MOD 1 FERRAMENTAS DE GENTICA MOLECULAR: MANIPULAO DO D A

1.1. Composio Qumica e Estrutura do D A:

Nas molculas de DNA os componentes so: acar (desoxirribose), bases
nitrogenadas (Purinas: adenina e guanina/ Pirimidinas: timina e citosina) e grupo
fosfato. As bases nitrogenadas ligam-se ao carbono 1 do acar, por ligao
covalente. Um acar mais uma base ligada a ele constituem um nucleosdeo. Um
nucleosdeo com um grupamento fosfato ligado ao seu carbono 5 constitui um
nucleotdeo, que a unidade bsica de repetio dos cidos nuclicos.
Para a formao da molcula de DNA necessrio que ocorra a ligao entre os
nucleotdeos. Os nucleotdeos esto ligados covalentemente por ligaes fosfodister
formando entre si pontes de fosfato (figura). O grupo hidroxila do carbono-3 da
pentose de um nucleotdeo se liga ao grupo fosfato ligado ao carbono-5 da pentose do
nucleotdeo adjacente atravs de uma ligao fosfodister. Devido a esta formao a
cadeia de DNA fica com uma direo determinada, isto , em uma extremidade temos
livre a hidroxila do carbono-5 da primeira pentose e na outra temos livre a hidroxila do
carbono-3 da ltima pentose. Isto determina que o crescimento do DNA se faa na
direo de 5' para 3'
Visualizao da ligao fosfodister entre os nucleotdeos de uma molcula de DNA.

A molcula do DNA formada pela unio de duas cadeias helicoidais, enroladas ao

longo de um mesmo eixo, formando uma dupla hlice. As duas fitas de DNA esto em
direo opostas, ou seja, uma das fitas tem a direo exata da sua sntese (5' 3')
enquanto que a outra est invertida (3'5'). Com base na estrutura de dupla hlice do
DNA e nas caractersticas de hidrofobicidade das molculas, a estrutura do DNA fica
da seguinte forma:
O grupo fosfato e o acar (parte hidroflica) - esto localizados na parte externa da
molcula.

 As bases nitrogenadas (parte hidrofbica) - esto localizadas na parte interna da

molcula.
O pareamento das bases de cada fita se d de maneira padronizada, sempre uma
purina com uma pirimidina, especificamente: adenina com timina e citosina com
guanina. A proximidade destas bases possibilita a formao de pontes de hidrognio,
sendo que adenina forma duas pontes de hidrognio com a timina e a citosina forma
trs pontes com a guanina. A dupla hlice mantida unida por duas foras:
Por pontes de hidrognio formadas pelas bases complementares
Por interaes hidrofbicas, que foram as bases a se "esconderem" dentro da dupla
hlice.
1.2. Propriedades do D A: 1.2.1. Desnaturao do D A:
Em temperaturas elevadas, as estruturas tridimensionais tanto das protenas quanto
dos cidos nucleicos so rompidas. Uma macromolcula em um estado rompido, no
qual sua conformao praticamente aleatria, dita DESNATURADA; o estado
ordenado, que supostamente o originalmente presente na natureza, chamado de
NATIVO. Uma transio do estado nativo para o desnaturado chamada de
DESNATURAO. Quando uma dupla hlice de DNA ou DNA nativo aquecida, as
focas das ligaes dentro dos filamentos e entre eles so rompidas, e os dois
filamentos podem se separar. Assim, o DNA desnaturado unifilamentar.
A desnaturao do DNA pode ser detectada atravs da observao do aumento da
habilidade de uma soluo de DNA em absorver a luz ultravioleta, no comprimento de
onda de 260nm. Uma medida-padro de tal absoro a proporo logartmica de luz
transmitida e luz incidente chamada de
ABSORBNCIA A; em 260nm, isto escrito A 260 . As bases dos cidos nucleicos
absorvem fortemente luz 260nm, e a quantidade de luz absorvida por um determinado
nmero de bases depende de sua proximidade uma da outra. Quando as bases ao
altamente ordenadas (muito prximas umas das outras), como no DNA bifilamentar, A
260 menor que a para o estado menos ordenado no DNA unifilamentar. Em
particular, se uma soluo de DNA bifilamentar tem um valor de A 260 = 1,0; uma
soluo de DNA unifilamentar na mesma concentrao tem um valor de A 260 = 1,37.
Esta relao geralmente descrita, dizendo que uma soluo de DNA bifilamentar
torna-se HIPERCRMICA quando aquecida. O valor correspondente para bases livres

 1,60, de modo que a absorbncia tambm pode ser utilizada para medir a
degradao dos cidos nucleicos.
Se uma soluo de DNA lentamente aquecida, e A 260 medida em vrias
temperaturas, obtida uma curva de dissociao. Nesta curva possvel verificar
diferentes estgios: (1) Antes que a subida comece, a molcula totalmente
bifilamentar; (2) Na regio da subida, os pares de bases de vrios segmentos da
molcula so rompidos. Este nmero varia gradualmente; (3) Na parte inicial do plat
superior, alguns pares de bases ainda permanecem unidos at que uma temperatura
critica seja atingida, na qual o ltimo par de bases se rompe e os dois filamentos se
separam completamente. Durante a dissociao toas as ligaes covalentes, incluindo
as fosfodister, permanecem intactas. Apenas as pontes de hidrognio e as interaes
de empilhamento so rompidas. Um parmetro conveniente para caracterizar uma
transio de dissociao a temperatura na qual a subida de A 260 a metade
completa. Esta temperatura chamada de TEMPERATURA DE DISSOCIAO;
designada como Tm .
Um grande nmero de informaes obtido observando como a T m varia com a
composio de bases e condies experimentais. Por exemplo, foi observado que a T
M aumenta com a porcentagem de G + C, que foi interpretada em termos do maior
nmero de pontes de hidrognio em um par G-C
(trs) do que um par A-T (duas). Isto , necessria uma temperatura mais alta (mais
energia) para romper uma dupla C-G do que uma A-T, porque a estrutura da dupla
hlice est estabilizada, pelo menos em parte, por pontes de hidrognio.
1.2.2. Renaturao do D A:
Uma soluo de DNA desnaturado pode ser tratada de tal modo que o DNA nativo
reconstitudo. Este processo chamado de RENATURAO ou REELICOIDIZAO,
e o DNA reconstitudo chamado de DNA RENATURADO.
Aps a desnaturao, a soluo de DNA composta de uma mistura de filamentos
essencialmente unifilamentares. Para se renaturar, o fragmento deve encontrar seu
parceiro complementar na soluo. Se as concentraes do fragmento e de seu
parceiro complementar na soluo forem baixas, eles levaram muito mais tempo para
se encontrar um com o outro do que se os fragmentos estiverem em altas
concentraes. A renaturao pode ser acompanhada observando a absorbncia da
soluo a 260nm, pois durante a renaturao as bases se organizam e a A 260 ir
diminuir como tempo. A velocidade de diminuio a taxa de renaturao, que est

relacionada concentrao de fragmentos individuais na soluo (Co ). Isto significa

que o
DNA resfriado sofre renaturao, mas a freqncia de reassociao depende no
apenas do tempo (t) mas tambm da concentrao inicial (Co) de uma dada seqncia
(Cot). O valor de A 260 na soluo pode ser usado para avaliar a concentrao geral
de DNA. A cintica de renaturao oferece um instrumento poderoso para a anlise da
presena de seqncias repetidas em uma amostra. O resultado desta anlise permite
avaliar qualitativamente a soluo de DNA, ou seja, a presena de vrias seqncias
de DNA: (1) seqncia de cpia nica (levam mais tempo para renaturar); (2)
levemente repetidas (1 a 10 cpias); (3) medianamente repetidas (10 a vrias
centenas de cpias); e (4) altamente repetitivas (vrias centenas a vrios milhes de
cpias).
1. 2.3.Hidrlise de cidos nuclicos:
Uma variedade de enzimas chamadas de NUCLEASES hidrolisa os cidos nuclicos.
Elas em geral apresentam especificidade qumica e so classificadas como
desoxirribonucleases (DNAse) ou ribonucleases (RNAses). Alm disso, as nucleases
que atuam apenas na ponta de um cido nuclico, removendo um s nucleotdeo por
vez, so chamadas de EXONUCLEASES, e tambm podem ser especficas para as
pontas 3 ou 5do filamento. A maioria das nucleases atua dentro do filamento e so
denominadas de ENDONULCEASES; algumas delas so ainda mais especficas, pois
cortam apenas entre determinadas bases.
1.3. Tipos de D A:
DNA cpia nica referem-se a seqncias de DNA que so encontradas apenas
uma vez (ou possivelmente poucas vezes) no genoma. O DNA de cpia nica
compreende cerca de 45% do genoma, e inclui os genes que codificam protenas.
Entretanto, o DNA que codifica protena representa apenas uma pequena proporo
de todo o DNA de cpia nica, a maior parte do qual encontrado em ntrons ou em
seqncias de DNA situadas entre os genes.
DNA repetitivo 5% do genoma consistem em DNA repetitivo, que so seqncias
que aparecem de modo repetido no genoma. Existem duas classes principais de DNA
repetitivo:
o DNA repetitivo disperso (45% do genoma) tendem a estar espalhadas
individualmente por todo o genoma; elas no ocorrem em tandem. Uma caracterstica

