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Nombre: Alex Bravo

Curso: 8vo Biotecnologa


Fecha: 18/05/2015
Catedra: Enzimologa

Cintica de la enzima Bromelina


INTRODUCCIN
Los enzimas son biomolculas especializadas en la catlisis de las reacciones qumicas que tienen
lugar en la clula. Son muy eficaces como catalizadores ya que son capaces de aumentar la
velocidad de las reacciones qumicas mucho ms que cualquier catalizador artificial conocido, y
adems son altamente especficos ya que cada uno de ellos induce la transformacin de un slo
tipo de sustancia y no de otras que se puedan encontrar en el medio de reaccin.

Determinacin de velocidad inicial.


La velocidad inicial de reaccin en la actividad cataltica de la enzima es la pendiente de la curva
de progreso, es decir el sustrato transformado frente al tiempo (tiempo cero). Al inicio las
reacciones ocurren linealmente. La cada de velocidad de reaccin se debe a la disminucin
significativa de la concentracin de sustrato, aunque puede influir otros factores como , pH,
inactivacin de la enzima, etc.

Inicialmente
se
produce
una
disminucin de sustrato, o aparicin de
producto, que es lineal con el tiempo.

Efecto de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica.


De forma general, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es proporcional a la
cantidad de enzima en la mezcla de ensayo

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

El pH afecta la actividad de una enzima en la reaccin. La curva se representa actividad frente a


pH, pero cada tipo de enzima puede actuar diferente. El pH ptimo es el valor al cual la actividad
es mxima. La relacin entre el pH y la actividad depende del comportamiento acido-base del
enzima y del propio sustrato.
El centro activo de la enzima contiene grupos funcionales cidos y bsicos, siendo el grado de
disociacin dependiente del pH, que determinar la conformacin de la protena, la capacidad
de unin del sustrato a l centro activo (km) y la capacidad de transformacin del sustrato.
A continuacin, efectos del pH sobre la actividad de diversas enzimas.

Efecto sobre la temperatura sobre la actividad enzimtica.


Al aumentar la temperatura de una reaccin enzimtica la velocidad enzimtica vara. El grafico
se representa en una curva de actividad enzimtica frente a la temperatura. Esta dependencia
refleja un doble efecto de la temperatura: positivo a bajos valores, debido al incremento que
experimenta a velocidad de cualquier reaccin qumica y negativo a valores altos debido a la
desnaturalizacin de la enzima por lo tanto se inactiva la enzima.
Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica.

El grafico representa el efecto de la


concentracin de sustrato sobre la
velocidad de una reaccin
catalizada enzimticamente.

Este comportamiento cintico es conocido como curva de saturacin hiperblica por el sustrato
denominado enzimas michaelianos. Como principal desviacin, algunos enzimas muestran
curvas sigmoides de saturacin por el sustrato.

Km: constante de Michaelis e indica la afinidad de la enzima por su sustrato


Vmax: velocidad mxima e indica la capacidad cataltica

Cintica de la bromelina obtenida a partir de la pia perolera (Ananas Comosus) de


Lebrija-Santander
El objetivo del proyecto es extraer la enzima bromelina de la pia y estudiar su comportamiento
cintico.
El comportamiento cintico de la bromelina se ajusta al modelo de Michaelis-menten en el cual
se determinaran la Vmax y Km.
BROMELINA
La Bromelina se obtiene del jugo, de la fruta o de los tallos de la pia. Es una glicoprotena del
grupo de las cisteino proteasas. Acta preferencialmente sobre aminocidos bsicos y cidos de
las protenas. Su pH ptimo se encuentra en el rango de 5 a 8.
Estudios de secuenciacin de aminocidos han demostrado que la bromelina debe su actividad
a un grupo sulfhdrico (-SH) propio de una cistena, grupo activo que se asemeja a otras cisteno
proteasas como la actinidina y la papana.
El corazn de la pia contiene bromelina de mayor actividad enzimtica que la de cualquier otra
parte de la fruta.
ENZIMA
La bromelina acta sobre otras protenas como la casena, la hemoglobina y la gelatina
La extraccin de la enzima se realiz a travs de la pia como materia prima. Se hicieron
extracciones mediante dos solventes: etanol y acetona trabajando en concentraciones v/v de
75% y 50% en agua. Se realiz la cuantificacin utilizando el mtodo Buiret.
INHIBIDORES:
La molcula que se una a las enzimas acta como una molcula que inactiva a la enzima, esta
tiene la capacidad de disminuir la velocidad. La correccin de un desequilibrio metablico o la
muerte de un patgeno se dan por la accin del inhibidor enzimtico.
Los inhibidores irreversibles por lo general reaccionan con la enzima y se cambian
qumicamente. Estos inhibidores de modifican los residuos de aminocidos claves para la
actividad enzimtica. En contraste, los inhibidores reversibles se unen no covalentemente tipos
y diferente de la inhibicin se producen en funcin de si el inhibidor se une a la enzima, el
complejo enzima-sustrato, o ambos.

