Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Este trabalho foi elaborado para que fosse possvel um melhor acompanhamento nas
tcnicas de Farmacologia Molecular aplicadas a esse Laboratrio. Para que fosse possvel sua
realizao, contei com a colaborao de muitos colegas, alguns, verdadeiros amigos que
passaram pelo Laboratrio de Farmacologia Molecular. Assim como Karime Bicas,
Alessandra Menezes, Gustavo Barra, Anglica Amato, Rutnia Pessanha, Raniere e Cristina.
Agradeo tambm aos professores que fazem parte do Farmol.
A sua verso atual est sendo revisada pela Profa. Dra. Marie Togashi e est sujeita
alteraes.
A todos que ajudaram os meus agradecimentos, pois a elaborao desse trabalho foi
muito gratificante e com certeza contribuir a todos que ainda iro passar pelo Farmol.
ii
iii
ORAO DO BILOGO
Credo Molecular
Amm
iv
ndice
Preparo de Clulas Competentes _______________________________4
Introduo
Teste de Controle de Qualidade das Clulas Competentes____________5
Teste de Esterilidade das Clulas Competentes ____________________6
Teste de Eficincia das Clulas Competentes______________________6
Preparo de Clulas Competentes - CaCl_________________________7
Preparo de Clulas Competentes TB___________________________8
Tampo TB 1x
Preparo de Clulas Competentes MgCl2 / CaCl2_________________9
Preparo de Clulas Competentes Cloreto de Rubdeo - RbCl_________10
Solues
Preparo de Clulas Eletrocompetentes____________________11
Preparo de Clulas de Baixa Competncia________________________12
Preparo do Tampo TSS1x.
Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes_________13
Introduo
Transformao de DNA plasmidial em Clulas Competentes_________14
Procedimento
Estoque em Glicerol 30%
Teste para simples verificao do plasmdeo ______________________15
STE pH 8.0
Extrao e Purificao de DNA plasmidial________________________16
Introduo
Extrao e Purificao - kit Miniprep da Promega._________________18
Extrao e Purificao - Miniprep modificado por Marie/Joaquim______19
Extrao e Purificao - kit Midiprep da Promega.__________________20
Extrao e Purificao - Maxprep com PEG 30%__________________21
Purificao de DNA com Fenol Clorofrmio______________________23
Solues PEG 30%_________________________________________24
Extrao e Purificao - kit Maxprep da QIAGEN__________________26
Solues Maxpreps da QIAGEN________________________________28
Extrao e Purificao - Kit Maxprep /Qiagen Modificado Prof: Luiz__30
Meio de cultura LB Medium (Luria Bertani)______________________31
Meio de cultura 2x YT Medium
Meio de cultura SOB Medium _________________________________32
Meio de cultura SOC Medium
Meio de cultura NZY Top Agarose______________________________33
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
M9 Minimal Medium
Preparo do 10x M9 Salt_______________________________________34
Eletroforese de DNA em gel de agarose__________________________35
Quantificao do DNA _______________________________________36
Manuseio do espectrofotmetro.
Diluio do DNA - 1/100 ou 1/50
Clculo da leitura do DNA dupla fita
Frmula
Preparo do Gel de agarose 1% (100mL)__________________________37
Aplicando o gel de Agarose ___________________________________38
Preparo das amostras de DNA reciclagem de gel de Agarose__________39
Preparo de reagentes e solues_________________________________40
Manipulao da Sala de Cultura_________________________________41
Introduo
Origem das Clulas Hela______________________________________43
Origem das clulas U937______________________________________45
Reao da Transfeco _______________________________________47
Experimento programad
Check list Transfeco / UV por 30 minutos______________________48
Transfeco de Clulas Aderentes Hela ________________________49
Contagem das Clulas na Cmara de Newbauer___________________51
Leitura de Transfeco de Clulas Aderentes______________________52
Descongelamento___________________________________________53
Cultivo e Replicao de Clulas Aderentes
Congelamento de Clulas Aderentes____________________________54
Transfeco em Clulas em suspenso U937______________________55
Leitura da Transfeco de Clulas em suspenso - U937_____________57
Cultivo das Clulas em Suspenso______________________________58
Congelamento de Clulas em Suspenso_________________________59
Antibitico / Solues para cultura de Clulas_____________________60
Soluo de Congelamento I e II
Tampo de Lise _ modificado
PBS (1000 mL) Tampo de Fosfato e Salina) _____________________61
PBS com clcio e glicose
Tripsina____________________________________________________62
Meio de Cultura DMEM______________________________________63
Meio de Cultura RPMI_______________________________________64
vi
+2
- 100mg/mL
50ug/mL Kanamicina
- 50mg/mL
15ug/mL Tetraciclina
- 15mg/mL
20ug/mL Clorafenicol
- 20mg/mL
1 dia - estriar
Plaquei as clulas a serem testadas em meio de cultura sem antibitico e Ou no antibitico no
qual ela resistente.
