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Director
Diego Ricardo Muoz
AGRADECIMIENTO
A mis padres Don Libardo y Doa Rosy, a mis hermanos, por todo su apoyo,
compresin, amor y cario, durante toda mi poca de estudios y los momentos
duros.
A mi amiga Jenny Lizarazo por su compaa durante toda la carrera, por su apoyo,
su compresin y por su ayuda para resolver mis dudas.
A mi director de tesis el Profesor Diego Ricardo Muoz y el Profesor Luis Eduardo
Diaz, por ser pacientes, por haber confiado en m y por haberme tenido en cuenta
para este proyecto.
A la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, por permitirme hacer parte
del grupo de investigacin y su apoyo econmico para realizar la parte
experimental de mi proyecto de grado.
CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 7
LISTA DE DIAGRAMAS .......................................................................................... 8
Abreviaturas ............................................................................................................. 9
Introduccin ........................................................................................................... 11
1 MARCO TEORICO ............................................................................................ 12
1.1 Generalidades de la familia Piperaceae ....................................................... 12
1.2 Descripcin botnica y taxonoma del genero Piper ..................................... 12
1.3 Distribucin geogrfica del genero Piper ...................................................... 13
1.4 Usos etnobotnicos del genero Piper ........................................................... 14
1.5 Estudios fitoqumicos del genero Piper......................................................... 15
1.5.1 Amidas ................................................................................................... 16
1.5.2 Flavonoides ............................................................................................ 17
1.5.3 Propilfenoles ........................................................................................... 19
1.5.4 Pironas ................................................................................................... 19
1.6.5 Terpenos ................................................................................................ 20
1.5.6 Lignanos y neolignanos .......................................................................... 21
1.6 Actividad biolgica genero Piper .................................................................. 23
1.7 Actividad antioxidante del genero Piper........................................................ 25
1.8 Piper Imperiale.............................................................................................. 26
1.8.1 Morfologa Piper imperiale...................................................................... 26
1.8.2 Clasificacin taxonmica Piper imperiale ............................................... 27
2. Parte experimental ............................................................................................. 28
2.1 Procedimientos generales ............................................................................ 28
2.2 Recoleccin del material vegetal .................................................................. 28
2.3 Preparacin del extracto ............................................................................... 28
2.4 Pruebas fitoqumicas preliminares ................................................................ 29
2.4.1 Anlisis preliminar de alcaloides (Residuo I) .......................................... 30
2.4.3 Anlisis preliminar de cumarinas y lactonas terpenicas ......................... 34
2.5 Fraccionamiento de extracto vegetal ............................................................ 35
2.6 Actividad antioxidante ................................................................................... 36
3. DISCUSIN Y RESULTADOS .......................................................................... 38
3.1 Pruebas fitoqumicas preliminares ................................................................ 38
3.2 Actividad antioxidante ................................................................................... 39
3.3 Elucidacin estructural del compuesto 1. ..................................................... 43
Conclusiones ......................................................................................................... 57
Recomendaciones ................................................................................................. 58
LISTA DE TABLAS
Tabla 1: Clasificacin taxonmica genero Piper.................................................... 13
Tabla 2: Usos etnobotnicos de especies del genero Piper.................................. 15
Tabla 3: Taxonoma especie Piper imperiale[36] .................................................. 27
Tabla 4: Pesos hojas seco y molidas Piper imperiale y su extracto etanlico. ...... 29
Tabla 5: Concentracin de diluciones patrn (Trolox) y extracto etanlico de las
hojas de la especie Piper imperiale ....................................................................... 37
Tabla 6: Resultados pruebas fitoqumicas preliminares ........................................ 38
Tabla 7: Resultados obtenidos de absorbancia DPPH frente al Trolox a diferentes
concentraciones ..................................................................................................... 40
Tabla 8: Resultados obtenidos de absorbancia y DPPH frente al extracto etanolico
de las hojas de la especie P. imperiale .................................................................. 40
Tabla 9: Resultados obtenidos de Porcentaje inhibicion de DPPH frente al Trolox
a diferentes concentraciones ................................................................................. 41
Tabla 10: Resultados obtenidos de Porcentaje de inhibicion de DPPH frente al
extracto etanolico de la hojas de la especie Piper imperiale .................................. 41
Tabla 11: Asignacin de seales 1H y 13C para el compuesto 1 aislado del extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.............................................. 54
