Revista Argentina de Lactologa - N22 - 2003

TRATAMIENTOS TRMICOS Y QUMICOS

PARA PREVENIR INFECCIONES POR FAGOS
DE BACTERIAS LCTICAS
Surez V., Quiberoni A., Binetti A., Guglielmotti
D., Capra M.L. y Reinheimer J.*
Programa de Lactologa Industrial, Facultad de Ingeniera Qumica
(Universidad Nacional del Litoral), Santiago del Estero 2829, 3000
Santa Fe, Argentina. Tel. 0342 4530302, Fax. 0342 4571162

Palabras clave
[ bacteriofagos
[ efecto viridicida
[ bacterias lcticas

RESUMEN
El perfeccionamiento en los mtodos para contener el nivel de bacteriofagos en
plantas elaboradoras de yogur y quesos se ha tornado imprescindible, a fin de
minimizar las prdidas econmicas en los procesos. Para investigar la resistencia fgica
se seleccionaron temperaturas utilizadas en tratamientos trmicos empleados
en la industria lctea (63C, 72C y 90C) y diferentes biocidas que comnmente
se emplean en la desinfeccin de ambientes industriales y laboratorios (hipoclorito de
sodio, alcoholes etlico e isoproplico y cido peractico). Estos tratamientos se aplicaron
sobre suspensiones ( 106 UFP/ml) de fagos especficos de Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus paracasei, calculndose los valores T99 (min) a partir de las cinticas de inactivacin.
En general, los calentamientos a 63C y 72C no fueron eficientes para asegurar
una eliminacin total de fagos. El tratamiento de 90C (5 min) inactiv las suspensiones,
salvo para un fago de L.delbrueckii subsp. bulgaricus ( Ib3). El ms eficiente biocida
result el cido peractico (0.15% v/v), siendo las suspensiones virales inactivadas
antes de 5 min. El hipoclorito de sodio result eficaz en concentraciones de
100 - 300 ppm, salvo para el fago Ib3, que requiri 1200 ppm para una inactivacin
total. El etanol result eficiente al 50 y 100% v/v. El isopropanol no produjo un efecto
significativo en ninguna concentracin ensayada (10, 50 y 100% v/v).
Los resultados del estudio permiten adoptar tratamientos para minimizar
los riesgos de ataques de fagos, en plantas industriales argentinas de quesos y
leches fermentadas, sobre las bacterias lcticas de los fermentos empleados.

55

Trabajo recibido el 15-09-03 y aceptado para su publicacin el 26-02-04

( )
* Autor al cual dirigir la correspondencia (jorreinh@fiqus.unl.edu.ar)

CHEMICAL AND THERMAL TREATMENTS

TO AVOID PHAGE INFECTIONS ON
LACTIC ACID BACTERIA
Surez V., Quiberoni A., Binetti A.,
Guglielmotti D., Capra M.L. y Reinheimer J.*

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

Revista Argentina de Lactologa - N22 - 2003

Programa de Lactologa Industrial, Facultad de Ingeniera Qumica

(Universidad Nacional del Litoral), Santiago del Estero 2829, 3000
Santa Fe, Argentina. Tel. 0342 4530302, Fax. 0342 4571162.
E-mail: jorreinh@fiqus.unl.edu.ar

Key words
[ bacteriophages
[ viridicidal effect
[ lactic acid bacteria

SUMMARY
Measures to avoid bacteriophage infections in yoghurt and cheese factories
are necessaries in order to diminish economic losses. Temperatures used in
industrial thermal treatments (63C, 72C y 90C) and different biocides
(sodium hypochlorite, isoprophylic and ethylic alcohols and peracetic acid) commonly
employed in disinfections of plants environments and laboratories, were assayed.
The treatments were applied on suspensions ( 106 PFU/ml) of
Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis,
Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus paracasei bacteriophages
and T99 (min) values were calculated from inactivation kinetic curves.
Treatments at 63C and 72C were not efficient to allow a total inactivation
of bacteriophage suspensions. A heating of 90C-5 min inactivated the phages,
except the phage Ib3 (L. delbrueckii subsp. bulgaricus). The more effective biocide
was the peracetic acid (0.15%), being the viral suspensions inactivated before 5 min.
The sodium hypochlorite was effective at concentrations of 100 - 300 ppm,
except for phage Ib3 which required 1200 ppm for a total inactivation.
Ethanol was effective at concentrations of 50 and 100 % v/v
and isopropanol turned out to be less effective than ethanol.
The results obtained in this work are useful to adopt effective thermal
and chemical treatments for phage inactivation in dairy environments.
* Author for correspondence (jorreinh@fiqus.unl.edu.ar)