marcante das seqncias LINE e SINE, que algumas delas podem gerar cpias de si
mesmas, as quais podem ento ser inseridas em outras partes do genoma. Essa
insero pode, algumas vezes, interromper um gene codificante de uma protena,
causando um distrbio gentico.
Elementos intercalantes curtos ou SINEs variam em tamanho de 90 a 500pb. Um
dos tipos mais importantes de SINEs denominado repetio Alu. Essas unidades
repetitivas, que medem ~300pb, contm uma seqncia de DNA que pode ser cortada
pela enzima de restrio Alu.
Elementos intercalantes longos ou LINEs variam em tamanho em at 7.000pb.
o DNA satlite (10% do genoma) apresentam-se agrupadas em certos locais do
cromossomo, onde ocorrem em tandem (isto , o comeo de uma repetio encontrase imediatamente adjacente ao final da outra). O DNA minissatlite e microssatlite
so de especial interesse para a gentica humana porque variam em comprimento
entre os indivduos, o que os torna extremamente teis para o mapeamento gnico.
DNA -satlite repeties em tandem de uma seqncia de 171pb ou mais, situadas
prximo aos centrmeros. DNA minissatlites repeties em tandem de uma
seqncia de 4 a 500pb. DNA microssatlite repeties em tandem de seqncias
com 2-4pb de comprimento.
1.4. Replicao do D A:
Durante o processo de sntese do DNA (replicao do DNA), as duas fitas de DNA de
cada cromossomo so desenroladas pela enzima helicase, e cada uma deles dirige a
sntese de uma fita complementar a si. Disso resultam dois dplices de DNA filhos,
cada um dos quais idntico molcula parental. Como cada dplice filho contem
uma fita da molcula parental e outra recm-sintetizada a partir dele, diz-se que o
processo de replicao semiconservativo. A enzima DNA polimerase catalisa a
sntese de novas fitas de DNA usando os quatro desoxinucleotdeos trifosfatados
(dATP, dCTP, dTTP, dGTP) como precursores de nucleotdeos.
A replicao do DNA inicia em pontos especficos, que so denominados origens de
replicao. Iniciando em uma dessas origens, o comeo da replicao do DNA resulta
em uma forquilha de replicao em que o duplex de DNA parental se bifurca em dois
novos dplices-filho. Como as duas fitas do duplex parental de DNA possuem
polaridades opostas, mas agem individualmente como moldes para a sntese de uma
fita-filha antiparalela complementar, as duas fitas-filhas tambm devem ter direes

opostas (i.e., a direo do crescimento da cadeia tem de ser 5 3 para uma das
fitasfilhas, a fita lder; e 3 5 para a outra fita-filha, a fita de crescimento lento).
As reaes catalisadas pela DNA polimerase incluem a adio de substrato de dNMP,
fornecido pelo dNTP precursor (os dois resduos distais de fosfatos do dNTP (resduos
e ) so clivados e descartados), ao grupamento livre hidroxila 3da cadeia de DNA
crescente. Esse requisito introduz uma assimetria no processo de replicao do DNA:
somente a fita lder possuir o grupamento 3-OH livre no ponto de bifurcao. Isso lhe
permitir uma adio continuada de nucleotdeos e um alongamento contnuo na
mesma direo em que a forquilha de replicao se move. A sntese da fita
descontnua, porm precisa ser realizado por meio de uma srie progressiva de
pequenos fragmentos (100 a 1.0 nucleotdeos de comprimento), denominados
fragmento de Okazaki. Uma vez que s a fita-lder sintetizada de forma contnua,
diz-se que a sntese das fitas de DNA semidescontnua. Cada fragmento da fita
atrasada sintetizado na direo 5 3, que oposta direo em que se move a
forquilha de replicao> As extremidades dos fragmentos, que so sintetizados em
sucesso, ligam-se covalentemente, sendo que a enzima DNA-ligase garante o
crescimento da cadeia na mesma direo do movimento da forquilha de replicao.
Nos cromossomos de mamferos, a replicao do DNA bidirecional, formando-se
bolhas de replicao a partir dos mltiplos pontos de iniciao. A distncia entre
origens de replicao adjacentes de cerca de 50 a 300kb. O incio da replicao do
DNA, na fase S do ciclo celular, d-se em momentos diferentes nas diversas origens,
mas, eventualmente, bolhas de replicao adjacentes podem fundir-se.
Enzimologia da replicao do DNA
Incio da Replicao (Primossoma): o Topoisomerase (DNA girase > desenrola o DNA)
o Helicase (separa as fitas do DNA) o SSBP (ptn que se liga ao DNA fita simples e
serve para estabiliz-lo) o RNA Primase (faz primer com ~30 nucleotdeos)
Alongamento - Replissoma (sntese no sentido 5>3): o PCNA (Proliferating Cell
Nuclear Antigen) liga-se as DNAs polimerases; o DNA polimerase - DNA polymerase
- sntese e iniciao da fita atrasada
- DNA polimerase - reparo do DNA
- DNA polimerase - sntese da fita lder e atividade 3> 5 exonuclease

- DNA polimerase - reparo do DNA e atividade 3> 5 exonuclease o Nucleotdios

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) o Fita de crescimento contnuo no sentido (5> 3) o Fita de
crescimento lento no sentido 3> 5 Fragm. de Okazaki.
Trmino: o Nucleases reparadoras retiram os seguimentos de primer; o DNA
polimerase b - reparo no DNA e preenchimento de brechas o DNA ligase une trechos
de DNA; o Telomerase sntese dos telmeros.
1.5. Ferramentas da Gentica Molecular Humana para Triagem de Mutaes:
Um dos principais objetivos da gentica molecular humana moderna caracterizar as
variaes polimorficas envolvidas com o desenvolvimento de doenas genticas, para
compreender o modo pelo qual estas mutaes afetam a sade e utilizar esta
informao para melhorar o seu diagnstico e tratamento. Os avanos na nossa
compreenso da gentica molecular levaram ao desenvolvimento de tecnologias, que
possibilitam uma anlise detalhada tanto dos estados normal e anormal dos genes
quanto da expresso de milhares de genes nos estados normal e patolgico.
1.5.1. Hibridizao em Southern Blot:
Nesta aplicao, o DNA genmico fragmentado utilizando-se enzimas de restrio e
os fragmentos so separados por eletroforese em gel de agarose de alta resoluo.
Posteriormente os fragmentos de DNA so transferidos a uma membrana de nylon e
hibridizados com sondas marcadas que contem seqncias complementares ao loco
gnico a ser estudado. Os fragmentos hibridizados so identificados por
autorradiografia ou outro sistema de deteco. As aplicaes desta tcnica so: (1)
deteco direta de mutaes pontuais patognicas por mapeamento de restrio; (3)
deteco de RFLP convencionais; (3) deteco de VNTR; (4) deteco de
delees/inseres gnicas por mapeamento de restrio.
1.5.2. Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturao (DGGE):
A triagem de mutaes por DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) um
mtodo no qual a dupla fita de DNA submetida eletroforese em gel de
poliacrilamida em que utiliza um gradiente de agente desnaturante (uria ou
formamida) ou de temperatura. Nestas condies, ocorre a separao das molculas
de DNA de acordo com sua temperatura de desnaturao ou Tm, em segmentos
denominados domnios. A dissociao das fitas de DNA em tais domnios resulta em
diminuio da mobilidade eletrofortica. A diferena de 1 par de bases entre as fitas de
DNA (homoduplex) pode alterar a temperatura de desnaturao em 1 C ou mais. A

falta de complementaridade de bases entre as fitas de DNA (heteroduplex) leva a

significante desestabilizao desses domnios, resultando em diferenas na Tm entre
homo e heteroduplex acima de 6 C. Por esta razo, heteroduplex formadas entre
fragmentos de alelos comuns e mutantes so geralmente utilizados para a triagem de
mutaes de ponto. Para deteco no DGGE, os produtos da PCR so marcados com
substncias radioativas. Atualmente, esse sistema foi substitudo por colorao dos
produtos com brometo de etdeo ou nitrato de prata. O tamanho do produto da PCR
submetido ao DGGE de aproximadamente 1000 pares de bases. Com o aumento do
nmero de domnios, a mobilidade diminui, por isto, a frao de mutaes detectadas
diminui com o aumento do tamanho do fragmento.
1.5.3. Polimorfismo de Conformao de Fita Simples (SSCP):
O SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) um mtodo de triagem de
mutaes que permite detectar alteraes na mobilidade eletrofortica de fitas simples
de cidos nuclicos em condies no-desnaturantes. As fitas simples de cidos
nuclicos formam estruturas secundrias em soluo que dependem da
composio/seqncia de bases e do tamanho da fita simples. Mudana em uma base
na seqncia do cido nuclico amplificado pela PCR pode ser detectada por SSCP.
Os perfis de SSCP podem ser detectados por autorradiografia marcando-se os
produtos da PCR com substncias radiativas. Atualmente so utilizados os sistemas
de deteco por colorao dos gis de eletroforese com nitrato de prata.
As mutaes detectadas por SSCP devem ser confirmadas por sequenciamento de
DNA. A sensibilidade de deteco de mutaes por SSCP maior quando os
tamanhos dos produtos da PCR so de 150 a 200 pb, e em condies timas, 80 a
90% de mutaes so detectveis.
1.5.4. Polimorfismo de Tamanhos de fragmentos de Restrio (RFLP):
O RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphysm) um mtodo que utiliza
enzimas de restrio para deteco de polimorfismos genticos. As enzimas de
restrio reconhecem stios especficos na seqncia do DNA que clivada somente
quando o stio est presente, gerando fragmentos de vrios tamanhos que so
separados e analisados por eletroforese. Quando as mutaes ou polimorfismos no
esto presentes em stios de restrio, podem ser criados stios artificiais utilizando-se
oligonucleotdeos modificados na PCR. Esta estratgia denominada mutagenese
sitio-dirigida mediada pela PCR. Os fragmentos gerados no RFLP podem ser
detectados por eletroforese e transferncia de DNA como o Southern blot. No caso
da PCR-RFLP, os fragmentos so separados por eletroforese em gel de agarose ou

