INFORME DE PRCTICAS CULTIVO DE TEJIDOS,

MICROPROPAGACIN, COMSERVACIN Y EXPORTACIN DE

GERMOPLASMA DE PAPA
INFORME NO 005
AL ING: Juan Larico Vera
De: Cabana Monzn Walter Elas
Asunto: Informe de prcticas cultivo in vitro a partir de meristemos
de papa (solanum tuberosum L.)
Curso: Cultivo de tuberosas y races
Fecha: 22/07/15

NDICE

Contenido
I . INTRODUCCIN.......................................................................................... 2
II . OBJETIVOS................................................................................................. 3
AISLAMIENTO DE MERISTEMAS...................................................................8
MICROPROPAGACION................................................................................ 10
MANTENIMIENTO Y ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZO...........................11
EXPORTACION IN VITRO............................................................................. 12
IV. MATERIALES Y METODOS........................................................................12
EQUIPOS.................................................................................................... 12
MATERIALES.............................................................................................. 12
PRODUCTOS QUMICOS............................................................................. 13
MEDIOS DE CULTIVO.................................................................................. 14
MEDIOS DE INTRODUCCION......................................................................14
MEDIOS DE MICROPROPAGACION.............................................................14
MEDIOS DE CONSERVACION......................................................................14
MATERIAL VEGETATIVO.............................................................................. 14
METODOS.................................................................................................. 15
V. RESULTADOS............................................................................................ 18
VI. CONCLUSIONES...................................................................................... 19
VII. RECOMENDACIONES.............................................................................. 19
VIII. BIBLIOGRAFA....................................................................................... 19
WEBGRAFA.................................................................................................. 19
IX . ANEXOS................................................................................................. 20

I . INTRODUCCIN
La mayora de las plantas que se propagan de manera convencional
mediante mtodos asexuales y cuando se descuidan los aspectos de
orden fitosanitario corren el riesgo de infectarse con microorganismos
como virus, hongos, bacterias y micoplasmas, causando en las
plantas infectadas trastornos fisiolgicos que se reflejan en la
calidad , longevidad, vigor y, principalmente , en los bajos ndices de
produccin. Hasta la fecha para las plantas propagadas con
enfermedades virosas no hay tratamientos qumicos eficientes a nivel
comercial que erradiquen completamente la accin de estos
organismos dentro de las plantas, por lo que su incidencia
incontrolada permite la diseminacin de este tipo de enfermedades
en clones completos.
Basndose en el principio de que la distribucin de los virus en las
plantas es de manera irregular, en los puntos de crecimiento la
concentracin de los virus disminuye, ya que las regiones apicales y
meristemticas hay una acelerada divisin mittica celular y una
elevada actividad metablica; los virus no pueden controlar su
maquinaria biosinttica dentro del hospedero, adems en estos
puntos de crecimiento existe una carencia de tejido vascular definido
que permita la libre trayectoria de los virus al no tener una va de
transporte para invadir los tejidos meristemticos y la alta
concentracin de auxnica endgena que inhibe la sntesis de los
virus, son justificantes importantes que explican que mediante el
aislamiento y cultivo in vitro de meristemos apicales podamos
obtener plantas libres de patgenos incluidos los virus.
Las tcnicas sobre el diagnostico de patgenos en plantas que incluye
el uso de micro injertos, uso de plantas indicadoras, microscopa
electrnica y el empleo de
marcadores moleculares, conjuntamente con la aplicacin de las
herramientas in vitro, permite cumplir satisfactoriamente los
programas de diagnstico, certificacin de plantas libres de
patgenos a nivel comercial.

