Tcnicas de Microscopa Electrnica como apoyo a la Biotecnologa

Agrcola.
Eder Durango Ballesteros, Maracay Venezuela, 2010
MICROSCOPIO ELECTRNICO, PRINCIPIO FSICO DE FUNCIONAMIENTO
COMPARACION DEL MICROSCOPIO PTICO CON EL MICROSCOPIO
ELECTRNICO DE TRANSMISIN, DESCRIPCIN Y ANALOGA DE SUS
COMPONENTES

El microscopio electrnico (ME) utiliza un flujo de electrones (Can de electrones)

propagados en el vaco que concentrados y refractados por campos magnticos se
proyectan sobre la preparacin y se proyectan en un foco donde proyectan una imagen
no visible, pero que puede fotografiarse o revelarse en una pantalla. Se logran
aumentos de 30.000 a 100.000 dimetros. Puede resolver partculas a 0.001m,
ultrapequequeos de1 y 2 , alcanzan sta capacidad de aumento debido a que la
longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles. On
line, http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_electrnico, 12 abril 2009
El principios fsico de funcionamiento de un microscopio electrnico, se basa en la
accin de un haz de electrones incidente que es generados por un can electrnico,
acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello al
alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire). On line,
http://www.enciclonet.com/documento/microscopio/, 12 abril 2009
El ME emite un haz de electrones que chocan o atraviesan la muestra que se desea
aumentar, estos electrones se producen generalmente en un filamento, por lo general
de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como
emisin termoinica o bien mediante emisin de campo, donde una parte de los
electrones rebotan o son absorbidos por la muestra y otros lo atraviesan formando una
imagen aumentada. El ME posee una potencia amplificadora mayor que la de un
microscopio ptico, ya que la de ste ltimo es limitada por la longitud de onda de la luz
visible.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRNICOS
El microscopio electrnico de transmisin (MET). Utiliza un haz de electrones
acelerados por un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una seccin muy fina
de la muestra, sean tejidos, clulas u otro material.
El microscopio electrnico de barrido (MEB) se utiliza para el estudio de la
morfologa y la topografa de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes
cercanos a los 20.000 voltios. Las lentes magnticas utilizan un haz muy fino de
electrones para penetrar repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada
de la superficie observada en la pantalla de un monitor.

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El microscopio electrnico mixto tiene propiedades comunes con el de transmisin y
con el de barrido y resulta muy til para ciertas investigaciones. Hay otros microscopios
analticos que detectan seales caractersticas de los elementos que constituyen la
muestra.
COMPARACION ENTRE MICROSCOPIO OPTICO Y MICROSCOPIO ELECTRONICO
Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticas. Tambin se le
conoce como microscopio de luz, fotnico (que utiliza luz, o "fotones", o de campo
claro), utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, Tanto
microscopio de Luz, como el electrnico nos permiten amplificar aquellos objetos que
son indistinguibles al ojo humano(Puede discriminar dos objetos si estn situados
no ms cerca de 0,l mm., mirando desde una distancia normal de 25 cm). La
diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminacin. (Arenas J, 2005)
Vase tabla 1. Figura 1.

Fuente: Tcnicas de Microscopia. CIP, Training manual.

Figura 1. Esquema de semejanzas entre Microscopio de luz y Microscopio Electrnico
(SEM Y TEM)

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Tabla 1. Comparacin del Microscopio ptico con el microscopio electrnico de
transmisin
MICROSCOPIO DE LUZ

MICROSCOPIO ELECTRONICO

Haz de luz

Haz de electrones

2000 - 7500

0.037 - 0.086

Lentes

Vidrio

Electromagnticas

Medio

Atmsfera

Vaco

2000

10 x - 2000 x

100 x - 450000 x

Mecnica

Elctrica

Absorcin - Reflexin

Scattering

Iluminacin
Longitud de Onda

Resolucin
Magnificacin
Focalizacin
Contraste

Fuente:http://www.criba.edu.ar/cribabb/servicios/secegrin/microscopia/apunte_col.htm, 2009

Las diferencias entre microscopio de luz y el microscopio electrnico se basan en:

Las lentes magnticas no tienen distancias focales fijas como las lentes pticas. La
distancia focal es dependiente de la intensidad de campo, cambiando la corriente
que pasa a travs de la bobina.