acrilamida e detectados diretamente pela colorao com brometo de etdeo ou outro

corante fluorescente como o SYBR Green ou ainda por colorao com nitrato de prata.
A especificidade do mtodo de 100% quando a enzima de restrio apropriada
utilizada. Para o controle de qualidade, amostras de DNA contendo alelos mutantes e
comuns devem ser includos na anlise.
1.5.5.N mero Varivel de Repeties em Tandem (V TR):
Os VNTRs, um enfoque similar ao usados para os RFLPs convencionais, visa explorar
os minissatlites existentes no genoma. O DNA digerido com uma enzima de
restrio, e os fragmentos so submetidos a eletroforese. A diferena principal que
sondas especiais so usadas para se hibridizar apenas com uma determinada regio
de minissatlite. Enquanto que os RFLPs revelam polimorfismos devido a presena ou
ausncia de um stio de restrio, os VNTRs revelam polimorfismos devido a nmeros
diferentes de repeties situadas entre dois stios de restrio. O numero destas
repeties pode variar consideravelmente nas populaes: uma regio de minissatlite
pode ter apenas duas ou trs repeties, ou at 20 ou mais.
Do mesmo modo que as regies de minissatlites podem variar de tamanho, os
microssatlites tambm podem variar em comprimento como resultado de nmeros
diferentes de repeties. Cada repetio de microssatlite substancialmente menor
que uma repetio de minissatlite (2-4pb). Elas so chamadas de repeties de
dinucleotdeos, trinucleotdeos e tetranucleotdeos, respectivamente. Uma repetio de
microssatlite pode ocorrer em tandem at vrias centenas de vezes, e este nmero
varia consideravelmente entre as pessoas. Estes polimorfismos de repetio de
minissatlites diferem dos VNTRs em termos de seus tamanhos, e tambm porque
no so definidos por stios de restrio que flanqueiam a regio de repetio. A
tcnica de PCR usada para isol-las.
1.5.6. PCR-HRM (melt de alta resoluo):
A anlise de melt de alta resoluo (HRM) um aprimoramento das antigas anlises
de dissociao de DNA (ou melting). Este tipo de anlise usado para
caracterizao de amostras de DNA de acordo com seus comportamentos de
dissociao durante sua transio de DNA dupla fita para DNA fita simples com o
aumento da temperatura (Figura).
Fundamentos de um grfico de HRM tpico. A curva de melt (verde) ultrapassa a
transio entre alta fluorescncia da fase inicial (pr-melt) atravs da fase de melt
(melt phase) para nveis de baixa fluorescncia at a basal da fase ps-melt. A

fluorescncia diminui medida que o corante intercalante liberado do DNA duplafita

enquanto este se dissocia em fitas simples. O ponto central da fase de melt, no qual a
proporo de mudana de fluorescncia maior, define a temperatura de melting (TM)
de um determinado fragmento de DNA em estudo.

Antes de realizar uma anlise de HRM, uma seqncia alvo deve ser amplificada por
meio de PCR na presena de um corante intercalante a DNA dupla fita. O corante no
interage com DNA fita simples mas se intercala ativamente ao sulco menor do DNA e
fluoresce fortemente quando assim ligado.Essa mudana na fluorescncia pode ser
usada primeiramente para medir o aumento da concentrao do DNA durante a fase
de amplificao pr-HRM e depois sim, para medir a dissociao do DNA induzida por
temperatura (HRM).Inicialmente a fluorescncia alta em uma anlise de melt porque
o DNA est na forma de dupla hlice, entretanto, essa comea a decair a medida que
a temperatura aumentada e o DNA se dissocia em fitas simples. O comportamento
de melting observado caracterstico de cada amostra de DNA em particular.
O mtodo de PCR-HRM pode ser usado para: detectar variaes de base nica tais
como SNPs (single nucleotide polymorhphisms) ou descobrir mutaes genticas
desconhecidas, identificar genes candidatos de pr-disposio, estudos de associao
(comparando casos e controles, gentipo fentipo), determinao de prevalncia de
alelos dentro de uma populao ou grupo, anlises de metilao de DNA, entre outros.
1.5.7. Arranjos de DNA por PCR em Tempo Real:
As anlises das atividades gnicas e a identificao de mutaes e polimorfismos so
realizadas de forma sistematizada usando o princpio da hibridizao de DNA. As
seqncias de genes que contem mutaes conhecidas so fixadas na matriz de vidro
(sondas de captura). Produtos da PCR so gerados utilizando-se iniciadores
especficos marcados com fluorforos. A seguir os produtos da PCR so hibridizados
com as sondas capturadas na matriz de vidro e os arranjos de sinais fluorescentes so
medidos utilizando-se um sistema ultra-rpido de deteco de fluorescncia e a
intensidade de cada ponto determinada. A localizao do ponto associado com a sua
intensidade determina a seqncia e a quantidade de material presente na amostra.
Estes dados so processados por programas sofisticados de computadores que
possibilitaro a anlise refinada dos resultados. A possibilidade de se colocar milhares

de seqncias em uma nica lmina de arranjo possibilita a obteno de informaes

do genoma inteiro em um nico ensaio, identificando milhes mutaes e
polimorfismos simultaneamente. Comercialmente j esto disponveis, em bioships,
conjuntos de polimorfismos e ou mutaes para fins de estudos farmacogenticos do
sistema citocromo P450 para cada grupo de frmacos potencialmente importantes,
assim como para diagnstico de alteraes genticas de utilidade teraputica na
clinica mdica.
1.5.8. Sequenciamento do DNA pelo mtodo dideoxi ou enzimtico:
O mtodo dideoxi para sequenciamento de DNA baseado na sntese in vitro de uma
fita de DNA complementar, realizado na presena dos dideoxinucleotdeos trifosfatos,
derivados dos deoxinucleotdeos trifosfatos normais que no tm o grupo hidroxil 3.
O protocolo bsico consiste em sintetizar in vitro molculas de DNA a partir de uma
mistura contendo: (1) molculas de fitas simples do DNA a ser seqenciado; (2) a
enzima DNA polimerase; (3) um iniciador curto de DNA, que permite que a DNA
polimerase inicie a sintese de DNA, e (4) os quatro deoxinucleotdeos trifosfatos
(dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Se um dideoxinucleotdeo (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)
tambm est presente na reao de sequenciamento, ele pode ser incorporado em
uma cadeia crescente de DNA. Como esta cadeia agora no tem o grupo OH 3, a
adio do prximo nucleotdeo bloqueada, e a cadeia de DNA termina neste ponto.
O ddNTP compete com o excesso de dNTP presente no tubo de reao, de maneira
que o ddNTP incorporado de maneira aleatria , em uma fita de DNA crescente.
Essa mistura ir produzir, eventualmente, um conjunto de DNAs de diferentes
comprimentos, complementares ao DNA-molde que est sendo seqenciado e
terminando em cada um dos seus diferentes ddNTPs. O comprimento exato dos
produtos de sntese de DNA pode ser utilizado para determinar a posio de cada um
dos quatro tipos de nucleotdeos na cadeia crescente.
Para determinar a seqncia completa de um fragmento de DNA, o DNA fita dupla
primeiramente separado em fita simples, e uma das fitas utilizada como molde para
o sequenciamento. Quatro ddNTPs so utilizados em quatro reaes de sntese de
DNA separadas com cpias da mesma fita simples de DNA molde. Cada reao
produz um conjunto de cpias de DNA que terminaram em pontos diferentes na
seqncia. Os produtos dessas quatro reaes so separados por eletroforese em
quatro canaletas paralelas de um gel de poliacrilamida. Os novos fragmentos
sintetizados so detectados por um marcador (radioativo ou fluorescente) que foi
incorporado no iniciador ou em um dos deoxinucleotdeos trifosfatos utilizados para
estender a cadeia de DNA. Em cada canaleta, as bandas representam os fragmentos

que foram terminados em um dado nucleotdeo, mas em diferentes posies no DNA.