( )

56

INTRODUCCIN
La infeccin fgica de bacterias lcticas (BAL) usadas como cultivos iniciadores
en la industria lctea fermentativa, es una de las causas principales de fallas en
su capacidad acidificante (1, 2). Este hecho determina una menor velocidad o, en
casos extremos, la detencin del proceso fermentativo, lo que deriva en severas
consecuencias tecnolgicas y comerciales (3). Una vez ingresados los fagos a las
plantas, el control de este problema no es sencillo, ya que la diseminacin de
estas partculas virales en el ambiente industrial es muy rpida (4).
En Argentina, el estudio de esta problemtica se ha profundizado en los
ltimos aos, a partir de la implementacin de cambios en el manejo de los
fermentos utilizados en quesera. El reemplazo de fermentos naturales por fermentos seleccionados importados con alta sensibilidad fgica, principalmente
para quesos blandos y semiblandos, puso en evidencia la presencia fgica en
las plantas industriales (5).
En nuestro pas, la BAL de mayor importancia tecnolgica es Streptococcus
thermophilus, especie usada en la elaboracin de yogur y una gran variedad de
quesos de pasta blanda (Cremoso, Cuartirolo, Port Salut, Fresco) y semiblanda
(Holanda, Fontina, Colonia, Edam y Pategrs)(6). Este hecho hizo necesario focalizar el estudio de la metodologa de control fundamentalmente sobre fagos
de esta especie bacteriana. No obstante, actualmente existe una tendencia a
utilizar fermentos mixtos que combinan BAL termfilas (S. thermophilus) con
BAL mesfilas (pertenecientes al gnero Lactococcus). El aislamiento de fagos
argentinos especficos de Lactococcus lactis (de elaboraciones defectuosas de
quesos) y de Lactobacillus delbreckii subsp. bulgaricus (de procesos de yogur),
permiti realizar en el Programa de Lactologa Industrial (FIQ-UNL) estudios
sobre fagos autctonos y relacionar los resultados obtenidos con los de trabajos
previos, realizados en otros pases.
En particular, no existen datos sobre la resistencia al calor y biocidas de los
fagos autctonos argentinos, informacin que resulta muy importante a los fines
prcticos. El objetivo de este trabajo fue investigar la termo y quimio resistencia
de fagos especficos de distintas especies de bacterias lcticas, autctonos y de
coleccin, y establecer bases para disear tratamientos eficientes que minimicen
su incidencia en procesos industriales.

57

MATERIALES Y MTODOS
Bacteriofagos, cepas sensibles y condiciones de cultivo
La Tabla 1 muestra los fagos utilizados en este trabajo y sus cepas hospedadoras. Los medios de cultivo usados para activar y desarrollar las cepas fueron
Caldo M17 (Biokar, Beauvois, France) para cocos y Caldo MRS (Biokar, Beauvois,
France) para lactobacilos. Los stocks de bacteriofagos se prepararon segn
Neviani y col. (7) y almacenaron a 4C y 80C en presencia de 15% (vol/vol) de
glicerol. El recuento de fagos, expresado en unidades formadoras de placas por
mililitro (UFP/ml), se realiz usando el mtodo de la doble capa agarizada (8).
Las placas fueron incubadas a la tempe-ratura ptima de desarrollo de las cepas
sensibles: 30C (L. lactis), 37C (Lactobacillus paracasei) y 42C (S. thermophilus,
L. helveticus y L. delbrueckii).