Tabla 12: Comparacion compuesto aislado Hojas Piper imperiale con estructura
sintetizada del ester etlico del cido dihidroferlico .............................................. 55
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Caractersticas morfolgicas de las partes areas del genero Piper ..... 13
Figura 2: Distribucin geogrfica del genero Piper a nivel mundial[14] ............... 14
Figura 3: Distribucin geografa del genero Piper en Colombia[15] ...................... 14
Figura 4: Piper Imperiale[35] ................................................................................. 27
Figura 5: Estructura del DPPH en su forma radical y no radical ........................... 36
Figura 6: Estructura del agente estndar trolox .................................................... 37
Figura 7: Efecto de degradacin de color del DPPH con disoluciones extracto
etanlico de las hojas especie Piper imperiale ...................................................... 39
Figura 8: % de inhibicin por metodologa DPPH para el patrn Trolox y el
extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale ................................ 42
Figura 9: CCD en revelado UV a 365nm del compuesto 1 aislado del extracto
etanlico hojas especie Piper imperiale ................................................................. 43
Figura 10: Espectro RMN 1H (CDCl3, 300MHz) del compuesto 1 aislado del
extracto etanlico de la hojas especie Piper imperiale .......................................... 44
Figura 11: Ampliacin del espectro 1H RMN entre 6.70 a 6.50 ppm para el
compuesto 1 .......................................................................................................... 45
Figura 12: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 5.60 y 3.80ppm para el
compuesto 1. ......................................................................................................... 46
Figura 13: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 3.0 a 1.0 ppm, para el
compuesto 1. ......................................................................................................... 46
Figura 14: Espectro RMN 13C (CDCl3 75 MHz,) del compuesto 1. ........................ 47
Figura 15: Espectro COSY 1H-1H del Compuesto 1.............................................. 48
Figura 16: Ampliacin espectro HSQC RMN 1H ( 2.0 a 7.0ppm y RMN 13C 25 a
125ppm) del compuesto 1. .................................................................................... 49
Figura 17: Ismeros posibles de la estructura del compuesto 1 aislado del extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.............................................. 50
Figura 18: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin cadena aliftica en anillo
aromtico. .............................................................................................................. 51
Figura 19: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin grupo hidroxilo y metoxilo
en el anillo aromtico. ............................................................................................ 52
Figura 20: Ampliacin espectro HMBC. Ubicacin grupo carbonilo y grupo
metileno unido a un tomo electronegativo oxigeno en cadena aliftica ............... 53
Figura 21: Estructura del compuesto 1 con sus respectivas correlaciones
identificadas por el espectro HMBC 1H - 13C ......................................................... 53
Figura 22: Estructura elucidada del extracto etanlico de la hojas de la especie
Piper imperiale Etil Dihidroferulato. ........................................................................ 54
Figura 23: Estructura del pentadecil ferulato derivado del acido ferlico aislado de
la especie Salicornea herbacea ............................................................................. 56
Figura 24: Derivados del acido ferulico aislados de Plumeria bicolor ................... 56
LISTA DE DIAGRAMAS
Diagrama 1: Tratamiento del material vegetal para realizar pruebas fitoqumicas
preliminares ........................................................................................................... 29
Diagrama 2: Prueba para el reconocimiento de alcaloides. .................................. 31
Diagrama 3: Anlisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas,
taninos y saponinas ............................................................................................... 32
Diagrama 4: Anlisis de cumarinas y lactonas terpenicas .................................... 34
Diagrama 5: Fraccionamiento de Columna del extracto etanlico de las hojas de
la especie Piper imperiale ...................................................................................... 36
Abreviaturas
CCD
L
AcOEt
CC
CDCl3
CH2Cl2
CHCl3
d
DPPH
EdP
EtOH
HCl
Hz
J
M
MeOH
Mg
MHz
mL
NaOH
Nm
Q
Ppm
RMN
RMN 13C
RMN 1H
S
T
UV
Cloroformo
Doblete
1,1-difenil-2-picril-hidrazil
ter de Petrleo
Etanol
Acido Clorhdrico
Hertz
Constante de acoplamiento
Multiplete
Metanol
Miligramos
MegaHertz
Mililitros
Hidrxido de Sodio
Nanmetros
Cuarteto
Parte por milln
Espectroscopia Resonancia Magntica Nuclear
Resonancia Magntica Nuclear de Carbono 13
Resonancia Magntica Nuclear de Hidrogeno
Singlete
Triplete
Ultravioleta
Desplazamientos qumicos (RMN)
Resumen
A partir del extracto etanlico de las hojas de la especie vegetal Piper imperiale se
realizo la determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo de radical libre
DPPH y adicionalmente, a travs del fraccionamiento por CCD y CC se logro el
aislamiento y la identificacin del ester etlico del cido dihidroferlico (-(4hydroxy-3-methoxy-phenyl)-propionato de etilo.
A una parte del extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale, se le
realizaron pruebas fitoqumicas preliminares obteniendo resultados positivos para
alcaloides, esteroides, flavonoides, taninos y cumarinas.
Con la actividad antioxidante por la metodologa de radical libre DPPH sobre el
extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale se observ que posee
un porcentaje de inhibicin frente a radicales libres como el DPPH de 46,9% a una
concentracin de 500ppm.
