Microbiologa de los Alimentos y CC.

M. Sc. Csar Julio Cceda Quiroz

PRACTICA N 33
ANALISIS MICROBIOLGICO DE PESCADOS Y DERIVADOS
I.

INTRODUCCIN

El pescado es un alimento proteico muy putrescible y que no puede

conservarse refrigerados durante mucho tiempo. La carne lleva vitaminas B 12,
riboflavina, cido pantotnico, flico, inacciona y piridoxina. Los pescados
grasos adems contienen vitaminas A y D, minerales. El contenido graso vara
con la especie y est constituida por triglicridos y fosfolpidos, es pobre en
hidratos de carbono. (Pascual, 1999)
En el caso e pescado fresco no suele haber justificacin para un anlisis
microbiolgico.
A no ser en casos muy concretos y por razones determinadas y especficas
debido a que:
Tienen un plazo de comercializacin muy corto, dada su fcil alteracin; este
plazo seria ms breve que el tiempo necesario para efectuar el anlisis.
(Pascual, 1999)
El pescado capturado en el mar, cuando se vende fresco, no suele estar
contaminado con los microorganismos que, habitualmente, reflejan el estado
higinico sanitario de los alimentos.
De aqu que los criterios microbiolgicos
utilizados en microbiologa
alimentara no se adapten al pescado fresco. Por el contrario, es de la mayor
utilidad valorar el estado de frescura de estos productos, mediante la
inspeccin de los caracteres organolpticos: aspecto, olor, rigidez, piel,
escamas, ojo, branquias, ano, vsceras y carne. (Pascual, 1999)
Es distinta la manera de proceder como el pescado transformado: troceado;
picado, fileteados, etc., que por las manipulaciones que sufre, puede ser
contaminado con microorganismos que, este caso, reflejara su estado
higinico-sanitario, por lo que requiere una vigilancia mediante el uso de
criterios sanitarios. De igual modo, se controlara el pescado fresco destinado a
la congelacin.
En la calidad microbiolgica del pescado y derivados hay que considerar 2
aspectos importantes: el Sanitario y el Econmico. (Pascual, 1999)
En el Aspecto Sanitario del pescado presentan riesgos de distinta
consideracin para el consumidor, de acuerdo con su naturaleza, hbitat y
transformaciones que sufren posteriormente a su captura. Es evidente que el

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hombre debe estar protegido de estos riesgos mediante el control de la

presencia de microorganismos patgenos o sus toxinas.
En el Aspecto econmico, es claro que los pescados son productos
perecederos que se alteran fcilmente. Su alteracin se debe a la presencia de
una flora saprofita que no presenta riesgos desde el punto de vista sanitario,
pero que es responsable de prdidas econmica. (Pascual, 1999)
En estos casos, los recuentos y determinaciones microbiolgicas serian:

II.

Recuento de colonias psicrotrficas (17C3 C).

Investigacin y recuento de Escherichia coli. .(Ver practica N15 )
Investigacin de Salmonella. .(Ver practica N16 )
Investigacin y recuento de Clostridium perfringens. .(Ver practica N 6)
Investigacin y recuento de St. aureus enterotoxigenico.(Ver practica
N12 )
OBJETIVOS:

III.

Determinar la calidad microbiolgica del pescado y derivados.

MATERIAL Y MTODOS:
a. Biolgico:
b. Materiales de laboratorio: los de uso comn en el laboratorio
c. Medio de cultivo y reactivo Material: Diluyente (Triptona), Cloruro
sdico, Agua destilada Solucin Ringer , Medio Agar
King ,Agar
GSP (Selectivo para Pseudomonas y Aeromonas)

IV. TECNICA (Pascual, 1999)

a.

PREPARACION DE LA MUESTRA

Piel.
Elegir la zona media del cuerpo, midiendo la superficie que se vaya a tomar.
Aspticamente, extraer la piel con mnimo de carne. La muestra se introduce
en un tubo con tapn de rosca que contenga 10 ml de solucin Ringer y un
poco de arena estril. Llevar al Stomacher durante 2 minutos Hacer diluciones.