En el microscopio electrnico, no es necesario cambiar la lente de Objetivo o las

proyectoras cuando se desean distintas magnificaciones. Esto se logra variando la
distancia focal de la proyectora, en tanto que la magnificacin del objetivo es
siempre fija.

El modo de formar la imagen es diferente en los 2 microscopios. En el Microscopio

ptico se forma por absorcin diferente de la luz, en tanto que en el Microscopio
Electrnico la prdida de electrones por dispersin en puntos individuales del
espcimen resulta en variaciones de la intensidad de la imagen (contraste). On line,
http://www.mdp.edu.ar/exactas/biologia/grupos/ersion%2011/Practicos/archivos/056073_TP_Microscopia.pdf,
14 abril
2009.

Referencias.
Arenas J, 2005. Contribuciones de la fsica en la historia de la microscopa. Revista
Digital Universitaria UNAM Mxico. Vol. 6 (7) 10 pginas.
Granada M. Y Horacio Troiani. 2007. Para captar el mundo muy pequeo: Los
microscopios electrnicos. Desde la Patagonia difundiendo saberes Vol. 6 (5) 5pginas.

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FORMACION DE LA IMAGEN EN UN MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO
Y TIPO DE IMGENES QUE SE OBSERVA
El principio del sistema SEM consiste en hacer incidir sobre la muestra un haz de
electrones finamente enfocado, la energa que pierden los electrones al colisionar
contra la muestra puede hacer que otros electrones salgan despedidos, los que son
llamados electrones secundarios, y producir rayos X, electrones Auger, etc. Los
electrones secundarios (de baja energa) se recogen sobre una placa cargada
positivamente que produce una seal elctrica proporcional al nmero de electrones.
Estas intensidades elctricas dependen de la forma y composicin qumica del objeto
irradiado; las seales se registran en un monitor. En unos puntos el haz de
electrones es desviado 1, 2, 3, n veces por los campos magnticos controlados
por el generador de barrido. Como consecuencia el haz es movido sobre la
superficie de la muestra y la seal es detectada por el colector de electrones (W, C.
Nixon 1969). Se puede ajustar el colector para detectar cualquier emisin como
rayos X, luz infrarroja, ultravioleta.
El barrido del haz est sincronizado con el barrido del tubo de rayos catdicos (CRT) y
produce una relacin uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT. El
sistema de amplificacin recoge las seales y procesa la informacin procedente
de la muestra, al mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra, el
generador de barrido est conectado CRT para que el haz de electrones en este tubo
sea barrido en la misma forma que el haz principal. Sin embargo, la potencia de la
corriente suministrada a la columna principal para el barrido puede ser atenuada
mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre un rea constante. Como
consecuencia de ello, cualquier reduccin en el rea de la muestra barrida da lugar a un
aumento de la imagen. Este aumento viene determinado por la relacin del rea de
la pantalla del tubo (constante) respecto al rea de la muestra barrida (variable).
El poder de resolucin en el microscopio electrnico de barrido (SEM) depende de
varios factores, tales como la dimensin del haz de electrones, la difusin del
mismo en la muestra antes de la misin de los electrones secundarios, y la
corriente estabilizada de la lente. Los electrones no se transmiten desde abajo como
en el TEM, si no que inciden desde arriba sobre la muestra, por lo que no hay limitacin
en el grosor de esta. (A, Naik)
El SEM, permite observar y caracterizar la superficie de materiales inorgnicos y
orgnicos, proporcionando informacin morfolgica, presentando imgenes
tridimensionales de las superficies de los objetos observados, el objeto es recubierto
inicialmente con una delgada pelcula de un metal pesado y a continuacin es
explorado por el haz de electrones, los electrones dispersados por el metal pesado son
reunidos y enfocados para formar la imagen final.