El compuesto 1 se aisl a travs del fraccionamiento por cromatografa en
columna del extracto etanlico de la especie Piper imperiale, el cual pudo ser
elucidado por tcnicas espectroscpicas de RMN 1H y 13C de 1 y 2 dimensiones,
obteniendo un metabolito derivado del acido dihiferlico.
10
Introduccin
Colombia se caracteriza por su biodiversidad vegetal y el uso de una gran
variedad de plantas por las comunidades indgenas con fines medicinales y
sociales, plantas que al ser estudiadas por el hombre podran ser una fuente de
nuevos compuestos qumicos que aporten soluciones a varios inconvenientes
medicinales.
Los cambios climticos, la deforestacin y la gran prdida de vegetacin por la
falta de conciencia del hombre podran impedir el estudio de muchos gneros y
especies vegetales y con ellos, los compuestos que estos contengan y les brinden
propiedades medicinales, por esto es necesario realizar pronto un estudio de estas
especies vegetales que han sido poco exploradas por el hombre.
Al norte de los Andes colombianos se puede encontrar la mayor diversidad de
plantas del neotrpico, entre ellas la familia Piperaceae la cual posee una variedad
de especies que pueden ser estudiadas y analizadas[1], obteniendo resultados
que podran ser la solucin para problemas de carcter medicinal. Dentro de la
familia Piperaceae se destacan las especies del genero Piper las cuales en su
mayora son utilizados como condimentos porque sus frutos son aromticos y
picantes, pero tambin se caracterizan por sus propiedades insecticidas,
antibacterianas y anti-inflamatorias como por ejemplo los extractos de acetato de
etilo y hexano de la especie Piper porphyrophyllum que presenta una elevada
actividad frente a bacterias como Staphylococcus aereus y un alta actividad
antiinflamatoria[2, 3].
Pocos estudios sobre la especie Piper imperieale han mostrado que posee cierta
actividad antioxidante frente a metodologas como el DPPH y FRAP, adems se
han logrado identificar una cierta cantidad de compuestos naturales como
polifenoles entre ellos el acido ferlico[4], estos compuestos se caracterizan por
ser antioxidantes y se han convertido en un tema importante debido que ayudan a
prevenir y retrasar la aparicin de enfermedades como el cncer, cirrosis hepatitis
y diabetes causadas por la presencia de radicales libres[5], por esta razn era
necesario realizar un estudio sobre la especie Piper imperiale, sus propiedades
antioxidantes y su composicin, contribuyendo al conocimiento qumico y biolgico
de la especie, y ayudando en avances mdicos frente a enfermedades provocadas
por la presencia de radicales libres.
11
1 MARCO TEORICO
1.1 Generalidades de la familia Piperaceae
La familia Piperaceae es una de las ms antiguas e importantes familias de
plantas que ha proporcionado una gran variedad de medicamentos y fuentes de
alimentos para las civilizaciones del pasado y presente, su origen se dio en el
sudoeste de la India con el uso de su especie ms conocida y cultivada la Piper
nigrum (pimienta) gracias a su utilidad como condimento en las comidas[6, 7]. En
la medicina tradicional latinoamericana algunas especies de la familia han
brindado algunos beneficios como por ejemplo las hojas de P. hispidum aplicada
en forma de ungento para el tratamiento de ulceras cutneas y la P. aduncum
usada para el control de inflamaciones, otra propiedad de las especies de la
familia es su actividad insecticida gracias a que estn constituidas por compuestos
como piperamidas[8, 9].
La familia est distribuida en lugares tropicales y subtropicales, constituida por 10
a 12 gneros entre los que se incluyen: Piper, Peperomia, Trianaeopiper, Ottonia,
Arctottonia, Macropiper, Manekia, Pothomorphea, Sarcorhachis, Verhuellia y
Zippeli[10]. En Colombia se pueden encontrar el Piper, Peperomia, Pothomorphea,
Sarcorhachis y Trianaeopiper[11] y cerca de 2000 especies.
Las especies de la familia Piperaceae se caracterizan por ser arbustos, pequeos
arboles o lianas, sus hojas son simples, enteras con glndulas con aceites
esenciales y sus flores son muy pequeas bisexuales o unisexuales que forman
racimos o espigas[12].
1.2 Descripcin botnica y taxonoma del genero Piper
El gnero Piper es uno de los ms importantes de la familia Piperaceae, est
constituida por ms de 1000 especies, las cuales se caracterizan por ser hierbas
terrestres o epifitas, arboles pequeos en raras ocasiones bejucos o arbustos, de
sexualidad hermafrodita, polgamos o dioicos. Sus tallos tienen forma de nudos
abultados, sus hojas segregan aceites esenciales gracias a que poseen unas
clulas secretoras, sus flores son pequeas , bracteadas y sus inflorescencias son
en forma de espigas flexibles, poseen un ovario unicelular con un ovulo que se
desarrolla en forma de fruto en baya (Figura 1) [13].
