TBX21: una variante funcional predice mejora en

asma con el uso de corticoesteroides inhalados

Kelan G. Tantisira*, Eun Sook Hwang, Benjamin A. Raby*, Eric S. Silverman, Stephen
L. Lake*, Brent G. Richter*, Stanford L. Peng, Jeffrey M. Drazen, Laurie H. Glimcher,
and Scott T. Weiss*

*Channing Laboratory and Pulmonary Division, Brigham and Womens Hospital and
Harvard Medical School, Boston, MA 02115; y Washington University School of
Medicine, St. Louis, MO 63110
Contribudo por Laurie H. Glimcher, Noviembre 17, 2004

TBX21 codifica el factor de transcripcin T-bet (T-box caja-T expresada en clulas T),
que influencia linfocitos T ingenuos y ha sido implicado en la patogenia del asma.
Especficamente, la inactivacin en ratones de T-bet desarrolla espontneamente una
hiperrespuesta de la via area y otros cambios consistentes con asma. Porque la
sensibilidad de la va area es moderada por el uso de corticoesteroides inhalados en
el asma, es concebible que la variacin gentica en la codificacin de TBX21 para
reemplazar la histidina 33 con glutamina se asocia con una mejora significante en el
PC20 (una medida de sensibilidad de la va area) de nios asmticos en ensayos
clnicos grandes abarcando 4 aos. Notamos que este incremento ocurre solo en los
nios aleatorizados para corticoesteroides inhalados y que mejora dramticamente la
mejora total en PC20 en una prueba final para sujetos que tomaban corticoesteroides
inhalados poseyendo un alelo variante estaba en el rango normal para no asmticos.
En modelos celulares, se muestra que la variante de TBX21 incrementa T-helper 1 y
disminuye la expresin de citosina T-helper 2 comparablemente con el tipo salvaje.
TBX21 puede ser una respuesta farmacogentica determinante importante para la
terapia del asma con corticoesteroides inhalables.

PC20 | farmacogentica | T-bet

Los corticoesteroides median una variedad de acciones inmunolgicas y son

comnmente usados en diversos tratamientos de enfermedades. Inhalados, los
corticoesteroides son los ms efectivos y ms comnmente usados en en la terapia
para el control del asma (1,2) pero puede ser asociado a serias reacciones adversas
(3). Al evaluar la respuesta a la terapia del asma, se mide la funcin de los pulmones,
como el volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV 1 forced expiratory volumen at
1 second), y la sensibilidad de la via area, son medidos por la concentracin
provocadora de metacolinacausando un decremneto del 20% en FEV1 (PC20) son las
ms comnmente usadas. Sin embargo, hay una gran variacin interindividual en las
respuestas del FEV1 y PC20 a los corticoesteroides inhalados (4, 5). Por lo tanto,
identificar estos pacientes puede ser valioso. Porque la respuesta intraindividual a los
tratamientos con corticoesteroides inhalados en pacientes con asma es altamente
repetible (6) y porque FEV1 y PC20 ambos son rasgos heredables (7, 8) una base
gentica para la heterogeneidad de esta respuesta teraputica es pausible.

El gen TBX21 codifica para la transcripcin del factor T-bet (T-box expresada en
clulas T), que es responsable por la induccin de clulas T-helper (Th)1 y a represin
de clulas Th2 por linfocitos T ingenuos (9). T-bet ha sido implicado en la patognesis
del asma (10,11). Porque las clulas del ratn T-bet inactivadas son espontneamente
hipersensibels en la va area (10), un fenotipo que es modulado por coritcoesteroides,
nos dirigimos a los resultados sonbre asma de la relacin de TBX21 con PC20. Solo
una (heterocigoidad estimada >5%) no sinnimo TBX21 SNP ha sido descrito hasta la
fecha, rs2240017, que codifica para un reemplazo de histidina 33 con glutamina
(H33Q). Evaluamos los roles de este SNP en la respuesta teraputica con
corticoesteroides inhalados en nios incritos en el Programa de Manejo de Asma de la
Infancia (CAMP, Childhood Asthma Management Program). El diseo de estudio de
CAMP permiti investigar esta asociacin farmacogentica con estos nios
aleatorizados para corticoesteroides inhablados y entre el grupo de corticoesteroides,
y esos no aleatoirzados para corticoesteroides. Aqu se demuestra una interaccin
sgnificativa entre H33Q y corticoesteroides inhalados, uso que resulta en una mejora
de la sensibilidad de la va area a niveles no asmticos. Tambin otrogamos un
contexto para la funcin celular de H33Q y una razn para el uso de los trminos de
interacciopn en anlisis farmacogeticos.