II . OBJETIVOS
1. aprender a localizar, disectar-aislar y sembrar in vitro meristemos
apicales de papa (Solanum tuberossum).
2. observar la influencia de la constitucin de los medios de cultivo y
reguladores en la regeneracin de plantas a partir de meristemos y
pices de tallos sembrados.
3. para recuperar cultivos en proceso de extincin

III MARCO TERICO Y CONCEPTUAL

VENTAJAS DE LAS TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS
El Centro Internacional de la Papa (CIP) mantiene una coleccin de
germoplasma de papa de aproximadamente 6 000 clones. Esta
coleccin es fuente de diversidad gentica aprovechable por
fitomejoradores en los programas de papa. La coleccin est
expuesta a una amplia gama de riesgos, como enfermedades
infecciosas o condiciones climticas adversas y su mantenimiento en
el campo es costoso. Por eso la coleccin de germoplasma in vitro
posee varias ventajas sobre el mantenimiento en el campo, a saber:
menores costos de mano de obra,
ausencia de infecciones de campo,
ausencia de peligros ambientales como granizadas y heladas,
acceso oportuno a material para micro propagacin,
acceso oportuno a material para eliminacin de patgenos,
disponibilidad
exportacin.

permanente

de

material

para

propagacin

En el CIP se est transfiriendo la coleccin de germoplasma de papa

del campo a in vitro (cultivo de tejidos) pero se necesitan varios aos
ms de trabajo para completar esa transferencia.

Trayectoria de un clon de papa a travs del cultivo de meristemas,

micro propagacin, almacenamiento y su eventual exportacin.

AISLAMIENTO DE MERISTEMAS
El meristema es un tejido compuesto por clulas que se dividen
rpidamente (clulas meristemticas) y constituye el punto activo de
crecimiento de la yema vegetal. Para la propagacin de cultivos de
yemas de papa, el meristema es ideal como material inicial ya que
tiene dos caractersticas 'favorables:
El meristema aislado se desarrolla en el medio de cultivo de una
manera genticamente estable. Este no es el caso, por ejemplo, de
los cultivos de callos, que son desorganizados y presentan
importantes variaciones genticas.
El aislamiento de meristemas reduce el nivel de infeccin virtica en
el tejido y, bajo condiciones apropiadas, puede ser utilizado para una
erradicacin completa de patgenos.
La cpula de la yema apical contiene las clulas verdaderamente
meris-temticas y est rodeada por primordios foliares y hojas
primarias. Como los tejidos vasculares ms diferenciados se
encuentran alejados del meristema (constituyen tejidos ms viejos en
el tallo), los elementos vasculares de los primordios foliares todava
no han estado en contacto con la parte principal del sistema vascular
del tallo. De ah que las partculas de virus, que puedan estar
presentes en el sistema vascular, llegan a la regin meristemtica del
pice solamente mediante un movimiento de clula en clula. Esta
es una de las principales razones por las cuales en una planta
infectada por virus la concentracin de los virus decrece a medida
que stos se acercan al meristema, sea de yema apical o axilar.
En principio esta situacin es similar en todos los vegetales; la nica
diferencia est en la forma del meristema y de los primordios foliares.
No se ha comprobado si otros factores como la produccin -eif las
clulas
meristemticas- de substancias inhibitorias de los virus, o el efecto de
las hormonas en el medio de cultivo, influyen en la eliminacin de los
virus mediante el cultivo de meristemas.
El aislamiento bajo condiciones aspticas del pice meristemtico, y
su cultivo en un medio asptico adecuado, conduce el desarrollo de
plntulas. Este desarrollo, en general, sigue un modelo que es
similar al de la planta entera: las clulas del meristema se dividen y la
diferenciacin de los tejidos continua. La nutricin de la parte
disecada de la planta es suplida por un medio artificial. Esta tcnica
llamada cultivo de meristema, fue aplicada por primera vez hace 30
aos por Morel y Martin (1952) en la dalia y puede llevar a obtener
plantas libres de patgenos.