12
13
14
Raz
En decoccin
Piper cubeba
Fruto
Piper erithroxyloides
Tallos
Masticado
Hojas
Piper guineense
En infusin
Semillas
Hojas
Frescas y
trituradas
Piper marginatum
Raz
Piper methysticum
Raz
Piper sylvaticum
Raz
Piper tuberculatum
Hojas
En decoccin
En infusin
Secas y trituradas
Control
de
dolores
menstruales y hemorragias
internas[16].
Uso
como
diurtico
y
antisptico de las vas
urinarias, empleado para
combatir afecciones como
cistitis y uretritis[17].
La tribu Bari usa los tallos
para prevenir la caries y
como
estimulante,
produciendo
un
efecto
narctico que duerme la
lengua[7].
Se emplean como remedios
para la tos.
Usadas como tratamiento
para
los
dolores
de
estomago[8]
Se emplea como astringente
para detener hemorragias
traumticas
y
como
hemosttico externo[18].
Usada
contra
paludismo[19]
el
1.5.1 Amidas
Las amidas (conocidas en el gnero Piper como piperamidas) son los compuestos
ms caractersticos del genero Piper porque han mostrando resultados de
propiedades insecticidas y fungicidas. Especies como la Piper tuberculatum estn
constituidas por amidas como la N-[10-(13,14-metilenedioxifenil)-7(E),9(Z)pentadienoil]-pirrolidina y la arboreumina las cuales poseen propiedades
antifungicas[23].
CH3
O
H
O
H
CH3
H3C
CH3
NH
H3C
CH3H3C
CH3
NH
OH
OH
Arberoumina
De las hojas de la Piper arboreum se han aislados pirrolidinas que son activas
contra el hongo Cladosporium sphaerospermum[23].
O
O
O
N-[10- (13,14-metilenedioxifenil)-7(E)-pentaenoil]-pirrolidina
O
O
O
N-[10-(13,14-metilenedioxifenil)-pentanoil]-pirrolidina
16
OH
HO
NH
OCH3
O
NH
R2
R1
4-metoxi-N-[2-(4-metoxi-5-hidroxi-fenil)-etil]-benzamida
4-hidroxi-N-[2-(4-metoxi-fenil)-etil]-benzamida
N-cis-feruloil-tiramina
N-pcumaroil-tiramina
1.5.2 Flavonoides
Los flavonoides de mayor abundancia en el gnero Piper son las chalconas,
flavanonas y dihidrochalconas. Las chalconas y dihidrochalconas por lo general no
poseen sustituyentes en el anillo B pero se han encontrado excepciones como la
asebogenina y flavokavaina C las cuales han sido aisladas de las especies P.
aduncum y P. methysticum. Las dihidrochalconas presentes en el gnero Piper
han demostrado actividad antiparasitaria frente a especies de Leishmania sp. y
Plasmodium falciparum (parasito causante de la malaria)[7].
17
OH
H3CO
OH
OH
Asebogenina
OH
H3CO
OH
OCH 3
Flavokavaina C
Del extracto etanlico de las partes areas de la especie P. septuplinervium, se
han logrado aislar dos compuesto de tipo flavonoide (uvangoletina y chrysina) que
presentan actividad frente dos hongos fitopatogeneticos como el Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi y Botrytis cinerea[24].
HO
OH
Chrysina
HO
OCH3
OH
Uvangoletina
18
R1O
OH
R1= H
R1=CH3
Pirocembrina
Pirostrobina
1.5.3 Propilfenoles
Compuestos propenilfenolicos como el hidroxichavicol, eugenol, chavibetol y
chavicol se han encontrado en las hojas de ciertas especies del genero Piper
como por ejemplo la P. betle[22].
R5
R4
CH2
R3
R1
Chavibetol
Chavibetol acetato
Chavicol
Eugenol
Hidroxichavicol
R2
1.5.4 Pironas
Las pironas tambin conocida como kavalactonas se crea que eran compuestos
encontrados solamente en la especie Piper methysticum, pero en algunos estudios
se han logrado aislar de la especie Piper sanctum[9, 20].
19
OCH3
R4
R1
R3
R2
Kavalactonas
10-Methoxyyagonina
Desmethoxyyagonina
Dihydromethusticina
Hydroxykavaina
Kavaina
Methysticina
Yangonina
R1
OCH3
R2
R3
OCH3
R4
C5 C6
=
=
C7 C8
=
=
=
=
=
=
OCH2O
OH
OCH2O
OCH3
1.6.5 Terpenos
Los aceites esenciales del genero Piper esta constituidos por una gran variedad
de monoterpenos como borneol, alcanfor, cineol, eugenol, cubebol y safrol. En la
especie Piper auritum se han identificado compuestos como nonanal, miristicina y
safrol, siendo este ultimo el de mayor concentracin con alrededor de 90%[26].