Fazendo a leitura das bandas em ordem, iniciando no final do gel e trabalhando
atravs de todas as canaletas at o topo, a seqncia de DNA da nova fita sintetizada
poder ser determinada. A seqncia idntica da fita 5-3da molcula de DNA fita
dupla original.
Sequenciamento Automtico do DNA
O sequenciamento automtico utiliza o princpio bsico do mtodo de Sanger e seus
ddNTPs terminais de reao. O maior avano relacionado ao sequenciamento
automtico a utilizao do laser e programas de computadores especficos que
permitem a deteco e identificao dos vrios fragmentos de DNA que so
produzidos. Alm disso, cada ddNTP marcado com uma molcula fluorescente, que
quando excitada pelo laser, emite uma fluorescncia em comprimentos de onda
especfico para cada uma das quatro bases. Dessa forma, no h a necessidade de
fazer quatro reaes independentes para cada fragmento de DNA a ser seqenciado,
uma vez que cada ddNTPs emite fluorescncia com comprimento de onda especfico,
os quatro ddNTPs podem ser misturados na mesma reao e o sequenciador detecta
o sinal que analisado por programas especficos de bioinformtica resultando na
seqncia de DNA.
MDULO 2 - EXPRESSO E REGULAO DA EXPRESSO GNICA: MANI
PULAO DE RNA E PROTENAS
2.1. Estrutura e Tipos de RNA:
O RNA uma molcula unifilamentar formada por ribose, grupo fosfato e quatro tipos
de bases nitrogenadas. Os diferentes tipos de molculas de RNA, existentes no
interior da clula, podem ser agrupados de acordo com a sua funo:
RNA transportador (tRNA): molcula responsvel por transportar aminocidos,
dispersos no citosol, para o ribossomo. Cada molcula de tRNA apresenta uma
extremidade que se liga a diferentes tipos de aminocidos e uma regio com uma
seqncia de trs nucleotdeos, o anticdon, que pode parear com um dos cdons do
RNAm;
RNA ribossomal (rRNA): molculas, que juntamente com protenas ribossmicas,
formam as sub-unidades ribossomais; RNA mensageiro (mRNA): molcula
responsvel por levar a informao gentica contida no DNA para ser traduzida em

protena; RNA nuclear de pequeno tamanho (snRNA): atuam no processamento do

mRNA; Micro RNA (miRNA): VERIFICAR A SUA FU O
2.2. Transcrio do RNA:
De modo geral, em todas as clulas, a expresso da informao gentica um
sistema de uma via: o DNA especifica a sntese do RNA e o RNA especifica a sntese
de polipeptdios que, subseqentemente, formam as protenas. Por sua
universalidade, o fluxo DNARNAPTN da informao gentica descrito como
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR. O primeiro passo, a sntese de RNA,
por meio de uma RNA- polimerase dependente de DNA, descrito como
TRANSCRIO e ocorre no ncleo das clulas eucariticas. O segundo passo, a
sntese de polipeptdios, descrito como TRADUO e ocorre nos ribossomos.
Embora o DNA seja o material hereditrio de todas as clulas atuais, muito provvel
que, nos primrdios da evoluo, o RNA tenha exercido tal funo. As molculas de
RNA podem auto replicarem-se, como as do DNA. Porm, o grupo hidroxila, presente
no carbono 2 da ribose, torna as ligaes fosfodister acar-fosfato instveis,
enquanto que no DNA, este mesmo carbono s apresenta ligaes com tomos de
hidrognio. Desse modo, o DNA muito mais adequado do que o RNA como portador
estvel da informao gentica. Entretanto, muitas classes virais possuem o RNA
como molcula da hereditariedade, no lugar do DNA. Nestes casos, o RNA replica-se
por meio de um DNA intermedirio, usando uma transcriptase reversa (DNA
polimerase dependente de RNA). Recentemente, tornou-se claro que as clulas de
mamferos contem seqncias de DNA cromossmicos no-viral que codificam
transcriptases reversas celulares. Sabendo-se que algumas seqncias de RNA noviral funcionam como molde para a sntese de DNA celular, o princpio do fluxo
unidirecional da informao gentica no mais estritamente vlido.
2.2.2. Unidades de Transcrio:
Somente uma pequena poro do DNA transcrita (unidades de transcrio ou
genes). Entretanto, a maior parte do DNA jamais transcrita, em qualquer clula. Esta
parte no transcrita composta principalmente por pseudogenes, DNA repetitivo e
seqncias regulatrias.
Alm de o genoma humano possuir uma pequena poro de unidades de transcrio,
apenas uma pequena poro deste total traduzida em ptn, isto porque: (1) grande
parte dos RNA no do tipo mensageiro (mRNA); (2) os transcritos primrios sofrem
reduo em seu tamanho, durante o seu processamento; e (3) apenas uma parte

central do mRNA maduro traduzida, isto porque as suas terminaes no so

traduzidas.
A sntese de RNA executada pela RNA polimerase, tendo o DNA como molde. O
RNA sintetizado como fita nica, e a direo da transcrio 5 3. O alongamento
da cadeia feito pela adio de resduos de AMP, GMP, UMP e CMP ao grupamento
hidroxila 3livre na extremidade 3da cadeia crescente de RNA. Esses nucleotdeos
resultam da eliminao de um resduo de pirofosfato (PPi) do trinfosfato
ribonucleosdeo (rNTP) precursor apropriado. Isso significa que o nucleotdeo
localizado na ponta 5 (ribonucleotdeo iniciador) diferente dos demais devido a
presena do grupamento trifosfato 5.
Para a transcrio, somente uma das fitas do DNA utilizada como molde para a
sntese de RNA. Neste caso, a fita-molde denominada de fita antesenso, enquanto
que a outra (no-molde) chamada de fita senso. Ao documentar seqncias gnicas,
costume apresentar apenas a fita senso. Geralmente, a orientao das seqncias
em relao a uma seqncia gnica ditada pela fita senso e pela direo da
transcrio (p. ex., a extremidade 5de um gene refere-se as seqncias localizadas na
extremidade 5de sua fita seno, e as seqncias a montante ou a jusante de um gene
referem-se a seqncias que flanqueiam esse gene, respectivamente, pela
extremidade 5 e pela extremidade 3de sua fita senso).
Nas clulas eucariticas, so necessrias trs molculas diferentes de RNA
polimerase para sintetizar os vrios tipos de RNA:
RNA polimerase I: atua somente na transcrio do rRNA 45S; RNA polimerase I: atua
na sntese de mRNA e da maioria dos genes de snRNA; RNA polimerase I: atua na
sntese de tRNA, 5S rRNA.
2.2.4. Fatores de Transcrio:
As RNAs polimerases no possuem autonomia para iniciar a transcrio. Para que
este processo se realize necessrio que a combinao de elementos de curta
seqncia (fatores cis-atuantes [tabela]), adjacentes ao gene, atue como sinais de
reconhecimento para que os fatores de transcrio (fatores trans-atuantes) possam
ligar-se ao DNA para guiar e ativar a RNA polimerase. Freqentemente, este conjunto
de seqncias curtas fica agrupado a montante da seqncia codificadora de um
gene, constituindo coletivamente, o promotor. Depois que vrios fatores comuns de
transcrio se ligam a regio promotora, uma RNA polimerase se une ao complexo

dos fatores de transcrio e ento ativada para iniciar a sntese de RNA a partir de
um nico ponto.
Tabela 2: Caractersticas dos Elementos Cis-atuantes
Elementos Cis Comentrios CG box Situado a -200pb a montante do gene. TATA box
Situado a -25pb a montante do gene. Pouco freqente, inclusive nos promotores de
genes de manuteno. CAAT box Localizado a 80pb do incio da transcrio. o
maior determinante da eficincia do promotor. Alm do promotor, existem outros
elementos cis que atuam potencializando a transcrio (acentuadores ou enhancers)
ou inibindo-a (silencidores). Ambos so elementos regulatrios, porm esto situados
bem distantes dos pontos de incio da transcrio.
2.2.5 Expresso Tecido-Especfica:
A expresso gnica tecido-especfica envolve a ativao seletiva de genes especficos
(denominados: genes com expresso tecido-especfica). Alm deste grupo, observa-se
que um nmero razovel de genes que esto ativos em toda e qualquer clula. Tais
genes so essenciais para a manuteno das atividades gerais da clula, e por isso
so denominados de GENES DE MANUTENO. Parte dos genes para mRNA
TECIDO-ESPECFICO, enquanto que todos os genes de rRNA, tRNA e alguns de
mRNA so genes de manuteno.
A distino entre as regies do DNA de uma clula que esto transcrevendo e as que
esto inativas reflete-se na estrutura da cromatina. A cromatina inativa apresenta uma
conformao altamente condensada e frequentemente relacionada s regies do
genoma que sofrem replicao tardia, durante a fase S do ciclo celular. O DNA ativo
na transcrio, por sua vez, apresenta uma conformao mais aberta e costuma
replicar-se logo no incio da fase S. Ele se caracteriza por uma ligao relativamente
fraca com as molculas de histonas H1 e pela ampla acetilao dos quatro tipos de
histonas que compem o nucleossomo. Alm disso, na cromatina ativa, as regies
promotoras no costumam apresentar metilaes.
2.3. Processamento do RNA:
O transcrito de RNA da maioria dos genes eucariticos sofre uma srie de reaes de
processamento. Freqentemente, isso envolve a remoo de segmentos internos
indesejveis e a reunio de segmentos remanescentes (encadeamento do RNA). No
caso de transcritos resultantes da RNA polimerase I, um nucleotdeo especializado

(trifosfato 7 metilguanosina) ligado a extremidade 5do transcrito primrio

(Capeamento),
2.3.1. Encadeamento: (Obs: no mRNA, este evento s ocorre aps a adio das
extremidades 5e 3modificadas)
As seqncias codificadores da maioria dos genes, tanto dos que codificam
polipeptdeos quanto os que codificam outras molculas de RNA, so divididas em
seguimentos codificadores (os exons), que so separados por seqncias
intercalantes no-codificadoras (os introns). A transcrio consiste na produo de
uma seqncia de RNA complementar ao comprimento total do gene, abrangendo
exons e introns. Freqentemente, entretanto, o transcrito de RNA sofre o
encadeamento do RNA, uma srie de reaes de processamento atravs das quais os
introns so removidos e descartados enquanto que os exons so unidos ponta com
ponta (encadeamento) para obter-se como produto um RNA mais maduro.
O mecanismo de encadeamento do RNA dependente da identidade das seqncias
de nucleotdeos nos limites exon/intron (juno de encadeamento). Ele
particularmente sensvel ao que tem sido denominado de regra GU-AG: os introns
quase sempre comeam com GU e terminam com AG. Embora os dinucleotdeos
conservados GU e AG sejam de importncia crucial para o encadeamento, eles no
so suficientes para indicar a presena dos introns. Atualmente, sabe-se que as
seqncias adjacentes aos dinucleotdeos GT e AG so consideravelmente
conservadas. Alm disso, h uma terceira seqncia conservada nos introns que
funcionalmente importante para o encadeamento. o chamado stio de ramificao,
quase sempre localizado perto do final do intron, mais de 40 nucleotdeos entre o
dinucleotdeo terminal AG.

