Biotecnologia experimental

Relatrios das prticas 9 e 10

Alunos: Alexander de Paula, Diogo Mendes, Naiara Farias, Natalia Azevedo e Victor de
Backer

Tanto para a prtica 9 quanto para a prtica 10 foi utilizado a curva de calibrao da
prtica 8, conforme sugerido pelo procedimento experimental. Seguem os dados a seguir dessa
curva de calibrao feita com uma soluo padro de glicose 5,0 mol/mL.
Tabela 1 Dados de volume de soluo utilizado, absorbncia e concentrao para a curva
padro.
Curva padro
V sol. Padro (ml) Abs C (mol/ml)
0
0
0
0,2
0,075
1
0,4
0,183
2
0,6
0,294
3
0,8
0,419
4
1
0,519
5

Absorbncia (adimensional)

Curva padro
0.6
0.5
0.4
0.3

y = 0.1068x - 0.0187
R = 0.9958

0.2
0.1
0
0

Concentrao (mol/mL)
Figura 1 Grfico da curva padro.

 = 0,1068 0,0187
=

+ 0,0187
0,1068

Em que Abs a absorbncia e C a concentrao (mol/mL).

Prtica 9: Influncia da temperatura sobre a atividade enzimtica

A seguir segue a Tabela 1 com os resultados da prtica. Vale lembrar que o tempo de
reao foi de 10 min para todas as temperaturas estudadas.

Tabela 1 Dados de temperatura, absorbncia, produto formado, fator de diluio e velocidade

de reao.
Temperatura Absorbncia
(oC)

Produto

Fator

Produto

Velocidade de

formado (no

de

formado

reao

corrigido pela

diluio

(mol/mL)

(mol/mL.min)

diluio)
(mol/mL)
0

0,540

5,2313

5,2313

0,5231

22,5

0,815

7,8062

15,6124

1,5612

50

1,740

16,4672

32,9345

3,2934

100

0,415

4,0609

4,0609

0,4061

A partir dos dados da tabela, pode-se construir um grfico de velocidade de reao

(mol/mL.min) versus temperatura (oC), ver Figura 2.

Velocidade de reao
(mol/mL.min)

3.50

y = -0.001x2 + 0.1032x + 0.2931

R = 0.9085

3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
0

20

40

60

80

100

120

Temperatura (oC)
Figura 2 Grfico de velocidade de reao (mol/mL.min) versus temperatura (oC).

A temperatura na qual a enzima apresenta a maior atividade pode ser obtida derivando
a equao de segundo grau gerada e igualando a zero, j que a parbola gerada possui a
concavidade voltada para baixo:

= 0,001 2 + 0,1032 + 0,2931

= 0,001 2 + 0,1032 + 0,2931

Em que v a velocidade de reao e T a temperatura. Derivando e igualando a zero:

0 = 0,002 + 0,1032
=

0,1032
0,002

= 51,6

A velocidade de uma reao qumica afetada pela temperatura, e podemos dizer que
o mesmo acontece com as reaes catalisadas por enzimas, a variao de temperatura afeta as
constantes cinticas Km e Vmx.
Como as enzimas so protenas, o aumento da temperatura no causa apenas o aumento
da velocidade da reao mas sim, dois efeitos opostos: at determinada temperatura, ocorre um
aumento da velocidade da reao; a partir de determinada temperatura, h uma diminuio na
velocidade da reao. Isso acontece porque as enzimas so protenas e como tal, podem ser
desnaturadas, ou seja, as enzimas perdem sua estrutura nativa, o que leva perda de funo.
Isso faz com que um mximo seja gerado no grfico de velocidade de reao versus
temperatura, caracterizando uma temperatura tima. Com os dados experimentais foi possvel
fazer uma regresso de segundo grau, que ao derivar, obteve-se a temperatura de 51,6 oC para
a temperatura na qual a enzima apresenta maior atividade, Vale lembrar que o R2 dessa
regresso foi de 0,9085, ou seja, apesar de ser um valor razoavelmente alto, caso seja necessrio
uma maior certeza quanto a esse valor de temperatura tima, seria recomendado o estudo de
mais temperaturas, a fim de gerar uma curva com o R2 mais prximo da unidade. No entanto,
mesmo assim, de se esperar que essa temperatura tima girasse em torno desse valor obtido.
No certo para cada tipo de enzima existe uma temperatura ideal, no qual a velocidade
da reao mxima, neste caso foi calculado 51,6 C, nesta temperatura permitindo o maior
nmero de colises moleculares sem desnaturar a enzima.