2 dia - isolar
Escolha de algumas colnias para teste. (pode-se escolher umas 4 colnias)
Diluir 1 colnia em 1000uL de H2O estril e plaquei 10uL em meio sem antibitico e Ou no
antibitico no qual ela resistente.
3 dia selecionar
Estriar 1 colnia da placa isolada (fazer a mesma diluio do passo anterior) em placas com
antibiticos, testando os vrios antibiticos, concentraes acima.
Marque na placa a colnia testada.
Controle negativo
Estrie as clulas preparadas em meio de cultura LB com todos os antibiticos, se possvel
veja tabela de antibiticos de Controle de Qualidade.
No deve crescer em nenhum dos antibiticos, exceto se a clula for resistente a algum
antibitico.
Libere a clula para uso s aps fazer este teste.
Se for usar as clulas a fresco ressuspenda apenas em 3 mL de CaCl2 gelado (50mM) e use
em seguida. OBS.: use solues estreis e geladas.
p/ 250mL
Solues:
Acetato de Potssio - C2H3O2K 1M
9,8g para 100mL H2O. Ajuste pH 7.5 com cido actico
MOPS 0.5M
2,1g para 20mL H2O. Ajuste pH 6.8
RF1
g/100mL
RbCl 10mM
1,2g
MnCl22H2O 50 mM
1g
C2H3O2K 30mM
3mL 1M pH 7.5 ( acetato de potssio)
CaCl22H2O..10mM
1,5g
Glicerol 15%
15mL
Ajuste pH 5.8 com cido actico 0,2 N
Esterilize por filtrao 0,22m
Armazene a 4C
RF2
g/100mL
MOPS 10mM
2mL 1M
RbCl 10 mM
0.12g
CaCl22H2O..75mM
1,1g
Glicerol 15%
15mL
Ajuste pH 6.8 com NaOH
Esterilize por filtrao 0,22m
Armazene a 4C
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
10
11
volume original)
para 10ml
LB ou 2YT..........95mL........................... 9,5mL
PEG (10%)..........10g...........................1g (polietilene glicol)
2M MgCl2...........2mL...........................200L (20-50 mM final)
DMSO 5%........... 5mL...........................500 L
Esterilize filtrando 0,22m..
Armazene a 4C.
12
13
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Imediatamente, adicione com assepsia 500uL de meio de cultura LB sem antibitico. Use
o bico de busen.
9.
10.
Plaquei 50uL em meio agar com antibitico no qual o plasmdeo confere resistncia.
11.
Incube a 37C por 16 horas ou overnight com o meio de cultura voltado para cima
12.
2-
3-
4-
5-
6-
14
Procedimento
1 Colete 500L da cultura
2 Centrifugue 13.000 rpm 2 minutos
3 - Ressuspenda o pellet em 40L de STE ( TE + 0,1 %de NaCl)
4 Adicione 20L de fenol pH 7.0
5 Adicione 20L de Clorofrmio/Acool isoamlico (24:1)
6 Centrifugue 13.000 rpm 5 minutos
7 Aplique 20L em gel de agarose 1% (pode ser reciclvel)
* Se aparecer uma banda ntida de acordo com o peso/tamanho de seu plasmdeo, proceda
com a purificao.
Maniatis 3 B20
15
DNA plasmidial em soluo. O DNA ressuspenso em TE, faz-se tratamento com RNase.
Para reduzir a contaminao do DNA purificado com protenas, pode-se empregar a extrao
com fenol:clorofrmio:lcool isoamlico e/ou clorofrmio:lcool isoamlico. O DNA ento
precipitado atravs da adio de alcool (0,8 1,0 X volume de isopropanol ou 2,5 x volumes
de etanol gelado) na presena de sais. Aps a lavagem com etanol 70% para remoo do
excesso de sais e RNAses.
Para algumas aplicaes, tais como o sequenciamento ou transfeco de clulas, existe
um requerimento alto para pureza do DNA plasmidial. Tradicionalmente, empregava-se a
purificao por gradiente com cloreto de csio. Esse mtodo requer uma ultracentrfuga, alm
de ser oneroso e usar grandes quantidades de brometo de etdeo. Por essas razes, houve uma
tendncia a usar cada vez menos esse mtodo, passando a utilizar outros mtodos que
empregam resinas de afinidade com DNA plasmidial e disponveis em kits comerciais. Outra
alternativa vivel consiste no emprego de precipitao em polietilenoglicol (PEG).