La diseccin asptica del meristema es un proceso delicado y

requiere muchas horas de prctica. La secuencia de diseccin est
presentada fotogrficamente en la Figura 2 y se hace de la siguiente
manera: Se cortan los tallos en segmentos, cada uno los cuales debe
tener un nudo con su yema axilar. Luego con mucho cuidado se
eliminan las hojas. Las piezas se desinfectan primero durante 30
segundos en alcohol de 70%, y a continuacin en una solucin de
2,5% de hipoclorito de calcio durante 15 minutos. Se lavan cuatro
veces con agua destilada esterilizada para quitar el exceso de
hipoclorito.
Con el apoyo de un microscopio binocular para diseccin, se
desprenden los fololos que rodean el punto de crecimiento hasta que
slo queden el pice y algunos primordios foliares. El pice con dos
primordios foliares se corta y se transfiere al Medio A (ver Seccin
6). Semanalmente se hace la transferencia a un medio fresco.
Despus de seis a ocho semanas las pequeas plntulas son
transferidas a tubos ms grandes para que continen su crecimiento.
La micropropagacin puede iniciarse cuando las plantas tengan 4 cm
de altura.

Secuencia fotogrfica de la diseccin de meristemas:

a Yema aislada en condicin estril.
b y c Etapas de la diseccin en que se eliminan las hojas primaras.
d Meristemo completamente disecado con dos primordios foliares.

MICROPROPAGACION
El objetivo de la micropropagacion es obtener un nmero grande de
plantas clnales en un perodo corto. En el CIP, se siguen dos
mtodos de micropropagacion de papa:
esquejes de tallo para medios de agar,
esquejes de tallo para medios lquidos.
Para ambos casos se utiliza iluminacin indirecta durante 16 horas.
Esquejes de tallo para medios de agar. De pequeas plntulas in
vitro, se cortan nudos simples con hojas. Las hojas grandes se
desecan con cuidado. Luego se coloca el esqueje sobre la superficie
del Medio B, que es slido. La yema axilar crecer rpidamente
(Figura 3) y en tres o cuatro semanas, habr otros seis o siete
esquejes disponibles para ser transferidos.
10

Esquejes de tallo para medios lquidos. Se cortan plntulas in

vitro en pedazos con tres o cuatros nudos y se eliminan las hojas
grandes. Estos
3 segmentos de tallos se introducen en un frasco con 15 cm del
Medio F lquido y el frasco se coloca en un agitador horizontal (80
rpm). Despus de
dos a tres semanas, se ha
producido un crecimiento muy veloz y de cada frasco
se obtendrn 60 a 70 nudos. Cuando se haya producido un nmero
adecuado de plntulas stas pueden ser trasplantadas a condiciones
no estriles.
Enraizamiento y trasplante a condiciones no estriles. A los
esquejes de tallo de plntulas in vitro, se les quitan las hojas. Luego
los esquejes se colocan en un Medio B donde crecen y enrazan.
Cuando las plntulas tengan una altura de tres a cinco centmetros y
hayan desarrollado un buen sistema radicular, estarn
listas para
el tras plante. Las plntulas enraizadas pueden ser trasplantadas a
macetas o tambin a almcigos que
contengan
una
mezcla
adecuada de
MANTENIMIENTO Y ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZO
El material in vitro puede ser conservado en cultivo indefinidamente
si se evita la contaminacin y se transfiere a medios frescos cada
cierto tiempo. Se puede mantener una reserva de material de sanidad
comprobada para utilizarlo en el futuro.
Para el mantenimiento a corto plazo, las plntulas se cultivan en el
medio B en tubos de ensayo. Estos se sellan con tapas de plstico
que puedan ser esterilizadas en autoclave. Aunque los tapones de
algodn son apropiados para un almacenamiento a corto plazo, no
son recomendados para un almacenamiento a plazo mediano o largo,
porque los hongos entran fcilmente en el algodn.
La tasa de crecimiento de las plantas depende de la temperatura de
incubacin, la composicin de los medios y la variedad de la planta.
De all que se requieran, para un almacenamiento a largo plazo,
modificaciones de los medios y de la temperatura de incubacin.
Tanto el Medio C como el Medio D ejercen un estrs osmtico y
pueden ser utilizados para un almacenamiento a 25C. El estrs
reduce la tasa de crecimiento y produce entrenudos cortos. De ese
modo se obtienen abundantes nudos para producir esquejes cuando
se
necesite
propagar
el
material
almacenado.
Con
un
almacenamiento en estas condiciones, el material slo necesita ser
transferido una vez al ao.
Sin embargo, al utilizar el Medio C, la temperatura puede ser bajada a
8C, lo cual reduce significativamente la tasa de crecimiento de la