RNA splicing involves endonucleolytic cleavage and removal of intronic RNA segments
and splicing of exonic RNA segments

O mecanismo de encadeamento segue nesta ordem: (1) clivagem na juno de cadeia

5; (2) ataque nucleoltico G terminal do stio doador de encadeamento, a fim de formar
uma estrutura em forma de lao; (3) clivagem na juno 3, com liberao do intron sob
a forma de lao e o encadeamento dos exons.
Essas reaes tambm podem ser mediadas por complexos de RNA e de protenas, o
ENCADEOSSOMO, que consiste de cinco tipos de snRNA (U1,U2, U4, U5, U6) e de
mais de 50 tipos de protenas. Neste processo, cada molcula de snRNA liga-se a
uma protena especfica, formando partculas de snRNP (ribonucleoproteinas de
pequeno tamanho), e cuja especificidade da reao de encadeamento estabelecida
por complementaridade de bases entre o transcrito e as molculas de snRNA. O
terminal 5do snRNA U1 tem uma seqncia que pareia com a seqncia consenso do
stio doador de encadeamento. Depois que snRNP U1 se ligou, o snRNA U2
reconhece o stio de ramificao por complementaridade de bases e, logo aps a
interao entre os snRNP U1 e U2 aproxima as duas extremidades que sero unidas.
Em seguida, uma partcula com mltiplos snRNP, contendo snRNAs U4, U5 e U6,
associam-se com o complexo U1-U2.

Mechanism of RNA splicing (GU-AG introns).

A) Mechanism. The nucleophilic attack involves the 2-hydroxyl group attached to the
conserved A at the branch site and the G of the conserved GU at the start of the intron,
and results in a new covalent bond linking these two nucleotides to give a branched
structure (lariat). (B) Role of snRNPs. Small nuclear ribonucleoprotein particles
(snRNPs) are part of the spliceosome. U1 snRNA has a terminal sequence
complementary to the splice donor consensus and binds to it by R A-R A base pairing.
After the U1 snRNP has bound, U2 snRNA recognizes the branch site by a similar
base-pairing reaction. Interaction between the splice donor and splice acceptor
junctions is stabilized by subsequent binding of a preformed multi-snRNP particle,
containing U4, U5 and U6 snRNAs, with the U5 snRNP able to bind simultaneously to
both splice donor and splice acceptor.

Quadro 2.1: Grupos e fases de introns

Grupos de Introns Fases dos Introns
( posio em que o intron interrompe os exons)
Introns de encadeossomos - So introns tradicionais;
- Possuem seqncias conservadas que servem para a indicar as suas extremidades
(stios de encadeamento 5e 3) e o stio de ramificao.
Introns de Grupos I e I - Possuem estruturas secundrias que permite catalisar a sua
remoo;
- Esto presentes nos transcritos de rRNA e tRNA;
- Podem atuar como elementos mveis.
Intron de Fase 0 : Interrompem a seqncia codificadora entre codons adjacentes.
Intron de Fase 1: Interrompem um cdon entre a primeira e a segunda base. Intron de
Fase 2: Interrompem um cdon entre a segunda e a terceira base.
2.3.2. Capeamento do mRNA:
Este evento que ocorre durante a transcrio, no qual adiciona-se um nucleosdeo
metilado (7 metilguanosina) ao primeiro nucleotdeo 5 transcrito. A enzima
guaniltransferase a responsvel pela unio entre esses dois nucleotdeos atravs de
uma ligao fosfodister especial 5-5. Assim como os mRNAs, os snRNAs tambm
so capeados, mas suas capas podem sofrer outras modificaes. Supe-se que as
funes da capa sejam: (1) facilitar o encadeamento; (2) facilitar o transporte no
ncleo para o citoplasma; (3) proteger o transcrito do ataque de exonucleases 5 3;
(4) auxiliar no encaixe da subunidade 40S ribossmica ao mRNA.
2.3.3. Poliadenilao do mRNA:
Os genes transcritos pela RNA-polimerase I no apresentam stios de termino de
transcrio, sendo assim, a polimerase transcreve at perder afinidade pelo DNA.
Posteriormente, uma endonuclease reconhece o stio AAUAAA e corta a jusante deste

ponto. Por fim, a enzima poli(A)- polimerase adiciona cerca de 200 resduos de
adenilato (AMP), para formar uma cauda poli(A). Supe-se que essa cauda tenha
vrias funes, tais como: (1) facilitar o transporte do mRNA para o citoplasma; (2)
maior durabilidade a molcula; (3) facilitar a traduo, ao permitir uma intensificao
do reconhecimento do mRNA pela maquinaria ribossmica. As excees a esta regra
so os mRNAs de histonas e snRNAs, que no sofrem adio de cauda poli(A).
2.4. Traduo do mRNA:
Para a traduo, somente o segmento central do mRNA determina a seqncia de
aminocidos do polipeptdio a ser transcrito. As seqncias adjacentes, isto , a regio
no-traduzida 5-P e no-traduzida 3-OH auxiliam a ligar e estabilizar o mRNA nos
ribossomos, onde ocorre a traduo do segmento central.
Os ribossomos so grandes complexos de RNA e protenas compostos por duas
subunidades. Nos eucariotos, os ribossomos citoplasmticos contm duas unidades: a
subunidade maior de 60S (formada por cerca de 50 protenas ribossmicas e rRNAs
28S, 5,8S e 5S), e a subunidade menor de 40S (formada por 30 protenas
ribossmicas e rRNA 18S).
O gene do rRNA 45S policistrnico, pois um nico transcrito possui a informao
gentica para trs tipos de rRNA. Aps a transcrio o pr-rRNA sofre metilao nas
regies referentes aos rRNAs 18S, 5,8S e 28S. Estas marcaes auxiliam na
determinao das seqncias iniciais e terminais de cada rRNA. Aps a adio desta
marcao, os introns (Classe I ou I) catalisam a sua prpria remoo.

Processamento do pr-transcrito de rRNA.

O incio da traduo marcado pelo reconhecimento pela subunidade ribossmica
40S ao cap 5, por intermdio de suas protenas que se ligam especificamente a ela.
Ento a subunidade 40S percorre o mRNA at encontrar o cdon de iniciao, que
quase sempre o AUG (os codons alternativos para a iniciao so: ACG, GUG e
CUG). Geralmente, mas nem sempre o primeiro AUG encontrado ser o codon de
iniciao. Porm, o

AUG s ser eficientemente reconhecido como tal se estiver inserido na seqncia

GCCP urina CCAUGG. Os determinantes mais importantes nesta seqncia so o G,
logo aps o cdon AUG, e a purina (preferencialmente a adenina) no terceiro
nucleotdeo anterior a ele. A seguir, sucessivos aminocidos so incorporados
cadeia polipeptdica crescente por reaes de condensao: o grupo amino do
aminocido, situado no stio A, reage com o grupamento carboxlico do aminocido
presente no stio P. A catlise dessa reao feita enzima peptidil-transferase, situada
na subunidade maior.
A traduo ocorre no sentido 5 3 e continua at o complexo ribossmico encontrar
um dos trs codons de parada (UAA, UAG, UGA). Por isso, o arcabouo do produto
primrio da traduo ter uma metionina com um grupamento amino livre em uma
extremidade (a terminao N) e um aminocido com um grupamento carboxila livre na
outra extremidade (a C-termial).
2.5. Controle da Expresso Gnica:
O principal nvel de controle da expresso gnica o inicio da transcrio. Entretanto,
vrios mecanismos reguladores so necessrios para manter os diferentes tipos de
expresso gnicas nos nveis temporal (estgios de desenvolvimento, estgios de
diferenciao, estgios do ciclo celular, expresso induzvel) e espacial (padro
rgo/tecido). Embora simplista, conveniente considerar-se trs amplos nveis nos
quais a regulao gnica pode operar: (1) Regulao da expresso gnica simultnea
a transcrio a regulao pode ocorrer por meio da regio promotora central de um
gene, em nvel de recrutamento e processabilidade da RNA-polimerase relacionada;
(2) Regulao da expresso gnica posterior a transcrio esta categoria inclui
mecanismos que operam em nvel do processamento do RNA (encadeamento e
adio das extremidades 5e 3), transporte do mRNA, traduo, estabilidade do mRNA,
processamento e sinalizao da ptn, estabilidade da ptn, etc; (3) Mecanismos
epigenticos de controle a longo alcance da expresso gnica.
2.5.1. Controle da Expresso Gnica em nvel de Transcrio:
Fatores de Transcrio trans-atuantes:
Os fatores de transcrio so protenas que reconhecem seqncias especficas na
regio de controle do gene (promotor), permitindo assim a chegada da RNApolimerase. As protenas que participam do processo de transcrio de todos os genes
estruturais, e so chamadas de FATORES GERAIS DE TRANSCRIO (RNA-pol I
TFI; RNA-pol I TFI; e RNA-pol II TFII). Outras chamadas de FATORES