Os Kits comerciais prontos para extrao e purificao de plasmdeo, tais como o
Wizard Plus Minipreps da Promega; ou Qiagen so baseados no emprego de resinas de slica,
especficas para a purificao dos plasmdeos. De modo geral, esses Kits comerciais iniciam
a purificao do plasmdeo utilizando o mesmo protocolo de Lise Alcalina at a obteno do
lisado, seguido de ligao do plasmdeo com uma resina especfica que aps a lavagem da
coluna e remoo das impurezas e contaminantes, o plasmdeo pode ser eludo com gua Milli
Q ou TE de forma pura.
Aps a purificao de um plasmdeo, sempre recomendvel analisar a identidade e
caractersticas do plasmdeo atravs da digesto com enzimas de restrio, para confirmar o
tamanho dos fragmentos esperados, ou em simples eletroforese de gel de Agarose
17
18
19
20
21
Purificao
10 - Adicione um volume NH4Ac 5M (acetato de amnio) e agite bem
- centrifugue 4000 rpm por 15 minutos
- transfira o sobrenadante para tubos de 50 mL
11 - Adicione 2 o volume de etanol absoluto
-incube a temperatura ambiente 5 minutos
- centrifugue 4000 rpm por 15 minutos - descarte o sobrenadante
-ressuspenda o pellet em 4 mL de gua, - adicione (4 uL RNAse 10mg / mL)
Incube 37C por 1 hora
* se no for continuar pode frizar -20C aps RNAse
12 - Adicione 4 mL de PEG 30% + 1.5M NaCl , incube no gelo 40 minutos
* pode substituir a incubao no gelo por geladeira 4C overnight
- transfira para TUBOS TAMPA ROXA OU AMARELA
- centrifugue por 40 minutos 4 C a 13000 rpm
13 - Ressuspenda o pellet em 400 uL de gua Milli Q
- adicione 40 uL buffer 10 X e 4 uL PK 10 mg/ mL
- incube 37 C por 30 minutos
14 - Proceda com Fenol/Clorofrmio
22
23
Soluo I
500mL
50 mM Glucose______________________25mL 1M
25 mM Tris HCl( pH 8.0)_____________12,5 mL -1M
10mM EDTA (pH 8,0)_________________10mL 0,5M
H2O q. s. p. _________________________ 500mL
Autoclave 15 minutos a 121C
Armazene a 4C.
Soluo II
500mL
100mL
Soluo III
100mL
500L
PEG 30%
......................................100mL
H2O destilada___________50mL
30% de PEG 8000________30g
1,5M de NaCl ___________8.7g
Agite aquecendo
Complete o volume com H2O p/ 100mL
Filtre 0,22m ou autoclave
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
24
10X PK Buffer
100mL
H2O destilada____________ 40mL
0,2 M Tris (pH 8,0) _______ 20mL (1M)
25mM EDTA_____________ 5mL (0,5 M)
0,3 M NaCl ______________6mL (5M)
2% SDS ________________ 20mL (10%)
Complete o volume com H2O p/ 100mL
PK 10mg/ml
Ressuspenda 10mg de Proteinase K em gua destilada
TE pH 8.0 Maniatis 3
10 mM Tris HCl (pH8.0)
1 mM EDTA (pH8.0)
B20
RNase 10mg/mL
25
26
15. Todas as solues devero estar em temperatura ambiente para minimizar a precipitao
de sais, embora as centrifugaes seja realizada a 4oC para prevenir um superaquecimento
da amostra.
16. Adicione na coluna 15 mL de Buffer Q.F tampo eluidor
17. Adicione 0,7 do volume de isopropanol temperatura ambiente ( p/ 15 mL de Q.F.
adiciione10,5mL de isopropanol
18. Centrifugue 13.000 rpm por 15 minutos e descarte o sobrenadante
19. Sem ressuspender o pellet, adicione 500L de etanol 70% em temperatura ambiente e
centrifugue a 13.000 rpm por 10 minutos. . O etanol a 70% remove sais precipitados, pois
mais voltil, tornando-se mais fcil a ressuspenso do DNA.
20. Descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar o pellet. O pellet de isopropanol
pode parecer hialino e podem dificultar a visualizao
21. Deixe os tubos invertidos sobre um papel toalha e espere que o pellet seque a temperatura
ambiente. Certifique que todo etanol tenha evaporado.