Fagos y cepas bacterianas utilizadas en este estudio

ESPECIE

FAGO

CEPA SENSIBLE

Streptococcus
thermophilus

021-4 a
021-5 a
0BJ a
031-D a
CYM a

ST12-4
ST12-5
STBJ
ST12-5
STYSD10

Lactococcus
lactis

001 a
046 a
QF12 a
QP4 a

ClM9
13-3
M12
15-1

Lactobacillus
helveticus

hv
ATCC 15807-B1
CNRZ 832-B1
CNRZ 0241

ATCC 15807
ATCC 15807
CNRZ 892
CNRZ 892

Lactobacillus
delbrueckii subsp.
bulgaricus

BYM a
YAB a
Ib3 a

YSD V
Ab1
Lb-Ib3

Lactobacillus
delbrueckii subsp.
lactis

LL-H

CNRZ 700

Lactobacillus
paracasei

ATCC 27092-B1 (PL-1)

ATCC 27139-B1 (J.1)

ATCC 27092
ATCC 27139

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

TABLA 1:

: Fagos aislados en Argentina

58

Surez y col. - Pgs. 55 a 76

Tratamientos trmicos
Se ensayaron tres temperaturas (63C, 72C y 90C) correspondientes a tratamientos trmicos utilizados a nivel industrial. El medio de suspensin fue Leche
Descremada Reconstituida (10%p/v) estril (LDR).
Las suspensiones fgicas (aproximadamente 106 UFP/ml) en LDR se incubaron a las temperaturas mencionadas, luego de distribuirlas en tubos Eppendorf
(alcuotas de 1 ml). A intervalos predeterminados se realiz un recuento de
partculas fgicas. Los resultados se expresaron como concentracin (UFP/ml)
de partculas fgicas viables y se graficaron en funcin del tiempo. El tiempo
(min) necesario para inactivar el 99% de los fagos presentes (T99) se calcul a
partir de las cinticas de inactivacin.
Tratamientos qumicos
Los biocidas utilizados fueron: hipoclorito de sodio, etanol (Cicarelli, Buenos Aires,
Argentina) (10, 25, 50 y 100% v/v), isopropanol (Cicarelli, Buenos Aires, Argentina) (10, 50 y 100% v/v) y cido peractico (Proxitane 1512, Qumica General,
Santa Fe, Argentina) (0.15% v/v). El hipoclorito de sodio se diluy en buffer fosfato
(Cicarelli, Buenos Aires, Argentina) (pH= 7, 0.1 M). Los alcoholes se diluyeron
en medio de cultivo y el cido peractico en agua destilada (pH final= 2.7). Los
ensayos se realizaron a 25C, excepto para el cido peractico que se utiliz a
40C (9). Estos biocidas se seleccionaron por su uso comn para desinfeccin en
plantas industriales y laboratorios.
Cada suspensin fgica se mezcl con las soluciones de biocidas y se incub
a las temperaturas mencionadas anteriormente, luego de distribuir la mezcla
(aproximadamente 106 UFP/ml) en tubos Eppendorf (1 ml como volumen final).
A intervalos predeterminados se realiz un recuento de partculas fgicas. Los
resultados se expresaron como concentracin (UFP/ml) de partculas fgicas
viables y se graficaron en funcin del tiempo, calculndose los valores de T99.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Tratamientos trmicos
En la Tabla 2 se muestran los valores de T99 para los fagos estudiados de distintos gneros y especies de BAL, a temperaturas de pasteurizacin y utilizando
leche descremada como medio de suspensin.