H3C
CH3
CH3
O
CH3
H3C
H
H3C
OH
Cineol
Borneol
20
OH
OCH3
O
CH2
CH2
Safrol
Eugenol
CH3
CH2
H3C
HO
H3C
Miristicina
H3C
CH3
Cubebol
H3CO
H3C
H3CO
CH2
H3CO
O
Kadsurenona
21
O
O
O
H
H
O
H3CO
Sesamina
Fargesina
H3CO
Conocorpan
H3C
H3C
CH3
O
CH2
HO
O
HO
Cuneifolin
O
CH3
22
OCH 3
CH3
HO
O
OH
HO
H3C
NH
CH3
Borneol
Aduncamida
OCH 3
Pipernolanina
23
CH3
H3C
NH
CH3
O
N-isobulilamida pellitorina
O
CH3
NH
O
CH3
O
Guineensina
O
CH3
NH
O
CH3
O
Pipercida
O
CH3
NH
CH3
O
O
Retrofractamida A
N
O
O
Piperidina
24
OH
O
H3CO
OH
HO
OH
OH
Acido Galico
HO
cido Ferlico
25
OH
OH
OH
OH
HO
HO
O
OH
OH
OH
OH
Quercetina
OH
Catequina
OH
OH
HO
HO
O
OH
OH
OH
Epicatequina
OH
Resveratrol
Plantae
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Piperales
Piperaceae
Piper
Imperiale
27
2. Parte experimental
2.1 Procedimientos generales
En las cromatografas de capa delgada (CCD) se utilizaron placas de slica gel 60
F254 de 20 x 20 cm con 0.20 mm de espesor de marca Merck. Como fase mvil se
utilizo una variedad de sistemas de solventes como EdP/AcOEt, benceno/AcOEt,
CHCl3/acetona, CH2Cl2/acetona, EdP/acetona, EdP/CHCl3, tolueno/AcOEt. Como
agentes reveladores se utilizo lmpara UV de 254 y 365 nm y cmara de yodo.
En el montaje de cromatografas en columna CC se utilizo como fase estacionaria
slica gel 60 de 0,063 0,2 mm marca Merck y como fase mvil se utilizaron los
sistemas de solventes nombrados anteriormente.
Los espectros RMN 1H y 13C fueron tomados en un equipo Bruker 300MHz
utilizando como disolvente cloroformo deuterado CDCl3.
Las pruebas de actividad antioxidante se realizaron con la metodologa de radical
libre difenilpicrilhidrazilo (DPPH), usando concentraciones de 500, 250, 125, 80,
62,5 y 50ppm del extracto en metanol.
Las pruebas fitoqumicas preliminares se realizaron con base a la metodologa del
profesor Antonio Sanabria del Departamento de Farmacia de la Universidad
Nacional de Colombia.
2.2 Recoleccin del material vegetal
La muestra vegetal fue recolectada en el Santuario de Fauna y Flora Guanenta
Alto Rio Fonce ubicado en la Cordillera Oriental en la Regio Andina entre los
departamento de Boyac y Santander cerca al municipio de Charala en la vereda
de Birolin por el profesor Diego Ricardo Muoz. Para confirmar su clasificacin
una muestra de la especie fue enviada al Herbario Nacional Colombiano del
Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia.
2.3 Preparacin del extracto
De la especie vegetal se separaron las hojas, madera e inflorescencias. Las hojas
se dejaron secar a la sombra por un periodo de tres semanas para luego ser
moliendas y pesadas, obteniendo 350 g. El material vegetal ya molido se someti
a un proceso de extraccin por maceracin con etanol al 96% a temperatura
ambiente. El extracto obtenido fue concentrado a presin reducida en rotavapor a
40 C obteniendo 28 g.
28
Extracto Etanolico
Volumen II
Volumen I
Volumen III
Eliminar solvente
Eliminar solvente
Extracto III
Residuo I
Residuo II
Pruebas:
Alcaloides
Pruebas:
Esteroides y/o triterpenoides,
Flavonoides
Nafto y/o antraquinonas
Saponinas
Taninos
Pruebas:
Lactonas terpenicas
Cumarinas
cardiotnicas
29
Hg
NH 2I
O
Hg
Oxiyoduro mercuriamonico
30
Filtrado
Residuo
(Descartar)
Tubo 1:
2 gotas Reactivo de
Dragendorff.