22. Ressuspenda o pellet em 300 L de TE e transfira para um eppendorf. Ressuspenda o
pellet de DNA enxaguando as paredes do tubo. Pipetar o DNA vrias vezes pode causar
danos e deve ser evitado. Uma secagem exacerbada do DNA pode dificultar sua
ressuspenso. O DNA dissolve melhor em condies levemente alcalinas, no fcil
dissolv-lo em tampes cidos.
23. Quantifique em espectrofotmetro e depois analise uma alquota (500ng) em gel de
agarose 1%
24. Armazene a 20C
27
10 mM EDTA;
(Resuspension Buffer)
Buffer P2
(Lysis Buffer)
Buffer P3
(Neutralization Buffer)
28
29
Soluo 2: Lyses
Para cada 20 mL de soluo calcule as concentraes finais de:
0,2 M de NaOH........................0,8mL (de uma soluo estoque 5M)
1% de SDS...............................2mL (de uma soluo estoque 10%)
- Complete o volume com H2O destilada.
- Prepare apenas a quantidade a ser utilizada.
Soluo 3: Neutralizante:
Para volume de 100 mL:
-Acetato de Potssio (KAc) 5 M...................60 mL
- cido Actico Glacial ..............................11,5 mL
- Complete o volume com H2O destilada.
- Homogeneze no agitador magntico.
- Armazene 4C
30
p/ 100 mL
1. H2Obidestilada........800mL......................................80 mL
2. Bacto triptone ...........10g................................................1g
3. Bacto yeast extract......5g.............................................2,5g
4. NaCl...........................10g ..............................................5g
5. Homogeneize em agitador magntico at dissolver.
6. Ajuste pH 7,0 com NaOH 5M.
7.
Ajuste o volume final (p/ quantidade que esta fazendo) com H2O destilada
p/ 500mL
p/ 200mL
1. H2Obidestilada........... 900mL..............400mL......................150mlL
2. Bacto triptone ..............16g....................8g............................3.2g
3. Bacto yeast extract.......10g....................5g..............................2g
4. NaCl...............................5g....................2,5g..........................1g
5. Homogeneize em agitador magntico at dissolver.
6. Ajuste pH 7,0 com NaOH 1M (+ ou 1,3 ml /500ml)
7. . Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
8. Autoclave por 20 minutos a 121C.
9. Se for fazer meio agar adicione 1,5% de agar, depois de ter ajustado o pH.
10. Adicione o antibitico na concentrao especificada pelo protocolo na temperatura entre
37 a 40C
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
31
P/ 1 litro
p/ 100mL
1. H2Obidestilada...................900mL................................ 80mL
2. Bacto triptone ....................20g..................................... 2g
3. Bacto yeast extract..............5g....................................... 0,5g
4. NaCl....................................0,5g.................................... 0,05g
5. Homogeneize em agitador magntico at dissolver.
6. KCl. 250 mM ......................10mL................................ 1mL
7. Ajuste pH 7,0 com NaOH 5N
8.
Ajuste volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
(Maniatis 3 pg A.2)
O SOC Medium similar ao SOB exceto por ele conter 20mM de glucose.
Aps autoclavar o meio SOB adicione a uma temperatura de 60C, 20mL/L de uma soluo
estril de Glucose 1M.
32
p/ 200mL
1. H2O bidest.........................................900mL..............180mL
2. NaCl .................................................. 5g.....................1g
3. MgSO4 .............................................. 2g.....................0,4g
4. Yeast extratct......................................5g......................1g
5. NZ amine (casein hydrolysate)..........10g.....................2g
6. Agarose...........................................7%
7. Ajuste pH 7,0 com NaOH
8. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
9. Autoclave por 20 minutos a 121C.
P/ 500ml
P/200ml
1. H2Obidestilada...............445mL...................................................175mL
2. Agar 1.5%........................7,5g......................................................3g
3. Autoclave por 20 minutos a 121C
4. Aps autoclavar a temperatura de 55C adicione:
5. CaCl2 1M........................50 L (autoclavado) (MW 110.99g/mol)....20L
6. M9 Salt 10x.................... 50mL (autoclavado)..................................20mL
7. MgSO4 1M......................1mL (autoclavado) (MW 246,5g/mol).......400 L
8. Glucose 20%.................10mL (autoclavado)...................................4mL
9. Vit. B1 1%.....................100 L. (filtre o,22m)...............................40 L
10. Arginine 100mg/ml......0,5mL (filtre o,22m)...................................100 L
11. Plaquei
33
p/ 500mL
p/250mL
p/ 100mL
1. H2Obidest.........400mL.......... ..........200mL............................ 6g
2. Na2 HPO4..........30g..........................15g (corrigir H2O).... .... 3g
3. KH2PO4............15g..........................7,5g.................................. 1g
4. NH4CL..............5g...........................2,5g.................................. 0,5g
5. NaCl..................2,5g........................1.25g...............................0,5g
6. Ajuste o volume final (p/ qtde que esta fazendo) com H2O bidestilada.
7. Autoclave 121C por 20 minutos.
PM 142..............15g ...250mL
PM 268...........x=28,3g
34
Nota:
Para purificar bandas no use agarose reciclada. Use culos de proteo contra a luz Ultra
Violeta. O Brometo de Etdeo altamente txico e carcinognico, deve-se ter o mximo de
cuidado ao manuse-lo, use luvas, no aspire vapores.