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Resistencia trmica (T99, min) de fagos de bacterias lcticas,

en leche descremada

ESPECIE

FAGO

TEMPERATURA

63C

72C

Streptococcus
thermophilus

021-4
021-5
0BJ
031-D
CYM

> 45
30.0
> 45
12.0
> 45

3.5
< 2.0
12.0
< 2.0
12.0

Lactococcus
lactis

001
046
QF12
QP4

> 45
16.7
2.7
> 45

20.0
2.2
< 2.0
4.3

Lactobacillus
helveticus

hv
ATCC 15807-B1
CNRZ 832-B1
CNRZ 0241

2.2
12.8
> 45
45.0

< 2.0
< 2.0
21.1
8.9

Lactobacillus
delbrueckii subsp.
bulgaricus

BYM
YAB
Ib3

> 45
> 45
> 45

2.3
< 2.0
2.9

Lactobacillus
delbrueckii subsp.
lactis

LL-H

15.8

< 2.0

Lactobacillus
paracasei

PL-1
J.1

2.5
3.1

< 2.0
< 2.0

El calentamiento de 63C, en general, no result suficiente para la inactivacin

de partculas virales. Para fagos de S. thermophilus, un calentamiento de 63C
30 min no fue un tratamiento suficiente para eliminar el 99% de partculas
fgicas presentes para 3 de los 5 fagos estudiados. Para los dos fagos restantes
(021-5 y 031-D), 45 min de tratamiento no aseguraron la eliminacin total de
partculas fgicas (Fig.1). Los resultados obtenidos para fagos de lactococos
fueron variables. Los fagos 001 y QP4 demostraron elevada resistencia (T99>45
min). Por el contrario, los fagos 046 y QF12 resultaron ms sensibles (T99=16.7
min y T99=2.7 min, respectivamente). La destruccin total de partculas virales
se logr solamente para el fago QF12, a los 15 min de tratamiento (Fig. 1). Los
fagos de L. helveticus utilizados mostraron resultados tambin variables. Los fagos
hv y ATCC 15807-B1 mostraron una baja resistencia trmica (T99<13 min). El
primero de ellos result muy lbil y suspensiones en leche de elevado ttulo se
inactivaron completamente despus de 15 min de exposicin (Fig. 1). En cambio,

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

TABLA 2:

60

Surez y col. - Pgs. 55 a 76

los fagos pertenecientes a la Coleccin CNRZ (0241 y 832-B1) mostraron una

elevada termorresistencia (T9945 min). Para fagos de L. delbrueckii, el fago LL-H
result el ms sensible a la temperatura. Los fagos autctonos mostraron valores
de T99>45 min, mientras que para el fago LL-H, este valor fue de 15.8 min, a
pesar de lo cual no se lograron eliminar todas las partculas virales presentes
con 45 min de calentamiento (Fig. 1). Los dos bacteriofagos especficos de L.
paracasei mostraron ser poco resistentes a la temperatura, como lo muestran los
valores de T99 hallados en cada caso (Tabla 2). Una suspensin de alto ttulo del
fago PL-1 en leche se inactiv a los 45 min de tratamiento (Fig.1).

FIGURA 1:
Cinticas de inactivacin trmica (63C) de fagos de distintas especies de bacterias lcticas, en leche descremada. Los valores representan el promedio de tres determinaciones.

61

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

A partir de estos resultados se puede inferir que la pasteurizacin de leche de

baja temperatura (63C 30 min) pudo ser resistida por la mayora de los fagos
estudiados, no resultando efectivo como mtodo de inactivacin fgica segura
en procesos de quesera.
El calentamiento a 72C result ms eficiente que el de 63C, aunque no lo
suficiente en todos los casos estudiados para lograr una eliminacin completa
de los fagos presentes (Tabla 2). Para fagos de S. thermophilus, los ms sensibles
resultaron el 021-5 y el 031-D (T99<2.0 min). Una inactivacin total de sus suspensiones fue alcanzada luego de 5 y 30 min, respectivamente (Fig. 2). En cuanto
a fagos de L. lactis, solamente las suspensiones en leche de los fagos 046 y QF12
fueron inactivadas luego de 45 y 5 min, respectivamente, a esta temperatura (Fig.
2). El fago 001 se mostr particularmente resistente (T99=20 min). En cuanto
a los fagos especficos de L. helveticus, las suspensiones de los fagos hv y ATCC
15807-B1 se inactivaron totalmente en menos de 2.0 min. En cambio, los fagos
pertenecientes a la Coleccin CNRZ (0241 y 832-B1) mostraron una elevada
resistencia a la temperatura ya que sus suspensiones no pudieron inactivarse
completamente en 45 min (Fig. 2). Los valores de T99 a 72C encontrados para
los fagos de L. delbrueckii subsp. bulgaricus resultaron bajos (< 3.0 min) (Tabla
2), con una inactivacin completa de las suspensiones en tiempos menores o
iguales a 45 min (Fig. 2). Es interesante remarcar la importante influencia del
aumento de la temperatura en el caso de bacteriofagos de L. delbrueckii, ya
que tratamientos de 63C fueron bien resistidos por los mismos. Por ltimo, los
bacteriofagos de L.paracasei mostraron baja resistencia al calentamiento, inactivndose completamente antes de 2.0 min de exposicin (Tabla 2).