11

plntula y, bajo estas condiciones, slo se necesita una transferencia

cada dos o tres aos.
En las condiciones de almacenamiento mencionadas en los prrafos
anteriores es posible mantener una coleccin de germoplasma.
Cuando llega un pedido de exportacin de un genotipo en particular,
ste puede ser
EXPORTACION IN VITRO
El material de la coleccin de sanidad comprobada puede ser
exportado a otros pases como plntulas in vitro. De un material
micropropagado se pueden obtener esquejes con un solo nudo, los
cuales son transferidos a tubos de ensayo que contengan el Medio E.
Cuando las plntulas tengan una altura de 2 cm y un sistema
radicular bien desarrollado, los tubos con las plntulas se embalan
con cuidado para su envo por avin. El destinatario es informado por
tlex o cable sobre los nmeros de vuelo y gua aerea para que el
envo pueda ser liberado de la aduana. Adjunto a cada envo in vitro
va una nota que explica el manejo que se le debe dar al material
despus de ser recibido, un certificado fitosanitario y una tarjeta, para
llenar y devolver al CIP, con los detalles sobre el estado del material
al llegar a su destino final.
Las plntulas in vitro que se reciben de esta manera, pueden ser
transferidas a una mezcla de musgo y arena, en macetas, o continuar
siendo micropropagadas.
Actualmente todos los envos in vitro se hacen en la forma de
plntulas de 2 cm de altura, pero se est investigando para
complementar o reemplazar este mtodo con la exportacin de
tubrculos in vitro . Estos son unos tubrculos muy pequeos,
aspticos y de sanidad comprobada, que pueden ser inducidos en un
medio de cultivo. Es mucho ms cmodo transportarlos y su manejo
por parte del pas de destino es ms fcil que en el caso de los tubos
de ensayo.

IV. MATERIALES Y METODOS

EQUIPOS
Autoclave para esterilizar medios soluciones
Agua destilada
Materiales de vidrio
Refrigeradora para guardas soluciones
PH metro para medir PH
Destilador de agua
Balanza analtica

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 Mango de bistur

MATERIALES
2 vasos de precipitado de 250 mL.
1 probeta de 250 mL.
1 pinza
1 mango para bistur nm. 3.
1 navaja de bistur nm. 10.
2 cajas petri estriles.
1 mechero de alcohol.
Tubos de ensaye (o frascos) con medios de cultivo.
2 frascos con agua destilada y esterilizada con antioxidantes
(150 mgL-1 de cido ctrico y 100 mgL-1 de cido ascrbico).
hipoclorito de sodio (cloro comercial).
alcohol etlico al 70%.
Tween-20.
10 g de detergente.
1 estereoscopio.
1 cmara de flujo de aire laminar (cmara de siembra)
Embudo
Frasco de maduracin

PRODUCTOS QUMICOS
Macro nutrientes

Nitrato de amono
Nitrato de potasio
Cloruro de calcio 2 hidratado
Sulfato de amonio
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Micro nutrientes

Cloruro de potasio
cido brico
Sulfato de manganeso
Sulfato de manganeso hidratado
Cloruro de cobalto hidratado
Y otros

Reguladores de crecimiento
Auxinas
Citocininas
Giberelinas
Modificadores de pH
cido clorhdrico
Dixido de sodio
Hidrxido de sodio

Desinfectantes

Hipoclorito de sodio
Hipoclorito de calcio
Detergente
Lega comercial

MEDIOS DE CULTIVO
Medio de cultivo sodio --------Agar
Medio lquido -------------------Reactor agitador
Medio semislido -------------Biscoso
MEDIOS DE INTRODUCCION
Auxinas
Citocininas
Giberelinas
MEDIOS DE MICROPROPAGACION
A G3
MEDIOS DE CONSERVACION
Sorbitol
Manitol
MATERIAL VEGETATIVO
El material vegetativo sern esquejes de plantas de papa (Solanum
tuberossum),
14

las cuales se encuentran creciendo bajo condiciones de invernadero.

