Medicina, Ribeiro Preto,

39 (4): 522-34, out./dez. 2006

Simpsio: FARMACOGENTICA
Captulo II

DA BIOLOGIA MOLECULAR MEDICINA: MTODOS

COMUMENTE UTILIZADOS EM FARMACOGENTICA
FROM MOLECULAR BIOLOGY TO MEDICINE: METHODS COMMONLY USED IN PHARMACOGENETICS

Mario Hiroyuki Hirata1, Vladimir Tavares2, Rosario Dominguez Crespo Hirata1

1

Docentes. 2Doutor do Programa de Ps-Graduao em Farmcia Analises Clinicas. Departamento de Anlises Clnicas e Toxicolgicas. Faculdade de Cincias Farmacuticas USP.
Correspondncia: Prof. Dr. Mario H. Hirata. Av. Prof. Lineu Prestes, 580 B. 17,
CEP 05508-900 So Paulo - SP. Tel.: (11) 3091-3634 - FAX: (11) 3813-2197 - E-mail: mhhirata@usp.br

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. Da biologia molecular medicina: mtodos comumente utilizados em
farmacogentica. Medicina (Ribeiro Preto) 2006; 39 (4): 522-34.

RESUMO: Nesta reviso, foram discutidos os procedimentos para obteno, manuseio e

armazenamento de amostras biolgicas teis em testes moleculares. Mtodos para triagem e
deteco direta de mutaes e polimorfismos genticos foram apresentados. Os princpios,
estratgias, aplicaes e limitaes de variaes da reao em cadeia pela polimerase (PCR),
tais como eletroforese em gel com gradiente de desnaturao (DGGE), polimorfismo de conformao de fita simples (SSCP), polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrio (RFLP),
amplificao alelo oligonucleotdeo-especfica (PCR-ASO), PCR em tempo real PCR, arranjos
de DNA e outras tcnicas moleculares, foram comentados.
Descritores: Farmacogentica. Reao em Cadeia da Polimerase. Polimorfismo Conformacional de Simples Fita. Polimorfismo de Fragmento de Restrio. DNA- Arranjos. Eletroforese
em Gradiente em Gel Desnaturante.

ABREVIATURAS

1- INTRODUO

PCR, reao em cadeia pela polimerase

Southern blot, tcnica de transferncia de DNA
RFLP, polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrio
SDS, duodecil sulfato de sdio
DEPC, dietilpirocarbonato
DGGE, eletroforese em gel com gradiente de
desnaturao
SSCP, polimorfismo de conformao de fita
simples
HDA, anlise de heteroduplex
CCM, mtodo da clivagem qumica
PTT, teste da protena truncada
PCR-ASO, amplificao alelo oligonucleotdeoespecfica

A procura pela teraputica individualizada e

com o menor risco de efeitos indesejveis ou colaterais sempre foi uma meta dos mdicos, farmacologistas, farmacuticos. Para isso tm sido pesquisadas
novas formas e formulaes farmacuticas procurando aumentar a eficcia e reduzir a toxicidade dos medicamentos. No entanto, at recentemente, os estudos dirigidos com abordagem gentica de pacientes
foram pouco explorados. A descrio da seqncia
completa do genoma humano trouxe perspectivas de
aplicaes potenciais das informaes do genoma,
transcriptoma e proteoma para o estudo de novos alvos teraputicos e da possibilidade, em um futuro breve, de uso da medicao individualizada.
A abordagem de mtodos utilizados no estudo