35
Frmula
Leitura da Abs.em 260nm x diluio x 50(=OD) : 1000 = g/L
g/uL
0,306 x 50 x 100 : 1000 = 1.5g/L (Concentrao em g/L)
36
1.
Em um erlem j destinado vidraria para uso com agarose e brometo de etdeo coloque a
agarose, e adicione a tampo TAE 1x (estoque 10x) ou TBE 1x (estoque 10x) leve ao
microondas por uns 3 minutos ou at que a agarose esteja completamente derretida, evite
ferver.
2.
Espere a agarose derretida ficar a temperatura de pelo menos 50C adicione Brometo de
Etdeo 10mg/mL (estoque 10.000x) para que fique na concentrao final de 1x, ou 0,5x se
preferir manusear menos quantidade de brometo, (d certo), evite aspirar vapores.
Gel pequeno 1,5L de Brometo
Gel grande - 3L de Brometo
3.
4.
Aps completa polimerizao retire o pente com cuidado, firmando a caminha para baixo
e puxando o pente reto para cima.
5.
Transfira o gel na posio horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampo usado
para fazer o gel.
37
Ex:
1.
Aps completa polimerizao do gel retire o pente com cuidado, firmando a caminha para
baixo e puxando o pente reto para cima.
2.
Transfira o gel na posio horizontal para a cuba e cubra-o com o mesmo tampo 1x.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
11.
12.
A leitura deve ser rpida porque o DNA se difunde no gel com o tempo. Quando for cortar
a banda do gel, evite a luz ultravioleta sobre o DNA.
Foto
38
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Transfira para recipiente maior cubra com H2O destilada, esse processo permite
hidratao do gel at o momento do preparo final.
Preparo final:
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
39
2.
3.
EDTA0,5 M(pH8)..20mL
4.
5.
6.
7.
8.
40
TAE 50x
Soluo Estoque - Maniatis 3 B23
100ml 50X
500mL 10x
1.
Tris base
24,2g............................24,4g
2.
cido actico
5.71ml..........................5,71g
3.
10ml ............................10mL
4.
5.
2.
3.
4.
Armazene a 4C
Usamos apenas o bromophenol blue, mas isso no afeta seu efeito e visualizao.
41
Introduo
42
Henrietta morreu h mais de 55 anos, e apesar disto, existem mais clulas suas
atualmente do que quando ela era viva. Clulas tumorais extradas de seu tero so cultivadas
at hoje e so responsveis pela elucidao de muitos mecanismos celulares e outras questes
importantes como o desenvolvimento da vacina da plio.
Em fevereiro de 1951, Henrietta Lacks deu entrada no Hospital Johns Hopkins, em
Baltimore, EUA, e foi diagnosticada com um tumor cervical. Uma amostra tecido uterino foi
enviada ao pesquisador George Gey que estava na poca tentando cultivar tecidos humanos
em meio sinttico, porm sem sucesso. As clulas de Lacks no entanto cresciam muito bem,
num ambiente ideal se duplicam a cada 24hrs. E comearam a ser enviadas a pesquisadores de
todo o mundo, recebendo o nome de clulas HeLa. Se voc colher uma amostra de tecido
prpria, um pedao da sua pele por exemplo, mantendo num ambiente a 37C, com
oxigenao controlada e meio nutritivo, suas clulas vo continuar se dividindo como se ainda
estivessem no seu corpo. Porm, elas no passaro da 52 gerao, limite conhecido como
limite de Hayflick, devido ao encurtamento dos telmeros, uma espcie de controle celular
para impedir que clulas se dividam sem controle (como o tumor que originou as clulas
HeLa). Acontece que as clulas HeLa so clulas chamadas transformadas e so capazes de
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
43
manter-se em diviso constante, o que permite que essas clulas sejam cultivadas at hoje.