Materiales y mtodos
Poblacin de estudio: El estudio CAMP es un estudio clnico multicntrico,
aleatorizado, doble-ciego, probando la seguridad y eficacia de budesonida inhalada
contra nedocromil, contra placebo sobre una media de 4.3 aos. El diseo de la
prueba y metodologa han sido publicadas (12, 13). CAMP inscribi a 1041 nios de 512 aos de edad con asma leve a moderado. Se recolect ADN de las familias
representando >700 probandas. En el criterio de inclusin se tomo en cuenta los
sntomas del asma y/o el uso de medicamentos >6 meses en los aos previos y una
va area sensible con PC20 >12.5 mg/ml.
La espirometra y prueba de metacolina fueron realizadas al menos 4 horass despus
del uso de un broncoldilatador de accin corta y 24 horas despus del ltimo uso de
un broncodlatador de accin larga. La espirometra fue realizada en un Collins SteadWells dry-seal Survey III. El espirmetro fue conectado a una computadora de
escritorio persona Dell y conoci o excedi los estndares de la Sociedad Americana
Torcica.
La sensibilidad de la va area fue determinada por pruebas de metacolina con la
tcnica de nebulizador de Wright despus de que el mtodo de Cockcroft et al. (14)
modificada para la administracin de metacolina y por Juniper et al. (15). La
metacolina sensitiva fue expresadda en tperminos de PC20 con la siguiente ecuacin:
PC20= antilog[logeC1 + (logeC2 logeC1)(20 R1)/(R2 R1)], donde C1 es de la
segunda a la ltima concentracin probada, C2es la pultima concentracines probada,
R1 es el porcentaje que decrece en FEV, por diluir despus C2Visitas de seguimiento con espirometra ocurran cada 2 a 4 meses y cada 4 meses de
ah en adelante. Los estudios de metacolina fueron realizados durante el periodo runin, a los 8 meses, despus anualmente. Nuestro enfoque primario fue en el CAMP
donde nios aleatorizados al grupo de corticoesteroides, fueron evaluados en su 1- y
4-aos de seguimiento para el cambio en el prebroncodilatador FEV, y en su cuarto