522

Mtodos moleculares em farmacogentica

da farmacogentica ser realizada de forma sucinta e

clara para facilitar a compreenso e estimular o leitor a
ampliar seu conhecimento procurando textos mais especficos e aprofundados em cada tema apresentado.
Os assuntos esto divididos em tpicos que abrangem
procedimentos de obteno de amostras, mtodos extrao de cidos nuclicos e mtodos de triagem de
mutaes e de estudo de polimorfismos genticos.
2- PROCEDIMENTOS DE OBTENO DE
AMOSTRAS
Os procedimentos de obteno de amostras biolgicas so parte da fase pr-analtica dos estudos
farmacogenticos. Nessa fase, so obtidas informaes sobre indivduo que est participando do estudo
que incluem o tipo de material biolgico a ser coletado,
horrio de coleta, procedimento de coleta do material,
forma de transporte e armazenamento da amostra, alm
de dados pessoais como sexo, idade, etnia, dieta, uso
de medicamentos e outras caractersticas necessrias
para anlise dos resultados. Estas informaes direcionaro a maneira que deve ser obtida e conservada,
para que ao proceder a anlise no se tenha dvida do
resultado que possa ser gerado nos processo analtico.
Na fase pr-analtica, primordial que se verifiquem os tipos testes a serem realizados e o cido nuclico a ser isolado para utilizar os procedimentos mais
adequados de conservao e armazenamento para
manter a integridade da amostra biolgica1. importante ter em mente que os cuidados no processamento
de amostras para obteno de DNA so distintos dos
utilizados para a extrao de RNA. Para o isolamento
de DNA, as amostras biolgicas podem ser refrigeradas em temperaturas que variam entre 4 a 10C. Por
outro lado, para a anlise de RNA as amostras devem
ser imediatamente conservadas em temperatura ultrabaixa (-70 a -80 oC), exceto se a extrao do RNA for
realizada imediatamente. Recomenda-se tambm a
adio de um conservante de RNA na amostra a ser
armazenada, geralmente fornecido comercialmente.
Uma outra observao importante nesta etapa
a escolha do material descartvel a ser utilizado para
a conservao da amostra, se for conservada em nitrognio lquido, ou em congelador de ultra-baixa temperatura, os tubos a serem utilizados devem ser resistentes nessa temperatura e ter tampa de rosca com
anel de vedao, de boa procedncia, e isentos de
RNAse e DNAses.
As amostras de tecidos a serem utilizadas para
estudos histolgicos ou in situ devem ser congela-

das no criostato do micrtomo e imediatamente processadas e transferidas para tubos termo-resistentes,

mantidos em gelo seco, se possvel com conservante
para RNA. A seguir, os tubos devem ser armazenados a -80 oC. Caso a amostra tiver que ser emblocada
em parafina para estudos anatomo-patolgicos, o material biolgico deve ser mergulhado em formol (de
boa procedncia) tamponado com tampo fosfato em
pH=7,0 a 7,4, recm preparado. Ressalta-se a importncia da averiguao da pureza do formol, pois quando se encontra armazenado de forma inadequada, pode
conter excesso de cido frmico que degrada os cidos nuclcos. Ao se utilizar a soluo de formol, devese vaporizar nitrognio dentro do frasco e fechar hermeticamente para aumentar a estabilidade do formol.
As amostras de clulas em cultura podem ser
armazenadas para anlise futura, em tubos termo-resistente, com uma prvia lavagem das clulas em tampo fosfato pH 7,4 e, posteriormente em tampo TrisEDTA, pH 8,0.
Amostras de rgos como fgado, rins, corao, entre outros que retm volume de sangue relativamente grande devem ser rapidamente limpos por
perfuso com salina tamponada gelada e o excesso
de salina e membranas aderidas devem ser rapidamente retiradas. As amostras devem ser congeladas
imediatamente em nitrognio liquido e armazenadas
em congelador -70 oC.
Amostras de sangue perifrico podem ser colhidas com o anticoagulante EDTA ou citrato. Para
extrao de DNA a amostra pode ser conservada
apenas em temperatura de 4 oC a 10 oC. Amostras de
cogulo tambm podem ser utilizadas para extrao
de DNA, mas devem ser armazenadas a -20 oC antes
do processamento.
3- MTODOS DE EXTRAO DE CIDOS
NUCLEICOS
Os estudos genticos requerem cidos nuclicos
ntegros e isento de contaminantes e interferentes que
possam prejudicar os testes moleculares. Mtodos
como a reao em cadeia pela polimerase (PCR), a
tcnica de transferncia de DNA (Southern blot) e
outros utilizados no estudo de polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrio (RFLP) podem sofrer interferncias significativas se a obteno do DNA
estiver comprometida.
Os mtodos de isolamento e purificao dos
cidos nuclicos consistem de trs etapas: (1) lise das
clulas e solubilizao do DNA ou RNA; (2) mtodo
523