Prtica 10: Modelo Cintico de Michaelis-Menten

A seguir segue a Tabela 2 com os resultados da prtica:

Tabela 2 Dados de concentrao de substrato [S], absorbncia, produto formado, velocidade

de reao V, 1/[S] e 1/V.
Concentraco

Absorbncia

Produto

Velocidade de

de substrato

formado

reao V

[S]

(mol/mL)

(mol/mL.min)

1/[S]

1/V

0,0000

0,00

0,3385

3,34

0,3344

0,2

2,9899

10

0,5600

5,42

0,5418

0,1

1,8455

25

0,9150

8,74

0,8742

0,04

1,1438

50

1,5340

14,54

1,4538

0,02

0,6878

100

1,6200

15,34

1,5343

0,01

0,6517

250

1,8900

17,87

1,7871

0,004

0,5595

500

1,5880

15,04

1,5044

0,002

0,6647

Construindo um grfico de velocidade de reao versus concentrao de substrato:

Velocidade de reao (mol/mL,min)

Velocidade de reao x Concentrao de substrato

2.00
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0

100

200

300

400

500

600

Conncentrao de substrato (mol/mL)

Modelo

Experimental

Figura 3 Grfico de velocidade de reao (mol/mL.min) versus concentrao de

substrato (mol/mL).

A seguir, na Figura 4, est representada o comportamento da cintica enzimtica

previsto na literatura [1].

Figura 4 Curva da literatura de velocidade contra concentrao de substrato.

Dessa forma, percebe-se que o grfico obtido experimentalmente apresenta o mesmo

perfil do previsto pela literatura. Vale lembrar que o ltimo ponto possui um valor de
velocidade abaixo do esperado. Esse resultado foi obtido tambm numa replicata e pelos outros
grupos que realizaram a prtica, levando a concluso de que, provavelmente, a soluo padro
para este ponto estava na concentrao errada.

Agora, pelo modelo de Michaelis-Menten para cintica enzimtica temos:

[]
+ []

Rearranjando, podemos escrever:

1
=
+
[]

Logo, de se esperar um comportamento linear quando plota-se um grfico de 1/[S]

versus 1/V. Alm disso, a partir do grfico, pode-se obter os parmetros Km e Vmax. A figura a
seguir este grfico:

1/V (mL.min/mol)

3.5
3
2.5
2

y = 12.318x + 0.5588
R = 0.9926

1.5
1
0.5
0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

1/[S] (mL/mol)
Figura 5 Grfico 1/[S] versus 1/V.

Pela coeficiente de correlao gerado, percebe-se que a equao gerada descreveu bem
o sistema. Para o clculo dos paramtros:

= 0,5588

= 1,7895 mol/mL. min

E tambm:

= 12,318

= 22,0437 mol/mL

Atravs do processo de linearizao do modelo de Michaelis-Menten, foi possvel com

a equao da reta do grfico 1/[S] versus 1/V obtermos a velocidade mxima da reao e a
constante de Michaelis-Menten.

 sabido que a Michaelis-Menten relaciona a velocidade inicial da reao, com a

concentrao de substrato e a velocidade mxima de reao, onde todas as enzimas (E) esto
com substratos ligados em seus stios ativos, formando o complexo ES. Essa relao pode ser
melhor entendida atravs da seguinte reao:

Onde E representa as enzimas; S stios ativos; ES o complexo formado e Produto

formado. Portanto, a medida que a concentrao de substrato aumenta, as velocidades de
substratos tambm aumentam. Esse aumento linear para concentraes baixas. Porm, esse
aumento linear no acontece para concentraes maiores, j que acontece a saturao dos
stios-ativos. Dessa forma, a velocidade continua aumentado at atingir um patamar, a
velocidade mxima, que na verdade calculada como sendo a assntota da curva desse grfico
de velocidade de reao contra concentrao de substrato. Esse comportamento pode ser
observado no grfico da figura 3, onde possvel observar esse comportamento do aumento
da velocidade de reao com o aumento da concentrao de substrato no meio.
O grfico da Figura 3 relaciona os dados obtidos experimentalmente com os dados
modelos atravs do modelo de Michaelis-Menten, aps a obteno do Km e da Velocidade
mxima. Com a obteno dos dois dados, foi possvel identificar que os dados obtidos
experimentalmente preveem uma velocidade mxima prxima da velocidade mxima obtida
pelo modelo. Ainda possvel observar que atravs do modelo, em concentraes elevadas de
substrato, a velocidade de reao tende a se manter constante, enquanto em nossos dados
experimentais identificamos que a mesma tendeu a diminuir. Esse erro experimental pode ter
sido oriundo da etapa do preparo das solues do experimento, alm dos erros e incertezas
associadas aos equipamentos e vidrarias utilizados.
No grfico gerado pelos dados experimentais pode-se observar esses dois perfis o
aumento linear para baixos valores de [S] e a formao de um plateau para concentraes
maiores assim como no grfico da Figura 4.
A constante de Michaelis-Menten (Km) a concentrao de substrato quando a
velocidade mxima a metade. Analisando nossos resultados obtivemos um valor de Km de
22.0437 mol/mL.

Referncias
[1]

Retirado

de

<http://sistemas.eel.usp.br/docentes/arquivos/5840494/383/6-

Cineticaenzimatica.pdf>. Acesso em 09/07/2015.