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Referencias
A. Naik. Fundamentos del microscopio electrnico y su aplicacin en la investigacin
textil
W. C. Nixon 1969. Introduction to Scanning Electron Microscopy, Proceedings of and
Annual Scanning Electron Microscopy Symposium, Patrocinado por IIT Research
Institute.
FORMACION DE LA IMAGEN EN UN MICROSCOPIO ELECTRNICO DE
TRANSMISIN Y TIPO DE IMGENES QUE SE OBSERVA

El microscopio electrnico ms sencillo es muy similar al microscopio ptico, ambos

tienen lentes y condensadores para concentrar la iluminacin sobre la muestra. El
modo de operar de este tipo de microscopio es similar al del microscopio ptico, ya que
est basado en el hecho de que la manera de actuar de un campo electromagntico
sobre un haz de electrones es anloga a la accin de la lente de cristal sobre el haz de
fotones. La imagen, sin embargo, se forma sobre una pantalla fluorescente.
En el MET, el haz de electrones pasa a travs de la muestra estudiada y
posteriormente, a travs de unas lentes electromagnticas que dan lugar a una imagen
amplificada. Esta imagen pasa a su vez por una lente proyectora hasta una pantalla de
material fluorescente, que brilla al recibir el impacto de los electrones. Debajo de la
pantalla se sita la cmara para fotografiar la imagen.
No obstante, al igual que en el microscopio ptico, el microscopio electrnico de
transmisin tiene la limitacin de ser til slo para un grosor determinado del objeto.
Las pelculas de muestra, adems de ser delgadas, no deben poseer materiales que
puedan dispersar o absorber electrones, deben ser lo suficientemente fuertes como
para poderlas manipular, y lo bastante estables, como para no volatilizarse, a causa del
bombardeo en el vaco. El interior del microscopio debe hallarse en vaco, ya que el
aire impide la movilidad de los electrones. Esto se efecta mediante las bombas de
vaco. Estas condiciones imposibilitan la observacin de microorganismos vivos, y de
sus procesos fisiolgicos. Las tcnicas que ms se utilizan para este tipo de
microscopio electrnico son: tincin negativa, microtoma y congelacin.

Los rayos de iluminacin atraviesan la muestra y son enfocadas por las lentes del
objetivo y de proyeccin para forma una imagen aumentada sobre una pantalla
fluorescente. Sin embargo el microscopio electrnico es mucho ms complejo. Para
que los electrones puedan ser acelerados hasta la velocidad prefijada, debe
trabajarse en condiciones de alto vaco (10-4 10-6 torr, torr = 1 mm de mercurio a
0C). El sistema central del microscopio electrnico incluyendo la pantalla
fluorescente y el equipo fotogrfico, lo constituye un tubo hueco. El equipo
elctrico que suministra la corriente necesaria se halla generalmente situado a una
cierta distancia para evitas la interferencia de los campos magnticos dispersados. La
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mayora de los microscopios estn equipados con dispositivos de seguridad que
no permiten conectar el filamento de alto voltaje hasta que no se ha conseguido
d vaco apropiado (9).
Las lentes magnticas del microscopio electrnico estn formadas por imanes en forma
de herradura. El imn puede ser permanente o de tipo dectromagn6tico Variando la
potencia de la corriente a la lente se consigue el efecto de variar la distancia
foca1 de la lente continuamente, lo cual es muy similar al sistema de "zoom".
Sin embargo, normalmente se preselecciona la corriente deseada. Se pueden ajustar
los voltajes de aceleracin en una gama que incluye 40, 60, 80 y 100 Kv, etc.
Ajustando Kv a un nivel inferior, se consigue aumentar el contraste.