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

enzimtico ou qumico para remover as protenas

contaminantes e outras macromolculas; e (3) precipitao alcolica para isolamento do DNA2. Os protocolos bsicos geralmente so aplicveis a uma ampla variedade de materiais.
3.1- Extrao de DNA genmico de leuccitos
A extrao de DNA dos leuccitos humanos
tornou-se uma realidade nos laboratrios que estudam
doenas genticas. Os mtodos atualmente disponveis possibilitam recuperar o DNA de alto peso molecular, sendo simples, rpidos e econmicos com rendimentos adequados para uso rotineiro.
O protocolo mais adequado rotina laboratorial
para avaliao de polimorfismos e mutaes genticas compreende a lise celular com detergentes, remoo das protenas por precipitao com cloreto de sdio concentrado (salting-out) e isolamento do DNA
genmico por precipitao etanlica3. A utilizao de
detergentes, como Triton X-100 e duodecil sulfato de
sdio (SDS), evita o uso de solventes orgnicos perigosos e o alto custo e demorada digesto da protenase
K. O rendimento e a integridade do DNA extrado so
excelentes quando comparados com os de outros mtodos de extrao. O DNA apropriado para as tcnicas moleculares como a PCR e RFLP. Atualmente
so utilizados produtos comerciais disponveis no mercado que minimizam erros de procedimentos resultantes de reagentes produzidos no laboratrio.
3.2- Extrao de DNA genmico de tecidos e
clulas
O mtodo bsico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o detergente inico SDS, extrao fenlica das protenas
(atualmente se substitui por cromatografia de afinidade) e precipitao etanlica do DNA. Este mtodo
til para preparao de DNA genmico de muitas
amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um
mnimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genmico produzido adequado para amplificao pela
PCR ou para a digesto com enzimas de restrio e
anlise de transferncia de DNA. Uma quantidade
substancial de RNA acompanha o DNA genmico, o
que dificulta a quantificao por espectroscopia no UV.
Para eliminar o RNA residual, a preparao deve ser
tratada com RNase isenta de DNAse que est presente na maioria dos reagentes comerciais.
Outro mtodo compreende a solubilizao dos
tecidos ou clulas com SDS que inativa as DNAses
endgenas. A protenase K usada para digerir as
524

protenas celulares, seguidas de digesto com RNase

para remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princpio anterior.
Este mtodo adequado para extrair DNA genmico
para anlise de DNA por Southern blot ou construo de bibliotecas genmicas. Porm no adequado
para extrair DNA de tecidos, pois no h etapa de
ruptura do tecido conjuntivo.
3.3- Extrao de RNA de clulas ou de amostras
biolgicas
A maioria dos mtodos de extrao de RNA
semelhante aos utilizados na obteno de DNA, exceto
que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitao do RNA. essencial que toda
gua usada diretamente ou nos tampes seja tratada com
dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.
O mtodo mais adequado para preparar RNA
de boa qualidade envolve a solubilizao simultnea
do tecido ou clulas e inativao de RNases endgenas na presena de isotiocianato de guanidina, com
subsequente isolamento do RNA por centrifugao em
gradiente de cloreto de csio. Dois outros mtodos
que no requerem ultracentrifugao podem ser utilizados: (1) lise com detergente no-inico para proporcionar um mtodo rpido para preparao de amostras de RNA citoplasmtico e (2) lise celular com
isotiocianato de guanidina, remoo das protenas pela
extrao fenlica em pH cido, seguida de precipitao do RNA2. O segundo mtodo freqentemente
utilizado para isolamento de genoma dos vrus RNA a
partir de amostras biolgicas.
A anlise e quantificao de RNA total particularmente importante para os estudos com RNAm.
recomendvel que se obtenha RNA com alto ndice
de pureza, ou seja razo OD260/OD280 igual ou maior
que 1,9 e sem contaminao por DNA2. Os mtodos
de extrao de RNA que utilizam colunas de afinidade para RNA e tratamento da amostra com DNase
isenta de atividade RNase fornecem RNA total com
alto grau de pureza. O RNAm pode ser purificado a
partir de preparaes de RNA total por cromatografia com oligo-dT celulose.
4- MTODOS DE TRIAGEM DE MUTAES
Vrios mtodos para a triagem de mutaes de
ponto, pequenas delees ou inseres foram descritos.
Para a escolha de um destes mtodos, algumas consideraes devem ser observadas, tais como: o tipo de cido nuclico a ser utilizado, o tipo de material biolgico

Mtodos moleculares em farmacogentica

(sangue perifrico, medula ssea, tecidos, secrees

ou excrees), o conhecimento ou no da mutao a ser
pesquisada, a confiabilidade do mtodo a ser utilizado
e que mtodo mais rpido e economicamente vivel.
Um dos mtodos moleculares mais utilizados na
triagem de mutaes a PCR, reao que possibilita
produzir milhares de cpias de segmentos de cidos
nuclicos in vitro utilizando uma enzima DNA polimerase termoestvel4. A Taq DNA polimerase apresentando ndice de erro de incorporao que varia de 10-4 a
10-5 por nucleotdeo, sendo amplamente afetada pelas
condies da reao (concentrao do cloreto de magnsio, dNTPs, pH e temperatura). Dependendo do
mtodo a ser utilizado, os erros da DNA polimerase
podem reduzir a especificidade da PCR, particularmente nos casos em que a freqncia de alelos raros
baixa5. Embora a probabilidade seja baixa, os erros
podem ser interpretados como mutaes quando as
anlises so realizadas com pequeno nmero inicial de
molculas de DNA molde (< 100 molculas)5.
importante ressaltar que os resultados dos
mtodos de triagem de mutaes devem ser confirmados por seqenciamento de DNA, pois um mtodo definitivo para a deteco de mutaes6.