ESPECFICOS DE TRANSCRIO tm funes mais especficas, ativando apenas

alguns genes em determinados estgios do desenvolvimento.
Os fatores de transcrio reconhecem e liga-se a seqncias curtas de nucleotdeos,
normalmente como resultado de uma complementaridade extensa entre a superfcie
da protena e as caractersticas das hlices do DNA. Os fatores de transcrio
apresentam duas caractersticas que so essenciais para o seu funcionamento
adequado: (1) DOMNIO DE ATIVAO estimula a transcrio atravs da interao
com outros fatores de transcrio, bem como na formao do complexo transcricional;
(2) DOMNIO DE LIGAO AO DNA permite a ligao especfica do fator de
transcrio aos seus genes-alvo. Os principais so: dedo de zinco, hlice-volta-hlice,
hlice-giro-hlice e zper de leucina.
Seqncias reguladoras cis-atuantes (silenciadores e reforadores):
O complexo formado pela polimerase e pelos fatores gerais de transcrio
conhecido como o aparato de transcrio basal; ele contm tudo o que necessrio
para iniciar a transcrio. Os genes que so constitutivamente expressos em uma taxa
mnima, determinada pela regio promotora central a menos que a taxa de transcrio
seja elevada ou desligada por elementos reguladores positivos (reforadores) ou
negativos (silenciadores) adicionais. Em geral, estes elementos esto situados a
alguma distncia da regio promotora.
Alguns genes que codificam polipeptdeos so genes de manuteno, mas ao
contrrio dos produtos dos genes transcritos pelas RNAs polimerases I e I, a grande
porcentagem dos genes transcritos pela RNA pol I demonstra possuir modelos de
expresso tecido-restrito ou tecido- especfico. Uma vez que o DNA de diferentes
clulas nucleadas de um indivduo essencialmente idntico, a identidade de uma
clula definida pelas protenas produzidas por ela. Alm dos fatores gerais de
transcrio, portanto, os fatores de transcrio tecido-especficos ou tecido-restritos
regulam a expresso de muitos genes que codificam polipeptdeos, pelo
reconhecimento e pela ligao especfica de elementos de seqncia cisatuantes.
A especificidade de tecido e a especificidade do estgio de desenvolvimento so,
freqentemente, conferidas pelas seqncias reforadoras e silenciadoras as quais
so reconhecidas por fatores de transcrio tecido-especficos. Alm de promover
ativamente a transcrio tecidoespecfica (reforadores), alguns elementos cisatuantes, denominados de silenciadores, conferem especificidade de tecido ou estgio
de desenvolvimento pelo bloqueio da expresso em todos os tecidos, exceto no tecido
desejado.

Regulao da transcrio em resposta a estmulos externos:

Sinais ambientais, tais como as concentraes extracelulares de certos ons e
pequenas molculas nutrientes, temperatura, choque, etc., podem resultar na
alterao dramtica do padro da expresso gnica nas clulas expostas a mudanas
nesses parmetros. Nestes casos, o controle da transcrio ocorre da seguinte forma:
um fator de transcrio, previamente inativo, ativado especificamente pela rota de
sinalizao e, depois, liga-se subseqentemente, a seqncias reguladoras
especficas, localizadas nos promotores dos genes-alvo, ativando, por meio disso, a
transcrio desses genes. No caso da transcrio regulada por molculas
sinalizadoras ou seus intermedirios, tais seqncias reguladoras so freqentemente
referidas como ELEMENTOS DE RESPOSTA.
Transcrio alternativa:
Vrios genes humanos possuem dois ou mais promotores alternativos, que podem
resultar em diferentes isoformas, com diferentes propriedades. As isoformas podem
proporcionar: (1) especificidade de tecido; (2) especificidade do estgio de
desenvolvimento; e (3) localizao subcelular diferente.
2.5.2. Controle da Expresso Gnica em vel de Ps-Transcrio:
Controle da traduo em resposta a estmulos externos:
Seqncias cis-atuantes presentes na regio 5UTR de alguns mRNAs contm um
elemento de resposta (stio) que reconhecida por uma protena de ligao a
seqncia cis-atuante, potencializando assim a traduo.
Controle da traduo durante o desenvolvimento inicial:
Aps a fertilizao de um ocito humano, nenhum mRNA inicialmente produzido, at
o estgio de 4 a 8 clulas, quando a transcrio zigtica ativada. Antes desse
perodo, as funes celulares so especificadas pelo mRNA materno, que foi
previamente sintetizado durante a oognese. Uma variedade de mRNAs
armazenada nos ocitos em uma forma inativa, caracterizada por apresentar caudas
de poli(A). Tais mRNAs foram previamente submetidos a desadenilao, e ascaudas
do poli(A) resultantes significam que eles no podem ser traduzidos.
Subseqentemente, na fertilizao ou, mais tarde, no desenvolvimento, as espcies
de mRNAs inativas armazenadas podem ser ativadas pela poliadenilao

citoplasmtica, que restaura o tamanho normal das caudas poli(A). A poliadenilao

citoplasmtica parece utilizar o mesmo tipo de atividade da poli(A)-polimerase. No
entanto, alm do sinal AAUAAA, o mRNA necessita possuir um elemento de
poliadenilao citoplasmtico a montante, rico em uracilas.
Encadeamento Alternativo:
Uma frao representativa dos genes humanos sofre encadeamento alternativo, pelo
quais deferentes combinaes de exons so includas em transcritos a partir do
mesmo gene, durante o processamento do RNA. O encadeamento alternativo resulta
em uma diversidade considervel nas regies no traduzidas, bem como isoformas
(que so tecido-especficas). As diferentes isoformas podem fornecer uma variedade
de possibilidades de propriedades funcionais alteradas, mas o conhecimento
detalhado da significncia funcional das diferentes isoformas ainda escasso.
Poliadenilao Alternativa:
Em muitos genes, dois ou mais sinais de poliadenilao foram encontrados na regio
3-UTR, e os transcritos alternativamente poliadenilados podem apresentar
especificidade de tecido; em outros casos, sinais de poliadenilao alternativos podem
ser produzidos aps o encadeamento alternativo.
Edio do mRNA:
Este um mecanismo de processamento posterior a transcrio, que pode envolver a
insero ou a deleo ou substituio de nucleotdeos a mediada por enzimas. Os
efeitos das edies so variados, podendo gerar: stop cdon prematuro tecidoespecfico, mutaes de sentido trocado entre outras.
2.5.3. Mecanismos Epigenticos de Controle da Expresso Gnica:
Metilao e Compactao do DNA:
No DNA de vertebrados, a seqncia CpG um sinal para metilao por uma DNA
metil-transferase citosina-especfica, que adiciona um grupo metil no carbono 5da
citosina. A 5-metilcitosina resultante quimicamente instvel e est sujeita
desaminao, resultando em timina. Durante longos perodos de tempo evolucionrio,
o nmero de dinucleotdeos CpG no DNA de vertebrados tem diminudo
gradativamente, devido a lenta, porem constante converso de CpG em TpG (e CpA

na fita complementar). Genes associados a ilhas CpG incluem todos os genes de

manuteno e genes que so amplamente expressos de uma maneira tecidoespecfica. As ilhas CpG associadas com stios de iniciao da transcrio de genes
cuja expresso restrita a certos tecidos no so metiladas, nesses tecidos, mas so
metiladas nos tecidos onde os genes so expressos. No entanto, as ilhas CpG
localizadas a jusante do stio de iniciao da transcrio podem ser metiladas em
tecidos onde o gene expresso.
Outro mecanismo, alm da metilao, atua na represso da expresso gnica. Este
mecanismo o grau de compactao da cromatina. As acetiltransferases especficas
de histonas adicionam grupamento acetil aos resduos de lisina prximos regio Nteminal de histonas. Os terminais N-acetilados formam, ento, caudas que se projetam
a partir do centro do nucleossomo. Imagina-se que, como as histonas acetiladas
possuem uma afinidade reduzida pelo DNA, e possivelmente uma pela outra, a
cromatina pode ser capaz de adotar uma estrutura mais aberta, que est mais
apropriada para a expresso gnica. A desacetilao das histonas, no entanto,
promove a represso da expresso gnica, presumidamente devido ao fato da
cromatina tornar-se mais condensada. Mudanas na estrutura da cromatina tm um
papel importante no controle da expresso gnica. A cromatina existe sob duas
formas, EUCROMATINA (pouco compactada) e HETEROCROMATINA (fortemente
condensada). A eucromatina transcricionalmente ativa, e replica-se cedo na fase S
do ciclo celular. A heterocromatina transcricionalmente inativa e replica-se
tardiamente na fase S do ciclo celular.
Pr-programao genmica (Imprinting):
A pr-programao baseia-se na inativao aleatria (independente da origem
parental) ou no (dependente da origem parental) do alelo materno ou paterno de
certos genes biallicos. O mecanismo de pr-programao ainda no est totalmente
elucidado, entretanto especula-se que alguns mecanismos moleculares sejam
capazes de distinguir entre alelos patri- e matrilinearmente herdados. Este mecanismo
deve ocorrer da seguinte maneira: a medida que os cromossomos passam atravs das
linhagens germinativas do macho e da fmea, eles devem adquirir alguma prprogramao para sinalizar uma diferena entre alelos paternos e maternos, no
organismo em desenvolvimento. Um componentechave, ao menos na manuteno do
status de pr-programao, a metilao do DNA, alelo-especfica.
A pr-programao uma propriedade de um nmero limitado de genes ou de uma
pequena regio cromossmica. Atualmente, so conhecidos no genoma humano mais
de 30 genes pr-programados, sendo os dois principais: regio de 1Mb em 11p15 que