FIGURA 2:
Cinticas de inactivacin trmica (72C) de fagos de distintas especies de bacterias lcticas, en leche descremada. Los valores representan el promedio de tres determinaciones.

62

63

Surez y col. - Pgs. 55 a 76

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

Un calentamiento de 5 min a la temperatura normalmente empleada para

leche destinada a la produccin de yogur (90C), inactiv la totalidad de las partculas virales presentes, para todos los fagos ensayados de las diferentes especies,
salvo el fago Ib3 para el cual se necesitaron 15 min (datos no mostrados).
Sozzi y Maret (10) demostraron que el fago s265, de S. thermophilus, permaneca
viable luego de 1 h a 65C, requirindose 1 h a 72C o 20 seg a 90C para la
eliminacin total de las partculas fgicas. Otros estudios (11, 12) revelaron una alta
resistencia trmica para fagos de L. lactis subsp. lactis. Estos fueron capaces de
sobrevivir a procesos normales de pasteurizacin, ya que exposiciones de 7 min
a 77.8C no lograron destruirlos completamente. Para fagos de L. lactis subsp.
cremoris, Daoust y col. (13) mostraron que tratamientos de 65C durante 1.25
a 3 min fueron suficientes para lograr disminuciones de 3.5 a 4 rdenes logartmicos en los recuentos. Auad y col. (14) informaron una muy alta sensibilidad
a la temperatura para un fago temperado de L. delbrueckii subsp. bulgaricus,
cuya poblacin inicial se redujo a 10, 0.1 y 0.01 % despus de 60 min de tratamiento a 50, 60 y 70C, respectivamente. Watanabe y col. (15) demostraron para
el bacteriofago PL-1 que un calentamiento a 60C durante 5 min en medio TM
inactivaba completamente una suspensin fgica de 104 UFP/ml.
Es interesante sealar que la inactivacin trmica de bacteriofagos de BAL
no sigue una cintica de primer orden (12, 16-18) (Figs. 1 y 2) y que esta cintica
puede separarse en dos o tres componentes lineales (13). Durante los primeros
estados del tratamiento, la concentracin viral decrece rpidamente, siguiendo
una cintica de primer orden hasta una destruccin de aproximadamente el 90%
de las partculas (19). Posteriormente, la velocidad de inactivacin se reduce hasta
el final del perodo de tratamiento. La heterogeneidad inherente a los virus fue
postulada por Wilkowske y col. (18) como justificacin a este comportamiento. La
presencia de una pequea proporcin de fagos resistentes al calor provocara la
disminucin de la velocidad en los segmentos finales de estas curvas. Por otro
lado, el agrupamiento de las partculas virales podra ser un factor fsico que
explique tambin este comportamiento bimodal de la inactivacin (19).