ao (44 meses) de visitas para diferencias en el PC20 de la lnea base. Estos puntos
de tiempo fueron elegidos porque la visita de 1 ao representada en el tiempo que el
mximo efecto de eesteroides fueron notados en el principal ensayo clnico (13) y las
visitas a 4 aos representadas en la ltima visita con el seguimiento casi completo. El
CAMP ancillary estudio de gentica fue aprobado por cada centro de estudio review
board, y consentimiento informado fue obtenido de todos los participantes y sus
padres.
Genotipado. El genotipado fue realizado usando el SEQUENOM MassARRAY MALDITOF plataforma de espectrometra de masa (Sequenom, San Diego). Cebadores
(primers)
fueron
diseados
usando
un
programa
semiautomtico
(SPECTRODESIGNER, Sequenom). Hemos usado un mtodo de extensipon muy
corto (16), donde secuenciando los productos son extendidos solo por una base de
tres o de cuatro nucletidos (representando uno de los alelos), permitiendo claramente
una delineada masa de separacin de las dos variantes allicas en un determinado
locus.
Para evaluar posibles estratificaciones de poblacin, tambin se genotipo un panel
aleatorio de 49 SNP a travs del genoma (17) obtenidos a travs de la base de datos
del consorcio SNP. SNPs fueron elegidos para excluir al gen propio (promotor, UTR
genmico, exones e intrones) de genes conocidos y ser distrubuido abiertamente a
travs del genoma. El control de calidad del genotipado consisti de al menos 90% de
llamadas exitosas, regenotipado de =10% de genotipos, y documentacin del equilibrio
Hardy-Weinberg para cada SNP.
Anlisis funcional de H33Q. Para investigar posibles consecuencias funcionales del
polimorfismo H32Q T-bet, que es el homlogo del raton para el H33Q humano,
usamos un kit de mutagnesis dirijida a sitio QuickChange para generar una T-bet
cDNA codificando una protena para la que el residuo de histidina en la posicin 32 es
reemplazado con glutamina. Wild-type (wt) T-bet o la versin H32Q de la T-bet fueron
cotransfecados dentro de clulas EL-4 con un gen informador promotor IFN- y un gen
informador -gal. Actividad relativa de luciferasa fue ensayada, estandarizada con
actividad -gal, y mostrada como induccin plegada. Tambin se prob la habilidad de
la H32Q versin de T-bet para controlar la produccin de citosina en clulas T
primarias tomando ventaja de los ratones T-bet deficientes (9). El wt y versiones
polimrficas de T-bet cDNAs fueron clonadas en un vector retroviral bicistronic (RV) y
el wt (RV-T-bet) y H32Q T-bet (RV-H32Q) retrovirus GFP fueron transducidos entre 24
36 horas dentro de clulas Th CD4+ aisladas del ndulo linftico T-bet -/-. Las
clulas fueron estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 y cultivado por 5 das ms bajo
condiciones no polarizantes. En el sexto da, las clulas fueron organizadas para
expresin de GFPy reestimuldas con anti-CD3; 24 hoaras despus, la expresin de wt
y H32Q T-bet fue medida por un anlisis Western blot y la produccin de citosina fue
evaluada por ELISA, de acuerdo al protocolo del fabricante (Pharmingen).
Efecto celular de corticoesteroides en expresin de T-bet. Clulas humanas tCD4
fueron aisladas desde sangre perifrica usando microperlas (Miltenyi Biotec) de CD4
humano. Estimulamos estas clulas CD4 con una placa unida anti-CD3 y anti-CD28
baj no polarizacin, y condiciones polarizantes de Th1 en presencia o ausencia de 10-7
M dexametasona. Relativos niveles de transcripcin gentica para T-bet humana
fueron medidos en tiempo real por RT-PCR. Como contro, medimos transcripciones
codificadas de IRF-4, un gen conocido regulado por esteroides. Por la rareza del alelo