contm ao menos 7 genes; um grupamento de 2,5Mb na regio 15q11-q13 tambm

contm ao menos sete genes.
A grande maioria dos genes pr-programados conhecidos autossmica. No entanto,
o gene XIST, que possui papel importante na inativao do cromossomo X, pode ser
considerado um exemplo de um gene pr-programado ligado ao X, uma vez que a
expresso do alelo matrilinearmente herdado preferencialmente reprimida no
trofoblasto. Nas demais clulas, esse mecanismo aleatrio.
2.5.4. Regulao da Atividade das Protenas:
A regulao da atividade da protena compreende principalmente 3 tipos de processos:
(1) translocaes de protenas em diferentes compartimentos celulares; (2) as
interaes protena-protena; e (3) as modificaes enzimticas reversveis ou
irreversveis. Estas funes aparentemente diferentes so intimamente relacionadas
umas com as outras.
A translocao subcelular de polipeptdeos recm-sintetizados ocorre por dois
caminhos principais. Na via citoslica, toda a protena traduzida no citoplasma
(traduo livre de membrana). Subseqentemente, o produto enviado para uma
organela ou fica no citoplasma. A captao por organelas mais provavelmente ocorre
por receptores especficos de organelas que reconhecem seqncias peptdicas
curtas (peptdeo sinal). As protenas que ficam residindo no citoplasma ficam l porque
no contm o peptdeo sinal. A segunda via atravs do retculo endoplasmtico. A
deciso por este caminho tomada durante a traduo. Uma protena destinada a
esta via geralmente contm uma seqncia de sinal hidrofobia com o seu N-terminal.
Esta seqncia de sinal reconhecida pela partcula de reconhecimento do peptdeo
sinal (SRP), um complexo protena-RNA, que por sua vez ancora o polissomo aos
receptores SRP da membrana do retculo. Durante a continuidade da traduo (agora
ligada a membrana), o polipeptdeo recm-sintetizado translocado para a luz do
retculo. As protenas so ou completamente secretadas na luz do retculo ou se forem
protenas transmembranares, ficam ligadas membrana do retculo.
Modificaes Ps-Traducionais e a Regulao da Estabilidade da Protena:
A meia-vida de uma protena parece uma conseqncia de algumas seqncias
estabilizadoras e caractersticas gerais da estrutura secundria. Os aminocidos Met,
Ser, Ter, Ala, Gli, Val e, mais provavelmente tambm Cis e Pro tm efeito estabilizador
sobre a protena quando localizados na extremidade N. Todos os outros aminocidos
tornam a protena vulnervel a uma protease que rapidamente a degrada. A

maquinaria proteoltica responsvel pela degradao seletiva de protenas

dependente de ubiquitina. A ubiquitina uma pequena protena de 76 aminocidos
que se liga a outras protenas. Quando a maquinaria proteoltica dependente de
ubiquitina reconhece um aminocido desestabilizante no N-terminal de uma protena,
uma molcula de ubiquitina ligada covalentemente ao terminal N ou a uma lisina
prxima. Subseqentemente, uma srie de ubiquitinas adicionais acrescentada,
produzindo uma protena ramificada multiubiquinada. Uma protease especfica
reconhece tais ubiquitinas e as degrada enquanto recicla os polipeptdeos de
ubiquitina. Como j mencionado, a degradao de protenas dependente de ubiquitina
especificada pelo primeiro aminocido no terminal N de cada protena. Embora em
todos os genes de protenas eucariticas o primeiro cdon (AUG) codifique uma
metionina, muitas poucas espcies de protenas prontas tm metionina em seu Nterminal. Geralmente, o N-terminal cotraducionalmente modificado por atividades de
aparo e adio de terminal no muito bem compreendido. Curiosamente, as protenas
que so endereadas ao retculo em geral tm o N-terminal no modificado, tornandoas altamente instveis no citosol mas no no retculo. Isto pode ser importante em
permitir que a clula seja capaz de degradar especificamente protenas que entram na
via citoslica por acidente.
2.6. Ferramentas para Manipulao de RNA e Protenas:
A estrutura, a expresso e a funo dos genes humanos podem ser estudadas por
uma variedade de mtodos. A prioridade inicial na definio da estrutura do gene
obter uma seqncia completa de cDNA e identificar os stios de iniciao e
terminao de traduo e os stios de poliadenilao. A estrutura exon/intron pode
ento ser determinada pela comparao da seqncia de cDNA com as seqncias de
clones de DNA genmico relacionados. Subseqentemente, podem ser feitas
tentativas para uma caracterizao gentica completa, em nvel genmico, por meio
do sequenciamento das regies promotoras, das seqncias flanqueadoras 5 e 3 e
das seqncias de introns.
2.6.1. Mtodos para obteno de clones de genes para estudar a sua estrutura,
expresso e funo:
Clonagem de cD A enriquecido o DNA genmico de todas as clulas humanas
nucleadas consiste basicamente da mesma coleo de seqncias, porm, a
representatividade das vrias populaes de mRNA variam entre as clulas. Por
exemplo, mRNA de -globina e -globina so abundantes entre as molculas de
mRNA de eritrcitos e, conseqentemente, seqncias de cDNA de globina so
abundantes em bibliotecas de cDNA de eritrcitos. Mtodos baseados em PCR

tambm foram desenvolvidos para amplificar seletivamente cDNAs correspondendo

aos subconjuntos de genes transcricionalmente ativos.
Clonagem direcionada protena a seqncia de aminocidos da um polipeptdeo
pode ser determinada para permitir a sntese de oligonucleotdeos especficos para um
gene os quais podem ser usados como sondas de hibridizao para isolar um cDNA
correspondente ou um clone de DNA genmico.
2.6.2. Mtodos para estudar a estrutura do gene:
2.6.2.1. Mapeamento de stios de transcrio
Ensaio de proteo nuclease S1 neste ensaio, um fragmento de restrio da
extremidade 5 de um gene clonado suspeito de conter o stio de iniciao de
transcrio. Ele marcado nas extremidades 5, desnaturado e misturado com o RNA
total de clulas nas quais acredita-se estar sendo expresso o gene relevante. O mRNA
cognato pode hibridizar com a fita de DNA anti-senso, formando um heterodplex
RNA-DNA. Tratamento subseqente com nuclease S1 (enzima que degrada acido
nuclico de fita simples) resulta na clivagem progressiva da extremidade livre 3 da
seqncia de DNA at o ponto em que o DNA est hibridizado extremidade 5 do
mRNA. Fracionamento por tamanho, em uma eletroforese em gel desnaturante, pode
identificar a diferena de tamanho entre o DNA original e o DNA hibridizado aps o
tratamento com nuclease S1.
Ensaio de extenso de primer neste caso, o fragmento de restrio suspeito de
conter o stio de iniciao de transcrio escolhido deliberadamente para ser
pequeno. A hibridizao com um mRNA cognato ir deixar um mRNA com uma
extremidade 5 livre. O DNA pode servir como um primer para a transcriptase reversa
(RT) estender a sua extremidade 3 at que a extremidade 5do mRNA seja alcanada.
O aumento de tamanho aps o tratamento com a transcriptase reversa (+RT)
comparado com antes do tratamento (-RT) mapeia o stio de incio da transcrio. Um
mapeamento mais preciso possvel, em ambos os mtodos, pelo seqenciamento do
DNA aps o tratamento com S1 ou RT.

Figura: (A) ensaio de proteo a nuclease S1. (B) ensaio de extenso de primer
2.6.2.2. Mapeamento dos limites exon/intron
A presena de introns pode ser usualmente inferida por meio de mapeamento
comparativo de clones genmicos e de cDNAs relacionados. Uma vez que toda a
seqncia de cDNA estabelecida, primers para o seqenciamento podem ser
definidos a partir dos vrios segmentos de cDNA e usados para o seqenciamento de
DNA por PCR com clones de cosmdeos desnaturados como moldes de DNA. As
sequencias obtidas devem cruzar a regio limtrofe exon/intron.
2.6.3. Mtodos aplicados ao estudo da expresso gnica:
Uma vez eu um clone genmico ou de cDNA torna-se disponvel, pode ser marcado e
usado como sonda para detectar a expresso daquele gene ao nvel de RNA. H
diferentes mtodos a disposio para se estudar a expresso de RNA, tais como:
Hibridizao pela tcnica de orthern blot - esse um mtodo de baixa resoluo, mas
que permite detectar padres de expresso por meio da hibridizao de uma sonda
gnica ou de cDNA, com extratos de RNA total ou RNA poli(A)+ preparados a partir de
diferentes tecidos ou de linhagens de clulas. O fato de o RNA ser fracionado por
tamanho em um gel possibilita estimar o tamanho de transcritos. A presena de
mltiplas bandas de hibridizao em uma canaleta pode indicar a presena de
isoformas de diferentes tamanhos.
Hibridizao in situ em tecidos neste procedimento, os tecidos so congelados ou
embebidos em parafina e cortados usando-se um micrtomo, para obter cortes muitos
finos, os quais so montados em uma lmina de microscpio. A hibridizao de uma
sonda especfica para um gene, no tecido presente em lmina, pode oferecer imagens
detalhadas de expresses representativas da distribuio de RNA no tecido de origem.