64

Surez y col. - Pgs. 55 a 76

Tratamientos qumicos
En general, para fagos especficos de L.helveticus y S. thermophilus, el hipoclorito de sodio fue un biocida eficiente a la concentracin de 100 ppm (Tabla 3),
para una eliminacin completa de las partculas virales presentes, al igual que
para los fagos de L. lactis 001 y QF12. Sin embargo, para los fagos 046 y QP4
de esta especie se necesitaron, para tal fin, concentraciones de 300 ppm (45 min
de contacto) y 200 ppm (30 min) (datos no mostrados), respectivamente, con
valores de T99 para 100 ppm, de 32.7 y 8.5 min (Tabla 3), respectivamente. Los
fagos de L. delbrueckii mostraron ser ms resistentes que los de las dems especies
estudiadas. Para una completa inactivacin de los fagos BYM, YAB y LL-H se
necesitaron 400 ppm de hipoclorito de sodio y tiempos de entre 5 y 45 min (Fig
3), an con valores de T99 2 min para 300 ppm (Tabla 3). Un caso particular
fue el del fago Ib3, cuyas suspensiones no se vieron afectadas con tratamientos
de 45 min y 100 400 ppm de hipoclorito. Se necesitaron concentraciones de
1200 y 1400 ppm para lograr destruir todas las partculas fgicas presentes, en
45 min o 15 min, respectivamente (Fig. 3).

FIGURA 3:
Cinticas de inactivacin qumica de los fagos BYM (A), YAB (B), LL-H (C) y Ib3 (D) (Lactobacillus delbrueckii) con 100 ppm (), 200 ppm (), 300 ppm (), 400 ppm (), 600 ppm
(), 800 ppm (), 1000 ppm (O), 1200 ppm () y 1400 ppm () de cloro libre residual.
Los valores representan el promedio de tres determinaciones.

(Sigue atrs)

65

66

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

Surez y col. - Pgs. 55 a 76

67

Los fagos de L. paracasei mostraron una resistencia relativamente elevada,

necesitndose una concentracin de 800 ppm para inactivar todas las partculas
virales presentes. Con una concentracin de 700 ppm se observaron reducciones
de 4.8 y 5.0 rdenes logartmicos para los fagos PL-1 y J-1, respectivamente
(datos no mostrados).
En cuanto al etanol, las concentraciones ms efectivas fueron 75% y 100%,
dependiendo del fago estudiado. En el caso de fagos de S. thermophilus y L.
helveticus, el uso de etanol 75% se correspondi con menores valores de T99, en
general. Para los segundos, las suspensiones de los fagos de la coleccin CNRZ
(832-B1 y 0241) fueron inactivados completamente con 5.0 min de exposicin
con etanol 50% (T99<2.0 min) (Tabla 3), mientras que los fagos hv y ATCC
15807-B1 fueron ms sensibles a la concentracin de 75%. Las suspensiones
de los fagos 021-4, 031-D y CYM fueron inactivadas completamente con etanol
al 75 y/o 100% en tiempos que oscilaron entre 15 y 45 min. Un caso particular
result el fago 021-4, cuya suspensin fue inactivada completamente en 15 min
cuando se us etanol al 75%, mientras que el etanol 100% solamente disminuy
en 1 orden logartmico el recuento de partculas virales (Fig. 4). Para los fagos de
lactococos estudiados (excepto el fago QP4), el etanol 100% fue la concentracin
ensayada ms efectiva, revelando menores valores de T99 y siendo el fago 046 el
ms resistente (Tabla 3). Para los fagos 001 y QP4 se logr una rpida (<5 min)
inactivacin completa de las suspensiones, con alcohol 100% y 75%, respectivamente (Fig. 5). La concentracin 100% de etanol tambin produjo la ms rpida
inactivacin de partculas fgicas para los cuatro fagos de L. delbrueckii estudiados.
El fago Ib3 fue el ms resistente (T99= 22.2 min) y en 45 min de tratamiento
disminuy su recuento en 3 rdenes logartmicos. El fago YAB result el ms
sensible (T99< 2.0 min) y la destruccin total de su suspensin se alcanz en 15
min. Una concentracin del 75% fue eficiente para una completa inactivacin
solamente en el caso del fago LL-H, luego de 30 min (datos no mostrados). Para
los bacteriofagos de L. paracasei estudiados, las concentraciones de 75% y 100%
resultaron igualmente las ms efectivas, brindando valores de T99 comprendidos
entre 5.5 y 10.3 min (Tabla 3).