4.1- Eletroforese em gel com gradiente de desnaturao (DGGE)

A triagem de mutaes por DGGE (Denaturing
Gradient Gel Electrophoresis) um mtodo no qual
a dupla fita de DNA submetida eletroforese em
gel de poliacrilamida em que utiliza um gradiente de
agente desnaturante (uria ou formamida) ou de temperatura7. Nestas condies, ocorre a separao das
molculas de DNA de acordo com sua temperatura
de desnaturao ou melting temperature (Tm), em
segmentos denominados domnios. A dissociao das
fitas de DNA em tais domnios resulta em diminuio
da mobilidade eletrofortica (Figura 1). A diferena
de 1 par de bases entre as fitas de DNA (homoduplex)
pode alterar a temperatura de desnaturao em 1 C
ou mais. A falta de complementaridade de bases entre as fitas de DNA (heteroduplex) leva a significante desestabilizao desses domnios, resultando em
diferenas na Tm entre homo e heteroduplex acima
de 6 C. Por esta razo, heteroduplex formadas entre fragmentos de alelos comuns e mutantes so geralmente utilizados para a triagem de mutaes de
ponto (Figura 2).

Selvagem

Fragmentos
amplificados pela PCR

Mutado

Selvagem
Molculas heteroduplex

+
Mutante

Selvagem

Mutante

Heteroduplex
T
C
G
A

Eletroforese

T
A
G
C
Gel com gradiente de desnaturao

Figura 1. Esquema da triagem de mutaes por eletroforese em gel com gradiente de desnaturao (DGGE).

525

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

Para deteco no DGGE, os produtos da PCR

so marcados com substncias radioativas7. Atualmente, esse sistema foi substitudo por colorao dos produtos com brometo de etdeo ou nitrato de prata.
No mtodo DGGE, podem ser feitas modificaes para aumentar o nmero de domnios a serem
analisados. Uma estratgia o acoplamento seqncias ricas em GC em um dos oligonucleotdeos na PCR
(GC clamp), conseqentemente, mais mutaes so
detectadas por DGGE para diferentes finalidades8,9.
O tamanho do produto da PCR submetido ao
DGGE de aproximadamente 1000 pares de bases
(pb). Com o aumento do nmero de domnios, a mobilidade diminui, por isto, a frao de mutaes detectadas diminui com o aumento do tamanho do fragmento. O limite de deteco do DGGE parece no ser
influenciado pela baixa freqncia de alelos mutantes
na presena de alta frequencia de alelos comuns.
4.2- Polimorfismo de conformao de fita simples (SSCP)
O SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) um mtodo de triagem de mutaes que
permite detectar alteraes na mobilidade eletrofortica de fitas simples de cidos nuclcos em condies
no-desnaturantes10 (Figura 3). As fitas simples de ci-

Selvagem
Selvagem

Mutante
Mutante

CC

CC

GG

GG

CC

TT

GG

AA

1- Selvagem, 2- Heteroduplex, 3- Mutante

Figura 2. Autorradiograma de produtos da PCR separados por
DGGE para a triagem de mutaes.

dos nuclicos formam estruturas secundrias em soluo que dependem da composio/seqncia de bases e do tamanho da fita simples. Mudana em uma
base na seqncia do cido nuclico amplificado pela
PCR pode ser detectada por SSCP. Os perfis de SSCP

CC
GG

PCR

CC
GG
TT
AA

Eletroforese
CC

GG
Figura 3. Esquema de triagem de mutaes por polimorfismo de conformao de fita simples (SSCP).