menor de H33Q, clulas CD4 no humanas con variante 33Q estuvieron disponibles
para la examinacin.
Metodologa estadstica. El porcentaje de cambio en FEV1 fue definido como (FEV1
al final de un periodo FEV1 aleatorizado) / (FEV1 aleatorizado x 100). Valores de
PC20 fueron transformados a log antes del anlisis. Cambio en PC20 fue definido
como PC20 a 4 aos PC20 al inicio del ensayo. Valores medios geomtricos fueron
calclados usando la media exponenciada de la transformacin a log del PC20 en un
tiempo determinado.
Modelos de reegresipon linear fueron usados para evaluar la asociacin entre el
estado genotpico de H33Q y el resultado de inters. Anlisis univariantes y
mutivariablesajustados por edad, sexo y base FEV1 (como porcentade de prediccin)
fueron realizados. Se incorpor la altura dentro de los modelos multivariables
involucrando resultados FEV1. Para probar la interaccin entre tratamiento esteroideo
y H33Q estados genotipicos, incluimos terimnos de interaccin en los modelos.
Pruebas t de estudiantes fueron usadas para evaluar la comparatibilidad entre los
grupos de el nedocromil y placeboantes de su combinacin como un solo grupo no
esteroideo. Dado el pqueo nmero de individuos con el genotipo de inters, nuestro
anlisis primario fue repetido usando la prueba no paramtrica exacta Mann-Whitney
U. Adicionalmente, para considerar la naturaleza de individuos que exceden el lmite
mximo para dosis de metacolina, se usaron mtodos de sobrevivencia no
paramtricos incoroporados dentro de las curvas Kaplan-Meier y pruebas log-rank
para evaluar las diferencias en el PC20 durante el tiempo. Este procedimiento ha sido
demostrado de ser adecaudo para el anlisis de sensibildad de va area en estudios
basados en poblacin (18).
Anlisis de estratificacin de SNPs procedi en dos pasos. Primero, por cada SNP
individual, una prueba allica estadstica 2 fue obtenida en moda estndar usando
tablas de contigencia 2x2 que asignaron los totales de wt y variantes allicas para las
cualidades ms altas y mas bajas de FEV1 y log PC20 respuesta para cada cuatro
clulas. Un resumen total de pruebas estadsticas 2 fue obtenido sumando las
pruebas estadsticas individuales 2 y ajustando los grados de libertad al nmero de
pruebas. Todos los anlisis fueron realizados en SAS V.8 (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados
Caractersticas de poblacin y respuesta a corticoesteroides. De todos los nios
CAMP, 701 fueron genotipados exitosamente en H33Q y tuvieron datos para
resultados de inters; =30% fueron aleatorizados al grupo de corticoesteroides. Edad
base, gnero, distribucin tnica, FEV1, y PC20 fueron similares entre los grupos de
esteroides y no esteroides. Con el tiempo, la utilizacin de corticoesteroides fueron
asociados con mejoras significativas en FEV1 y PC20. No hubo diferencias
significativas entre nios aleatorizados con nedocromil o placebo (P=0.62 y 0.39 por 1
ao FEV1 y 4 aos PC20 cambio, respectivamente). Por lo tanto, estos nios fueron
combinados en un grupo no esteroideo ms grande.
Se confinaron anlisis a los nios cuyos padres se identificaron como caucsicos, por
preocupaciones sobre posile estratificacin de poblacin y las muestras pequeas de

otros grupos tinicos. En los nios caucsicos, no se encontr evidencia de

estratificacin de poblacin abierta (P>0.05 para cada uno de los tres resultados).
Asociacin de TBX221 con PC20 mejorado en el grupo de corticoesteroides la
menor (G) frecuencia de alelos para el TBX21 SNP que codifica glutamina, fue 4.5%
en el CAMP de caucsicos (n=24); se esperaron u observaron no homocigotos. El
SNP esaba en eqiulibrio Hardy-Weinberg.
Para nios con corticoesteroides inhalados, el cambio en PC20 log-transformado en 4
aos fue relativamente de distribucin normal, sugiriendo que factores otros del tipo de
tratamiento contribuyeron a esta respesta. H33Q fue presentda en cinco de estos
nios y fue significativamente asociado con este cambio en ambos, univariantes
(=2.97, P=0.0002) y multivariante (=3.03, P=0.0001) modelos. La media estimada
incremena en PC20 log-transformado en esteroides inhalados despus de 4 aos fue
=3.5-pliegamento, mas en los nios con variantes de glutamina comparados con los
homocigotos con wt histdina 33TBX21. H33Q no fue asociado con cambios de 1 ao o
4 aos en FEV1.
Para explorar estos descubrimientos, nuesto anlisis primario de nios con
corticoesteroides inhalados fue repetido usando el Mann-}whitney U test. En esta
comparacin no parametica, H33Q se mantuvo significativamente asociada con lso 4
aos log cambio PC.
Interaccin de tbx21 con corticoesteroides.

