin

Objetivo General

Objetivos Especficos

o Marco Terico

Globisporangium spp.

Taxonoma

Biologa

Enfermedad que causa

Marcadores Genticos

Marcadores SSR

Anlisis Filogentico

o Hiptesis

CAPTULO 2: MATERIALES Y MTODOS

o Revisin Bibliogrfica
o Extraccin de ADN
o Determinacin de la pureza y concentracin de los aislados
o Dilucin del ADN
o Anlisis gentico con marcadores SSR

PCR

Electroforesis capilar

o Anlisis estadstico
23

PROYECTO DE INVESTIGACIN

CAPTULO 3: RESULTADOS

CAPTULO 4: DISCUSIN

CAPTULO 5: CONCLUSIONES

CAPTULO 6: RECOMENDACIONES

CAPTULO 7: BIBLIOGRAFA

ANEXOS

JULIO/2015

26 CRONOGRAMA

En la Figura 1 se observa el cronograma del proyecto elaborado en forma de un

Diagrama de Gantt. El proyecto una duracin de 4 meses y est previsto a iniciar en la
segunda semana de agosto.

Figura 1. Cronograma del Proyecto

27 FECHA DE PRESENTACIN DEL PROYECTO

16 de Julio del 2015

28 FIRMA DEL RESPONSABLE

24

PROYECTO DE INVESTIGACIN

JULIO/2015

___________________________
Christian Orlando Ayala Ortiz
CI: 1713535530
29 FECHA DE APROBACIN DEL PROYECTO

___________________________
30 FIRMA DE LA AUTORIDAD

___________________________
Dra. Mara Augusta Chvez
Coordinadora de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa

___________________________
Alma Koch M. Sc.
Posible Directora del Proyecto

25