526

AA
TT

Mtodos moleculares em farmacogentica

podem ser detectados por autorradiografia marcando-se os produtos da PCR com substncias radiativas.
Atualmente so utilizados os sistemas de deteco por
colorao dos gis de eletroforese com nitrato de prata (Figura 4).
O SSCP foi inicialmente descrito para analisar
DNA, entretanto, a anlise do RNA tambm possvel11. Estruturas secundrias distintas so formadas
com maior freqncia pelo RNA do que por molculas de DNA e fragmentos maiores podem ser analisados. As mutaes detectadas por SSCP devem ser
confirmadas por sequenciamento de DNA6. Alm disso, em vrias aplicaes, sistemas eletroforticos com
gis de tamanhos menores so utilizados em substituio aos sistemas eletroforticos padronizados para
seqenciamento de DNA12.
A sensibilidade de deteco de mutaes por
SSCP maior quando os tamanhos dos produtos da
PCR so de 150 a 200 pb13. O nmero de mutaes
detectveis diminui quando fragmentos maiores so
analisados. A triagem de mutaes de produtos maiores sem prejudicar significativamente a sensibilidade
do mtodo pode ser alcanada utilizando-se RNASSCP11.
A eletroforese realizada em gel de poliacrilamida no-desnaturante. Dependendo da concentrao
da poliacrilamida, do tamanho do fragmento e da presena de glicerol no gel, o tempo de separao varia
de 2 a 6 horas. A resoluo maior em sistemas de
gis especiais comercialmente disponveis 14. A anlise de um fragmento sob diferentes condies pode
aumentar o ndice de deteco de mutaes, sendo
que as condies ideais devem ser determinadas empiricamente. O limite de deteco depende do tamanho do produto da PCR (< 200 pb) e da execuo da
eletroforese em pelo menos duas temperaturas ou dois
tampes de eletrodos no sistema eletrofortico. Nessas condies 80 a 90% de mutaes so detectveis
por SSCP15.
4.3- Anlise de heteroduplex (HDA)
A HDA (Heteroduplex Analysis) se fundamenta na separao de fitas hbridas de DNA por sistema eletrofortico no-desnaturante16. As fitas duplas de DNA (produtos da PCR) de amostras com
mutao so desnaturadas por aquecimento e, a seguir, so hibridizadas com amostras sem mutao, formando-se hibridos homoduplex e heteroduplex. As
molculas hbridas so separadas por eletroforese em
gel poliacrilamida no-desnaturante, sendo que as molculas homoduplex e heteroduplex apresentam di-

1- MUTANTE
2- MUTANTE

3- NORMAL
4- NORMAL

Figura 4. Perfis de SSCP de produtos da PCR separados por

eletroforese em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata.

ferentes migraes eletroforticas (Figura 5). A deteco desses produtos pode ser realizada por colorao com brometo de etdeo ou nitrato de prata.
A resoluo de HDA pode ser aumentada utilizando-se gis especiais (MDE gel) que esto disponveis comercialmente17. Melhor definio das bandas pode ser obtida pela separao das mesmas na
presena de uria (15%). O tamanho do produto de
PCR detectado por HDA varia entre 200 a 600 pb,
entretanto, a deteco de mutaes para produtos com
tamanho acima de 900 pb tem sido realizada15.
O limite de deteco de mutaes por HDA
dependente principalmente da posio e do tipo de base
que no apresenta complementaridade. Foram descritas diferentes mutaes atravs da aplicao desta
metodologia, com o poder de deteco variando em
torno de 80%16. O limite de deteco depende da intensidade do sinal e da separao das heteroduplex
e homoduplex.
O tempo de eletroforese em gel de poliacrilamida no-desnaturante pode variar entre 14 a 30 horas, dependendo do tamanho do produto da PCR. O
tempo pode ser reduzido utilizando-se eletroforese em
capilar18.
4.4- Mtodo da clivagem qumica (CCM)
O mtodo CCM (Chemical Cleavage Method)
se fundamenta na clivagem de seqncias especficas de DNA heteroduplex por agentes qumicos. Os
produtos da PCR em heteroduplex formados entre
amostras com e sem mutao apresentam despareamento no ponto da mutao que vulnervel a modi527

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

T C

Heteroduplex

T A

Homoduplex

Desnaturao

G C

T A
Hibridizao

Selvagem (wild-type)

G C

Mutante

Eletroforese

Figura 5. Esquema de triagem de mutaes por anlise de heteroduplex (HET).

ficaes qumicas (por exemplo, hidroxilamina modifica citosina no pareada). Os hbridos DNA:DNA
formados so clivados pela piperidina em stios de
modificao qumica (Figura 6). Os pontos de mutao geram fragmentos de clivagem so analisados por
eletroforese19,20.
Originalmente o mtodo foi descrito para analise de DNA:DNA (heteroduplex), porm, pode tambm ser aplicado para a analise de DNA:RNA
(heteroduplex)20. A CCM permite analisar produtos
com tamanho superior a 2 kb. Utilizando-se substncias fluorescentes, uma clula mutante pode ser detectada em dez clulas normais19. O sistema de deteco inicialmente proposto era por marcao dos
fragmentos com 32P ou 35S. Quando pequenas quantidades de alelos mutantes so analisadas na presena
de grandes quantidades de alelos comuns, a sensibilidade pode ser aumentada pela separao e deteco
de fragmentos marcados com substncias fluorescentes e detectados num aparelho para seqenciamento
automtico21.
A vantagem do mtodo CCM que todos os
pontos de mutao so detectados quando as fitas
528