Caracteristicas funcionales de H32Q. Las versiones wt y H32Q (el homlogo en

ratn de H33Q humano) de T-bet son potentes transactivadores del gen de IFN-
medido/registrado/estudiado? Por la expression del gen reportador? Luciferasa (Fig.
5A), sin diferencias significativas observadas entre los dos. Posteriormente, probamos
la habilidad de la version H32Q de T-bey para controlar la produccin de citocinas en
clulas T primarias. T-bet -/- en clulas Th transducidas con retrovirus GFP como
control, produjeron cantidades muy bajas de IFN-y pero grandes cantidades de
citocinas Th2: IL-4, IL-5 e IL-3. Las clulas Thp con RV-T-bet (wt) transducido, como se
esperaba, produjeron grandes cantidades de IFN-y y exibieron una supresin
significativa de produccin de citocinas TH2. La version H32Q de T-bet fue igualmente
efectiva en estas funciones.
Inhibicin de T-bet por corticoesteroides. La correlacin entre poliformismos T-bet y
PC20 y la respuesta a la terapia esteroidea increment la posibilidad de que el
tratamiento con esteroides puedan controlar la expression de T-bet. Como observado
por otro, despus de estimular clulas CD4 humanas en la presencia o ausencia de
dexametasona, encontramos que los glucocorticoids inhibieron la induccin de T-bet.
Discusin
Nuestros resultados demuestran que un SNP no-sinnimo? En el gen TBX21 mejora
sustancialmente los efectos del uso de corticoesteroides inhalados en la respuesta de
va area de nios asmticos. Los 33 transportadores de glutamine aleatorizados para
corticoesteroides demostraron una mejora sustancial en PC20 a travs del tiempo, con
un promedio de valor en rangos normales para no asmticos al final del studio. Estos
hallazgos son consistentes con ambas asociaciones conocidas del uso de
corticosteroids con la mejora en PC20 y la biologa conocida de TBX21. An ms, la
asociacin farmacogentica reportada representa una verdadera interaccin genticaambiental respect a que el cambio notado en sujetos que poseen ambas variantes
genticas de interes y tratamiento de inters fue considerablemente mayor que el
respresantado por la variacin gentica, efecto del tratamiento o la combinacin de los
efectos aislados.
TBX21 es un miembro de la familia de genes de la caja-T, una serie filogentica de
series ancestrales de factores de transcripcin caracterizados por una gran
conservacin de dominio de sitio de union de AND. T-bet fue primeramente descrito
por Szabo et al., como un factor de transcripcin responsible por el compromise de
clulas Th vrgenes al linaje Th1. Especficamente, T-bet induce la produccin de INF-y
y suprime IL-4 e IL-5. Alterando el balance en una edad temprana de predominio de
linfocitos Th1 sobre Th2 y puede aumentar el riesgo del nio para enfemedades
atpicas, incluyendo asma: la llamada Hiptesis de la higiene. Dado que T-bet puede
incrementar el desarrollo de clulas Th1 y se expresa en pulmn, se ha postulado e
investigado un rol de TBX21 en la patognesis del asma. Vas areas humanas de
sujetos asmticos demuestran un nmero disminuido de clulas T CD4 + expresando
TBX21 comparados con controles. Deleciones del gen TBX21 en ratones ha rsultado
en hiperreactividad de la va area. Las vas areas de ratones con TBX21 tambin ha
demostrado eosinophilia aumentada y remodelamiento. Dado que PC 20 es una medida
de hiperreactivdad de va ara que est relacionada con el grado de eosinophilia
pulmonary y remodelamiento a travs del tiempo, nuestra asociacin farcogentica
con TXB21 y PC20 a travs del tiempo, es biolgicamente relevante y plausible.
Consistente con nuestra asociacin, nuestros moedelos celulares indicaron que H33Q
potencialmente activa la expression de IFN-y, incrementa la produccin de citocinas
Th1 y disminuye la de Th2.