FAGO

021-4
021-5
0BJ
031-D
CYM

001
046
QF12
QP4

hv
ATCC 15807-B1
CNRZ 832 - B1
CNRZ 0241

BYM
YAB
Ib3

LL-H

PL-1
J.1

ESPECIE

Streptococcus
thermophilus

Lactococcus
lactis

Lactobacillus
helveticus

Lactobacillus
delbrueckii subsp.
bulgaricus

Lactobacillus
delbrueckii subsp.
lactis

Lactobacillus
paracasei
-

8.1

13.0
8.7
-

<5.0
<5.0
<5.0
<5.0

<5.0
32.7
<5.0
8.5

<5.0
<5.0
<5.0
<5.0
<5.0

100

2.5

3.0
6.5
-

<5.0
<5.0

200

>45
>45

<2.0

<2.0
2.8
>45

300

HIPOCLOR. DE SODIO (ppm)

>45
>45

>45

>45
>45
>45

>45
>45
14.7
>45

>45
>45
>45
>45

>45
>45
45
>45
>45

10

>45
>45

>45

>45
>45
>45

7.2
2.2
<2.0
<2.0

>45
>45
>45
>45

18.0
45.0
3.5
2.1
45.0

50

9.7
5.5

7.4

8.4
7.6
>45

2.2
<2.0
<2.0
<2.0

18.5
>45
4.9
<2.0

<2.0
3.5
<2.0
2.1
2.4

75

ETANOL (% v/v)

BIOCIDA

10.3
9.0

4.8

2.5
<2.0
22.2

7.2
2.8
<2.0
<2.0

<2.0
24.3
3.6
3.8

>45
5.3
<2.0
3.5
3.2

100

>45
>45

>45

>45
>45
>45

>45
>45
>45
>45

>45
>45
>45
>45

>45
>45
>45
>45
>45

10

>45
>45

>45

>45
>45
>45

35
2.8
<2.0
<2.0

3.8
>45
>45
>45

3.5
11.0
<2.0
5.0
7.9

100

Resistencia (T99, min) a hipoclorito de sodio y alcoholes, de fagos de distintas especies

de bacterias lcticas

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

>45
>45

>45

>45
>45
>45

5.0
5.0
<2.0
<2.0

45.0
>45
>45
>45

32.0
5.0
8.2
3.0
>45

50

ISOPROPANOL (% v/v)

TABLA 3:

68

FIGURA 4:
Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 021-4 (A), 021-5 (B), OBJ (C), 031-D (D)
y CYM (E) (Streptococcus thermophilus), con 10 (), 50 (), 75 () y 100 () % (v/v) de
etanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones.

69

Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 001 (A), QP4 (B), QF12 (C) y 046 (D)
(Lactococcus lactis), con 10 (), 50 (), 75 () y 100 () % (v/v) de etanol. Los valores
representan el promedio de tres determinaciones

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

FIGURA 5:

70

El alcohol isoproplico se ensay como biocida en concentraciones del 10, 50 y

100%. Un 10% del alcohol no produjo un efecto apreciable sobre la inactivacin
viral (T99>45 min, Tabla 3). Las concentraciones del 50 y 100% fueron efectivas
en el caso de fagos de L. helveticus. Para el fago hv fue ms eficiente la concentracin del 50% (T99= 5 min), mientras que para el fago ATCC 15807-B1 lo fue
el 100% (T99= 2.8 min). Para este ltimo, se logr una inactivacin total a los
45 min de tratamiento (Fig. 6). Para los fagos de la coleccin CNRZ (832-B1 y
0241) las dos concentraciones resultaron igualmente eficaces (T99<2.0 min),
logrndose una destruccin completa de las suspensiones virales a los 5 min
de tratamiento (Fig. 6). Para fagos de S. thermophilus, el isopropanol no fue un
buen biocida, ya que la destruccin total de partculas fgicas en suspensiones
de elevada concentracin se logr solamente para el fago 031-D, con concentraciones de 50% y 100%, a los 15 min (Fig. 7). Para los dems fagos (021-4,
021-5, 0BJ y CYM), las dos concentraciones tuvieron efectos similares, disminuyendo de 2 a 4 rdenes logartmicos los recuentos de partculas virales (Fig. 7).
El alcohol isoproplico tuvo un bajo poder viridicida sobre los fagos de lactococos
estudiados. Los valores de T99 resultaron siempre mayores de 45 min (Tabla 3),
excepto para el fago 001, que mostr un reducido valor de T99 (3.8 min) para la
concentracin del 100 %. Bajo ninguna condicin se logr una total inactivacin
de las suspensiones virales (datos no mostrados). Pequeas reducciones en los
recuentos se observaron cuando se utiliz isopropanol con fagos de L. delbrueckii
y L. paracasei (T99>45 min) (Tabla 3).