sense e antisense so analisadas. As desvantagens

so a utilizao de substncias txicas para fazer a
clivagem e a limitao do potencial de automao.
4.5- Teste da protena truncada (PTT)
O seqenciamento do genoma humano despertou grande interesse na rea da protemica. Sistemas
de expresso livre das clulas podem ser utilizados
como ligao entre genmica e protemica pela converso de seqncias de cidos nuclicos em protenas. A aplicao destes sistemas de expresso in vitro para a deteco de mutaes referida como PTT
(Protein Truncation Test)22. Este mtodo til para
a deteco de mutaes que alteram a fase de leitura
(reading frame) da protena expressa e que gera um
produto protico menor.
O mtodo PTT envolve a transcrio reversa
(RT) onde o RNA utilizado para produzir cDNA
(DNA complementar). A seguir, utilizando-se da PCR
com um oligonucleotdeo sense que inclui sinal apropriado para transcrio e traduo, produzido um
produto que codifica uma protena funcional. Acoplando os produtos da PCR com um sistema transcrio e

Mtodos moleculares em farmacogentica

CC

AA

GG

TT

Selvagem (Wild-type)

Mutado

AA

GG

Heteroduplex 1

+
S

Heteroduplex 2

(marcada)

Eletroforese

*
Somente os fragmentos marcados so detectados

*
Figura 6. Esquema de triagem de mutaes por Clivagem Qumica.

traduo in vitro, que inclui RNA polimerase, aminocidos marcados por radiativos, ribossomos e tRNAs,
so produzidos peptdeos marcados a partir dos produtos da PCR moldes (Figura 7). Os peptdeos marcados so separados por sistema de eletroforese em
gel de poliacrilamida com desnaturante (SDS). A deteco de uma banda, na eletroforese, com menor peso
molecular que a protena natural indica a presena de
um polipeptdio truncado que corresponde a uma mutao de fase de leitura que introduziu um cdon de
parada na seqncia de DNA. A mutao poder ser
confirmada por sequenciamento de DNA.
O mtodo pode iniciar com a transcrio reversa
do RNAm e o cDNA resultante amplificado pela
PCR. Rearranjos grosseiros e mutaes que afetam
o processamento do RNA tambm podem ser detectados pela anlise dos produtos da RT-PCR23. O tamanho do produto de PCR pode variar entre 4 e 5 kb
com bom desempenho nas reaes subseqentes de
transcrio e traduo23.
O mtodo PTT particularmente adequado para
genes nos quais a maioria das mutaes (> 80%) resulta em protenas truncadas23. At o momento, no

se conhece qual a relao entre alelos mutantes e

normais que pode ser analisada.
Neste sistema podero aparecer bandas adicionais, provavelmente devido a isoformas que podem
complicar a interpretao dos resultados. Portanto,
diferenas na mobilidade eletrofortica de protenas
truncadas e no truncadas podem ser analisadas visualmente. Desde que PTT envolve certo nmero de
passos (RT-PCR, transcrio e traduo in vitro e
eletroforese), um controle positivo interno deve ser
includo.
5- MTODOS DE ESTUDOS DE POLIMORFISMOS GENTICOS
A deteco direta de mutaes e polimorfismos genticos de nucleotdeo nico (SNPs) realizada por mtodos que permitem a identificao da seqncia de DNA alterada. Esses mtodos so tambm utilizados para confirmao de mutaes detectadas por mtodos de triagem. Algumas das estratgias mais utilizadas nos estudos de polimorfismos genticos so descritas neste tpico.
529

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

RNA

cDNA
Transcrio reversa
PCR

MOLDE transcrio/traduo

Transcrio/traduo in vitro

Produtos proticos
Separao das proteinas SDS-PAGE

Selvagem
Mutado
Autorradiografia
Figura 7. Esquema de triagem de mutaes por Teste da Protena Truncada (PTT).

5.1- Polimorfismo de tamanhos de fragmentos de

restrio (RFLP)
O RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymorphysm) um mtodo que utiliza enzimas de
restrio para deteco de mutaes e polimorfismos
genticos24. As enzimas de restrio reconhecem stios especficos na seqncia do DNA que clivada
somente quando o stio est presente, gerando fragmentos de vrios tamanhos que so separados e analisados por eletroforese.
Os tamanhos de fragmentos gerados so muito
variveis. Originalmente este mtodo foi utilizado no
Southern Blot para deteco de grandes fragmentos
de DNA. Nesta aplicao, o DNA genmico fragmentado utilizando-se enzimas de restrio e os fragmentos so separados por eletroforese em gel de agarose de alta resoluo. Posteriormente os fragmentos
de DNA so transferidos a uma membrana de nylon e
hibridizados com sondas marcadas que contem seqncias complementares ao loco gnico a ser estudado.
Os fragmentos hibridizados so identificados por
autorradiografia ou outro sistema de deteco.
530