En CMP, empeoramiento de la hiperreactividad de va area, como se manifiesta por

disminucin en PC20, se asoci a dimisnucin de funcin pulmonary, eosinophilia
incrementada, e incremento de sntomas de asma as como su duracin y severidad.
El uso de corticoesteroides inhalados mejora la inflamacin de vas areas,
hiperreactividad, obstruccin y sntomatologa clnica en asma. El mejoramiento de
PC20 en CAMP en el brazo(tratamiento?) ha sido documentado y se refleja en nuestros
resultados (Tabla 1 y Fig 2). Sin embargo, repotamos una mejora significativa de cada
uno de los sujetos con corticoesteroides y la variante H33Q, comparado con el uso de
esteroides inhalados con el genotipo wt solamente. Aunque el mecanismo biolgico
exacto por el cual tan fuerte efecto de esta modificacin gentica an espera ser
elucidado, despus de la administracin de corticoesteroides orales, especmenes de
biopsia bronquial de pacientes asmticos demostr que una reduccn de la expression
de ARNm de IL-4 e IL-5 y un incremento de la expression de ARNm de IFN-y. Como se
demostr, la transduccin de TBX21 H33Q se paralela con los cambios en citocinas
resultando precisamente del uso de corticoesteroides. Aunque hubieramos podido
esperar que los esteroides incrementaran la expression de T-bet concordando con su
habilidad para aminorar el asma, nuestros indicaron que la examinacin de la
expresin gnica en vitro no se aproxima necesariamente a la situacin in vivo.
Adicionalmente, las clulas con la variante H33Q pueden responder diferentemente a
la administracin de corticoesteroides exgenos.
Una limitacin potencial de nuestro studio es el tamao de la muestra. Aunque el
tamao de nuestra muestra es razonable por las pruebas de relativamente communes
alelos, la frecuencia menor de alelo fue de solo 4.5% para H33Q, y no observamos
ningn allele homocigoto menor. Interesantemente, TBX21 heterocigoto de ratn
demosntr las mismas caractersticas fenotpicas que ratones homocigotos,
incluyendo el desarrollo espontneo de hiperreactividad de va area, lo que sugiere
que incluso cambios ligeros en la expresin gnica, tal como en H33Q heterocigotos,
puede contriubir a una expresin fenotpica alterada y es consistente con nuestra
asociacin observada. Adems, sentimos que la fuera de la asociacin entre el grupo
que utiliz esteroides, la demonstracin de que una verdadera interaccin gnicaambiental y la plausibildiad biolgica, apoyan fuertemente la validez de nuestros
hallazgos.
En conclusin, nuestros hallazgos de una mejora genotpica-especfica de TBX21 en
la respuesta de la va area entre asmticos que usan corticoesteroides inhalados
provee pautas de entendimiento de la terapia del asma y puede permitir la
identificacin de al menos un pequeo grupo de individuos con asma que podran
beneficiarse con esta forma de tratamiento. Estudios de replicacin deberan
enfocarse en la interrogante de PC20 en una cohort ms grande de asmticos usando
corticoesteroides inhalados durante un period de tiempo relativamente ms croto.
Estos resultados tambien pueden ser pertinentes a las numerosas enfermedades
tratadas con corticoesteroides y el nmero increntante de enfermedades en los que se
cree que T-bet juega un rol. Finalmente, nuestra desmostracin de una interaccin
gnica-ambiental prove una aproximacin estadstica alternative hacia la elucidacin
de lo que compromete un verdadero efecto farmacogentico. La interaccin formal
debera ser considerada cuando el resultado primario de interes sea medido y segn
como vara en el tiempo ya sea como un resultado de la intervencin teraputica o
como parte de la historia natural de la enfermedad subclnica.