71

Cinticas de inactivacin qumica de los fagos hv (A), ATCC 15807-B1 (B), CNRZ 832-B1
(C) y CNRZ 0241(D) (Lactobacillus helveticus), con 10 (), 50 () y 100 () % (v/v) de
isopropanol. Los valores representan el promedio de tres determinaciones

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

FIGURA 6:

72

FIGURA 7:
Cinticas de inactivacin qumica de los fagos 021-4 (A), 021-5 (B), OBJ (C), 031-D (D) y
CYM (E) (Streptococcus thermophilus), con 10 (), 50 () y 100 () % (v/v) de isopropanol.
Los valores representan el promedio de tres determinaciones

73

Rev. Arg. de Lactologa - N22 - 2003

El cido peractico al 0.15%, produjo una rpida destruccin viral en todos

los casos, ya que suspensiones fgicas fueron completamente inactivadas antes
de los 5 min de tratamiento (datos no mostrados).
Basndose en los resultados obtenidos, se puede asegurar que el cido peractico fue el mejor agente viridicida. Trabajos previos (20, 21) demostraron que
este compuesto, al 1%, modifica la estructura del ADN del bacteriofago F116
(especfico de Pseudomonas aeruginosa) y que una concentracin de 0.1%
logra la reduccin del 99.99% de las partculas virales presentes en 10 min de
contacto. El hipoclorito de sodio fue eficiente en concentraciones de 100 300
ppm, salvo para un fago de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Ib3), para el que
se necesit una concentracin de 1200 ppm para inactivar completamente sus
suspensiones. Bennet y Nelson (22), y Hunter y Whitehead (23) demostraron que
concentraciones mayores a 500 ppm fueron necesarias para inactivar fagos de
L. lactis subsp. lactis, pero utilizando leche y suero como medio de suspensin.
Otro estudio reciente (24) sobre fagos de L. lactis demostr la necesidad de utilizar
concentraciones entre 1000 1200 ppm de hipoclorito de sodio cuando se realizaba el ensayo en leche, y 100 300 ppm cuando el medio de suspensin era
Caldo M17. Segn Maillard y col. (25), el fago F116, activo sobre P. aeruginosa
PAO1, fue altamente sensible a bajas concentraciones (5 y 75 ppm) de hipoclorito
de sodio, logrando reducciones del ttulo de al menos 4 rdenes logartmicos en
30 seg. Sobre este fago, tratamientos con etanol 70% y 100% durante 30 min
produjeron alteraciones en la cpside viral, pero no en el ADN del fago (20).

CONCLUSIONES
- Los tratamientos de pasteurizacin (63C y 72C) no aseguran la eliminacin
completa de fagos de bacterias lcticas en leche. Slo tratamientos de 90C (<5
min) logran este efecto.
- Entre los biocidas, slo el cido peractico (0.15%) asegura una rpida y
completa inactivacin de partculas fgicas, aun en alto nmero. La respuesta del
hipoclorito de sodio y etanol result muy dependiente de los fagos considerados.
El isopropanol demostr muy escaso poder viridicida.

74

Surez y col. - Pgs. 55 a 76

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