Estas secciones ultradelgadas del material biolgico son necesarias, debido a la

limitada penetracin del haz de electrones a 75-100 kV. Para una adecuada
penetracin y resolucin el espcimen no debera ser ms grueso de 100nm,
preferiblemente ms delgado (70-90 nm). Slo unas pocas muestras, tales como virus y
organelos sub-celulares son suficientemente delgados como para observarlos
directamente, y sin embargo, requieren de tcnicas de procesamiento adecuadas y
diferentes.

El TEM puede analizar la seal de los electrones incidentes, los electrones dispersados
y los electrones difractados permitiendo trabajar en diversas tcnicas y obtener
informacin en imagen.

Mtodos de preparacin de muestras tanto para microscopia de barrido como de

transmisin (para plantas)?
La metodologa escogida para preparar las muestras, va a depender del tipo de material
y del tipo de informacin que busquemos obtener, per las mas comunes en MET para el
anlisis ultraestructural son:
Tcnicas para MET
1. Tcnica de rutina

Fijacin: Se realiza con paraformaldehdo, glutaraldehdo, tetrxido de osmio

o Acido tnico.
Inclusin: Resinas de distinta naturaleza (araldita, epon, LR White, Spurr)
Secciones Ultrafinas: 40 70 nm.
Contraste con sales metlicas pesadas: Acetato de uranilo, Citrato de plomo.
Aplicacin: visualizacin de estructuras biolgicas subcelulares.

2. Tcnica de inmunomarcacin
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Emplea anticuerpos unidos a partculas de oro coloidal (de 2 a 150 nm) como
mtodo de localizacin al MET. Este procedimiento puede realizarse previo a la
inclusin del material en una resina (generalmente hidroflicas como el LRW),
luego de realizar las secciones ultrafinas (post-inclusin), dependiendo del
protocolo a seguir.
Aplicacin: localizacin de molculas.
3. Tcnica de tincin negativa

Esparcido de partculas (fijadas o no) sobre un film de soporte.

Sombreado con sales metlicas pesadas: acetato de uranilo, citrato de plomo,
cido fosfotngstico.
Aplicacin: visualizacin de microorganismos (bacterias y virus), de
macromolculas, de complejos macromoleculares o de nanopartculas de
materiales inertes.

4. Tcnica de sombreado rotativo con metales

Sembrado de micro partculas sobre un film de soporte. Sombreado con oro,

oro-paladio y otras aleaciones evaporadas sobre la preparacin.
Aplicacin: visualizacin de macromolculas aisladas (ADN o protenas) y
microorganismos.

5. Tcnica de criofractura

Fijacin del material (en fro o no). Fractura de la muestra en un ambiente con
alto vaco y en fro.
Evaporacin de platino-carbn o tungsteno-tntalo para construccin de la
rplica. Digestin de la muestra biolgica con cido (crmico o sulfrico).
Aplicacin: visualizacin de rplicas de superficies de materiales biolgicos.

6. Tcnica de criograbado profundo

Fijacin del material (en fro o no). Fractura de la muestra en un ambiente con
alto vaco y en fro.
Sublimacin del hielo. Evaporacin de platino-carbn o tungsteno-tntalo
para construccin de la rplica.
Digestin de la muestra biolgica con cido (crmico o sulfrico).
Aplicacin: visualizacin de elementos intracelulares no solubles.

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Tcnica de visualizacin con sem
Fijacin: paraformaldehdo, glutaraldehdo, tetrxido de osmio, cido tnico.
Deshidratacin y secado de punto crtico con CO2. Evaporacin de metales
sobre la superficie de la muestra (oro, oro-paladio, platino o tungsteno).
Aplicacin: Anlisis de la superficie de muestras biolgicas completas o
porciones de las mismas. Este tipo de microscopio permite adems, la
visualizacin de determinados materiales sin necesidad de procesamiento previo.