Henrietta morreu cerca de 8 meses aps seu diagnstico, em 4 de outubro de 1951,
aparentemente seu tumor foi diagnosticado como epitelial tpico e tratado com radiao, o que
no funcionou (no seu caso, o necessrio seria a remoo cirrgica do tecido). Sua famlia s
ficou sabendo do uso de suas clulas em 1975, e apesar das diferentes aplicaes e inclusive
da comercializao de alguns mtodos celulares que envolvem o uso de clulas HeLa, nunca
receberam um centavo. Atualmente se sabe que o que provavelmente causou o tumor de
Lacks foi uma infeco com HPV, o herpes papiloma vrus, conhecido por estar presente em
grande parte dos casos de cncer cervical, e que tem marcadores moleculares que podem ser
encontrados nas clulas HeLa. Hoje em dia existem vrias outras linhagens celulares, de
diferentes tecidos, transformadas ou no, mas nenhuma to estudada e utilizada como a
linhagem de Henrietta.
Alguns pesquisadores consideram suas clulas como um organismo parte, ou mesmo uma
outra espcie (devido ao nmero diferente de cromossomos que elas tm), batizada de
Helacyton gartleri.
Fontes:
SEXO E AS ORIGENS DA MORTE - WILLIAM R. CLARK - ISBN: 8501074004
AS DEZ MAIORES DESCOBERTAS DA MEDICINA - MEYER FRIEDMAN, GERALD
WIRILDLAND - ISBN: 8535908684
44
45
Condies de Sobrevivncia
Meio de cultura:
90% de RPMI, 2mM de L-glutamina, 2 g/L de bicarbonato de sdio,
4,5g/L de glicose, 10mM de HEPES, 1mM de piruvato de sdio,
10% de Soro Fetal Bovino, 10 mL de penicilina (100U/mL) estreptomicina (100/mL).
RPMI a abreviao de Roswell Park Memorial Institute. Este meio de cultura contm uma
grande quantidade de fosfato e formulado para ser utilizado em uma atmosfera de 5% de
CO2. O meio sempre suplementado com soro e soluo de antibiticos.
O meio de cultura deve ser trocado 2 a 3 vezes por semana.
Temperatura: 37C. Atmosfera: 95% de ar e 5% de CO2
Preservao das clulas:
Congeladas em nitrognio liquido ou freezer 80C
Meio para congelar: Meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO.
Temperatura de congelamento: fase de vapor do nitrognio lquido
46
Reao da Transfeco
No ncleo da clula, via plasmdeo de expresso, a transcrio do RNA feita e os
RNAm so transferidos para o citoplasma e codificados na protena (gene de interesse do
plasmdeo de expresso), que volta para o ncleo da clula e se senta no endereo do
elemento responsivo, plasmdeo reprter / gene da luciferase.
O ligante (droga) se liga protena sintetizada dando-lhe uma conformao diferente,
proporcionando a ao juntamente com protena RXR ou no, e ativar a maquinaria do gene
da luciferase.
A transcrio RNA feita no ncleo e os RNAm so transferidos para o citoplasma e
traduzido na protena luciferase que age com a luciferina adicionada e produz luz. A
intensidade da luz medida e correlacinonada ao controle positivo.
Experimento programado
Plasmdeos
Tratamento
47
lcool 70%
Luvas
Papel toalha
Obs.: Cuvetas e placas de 12 poos: mant-las abertas durante exposio por 30 min luz
UV. Utilizar placas novas ou esterilizadas com lcool.
CHECAR
Rascunho da transfeco
Plasmdeos aliquotados
Ligantes - concentrao
PBS 1x
H2O autoclavada
Pipetadores carregados
Rotor da centrfuga
Cmara de Newbauer
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
48
Procedimento:
1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas e se esto livre de
contaminaes. O meio deve ser trocado com no mximo 48 horas antes da
transfeco. Se ultrapassar s 48 horas, retire o excesso do meio de cultura.
2. . Complete com meio novo e deixe crescer por mais 12 horas.
3. Identifique um tubo eppendorf de 1,5mL para cada transfeco e aliquote os
plasmdeos (na bancada) na concentrao desejada para cada experimento. Deve-se
colocar uma gota em cada lateral do tubo.
4. NA CAPELA: Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur e uso da bomba de
vcuo. Adicione 10ml de soluo PBS na placa 150X15. Homogeneze
cuidadosamente em movimentos circulares e aspire soluo.
5. Adicione 2ml de Tripsina. Homogeneze cuidadosamente em movimentos circulares.
6. Coloque na incubadora de CO2 a 37C por 1 minuto, at as clulas soltarem da placa.
Observe ao microscpio (s vezes necessrio deixar uns 5 minutos)
7. Adicione 8ml de meio de cultura DMEM com 10% de SFB na placa para bloquear a
Tripsina. (quem faz o bloqueio o soro)
8. Antes de aspirar s clulas, lave toda superfcie da placa (incline placa e pipeta para
que sua mo no fique por cima da placa, se possvel no abra toda a placa).