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Carne
Tomar aspticamente, un trozo de tejido sin piel, para evitar contaminacin.
Diez gramos de carne se maceran en 90 ml de solucin de Ringer durante 5
min. Llevar al Stomacher durante 1 minuto. Hacer diluciones.
Branquias
Con material estril, se toma un trozo de branquia y se opera como en el caso
de la piel. Hacer diluciones decimales.
Contenido Intestinal
Aspticamente ligar el intestino en sus extremos con pinzas y extraer en el
contenido intestinal del asa. Las heces extradas se depositan en un tubo con
tampn de rosca y con 10 ml de solucin de Ringer. Homogeneizar en
Stomacher durante 1-2 minutos. Hacer diluciones..
b.

PREPARACION DE DILUCIONES DECIMALES

Las preparaciones de las diluciones decimales a partir de una muestra tiene

por objeto efectuar diluciones progresivas de dicha muestra, para poder
recuentos microbianos posteriores.

Pesar, aspticamente, una porcin representativa de la muestra

analtica. La cifra de pesada obtenido se multiplica por 9 y el resultado
dar el volumen en mililitros de diluyente (TW) que es necesario aadir
para obtener la dilucin 1:10.

Esta mezcla, homogenizada y/o triturada en triturador homogenizador o

triturador de paletas (Stomacher), constituye la suspensin madre y
primera dilucin de la serie (1:10)

A un tubo que contenga 9ml de agua de TW se transfiere 1ml de la

suspensin madre.

Mezclar 30 segundos en agitador excntrico. As se obtiene la dilucin

1:100. Desechar la pipeta usada. De la mezcla anterior, y con nueva
pipeta estril, se incorpora un mililitro a otro tubo que tenga 9 ml de agua
tristona estril (TW). Mezclar 30 segundos en agitador excntrico. As se
obtiene la dilucin 1:1000. Desechar la pipeta usada y repetir la
operacin en varios tubos, hasta lograr las diluciones deseadas.

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De esta forma se obtiene la serie de diluciones decimales (10 -1 ;10-2 ;

10-3 ; etc.), que servir para iniciar las determinaciones en las que sea
necesario obtener recuentos.

Los tubos de la serie se mantendrn en frigorfico hasta el comienzo del

anlisis, el cual, aun en condiciones de refrigeracin, no debern
demorarse ms de dos horas a partir del momento en que se haya
preparado la serie de diluciones decimales.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTRFICOS: (PASCUAL

1998)
Tcnica:

Antes de describir la tcnica hay que decir que se puede utilizar

cualquier medio de los que se emplea para el recuento total de aerbios,
siempre que la incubacin se realice a 5 C durante 7 a 10 das.

A partir de la serie de diluciones decimales utilizando como diluyente

solucin Ringer 1/4, se siembra por duplicado, 0.1 ml de cada dilucin,
sobre la superficie bien seca de placas Petri con Agar King y /o Agar
GSP. Diseminar cuidadosamente con asa de vidrio estril.

Incubar a 17 C durante 5 das, finalizar la incubacin, se cuentan en las

placas de ambos medios, las colonias no puntiformes que hayan
crecido. El nmero se multiplica por factor de dilucin de la placa elegida
para el recuento. Esta cifra corresponde a 0,1 ml. que al ser multiplicada
por 10 da el recuento total de microorganismos psicrotrficos por gramo
o ml. del alimento en estudio.

Recuento de microorganismos halotolerantes:

La proporcin de sal del Agar de recuento ser 5 g por 100 ml. La

incubacin en estufa a 17 3 C durante 5 das

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INVESTIGACIN DE E. coli
MTODO: CON CALDO LACTOSA 2% DE BILIS VERDE BRILLANTE, Y
CONFIRMACIN EN MEDIO SLIDO. (ICMSF)

Pesar 25gramos y adicionar a un vaso de homogenizacin y aadir

225ml de diluyente (agua peptonada o agua triptonada).