Las plantas madre de donde se extraern los esquejes
necesariamente debern tener caractersticas vegetativas, es decir,
que los tallos no presenten el desarrollo de madurez ligado a la
floracin o emisin de brotes florales Los explantes que se utilizaran
para realizar la siembra in vitro, sern los meristemos y pices de
papa (Solanum tuberossum).
METODOS
Actividades de laboratorio

Limpieza
Medios de cultivo
Micro propagacin
Conservacin

Preparacin del medio de cultivo para papa 250 ml

Pesar 1.1 g. de medio comercial MS (Murashigi Scoog)

Pesar 1.75 g. de Agar
Pesar 7.5 g. de azcar
Alistar 1.5 ml de vitaminas en stock
Alistar 0.25 ml de agar en stock

En un vaso de precipitado aadimos 200 ml de H 2O destilada

agregamos 1.1 gramos de medio MS Y aadimos 0.25 ml de vitaminas
en stock, a continuacin agregamos 0.25 ml de cido giberelico en
stock .

Luego de agregar esto enrazamos hasta 250 ml con agua destilada

mesclamos con una esptula o vageta en medio del cultivo .
Ajustamos el pH A 5.6 5.8 con ayuda de hidrxido de sodio para
subir el pH acido clorhdrico para bajar el pH.
15

Una vez ajustado el pH llevamos el medio de cultivo a la cocinilla

elctrica

Y antes de que empiece a hervir agregamos 1.8 g. de agar 7.5 g. de

azcar removiendo constantemente.

Diferenciamos 10 ml de medio de cultivo en cada frasco de

produccin por ltimo se tapa bien los frascos de produccin para
llevarlo al autoclave a 125oc 15 libras de presin para esterilizarlo por
20 min

16

ETAPA 2
A partir de una plntula

Ubicacin del pice de la plntula para proceder a cortarla y dejarla

como se observa en la figura

17

Una vez cortado el pice se introduce la porcin de plntula (que

contenga 1 o 2 nudos) en el medio de cultivo

V. RESULTADOS

Estos seran los resultados esperados al finalizar la practica (la

obtencin de mini tubrculos) y el desarrollo de la plntula a partir de
un esqueje

18

VI. CONCLUSIONES
Para realizar un buen cultivo in vitro se debe tener en cuenta las
siguientes consideraciones, la especie a propagar, el problema a
eliminar y el tipo mtodo a realizar.
El explante del meristemo ms adecuado, que permiti el normal y
rpido desarrollo fueron la parte axilar por estar en un gran
porcentaje libre de virus.

El cultivo de meristemos es el ms comercial gracias a ello se

obtienen microplantas y microtuberculos que estn garantizadas ya
que estn libres de patgenos.

VII. RECOMENDACIONES

1.- En general, a medida que es ms grande el tamao de

meristemo, mejor es su supervivencia in vitro
2.-La presencia de primordio foliar tambin parece determinar
la habilidad
de un meristemo para desarrollarse en una
plntula. Por ello, se ha sugerido que los meristemos cortados
deban incluir uno o dos primordios foliares.
3.- poner en practica esta tecnologa en toda la regin para
incrementar los
rendimientos y mejorar los ingresos econmicos en el cultivo
de papa.

VIII. BIBLIOGRAFA
Espinoza, N., Lizrraga, R., Sigeas, C., Buitrn, F.Bryan, J. y Dodds,
J.H. 1992. Cultivo de tejidos: Micropropagacin, conservacin y
exportacin de germoplasma de papa. Gua de investigacin CIP,
Centro Internacional de la Papa. Lima. Peru. 19 pp..

Hartman, H. T. y Kester D. E. 1988. Principios de cultivo de tejidos

para micropropagacin, En: Propagacin de plantas: principios y
prcticas. Compaa Editorial Continental, S.A de C.V. Mxico, D. F. Pp.
549-590

WEBGRAFA

Ministerio de Agricultura: Cadenas Productivas Disponible en

www.minag.gob.pe
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IX . ANEXOS

Fotos tomadas en el laboratorio de practicas

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