Com o advento da PCR e do conhecimento e

disponibilidade das seqncias de DNA em bancos genmicos, o mtodo passou a ser utilizado no formato de
PCR-RFLP (Figura 8) que permite analisar fragmentos
de tamanhos menores25. Quando as mutaes ou polimorfismos no esto presentes em stios de restrio,
podem ser criados stios artificiais utilizando-se oligonucleotdeos modificados na PCR. Esta estratgia denominada mutagenese sitio-dirigida mediada pela PCR26.
Os fragmentos gerados no RFLP podem ser
detectados por eletroforese e transferncia de DNA
como o Southern blot. No caso da PCR-RFLP, os
fragmentos so separados por eletroforese em gel de
agarose ou acrilamida e detectados diretamente pela
colorao com brometo de etdeo ou outro corante
fluorescente como o SYBR Gold ou ainda por colorao com nitrato de prata. O limite de deteco da
PCR-RFLP de uma clula mutante pode ser detectada entre cinqenta a cem clulas normais27.
A especificidade do mtodo de 100% quando
a enzima de restrio apropriada utilizada. Para o
controle de qualidade, amostras de DNA contendo
alelos mutantes e comuns devem ser includos na an-

Mtodos moleculares em farmacogentica

lise. O mtodo tambm deve ser ajustado para condies que no permitam que resultados falsos positivos sejam obtidos quando quantidade varivel e diferentes propores de DNA mutante e selvagem estejam sendo analisadas. Resultados questionveis devero ser confirmados por repetio dos testes e seqenciamento de DNA.

1 2 3 4 5

5.2- Amplificao Alelo Oligonucleotideo-Especfica (PCR-ASO)

A PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotide
Amplification) um mtodo de deteco direta de
mutaes, tambm conhecido como ARMS
(Amplification Refractory Mutation System). Neste sistema, utilizado um par de oligonucleotdeos com
seqncia especfica na extremidade 3 para cada alelo
presente no lcus gnico28,29. As reaes so realizadas separadamente para cada par de oligonucleotdeos (iniciadores da PCR) e apenas os iniciadores que
contem a seqncia 100% complementar ao alelo
mutante ou comum possibilitam gerar o produto de
PCR especfico. A deteco dos produtos da PCR
realizada por eletroforese em gel de agarose. Heterozigotos e homozigotos podem ser discriminados em
um nico ensaio da PCR quando diferentes alelos so
amplificados utilizando-se marcados com diferentes
fluorocromos como o caso da PCR em tempo real30.
A especificidade da reao influenciada por
variaes nas concentraes dos reagentes (magnsio, oligonucleotdeos, desoxirribonucleotdeos, DNA
e DNA polimerase), temperatura e tempo de hibridi-

303
199
158
104

Figura 8. Perfis de RFLP obtidos por eletroforese em gel de

agarose a 2% corado com brometo de etdeo de produtos de PCR
digeridos com a enzima NIa III. Produto de PCR (coluna 2).
Gentipos: CC (coluna 3); CT (coluna 4) e TT (coluna 5). Marcador
de pares de bases de DNA de 50 bp (coluna 1).

zao e nmero de ciclos31. A adio de formamida

pode reduzir a gerao de produtos inespecficos. Condies de baixa estringncia na PCR propiciam a hibridizao e extenso dos iniciadores nas seqncias de
ambos os alelos que levam a gerao de resultados
incorretos. A especificidade crtica quando a freqncia do alelo mutante baixa ou desconhecida.
A possibilidade de resultados falso-positivo ou
falso-negativo a principal limitao do mtodo. Fal-

Amplificao

Alelo A
M

Oligonucleotdeo comum
1

MN
2

N
2

Oligonucleotdeo especfico para o alelo A

1 Oligonucleotdeo especfico para o
alelo M

Alelo B

2 Oligonucleotdeo especfico para o

alelo N

Ponto de mutao

Grupo sanguneo MN

Figura 9. Esquema de deteco de mutaes pela PCR Alelo Oligonucleotideo-Especfico (PCR-ASO).

531

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

so-positivo pode resultar de contaminao ou de extenso incorreta pela DNA polimerase. Para a excluso de resultados falsos, as condies de reao devem ser otimizadas e a concentrao do DNA de interesse deve ser definida e precisamente controlada.
A utilizao de controles deve ser realizada para excluir resultados indesejados. A utilizao de controle
interno na PCR-ASO importante para excluir resultados falsos negativos principalmente para a identificao de heterozigotos.
5.2- PCR em tempo real
Na PCR em tempo real (Real-time PCR) so
utilizadas pequenas sondas de DNA marcadas nas extremidades 5 e 3com compostos fluorescentes denominados reporter (marcador) e quencher
(bloqueador), respectivamente32,33. As sondas so
construdas de maneira a hibridizar perfeitamente com
um alelo especifico em um determinado lcus, porm,
de forma incompleta com outro alelo.
No sistema TAqMan, o fluorforo bloqueador est prximo do marcador, bloqueando a emisso
do sinal fluorescente32. Na fase de extenso da PCR,
a atividade exonuclase 5 e 3 da DNA polimerase
responsvel pela digesto da sonda, o marcador liberado distanciando-se do bloqueador e a fluorescncia emitida (Figura 10). As seqncias de iniciadores e sondas, assim como as condies de PCR devem ser muito bem estabelecidas para evitar pareamentos incorretos durante as etapas de hibridizao e
extenso na PCR em tempo real.