Tubo 2:
2 gotas Reactivo de
Mayer
Tubo 3:
2 gotas Reactivo de
Valser
Tubo 4:
2 gotas Reactivo
Reineckato de Amonio
Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides
Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides
Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides
Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides
Preparacin de Reactivos.
31
Filtrado
Residuo
Concentrar a 5mL de
volumen
Residuo
Solucin B
5mL
Nafto y/o
antroquinonas
Solucin C
10mL
Taninos y saponinas
Esteroides y/o
triterpenoides
Solucin A
5mL
Flavonoides
O
O
Mg/2HCl
MgCl2
O
OH
O Cl
HCl
OH
H2O
H2
OH
OH
Residuo
(Desechar)
Residuo
1. Concentrar a 3mL
2. Purificar con columna de 10mm de dimetro con silica gel
como fase estacionaria y un sistema CHCl3/MeOH 9:1 como
fase mvil
Solucin 1
34
35
NO 2
O 2N
NO 2
NH
NO 2
O 2N
NO 2
Cuando una solucin de DPPH se mezcla con una solucin donadora de protones
como un antioxidante, el radical se reduce perdiendo la intensidad de color y su
absorbancia dndose la siguiente reaccin[39, 40]:
DPPH
DPPH + A
AH
CH3
HO
O
H3C
CH3 OH
CH3
Trolox
Figura 6: Estructura del agente estndar trolox
CONCENTRACION (mg/mL)
200
500
100
250
75
175
50
125
20
80
5
62,5
50
3. DISCUSIN Y RESULTADOS
3.1 Pruebas fitoqumicas preliminares
Tabla 6: Resultados pruebas fitoqumicas preliminares
Extracto etanlico
METABOLITO
PRUEBA
Hojas Piper imperiale
Alcaloides
Dragendorff
Esteroides, terpenos
Liebermann-Burchard,
Vainillina en H2SO4
Flavonoides
Quinonas
Borntrger
Taninos
Gelatina-sal
Lactonas Terpenicas
Vainillina en Acido
fosforico
Saponinas
Cloruro de zinc
Cumarinas
KOH en metanol
38
39
ABSORBANCIA
200
0,057
0,059
0,057
100
0,067
0,064
0,063
75
0,132
0,125
0,119
50
0,319
0,327
0,312
20
0,583
0,574
0,573
0,741
0,703
0,721
ABSORBANCIA
500
0,416
0,425
0,393
250
0,575
0,574
0,481
175
0,648
0,66
0,57
125
0,687
0,663
0,612
80
0,71
0,725
0,641
62,5
0,724
0,717
0,694
50
0,748
0,743
0,755
40
[]
g/mL
MEDICION 1
MEDICION 2
MEDICION 3
PROMEDIO
DESVIACION
ERROR
ESTANDAR
200
92,61
92,35
92,61
92,53
0,15
0,02
100
91,32
91,71
91,84
91,62
0,27
0,03
75
82,89
83,80
84,58
83,76
0,84
0,09
50
58,66
57,63
59,57
58,62
0,97
0,13
20
24,45
25,62
25,75
25,27
0,71
0,14
3,98
8,90
6,57
6,48
2,46
0,97
[]
g/mL
MEDICION 1
MEDICION 2
MEDICION 3
PROMEDIO
500
46,09
44,93
49,07
250
25,49
25,62
175
16,03
125
10,98
80
DESVIACION
ERROR
ESTANDAR
46,70
2,14
0,31
37,67
29,59
7,00
1,29
14,47
26,14
18,88
6,33
1,46
14,09
20,69
15,25
4,96
1,27
8,00
6,05
16,94
10,33
5,81
1,81
62,5
6,18
7,09
10,07
7,78
2,03
0,73
50
3,07
3,72
2,16
2,98
0,78
0,45
41
42
43
TMS
CDCl3
Figura 10: Espectro RMN 1H (CDCl3, 300MHz) del compuesto 1 aislado del
extracto etanlico de la hojas especie Piper imperiale
En la ampliacin del espectro de RMN 1H en 6.70 a 6.50ppm se observan dos
seales, la primera de 6.83 (1H, d, J = 7.8 Hz), y la segunda de 6.69 (2H, m, J
= 8.3 Hz y J = 1.84) con una constante de acoplamiento cercana a 8 Hz y a 2Hz
que integran para 1 y para 2 respectivamente, lo que indica la presencia de dos
protones aromticos en posicin orto y un protn en posicin meta con respeto a
alguno de los otros dos protones (Figura 11)
.