9. Transfira para 2 falcons de 50ml, retire 10uLe coloque na cmara de newbauer para a
contagem. Centrifugue os tubos por 5 minutos a 2000 rpm.
10. Coloque o meio de cultura novo na placa. Use outra pipeta. Coloque a placa na
incubadora de CO2 a 37C.
11. Coloque em tubo falcon de 50mL, 12mL de meio de cultura DMEM para cada cuveta
eletroporada Reserve. Adicione um pouco mais para que no falte ao finalizar a
Laboratrio de Farmacologia Molecular
49
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
50
Frmula
Nmero de clulas contadas x diluio x 104 (constante) = n de clulas /mL
25x100x10000 = 25.000.000 clulas/mL
Clculo para encontrar 5 milhes para cada cuveta 500uL (cl. Hela aderentes)
C1
V1
C2
V2
25.000.000 V1
5.000.000 . 500L
V1 = 100L das clulas ressuspendidas e 400L de PBS + clcio + glicose por cuveta.
As clulas tambm podem ser contadas sem diluio, antes de centrifugar coloque
10L da cultura de clulas na cmara de Newbauer. Multiplique o nmero de clulas
contadas por 10 000 e por o volume centrifugado.
Frmula
38x10.000x 80mL = 30.000.000
Ressuspender:
Se quero 5000.000
em 0,5mL
51
CMV LUC-DMSO/ETHO
2,101
1,316
1,383
CMV h TR1 DMSO/ETHO
0,6810
1,451
0,377
CLCULO
DA
MDIA E FATOR
DE ATIVAO
Mdia:
Somam-se as leituras e
divide por trs.
Fator de ativao:
Diviso da Mdia / Mdia
basal.
ATIVAO.
CMV +DMSO/ETOH
CMV +T3
TRb +DMSO/ETOH
TRb + T3
Triplicatas
2
1
1
4
4
4
1
1
0
11
13
7
Mdia
Fator de ativao
1,00
2,50
1,00
10
12,35
52
Descongelamento
1. Prepare a capela/materiais.
2. Aquea o meio de cultura em banho maria a 37C.
3. Retire 2 frascos das clulas de interesse do freezer -80C.
4. Coloque a 37C. por alguns minutos
5. . Transfira imediatamente para uma placa pequena
6. Coloque 10ml de meio de cultura na placa
7. Incube com 5% de CO2 a 37C
8. Troque o meio de cultura no dia seguinte
53
*As clulas s devem ser congeladas aps a replicao e quando estiverem em com
confluncia de uns 70% da placa. Use o mesmo meio de cultivo para o congelamento, ou soro
com DMSO-Veja soluo de congelamento.
54
Procedimento:
1. Verifique no microscpio se clulas esto bem nutridas e se esto livre de contaminaes.
O meio deve ser trocado com no mximo 48 horas antes da transfeco. Se ultrapassar s
48 horas, retire o excesso do meio.
2. . Complete com meio novo e deixe crescer por mais 12 horas.
3. Identifique um tubo eppendorf de 1,5mL para cada transfeco e aliquote os plasmdeos
(na bancada) na concentrao desejada para cada experimento. Deve-se colocar uma gota
em cada lateral do tubo.
4. NA CAPELA: Aspire o meio de cultura com pipeta pasteur use a bomba de vcuo.
5. Antes de aspirar s clulas, lave toda superfcie da placa (incline garrafa e pipeta para que
sua mo no fique por cima da garrafa).
6. Transfira para 2 falcons de 50ml e centrifugue por 5 minutos a 2000 rpm.
7. Coloque o meio de cultura novo na garrafa. Use outra pipeta. Coloque a garrafa na
incubadora de CO2 a 37C.
8. Coloque em tubo falcon de 50mL, 6mL de meio de cultura RPMI para cada cuveta
eletroporada Reserve.
55
13. Transfira 500L do pool de clulas ressuspendidas ( U937 - 10 milhes de clulas por
cuveta,, no deve usar menos), para os eppendorfs com os plasmdeos, homogeneze com
a prpria pipeta e transfira para a cuveta.
14. Condies de eletroporao clulas em suspenso U937
15. Voltagem 0.300 Kv ( kilovolts) Capacitncia 0,950F (microfire)
16. Pressione os 2 botes ao mesmo tempo at apitar.
17. Transfira com pipeta de transferncia as clulas eletroporadas para o tubo contendo meio
RPMI (item 8). Homogeneze bem, ao transferir. Junte as clulas eletroporadas com os
mesmos parmetros, para que tenha um pool de clulas transfectadas mais homogneo.