MTODOS MORFOLGICOS EMPLEADOS EN EL ESTUDIO DE LAS CPSIDES

VIRALES.
El conocimiento de la estructura detallada de las partculas virales es un prerrequisito
esencial para conocer muchos aspectos de virologa
El trmino cpside se utiliza para denominar a la cubierta cerrada o tubo de un virus y el
trmino subunidades morfolgicas se refiere a los grupos de subunidades de protenas
revelados por el microscopio electrnico y la cristalografa de rayos X. La MET es la
ms utilizada para determinar morfologa de capsides virales por su capacidad de
resolucin. Los virus son clasificados segn la morfologa de su capside en:
isomtricos, con morfologa de varillas, con estructura binal y con aspecto pleomrfico.
Para visualizar ultraestructuras ms finas dentro de la capside se debe usar tcnicas
ms finas como la Difraccin de Rayos X.
Las protenas que forman la cpside, suelen ser protenas simples, fosfoprotenas y
normalmente suele estar constituida por un solo tipo de protena, o en algunos casos
por 2, 3 o hasta 9.
La cpside suele ser regular, en forma y tamao en los distintos virus, y suelen estar
constituidas por monmeros proteicos, de igual naturaleza o de distinto tipo. Los
monmeros proteicos, se les denomina Unidades estructurales de las Cpsides. Esta
naturaleza permite predecir dos caractersticas:

Si existen muchas subunidades proteicas, indican la formacin de muchos enlaces

para formar la estructura, dicha estructura es fsicamente estable.

Estables genticamente, mientras ms pequeas sean las protenas, ms pequeo

el gen y por tanto menos probabilidad de mutaciones.
Horne en 1985 descubri la aplicabilidad del microscopio electrnico (ME) en el
estudio de la estructura de los virus de plantas.

Preparaciones de sombreado con metal. En estudios tempranos de partculas virales

con ME, el sombreado con metales pesados fue usado para realzar el contraste.,
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este tipo de sombreado oscureci los detalles de la superficie, dando informacin
del tamao y forma de la partcula. Se obtuvo ms informacin cuando la era secado
al fro y sombreado en alto vaco.

Congelado con vapor de agua. Esta tcnica da informacin til acerca de la

superficie y estructura de virus largos, particularmente los de membranas
lipoprotenicas de doble capa.

Tincin Negativa y Positiva. El uso de tinciones electrn-densa ha provisto de

informacin mucho ms valiosa que el sombreado con metal para revelar detalles de
la morfologa de las partculas virales. Tales tinciones pueden ser positivas y
negativas. La tincin positiva reacciona qumicamente con el virus (ej. Osmio de
vario, plomo y compuestos uranilos y cidos fosfotungstenico bajo condiciones
apropiadas). La combinacin qumica puede llevar a la alteracin o desintegracin
de la estructura de los virus. En la tincin negativa el material electrn-denso no
reacciona con el virus pero penetra los espacios disponibles en la superficie o dentro
de la partcula del virus. Esta es la tcnica preferida en la actualidad para examinar
la estructura del virus por microscopa electrnica. La tincin negativa ms comn es
la del fosfotungstato de potasio (KPT) a pH 7 y acetato de uranilo o formato usado
cerca del pH 5. La estructura del virus
Los detalles ms finos de la estructura del virus tienden a ser oscurecidos, primero,
por ruido debido a las irregularidades menores en la estructura actual del virus y
otros factores tales como irregularidades en la tincin, segundo, por el hecho de que
el contraste debido a la tincin es a menudo desarrollado en ambos lados de la
partcula a grados variables.
Para superar esas dificultades y extraer mayor informacin puntual y detallada de
las imgenes de las partculas virales individuales teidas negativamente, se han
desarrollado varios mtodos como: superposicin fotogrfica, sombreado y
transformacin ptica.
Algunos aspectos de la estructura de la envoltura de los virus, particularmente las
membranas de doble capa, pueden ser estudiadas usando secciones delgadas de
clulas infectadas a de pellets que contienen el virus.