La enzima bromelina se inhibe por derivados mercuriales como el p-CMB (Acido pcloromercuribenzoico) lo que demuestra que los grupos SH reactivos son necesarios para la
actividad. Esta prdida de actividad puede ser recuperada con concentraciones crecientes de
cistena. El agente nuclefilo es el tomo de azufre de la cistena que formara un intermediario
covalente durante la reaccin.
SUSTRATO
La eficiencia cataltica de la bromelina se determin usando casena como sustrato.
El proceso de estudio para la actividad enzimtica sobre la casena se llev de la siguiente
manera:
Concentracin de enzima 4,5e-5 M.
Se prepararon 100 mL de una solucin acuosa de casena al 2% en peso, dando una
concentracin de 8e-4. Lo ms relevante para esta medicin es que la concentracin de
sustrato sea mayor que la enzima.
Preparacin de solucin buffer fosfato 0,1M pH 6 y una solucin de cido actico 1M.
Se hicieron pequeas mezclas de las soluciones de enzima y sustrato en presencia de buffer,
3mL de cada una y 1,5mL de buffer. Se adiciono a la mezcla 3mL de la solucin cido actico 1M
con el objetivo de parar la reaccin. Este ltimo componente se coloc cada 30seg hasta
completar 8 muestras.
ACTIVIDAD ENZIMATICA
Se comprob el pH ptimo de la bromelina mezclando 3 mL de solucin de casena 8e-4 y 3mL
de solucin de enzima 4,4e-5M, en presencia de 1,5mL de buffer fosfato 0,1M. como se puede
observar en la figura, el rango de pH de la enzima es de 6 a 8.

Bajo la accin del mismo buffer y deteniendo de nuevo la reaccin con cido actico 1M, se
puede hallar la velocidad expresada en unidades pticas por segundo dividiendo la absorbancia
ptica entre el tiempo (180seg) en todas las muestras.

Estas velocidades se muestran a continuacin en la grfica, velocidades en funcin de las


concentraciones molares de sustrato, basndonos en el diagrama de Michaelis-menten.

Se puede observar que la velocidad mxima con que acta la bromelina corresponde
aproximadamente a 9,8e-4 U.O/seg. Segn la cintica de Michaelis, la interpolacin al eje de las
abscisas del valor correspondiente a la mitad de la velocidad es equivalente a Km.
El valor de Vmax/2 equivale a 4,912e-4 U.O/seg, dato que da como resultado una constante de
Michaelis con el valor de 7,962e-4M.

APLICACIONES
La bromelina extiende su uso a la industria crnica, cervecera, vincola, cosmtica, farmacutica,
eso sin contar las amplias aplicaciones clnicas en la que se ha visto exitosamente aplicada.
La enzima se utiliza principalmente como ablandador de carne (tiene buena actividad sobre los
tendones y el tejido conectivo rico en elastina) y para hidrolizar protenas solubles de la cerveza
que pudieran precipitar y causar opacidad por el enfriamiento.
La Bromelina tiene una actividad hidroltica sobre el tejido conectivo, lo que hace que estas
enzimas tengan la capacidad de proporcionar un rpido ablandamiento de la carne vacuno
adulto. La aplicacin para degradar el material fibroso de los crnicos, tanto la cascara, como la
pulpa y el corazn de la pia contienen bromelina para ejercer un efecto ablandador sobre las
carnes.
En la industria cervecera, la bromelina es usada como aclaradora de tal bebida, se aplica sobre
el producto en la instancia final de su fabricacin para que hidrolice ciertos complejos proteicos
formados durante la fermentacin de la bebida. Resulta ser una enzima ideal para la fabricacin
de cerveza ya que las protenas hidrolizadas por la bromelina dejan como residuos polipptidos
que dan sabor a la cerveza y le proporcionan adems la capacidad de generar espuma.
En la industria de los aceites vegetales se utiliza para refinar aceites y otros productos grasos. Al
aplicar la bromelina, esta es capaz de degradar impurezas del producto y producen por medio
de una floculacin que los residuos floten sobre el producto, siendo fcil separarlos por
decantacin o filtracin.

BIBLIOGRAFA

Illanes, A. (1994). Biotecnologa de enzimas. Ediciones Universitarias de Valparaso de


la Universidad Catlica de Valparaso, Chile, 396-403.
Hernndez, M., Chvez, M., Bez, R., Carvajal, C., Mrquez, M., Morris, H., ... &
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Lago, I. L., Varela, J. D., & de Cceres, F. M. (1996). La bromelina: una proteasa de
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Clavijo, D., Portilla Martnez, M. C., & Quijano Parra, A. (2012). Cintica de la
bromelina obtenida a partir de la pia perolera (Ananas comosus) de Lebrija-Santander.
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http://www.redalyc.org/pdf/903/90326388008.pdf