44
J=8.30 Hz
J=7.80 Hz
J=1.84 Hz
Figura 11: Ampliacin del espectro 1H RMN entre 6.70 a 6.50 ppm para el
compuesto 1
En la ampliacin del espectro de RMN 1H en 5.60 a 3.80ppm se pueden observar
dos seales de protones en 5.51 (1H, s) y 3.87 (3H, s), que corresponde a un
protn de grupo hidroxilo y a tres protones de un grupo metilo que est unido a un
tomo electronegativo que posiblemente sea oxigeno. En la misma zona se
encuentra una seal con un desplazamiento 4,12 (2H, q, J = 7.21) perteneciente
a dos protones de un grupo metileno tambin unido a un tomo electronegativo
(Figura 12).
45
J=7.21Hz
Figura 12: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 5.60 y 3.80ppm para el
compuesto 1.
En la regin de 1.0 a 3.0 ppm se encuentran tres seales que corresponde a
2.88 (2H, t, J = 7.76), 2.58 (2H, t, J = 7.76), 1.24 (7H, m) (Figura 13)
pertenecientes a protones de grupos metilenos y metilos de una cadena aliftica.
J=7.76Hz J=7.76Hz
Figura 13: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 3.0 a 1.0 ppm, para el
compuesto 1.
46
Con el espectro de RMN 13C JMOD a 75 MHz (Figura 14) se puede establecer que
el compuesto 1 posee 12 seales de carbono, con las caractersticas de: cuatro
carbonos tipo cuaternario 173.29, 146.39, 143.98, 132.28, dos carbonos tipo
metilo 56.26, 14,23, tres carbonos tipo metileno 60.23, 36.60, 30.75 y tres
seales tipo metino 121.13, 114.49, 110.64.
Las seales de los carbonos cuaternarios pertenecen a: un carbono de un grupo
carboxilo en 173.29 y tres carbonos aromticos sustituidos en 146.39, 143.98,
132.28. Desplazamiento que indican la presentica de una estructura con un anillo
aromtico trisustituido.
Tambin se encuentran tres seales de carbonos de tipo metino en 121.13,
114.49, 110.64 de un anillo aromtico; dos seales en 60.23 y 56.26 de
carbonos de tipo metileno y metilo respectivamente unidos cada uno a un tomo
electronegativo oxigeno, y por ltimo se observan seales en 36.60, 30.75 de
carbonos metilenos y en 14.23 de un carbono metilo los cuales hacen parte de la
cadena aliftica.
47
48
Figura 16: Ampliacin espectro HSQC RMN 1H ( 2.0 a 7.0ppm y RMN 13C
25 a 125ppm) del compuesto 1.
Con los espectros de RMN 1H, RMN 13C, COSY y HSQC se pudo determinar que
la estructura del compuesto 1 corresponde a un anillo aromtico con tres protones
(dos en posiciones orto y uno en posicin meta con respecto a los otros dos
protones) y tres sustituciones; un grupo hidroxilo, un grupo metoxilo y una cadena
aliftica con un grupo ester, obteniendo la posibilidad de seis ismeros para la
estructura del compuesto 1 (Figura 17).
49
CH3
O
H
OH
OH
H3C
OH
H
CH3
OH
OH
R
R
O
CH3
CH3
H
R
H
O
H
OH
H3C
50
Figura 18: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin cadena aliftica en anillo
aromtico.
Se determino que la ubicacin del grupo metoxilo en el anillo aromtico esta sobre
el carbono cuaternario 146.39 por su correlacin con los protones en 3,87
(Figura 19). Para el grupo hidroxilo se determino que este se encuentra entre el
carbono con el grupo que posee el grupo metoxilo y un carbono de tipo metino por
sus correlaciones de protn en 5.51 con los carbonos 114.49, 143.97, 146.39
(Figura 19).
51
Para la cadena aliftica se pudo determinar la ubicacin del grupo carbonilo por su
correlacin con protones de tipo metileno 2.88 y 2.52 (Figura 20). Los protones
del grupo metileno unido al tomo electronegativo oxigeno 4,12 poseen una
correlacin con un carbono de tipo metilo 14.23 y con el carbono del grupo
carbonilo 173.29 (Figura 20) dando la ubicacin del grupo ester en la cadena
aliftica.
52
O
CH3
H3C
Gracias a la informacin recolectada con los espectros RMN 1H, RMN 13C, COSY,
HSQC Y HMBC se realizo la designacin completa para cada uno de las seales
con sus respectivos desplazamientos para el compuesto 1 aislado del extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale. En la figura 22 se muestra la
estructura para el compuesto 1 y en la tabla 11 las asignaciones para cada uno de
sus tomos de Carbono e Hidrogeno.