Microscopa de Crio-electrn. Jeng y col (1989) usaron una prueba con el TMV para
desarrollar un procedimiento basado microscopa de Crio-electrn, que no es ms
que el congelamiento extremadamente rpido en un medio acuoso, para determinar
los detalles estructurales en el objeto con simetra helical. Ellos obtuvieron datos del
TMV con diferencia de 10 A de la imagen del electrn del TMV hidratado y
congelado en hielo vtreo. Butler y col (1990) usaron este procedimiento para
demostrar la presencia de doble disco de TMV bajo condiciones de ensamblaje.

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EMPLEO DE LA CRIOMICROSCOPIA COMBINADA CON LA
RECONSTRUCCIN 3D (TRIDIMENSIONAL) PARA EL ESTUDIO DE CAPSIDES
VIRALES.
El mtodo de reconstruccin de imagen icosadrico produce una estructura 3D,
interpretando imgenes separadas de diferente vistas de la misma partcula
Una vez obtenidas las imgenes, la determinacin de la estructura se realiza en tres
pasos: Determinando la orientacin y centro de la partcula, refinar los parmetros por
comparacin de los datos comunes entre las diferentes vistas y combinacin de los
datos en un diagrama esquemtico y la construccin de una imagen 3d.
El desarrollo de la Crio-ME, como mtodo alterno al procesamiento qumico de las
muestras biolgicas, introdujo la posibilidad del estudio estructural de las partculas
virales en estado hidratado - vitrificado (Adrian y col, 1984), sin la utilizacin de
fijaciones qumicas y en condiciones que preservaran su simetra, la tcnica consiste
en un congelamiento extremadamente rpido en un medio acuoso, para determinar los
detalles estructurales en objetos con simetra helical. El conocimiento de la arquitectura
de los virus ha incrementado enormemente en los ltimos aos, debido a que hay
mayor cantidad de informacin qumica y morfolgica detallada. La combinacin de la
Crio-ME con la tcnica 3D permiti la reconstruccin tridimensional de estructuras de
varios virus icosaedricos a mayor resolucin, incluyendo algunos virus con doble
envoltura: Semiliki Forest virus (SFV)(Vogel y col., 1986) y sindbis (Fuller, 1987); no
envueltos SV40 (Baker y col, 1988), Rotavirus(Prasad y col., 1988), las nucleocapsides
del herpes simple (Schrag y col., 1989), Adenovirus (Stewart y col., 1991), las
subunidades proteicas de Rotavirus (Yeager y col., 1994), y el virus helicoidal TMV
(Jeng y col., 1989). La reconstruccin tridimensional de imgenes, abri la posibilidad
para la observacin de las partculas virales, a una resolucin de 10-20 sin el empleo
de soluciones contratantes ni sombreado metlico (Sanchez y col., 2000).
PROTOCOLOS A SEGUIR SEGN MUESTRA DE INTERS

Material Vegetal a estudiar: Tallos y hojas de arroz de 60 a 70 das, inoculados con

Rhizoctonia solani, en dos materiales, uno susceptible (FONAIAP 1) y otro tolerante
(LEMON).
El material vegetal se sembr en el invernadero del INIA Maracay, al cual despus de
60 das se inoculan controladamente con el hongo patognico, transcurrido un dia se
tomaran muestras de tejidos, cada 12 horas.

El protocolo segn el inters y la necesidad de establecer la interaccin planta

patgeno es un procedimiento para microscopio electrnico de barrido, segn el
siguiente esquema.
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Tallos de Arroz
Prefijado
2 lavados de 10 minutos
cada uno, con Buffer de
fosfato 0.1 M a pH de
6.5.

Lavados
Fijado

2 lavados de 10 minutos
cada uno, con Buffer de
fosfato 0.1 M a pH de
6.5.