18. Distribua 1mL em cada poinho da placa. Homogeneze bem a cada retirada para ter o
mesmo nmero de clulas em cada poo.
19. Pipete sempre na posio inclinada, no tubo e placa para evitar contaminaes
Tratamento: Usando uma p10 bem calibrada coloque 1L do veculo na lateral interna dos
trs primeiros poos. Puxe a pipeta com cuidado ainda pressionando o dedo, tenha certeza
de que no aspirou de volta o reagente pipetado.
20. Proceda com o tratamento nos demais poos de acordo com o experimento.
21. De leves tapinhas na lateral da placa e faa gentilmente alguns movimentos circulares para
homogeneizar bem. Cuidado para o meio no encostar-se tampa proporcionando
contaminaes.
22. Incube com 5% de CO2 a 37C por 20 a 24 horas
23. Faa a leitura veja protocolo de leitura de clulas em suspenso.
56
57
6.
58
*As clulas s devem ser congeladas aps a replicao e quando estiverem em com
confluncia de uns 70% da placa. Use o mesmo meio de cultivo para o congelamento.
59
10% de DMSO.........................1mL
Use na hora
60
10X
1x
1. 800 mL de gua
800 mL de gua
2. 80 g de NaCl
8 g de NaCl
3. 2 g de KCl
0,2 g de KCl
1,44 g - Na2HPO4
KH2PO4 0,24 g
PM 142..............1,44 g
PM 268...........x=2,7g
27g p/ 1Litro
61
Tripsina
O PBS 1x deve ser sem clcio e glicose. Se for estril use a capela para abrir o frasco.
Na bancada com o uso de um agitador magntico prepare a soluo.
Volte para a capela e filtre esterilizando, 0,22m.
62
Procedimento
1) Coloque a gua em um bcker 2 litros. Adicione o envelope DMEM e o bicarbonato,
homogeneze no agitador magntico com auxlio de uma bailarina.
2) Ajuste o pH para 6,9 com HCl 50% (se for puro mais ou menos umas 3 gotas ser o
suficiente, porm aconselhvel usar um HCl diludo)
3) Adicione o antibitico ajuste o volume para 900mL H20 destilada e transfira tudo para
o fluxo laminar e filtre em membrana estril, com poros de 0,22m).
4) Acrescente soro fetal bovino. Transfira para garrafas autoclavadas, identifique.
5) Armazene a 4oC.
Teste de Esterilidade
Faa alquotas de 1mL em tubo de start estril e coloque no shaker a 37C e observe se houve
crescimento em 24 horas / 48 horas / 72 horas
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
63
Aps 72 horas de observao libere o meio para uso e retire o tubo de 15 mL do shaker.
RPMI a abreviao de Roswell Park Memorial Institute. Este meio de cultura contm
uma grande quantidade de fosfato e formulado para ser utilizado em uma atmosfera de 5%
de CO2. O meio sempre suplementado com soro e soluo de antibiticos na concentrao
final de penicilina 100U/mL / estreptomicina 70g/mL.
Meio RPMI (1000 mL)
1. 890mL de H20 destilada para um envelope de RPMI para 1 litro
2. 2g de bicarbonato de sdio
3. Ajuste pH para 6.9 com HCl a 50% (0.2 a 0. 3 abaixo do pH final desejado.
4. Adicione 10mL da soluo estoque de penicilina / estreptomicina 100x
5. Filtre membrana de 0,22m
6. Adicione 100 mL de soro fetal bovino
Procedimento
1. Coloque a gua em um becker 2 litros. Adicione o envelope - RPMI e o bicarbonato,
homogenezem no agitador magntico com auxlio de uma bailarina.
2. Ajuste o pH para 6.9 com HC a l50% (se for puro mais ou menos uma 3 gotas ser o
suficiente, porm aconselhvel usar um HCl diludo)
3. Adicione o antibitico e transfira tudo para o fluxo laminar e filtre em membrana estril,
com poros de 0,22m).
4. Acrescente soro fetal bovino. Transfira para garrafas autoclavadas, identifique.
5. Armazene a 4oC.
Teste de Esterilidade
Faa alquotas de 1mL em tubo de start estril e coloque no shaker a 37C e observe se houve
crescimento em 24 horas / 48 horas / 72 horas
Aps 72 horas de observao libere o meio para uso e retire o tubo de 15 mL do shaker.
Laboratrio de Farmacologia Molecular
Faculdade de Cincias da Sade UnB
Rilva Grigrio Pinho Soares
64
65