OH
3a
CH3
5
2
H
9
O
H3C
1
7
1'
2'
POSICION
RMN H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3a
4a
RMN
13
C (JMOD)
132.28 (C)
121.13 (CH)
146.39 (C)
143.97 (C)
114.49 (CH)
110.64 (CH)
30.75 (CH2)
36.60 (CH2)
173.29 (C)
60.23 (CH2)
14.23 (CH3)
56.23 (CH3)
-
HMBC
54
13
POSICION
Estructura
sintetizada
1
2
3
4
5
6
132.28 (C)
121.13 (CH)
146.39 (C)
143.97 (C)
114.49 (CH)
110.64 (CH)
132.5 (C)
120.9 (CH)
146.6 (C)
144.1 (C)
114.5 (CH)
111,1 (CH)
30.75 (CH2)
30.8 (CH2)
36.60 (CH2)
36.5 (CH2)
173.29 (C)
173.2 (C)
60.23 (CH2)
60.5 (CH2)
14.23 (CH3)
14.3 (CH3)
3a
56.23 (CH3)
55.9 (CH3)
55
CH3
CH3
O
HO
Figura 23: Estructura del pentadecil ferulato derivado del acido ferlico
aislado de la especie Salicornea herbacea
Otros compuestos de este tipo son el 34-hidroxi tetratriacontanil ferulato y 34-Oacetil tetratriacontanil ferulato, dos metabolitos derivados del acido ferulico (Figura
24) aislados de la especie Plumeria bicolor, que al igual que el pentadecil ferulato
han presentado actividad antioxidante frente a pruebas como el DPPH y
FRAP[46].
HO
H3C
1
2
R=H
R=COCH3
(CH 2)32
OR
El ester etlico del cido dihidroferlico aislado del extracto etanolico de la especie
P. imperiale es un metabolito secundario que podra poseer caractersticas de
actividad antioxidante ya que estructuras similares como las nombradas
anteriormente han sido estudiadas y dado prueba positiva frente a metodologas
de DPPH y FRAP, adems se ha encontrado que el acido ferulico posee actividad
antioxidante[47] una caracterstica que tambin podran tener sus derivados,
adems en estudios previos se logro identificar la presencia del acido ferulico en el
extracto etanolico de las hojas de la especie Piper imperiale[4].
56
Conclusiones
Del extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale se logro el
aislamiento e identificacin de un compuesto derivado del Acido ferlico
compuesto que no haba sido aislado hasta ahora, ya que en este extracto
solamente se haba logrado identificar la presencia de polifenoles como el Acido
ferlico, Acido glico, Catequina, Quercetina, sin embargo se han encontrado
reportes de compuestos derivados del acido ferlico aislados de otras especies
como la Salicornea herbacea y Plumeria bicolor, pero se debe tener en cuenta que
no en especies del genero Piper.
La actividad antioxidantes (DPPH) del extracto etanlico de las hojas de la especie
Piper imperiale resulto ser positiva, donde se demostr que con una concentracin
de 500ppm de extracto se logra un porcentaje de inhibicin del 46%, esto quizs
sea por la presencia de compuestos antioxidante de tipo fenlico.
Las pruebas fitoqumicas preliminares indican que el extracto etanlico de las
hojas de la especie P. imperiale est compuesto por metabolitos secundarios
como alcaloides, flavonoides, taninos y cumarinas.
57
Recomendaciones
58
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
http://www.biovirtual.unal.edu.co/ICN/?controlador=ShowObject&acci
on=show&id=121834. [cited.
Galindo A., Analisis Fitoquimico Preliminar. Metodologia y su aplicacion en
la evaluacion de 40 plantas de la familia Compositae, ed. Universidad
Nacional de Colombia. 1983.
Bilbao, M., Analisis Fitoquimico Preliminar. Quimica de Productos
Naturales, ed. Universidad del Quindio. 1997, Armenia.
Molyneux, P., The use of the stable free radical diphenylpicryohydrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol,
2004.
Martirosyan, D., Functional Foods for Cardiovascular Diseases. 2005.
Gros E., Pomilio A., Introduccion al estudio de los productos naturales, ed.
S.g.d.l.o.d.l.E. Unidos. 1985, Washington D. C.
Gonzalez Y., Pea M., Taninos de diferentes especies vegetales en la
prevencion del fotoenvejecimiento. Revista Cubana de Investigaciones
Biomedicas, 2001. 20.
Hatano, Y., Katsumura Y., Charged Particle and Photon Interactions with
Matter, ed. C. Press. 2011, United States of America.
Beck, J., Kim J., Campbell B., Fungicidal Activities of Dihydroferulic Acid
Alkyl Ester Analogues. Journal of Natural Products, 2006. 70.
Xiaomin W., Pentadecyl ferulate, a potent antioxidant and antiproliferative
agent from the halophyte Salicornia herbacea. Elsevier, 2013. 141.
Dobhal M., Aidross M., Ferulic acid esters from Plumeria bicolor. Pergamon,
1999.
Maurya, D. Paul T., Antioxidant and prooxidant nature of hydroxycinnamic
acid derivatives ferulic and caffeic acids. Food and Chemical Toxicology,
2010. 48.
61