Glutaraldehido al 4% en
Buffer de fosfato a pH
de 6.5, por 2 horas

Con OsO4, al 1%, en

buffer, durante 24 horas

Lavados
Deshidratacion

3 veces con Etanol, al 50,

75 y 100%, en cada
concentracin dejar 10 min
sumergido el material

Secador Punto
Crtico
Cubrimiento con
Oro
SEM

MECANISMO DE TINCIN NEGATIVA Y MUESTRAS A LAS QUE SE LES

APLICA.
La tincin negativa es un mtodo simple y rpido, para estudiar la morfologa y
estructura de especmenes tales como virus, componentes celulares (ribosomas,
Mitocondrias, etc.), fragmentos celulares (membranas) y macromolculas aisladas
(Protenas), esta tincin preserva la estructura macromolecular. El mecanismo de
tincin negativa incrementa el contraste, como un resultado de la penetracin de
tomos de metales pesados en las regiones hidrfilas de las muestras, producindose
diferentes interacciones entre el tinte y la muestra, resultando en imgenes oscuras las
zonas de cubrimiento de la tincin. La tincin forma depsitos espesos en regiones
hidroflicas, remplazando el agua y secando rpidamente, formndose una cubierta
alrededor de estas regiones, incluyendo regiones lipdicas. El porcentaje de tincin en
las cavidades de una protena se debe bsicamente a las cargas inicas y al tamao de
los reactivos usados para tincin, como los iones de Uranil acetato y PTA (Acido
fosfotungstnico), los cuales tienen un dimetro de 0.4 a 0.5 nm y 0.8 -1.5nm
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respectivamente. Las propiedades superficiales de la muestra, determina la adhesin
de la solucin de tincin afectando la imagen final.
La tincin negativa es una tcnica fundamental para contrastar muestras particuladas.
El contraste se obtiene embebiendo la partcula a observar en una sal de un metal
pesado, cido fosfotngstico al 2%, acetato de uranilo al 4%, que perfila mnimos
detalles ultraestructurales sobre un fondo oscuro; de ah su denominacin como tcnica
de contraste negativo, o de tincin negativa. Siempre que se aplique esta tcnica, es
necesario trabajar con grillas cubiertas por un soporte o membrana plstica (formvar o
colodin), para evitar que la muestra lquida se escurra entre los agujeros de la grilla. La
tincin negativa se aplica al estudio de microorganismos (virus, bacterias (pilis y
flagelos), protozoarios), fragmentos celulares (membranas) y macromolculas aisladas
(protenas). Esta tcnica permite realizar una identificacin morfolgica rpida y un
diagnstico diferencial de los distintos virus contenidos en la una muestra.
Referencia
M.A, Hayat. Principles and Techniques of electron microscopy

EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO, QU INTERESA OBSERVAR

EN LA MUESTRA

El SEM permite observar y caracterizar la superficie o topografa, proporcionando

informacin morfolgica con imgenes tridimensionales del material observado, de
muestras orgnicas o inorgnicas, es especialmente til para conocer el aspecto
superficial de las clulas y/o la disposicin y distribucin de stas en los tejidos.
Solamente hasta el momento, pueden ser observados organismos muertos, y no se
puede explorar ms all de la morfologa externa de la muestra. Los microscopios
electrnicos slo pueden ofrecer imgenes en blanco y negro puesto que no utilizan la
luz.

En mi caso, en el estudio de interaccin planta patgeno, me interesa observar, como

esta interrelacionndose las estructuras del patgeno (hifas, micelio, etc.) con las
estructuras vegetales y como el hongo est penetrando las estructuras celulares del
vegetal, para posterior mente por un anlisis protemico de esa interaccin, establecer
la preferencia y relacin por un tejido especifico en la planta, por ejemplo (Por que
ataca solo hojas y no tallos u otra estructura de la planta, en este caso cual ser la
deficiencia de la hoja (morfolgica o bioqumica) para que el hongo ataque por all)

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