Realizar diluciones al 1:10, 1:100, 1: 1000, seguir el protocolo

microbiolgico.

Pipetear 1ml de cada dilucin del homogeneizado de alimento en tubos

de caldo lactosa bilis (2%) verde brillante, utilizando tres tubos por cada
dilucin.

Incubar los tubos a 35-37 C durante 24-48 horas.

Pasadas las 24 horas, anotar los tubos que muestren produccin de gas.
Volver a la estufa los tubos gas negativos para su incubacin durante 24
horas ms.

Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestran produccin de gas.

Escoger los tubos para las pruebas de confirmacin y para la

determinacin del NMP como se ya se indico en practicas anteriores.

Confirmar los tubos gas positivos de caldo lactosa bilis (2%) , verde
brillante seleccionados en el punto anterior, sembrando por estras un
asa de cada uno de ellos en Agar Bilis lactosa rojo neutro cristal violeta o
Agar Endo . Incubar las placas a 35-37 C. Examinar las placas de Agar
bilis lactosa rojo neutro cristal violeta despus de 24 horas y las de Agar
Endo despus de 48 horas. La presencia de organismos coliformes se
confirma por el crecimiento en el primero de estos medios de colonias de
color rojo oscuro con dimetro mayor de 5 mm y en Agar Endo por la
formacin de colonias rojas rodeadas por un halo tambin rojo.

Anotar el nmero de tubos confirmados en cada dilucin como positivos

de coliformes.

Calcular el NMP de coliformes.

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INVESTIGACIN DE Salmonella-Shigella
Dentro de la sistemtica analtica para el aislamiento e identificacin del gnero
Salmonella se utilizan, habitualmente varias etapas:

Pre-enriquecimiento en medio liquido no selectivo

Enriquecimiento en medio liquido selectivo

Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos

Confirmacin bioqumica de las colonias sospechosas

Confirmacin serolgica de las colonias sospechosas

Ver practica N 16
INVESTIGACIN DE Staphylococcus aureus
Ver practica N 12
INVESTIGACIN Y RECUENTO DE Clostridium SULFITO REDUCTORES
Ver practica N 6

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V.

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PROTOCOLO

RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTRFICOS: (PASCUAL

2002)
25 gr de muestra
+
225 ml de diluyente
Ringer 1/4
10

Se homogeniza

Serie de diluciones de Ringer 1/4

10 10
4-

10

Agar King y /o
Agar GSP.

104- 10
durante 5 das

10

Incubar por 17 C

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Hacer lectura
INVESTIGACIN DE Staphylococcus aureus (MTODO DE RECUENTO EN
PLACA

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INVESTIGACION DE SALMONELLA. ISO 65792002

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PROTOCOLOS DE AISLAMIENTO:
DE E. coli O157:H7 EN ALIMENTOS (FDA, 2001)

10

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RECUENTO EN TUBO ANAEROBIO - SULFITOS REDUCTORES

(PASCUAL 1999)

11

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VI

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

FRAZIER W. C. Y D. C. WESTHOFF. 1990. Microbiologa de los

Alimentos. Tercera Edicin. Edit. Acribia S. A. Zaragoza - Espaa

12

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PASCUAL ANDERSON, Mara del Rosario . 2000. Microbiologa

Alimentaria Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas. Edit. Das
de Santos S.A.
Madrid- Espaa

REGLAMENTO SANITARIO DE LOS ALIMENTOS. 1986. Decreto

Supremo
N 0014-84 S.P. Ministerio de Salud.

I.C.M.S.F. 2000. Los Microorganismos de los Alimentos. Vol. I: Su

significado y mtodos de enumeracin. 2 a edicin. Editorial Acribia, S.A.
- Zaragoza (Espaa).

ADAMS M.R. y MOSS M. O. 1995. Microbiologa de los Alimentos.

Editorial Acribia. Zaragoza - Espaa

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