5.3- Arranjos de DNA

Os arranjos de DNA (DNA Arrays) foram concebidos para ampliar e agilizar as anlises genmicas.
O microarray a forma miniaturizada de arranjos
em que os fragmentos de genes esto fixos em uma
lmina de vidro34. Tambm conhecido como bioship
ou ship biolgico35.
As anlises das atividades gnicas e a identificao de mutaes e polimorfismos so realizadas de
forma sistematizada usando o princpio da hibridizao de DNA. As seqncias de genes que contem
mutaes conhecidas so fixadas na matriz de vidro
(sondas de captura). Produtos da PCR so gerados
utilizando-se iniciadores especficos marcados com
fluorforos. A seguir os produtos da PCR so hibridizados com as sondas capturadas na matriz de vidro e
os arranjos de sinais fluorescentes so medidos utilizando-se um sistema ultra-rpido de deteco de fluorescncia e a intensidade de cada ponto determinada. A localizao do ponto associado com a sua intensidade determina a seqncia e a quantidade de material presente na amostra. Estes dados so processados por programas sofisticados de computadores que
possibilitaro a analise refinada dos resultados.
A possibilidade de se colocar milhares de seqncias em uma nica lmina de arranjo possibilita a
obteno de informaes do genoma inteiro em um
nico ensaio, identificando milhes mutaes e polimorfismos simultaneamente35. Comercialmente j esto disponveis, em bioships, conjuntos de polimorfis-

F
F

Alelo A

Alelo A
Q

F
5

5
3

Alelo B
Figura 10. Esquema de deteco de mutaes pela PCR em tempo real.

532

Alelo B

Mtodos moleculares em farmacogentica

mos e ou mutaes para fins de estudos farmacogenticos do sistema citocromo P450 para cada grupo
de frmacos potencialmente importantes, assim como
para diagnstico de alteraes genticas de utilidade
teraputica na clinica mdica36.
6- CONSIDERAES FINAIS
Nesta reviso foram abordados mtodos moleculares que podem ser utilizados nos estudos farmacogenticos. Foram apresentados os mtodos utilizados na obteno de cidos nuclicos e na deteco
mutaes e polimorfismos genticos, indicando suas
especificaes, aplicaes e limitaes.
Alguns desses mtodos podem ser aplicados
para estudos de alteraes genticas em larga escala.
A anlise do enorme conjunto de resultados gerados
por esses mtodos dependente da Bioinformtica

que tornou-se uma cincia imprescindvel no desenvolvimento da tecnologia molecular com a integrao
das cincias da sade, biolgicas e da computao.
A simulao in silico uma ferramenta potencialmente importante na formulao de reaes e de
interaes medicamento-protena, protena-DNA, medicamento-DNA e outras possibilidades que esto
envolvidas na eficcia e na segurana teraputica dos
medicamentos.
Com os avanos crescentes da tecnologia molecular e bioinformtica tem sido possvel aplicar os
conhecimentos gerados pelos estudos farmacogenmicos, transcriptmicos e protemicos na investigao de novos alvos teraputicos. Esses conhecimentos permitiro, em futuro prximo, aplicao da terapia individualizada que melhoraro significativamente
a ateno mdica e farmacutica e, conseqentemente, a qualidade de vida das pessoas.

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. From Molecular Biology to Medicine: methods commonly used in
pharmacogenetics. Medicina (Ribeiro Preto) 2006; 39 (4): 522-34.

ABSTRACT: In this review, we discussed the procedures for obtaining, handling and storage
of biological samples useful in molecular tests. Methods for screening and direct detection of
mutations and gene polymorphisms were presented. Principles, strategies, applications and
limitations of polymerase chain reaction (PCR) variations, such as denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE), single strain conformational polymorphism (SSCP), restriction fragment
length polymorphism (RFLP), allele oligonuleotide-specific amplification (PCR-ASO), Real time
PCR, DNA arrays and other molecular techniques, were commented.
Keywords: Pharmacogenetics. Polymerase Chain Reaction. Polymorphism, Single-Stranded
Conformational. Polymorphism, Restriction Fragment Length. DNA Arrays. Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis.

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