Hibridizao de D A em microarranjo para investigar a expresso de genes de

interesse, dispostos nos microarranjos, o RNA extrado das clulas-alvo
selecionadas, convertido em cDNA (pela enzima transcriptase reversa), marcado com
substncia fluorescente e hibridizado ao microarranjo. O cDNA marcado ,
naturalmente, uma populao bastante heterognea, correspondente ao RNA
transcrito de todos os genes expressos nas clulas-alvo. Um gene que intensamente
expresso nas clulas-alvo ser, portanto, bem representado na sonda de cDNA total;
por sua vez, um gene que pouco expresso ser escassamente representado no
cDNA marcado. Quando o cDNA marcado hibridizado ao microarranjo, a intensidade
do sinal que permanece ligado aos clones individuais de cDNA, ou aos
oligonucleotdeos individuais, indica o quanto a respectiva seqncia bem
representada no cDNA marcado, sendo portanto, uma medida de expresso gnica.
O estudo da expresso gnica tambm pode ser conduzido em nvel de expresso de
protenas. As principais abordagens so:
Imunobloting (ou Western blotting) esse mtodo foi projetado para analisar a
expresso bruta de protenas usando extratos celulares fracionados, de acordo como
o tamanho das molculas. Geralmente isso obtido por meio de um SDS-PAGE
unidimensional, uma forma de eletroforese em gel de poliacrilamida na qual a mistura
de protenas extradas dissolvida em uma soluo de SDS (um detergente aninico
que interrompe quase todas as interaes no covalentes em protenas nativas).
Mercaptoetanol tambm adicionado para reduzir as pontes de enxofre. Aps a
eletroforese, as protenas fracionadas podem ser visualizadas por meio de colorao
com um corante apropriado. Gis bidimensionais tambm podem ser utilizados: a
primeira dimenso envolve o ponto isoeltrico, que a separao, de acordo com a
carga, em um gradiente de pH. A segunda dimenso envolve o fracionamento por
tamanho por meio do SDS-PAGE. Nesse caso, as protenas fracionadas so
transferidas (blotted) para uma membrana de nitrocelulose e expostas a um anticorpo
especfico.
Imunocitoqumica - essa tcnica visa estudar os padres gerais de expresso em nvel
de protenas, dentro de um tecido ou outra estrutura multicelular. Essa tcnica
considerada como o equivalente protico dos mtodos de hibridizao in situ, em
tecidos para rastrear a expresso de RNA. Assim como este caso, os tecidos so
geralmente congelados ou embebidos em parafina, e ento cortados em seces
muito finas antes de serem montados em lamnula. O anticorpo apropriado utilizado
para ligar-se protena no corte do tecido, podendo produzir dados de expresso
disponveis para comparao com a colorao histolgica de cortes de tecidos
vizinhos.

Microscopia de imunofluorescncia esse mtodo usado na investigao da

localizao subcelular de uma protena de interesse. Para tanto, um corante
fluorescente apropriado, acoplado ao anticorpo desejado, permitindo que a protena
relevante seja localizada dentro da clula por meio de microscopia de
imunofluorescncia.
2.6.4. Mtodos aplicados na investigao da funo de genes:
Aps um gene codificador de um polipeptdeo ter sido caracterizado ao nvel de
nucleotdeos e uma seqncia polipeptdica esperada ter sido descoberta,
investigaes adicionais se concentram na expresso, na regulao da expresso e
na funo biolgica do gene. Os mtodos mais eficientes para a investigao da
funo de um gene humano baseiam-se na extrapolao de resultados obtidos em
camundongos. O gene equivalente (ortlogo) identificado em um camundongo e o
direcionamento a um gene-alvo usado para eliminar a sua expresso e ver se o seu
silenciamento produz algum tipo de fentipo mutante. Outro mtodo muito eficiente
expressar uma seqncia de interesse, para produzir uma protena e usar essa
protena de modo a identificar outras protenas ou cidos nuclicos aos quais ela
possa se ligar.
MDULO 3 GE TICA DE DOE AS HUMA AS
As doenas hereditrias humanas so normalmente classificadas sob os ttulos de:
Monognicas quando um carter hereditrio determinado pela modificao em um
nico gene. Cromossmicas quando o distrbio gentico resulta da perda ou ganho
de uma quantidade significativa de material cromossmico.
Polignicas (multifatoriais) quando a doena gentica decorrente dos efeitos
combinados de vrios genes, cada um fazendo uma pequena contribuio, associado
com fatores ambientais de risco. Esta classe de doena gentica mais comumente
observada. A maioria das malformaes congnitas e de doenas comuns como
cncer e diabetes so exemplos de doenas genticas multifatoriais.
3.1. Padres de Herana Monognica: 3.1.1. omenclatura Bsica: Gene autossmico
o que est situado em um cromossomo autossomo, ou seja, um dos cromossomos
numerados de 1 a 2.

Gene Ligado ao X ou Ligado ao Y refere-se ao gene situado no cromossomo X ou Y,

respectivamente. Locus (plural loci) a posio ou local em um cromossomo onde o
gene est situado. Alelos so formas alternativas do mesmo gene. Heterozigoto
refere-se a presena de dois alelos diferentes em um mesmo lcus. Homozigoto
refere-se a presena de dois alelos idnticos em um mesmo lcus. Gentipo a
combinao dos alelos presentes em um ou mais loci. Fentipo expresso
observada de um gentipo. Heterogeneidade refere-se a diversidade.
Heterogeneidade de lcus significa que uma condio pode ser causada por
mutaes e loci diferentes. Heterogeneidade allica indica que um carter gentico
pode ser causado por mutaes diferentes no mesmo lcus. Dominante significa que
uma nica cpia de um gene anormal o suficiente para o desenvolvimento do
distrbio gentico. Recessivo - indica que ambas as cpias do gene tm que estar
alteradas para a expresso da doena.
Heredograma construo esquemtica de uma rvore familial com o propsito de
facilitar o reconhecimento do padro de transmisso do distrbio gentico.
3.1.2. Herana Autossmica Dominante:
Mas da metade dos distrbios mendelianos herdado como autossmico dominante.
A incidncia de alguns distrbios autossmicos dominantes alta, pelo menos em
reas geogrficas especficas, como por exemplo: 1 em 500 para hipercolesterolemia
familiar em populaes descendentes de europeus e japoneses; 1 em 550 para a
distrofia miotnica no noroeste de Quebec/Canad; e de cerca de 1 em 2.500 a 3.0
para diversas condies, como a doena de Huntington, neurofibromatose e doena
dos rins policsticos em populaes de norte-americanas.
Um fentipo que expresso tanto em homozigotos quanto em heterozigotos para um
alelo mutante reconhecido como dominante. Os distrbios dominantes ocorrem se
houver ou no um produto gentico normal produzido pelo alelo normal remanescente.
Em uma doena dominante pura, homozigotos e heterozigotos para o alelo mutante
so, ambos, igualmente afetados. Entretanto, os distrbios dominantes so mais
graves em homozigotos do que em heterozigotos, situao na qual a doena
denominada incompletamente dominante (ou semi-dominante).
O risco e a gravidade da doena dominantemente herdada na prole dependem de se
um ou ambos os genitores est afetado e de se a caracterstica estritamente
dominante ou incompletamente dominante. Estipulando-se D como o alelo mutante e
d como o alelo normal, as unies que produzem crianas com doena autossmica
dominante podem ser entre dois heterozigotos (D/d) para a mutao ou, mais

freqentemente, entre um heterozigoto para a mutao (D/d) e um homozigoto para o

alelo normal (d/d):
Unio parental Prole Risco para a prole
Afetado com no afetado D/d x d/d D/d
d/d,

afetado,

no afetado,

Afetado com afetado D/d x D/d D/D D/d

d/d
Se estritamente dominante: afetados no afetado
Se incompletamente dominante: afetado semelhante aos genitores mais
gravemente afetado que os genitores no afetado
Cada filho de uma unio D/d com d/d possui uma probabilidade de 50% de receber o
alelo D anormal do genitor e uma chance de 50% de receber o alelo normald.Na
populao como um todo, a descendncia de genitores D/d com d/d de,
aproximadamente, 50% D/d e 50% d/d. Obviamente, cada gestao um evento
independente, no governado pelo resultado de gestaes anteriores. Portanto, dentro
de uma famlia, a distribuio de filhos afetados e no afetados pode ser bem diferente
da proporo terica esperada de1:1, especialmente se a prole for pequena.
Na prtica mdica, os homozigotos para os fentipos dominantes no so
freqentemente vistos porque as unies que poderiam produzir uma descendncia
homozigota so raras. Novamente, estipulando o alelo mutante como D e o alelo
normal d, as unies que podem produzir um homozigoto D/D podem, teoricamente,
ser D/d com D/d, D com D/d ou D/D com D/D, ou o paciente, em situaes
excessivamente raras, ter recebido a mutao de um genitor geneticamente no
afetado. Em termos prticos, somente a unio entre dois heterozigotos precisa ser
considerada porque os homozigotos D/D so raros e, geralmente, gravemente
afetados para se reproduzirem. Na hiptese de unio entre dois heterozigotos, dos
afetados poderiam apresentar a mesma condio se esta for dominante pura, ou 1/3
dos afetados poderia ser homozigoto e mais gravemente afetado do que os
heterozigotos D/d. De fato, no foi claramente provado que nenhum distrbio
dominante humano fosse dominante puro. Mesmo a doena de Huntington, que um

distrbio mais freqentemente invocado como dominante puro, porque a doena

geralmente semelhante em natureza e gravidade dos sintomas tanto em
homozigotos quanto em heterozigotos, parece apresentar um curso de durao
acelerado desde o incio da doena at o bito em indivduos homozigotos, se
comparados aos heterozigotos.
Herana incompleta dominante a acondroplasia um distrbio esqueltico
incompletamente dominante, que se manifesta como um nanismo de membros curtos
e cabea grande. Os casamentos entre dois indivduos acondroplsicos no so
incomuns. Freqentemente, o exame clnico j suficiente para identificar um filho
homozigoto D/D do heterozigoto D/d; os indivduos homozigotos para a acondroplasia
so mais gravemente afetados do que os heterozigotos e comumente no sobrevivem
ao perodo ps-natal.
Mutao nova na herana autossmica dominante a maioria das condies
dominantes de importncia clnica ocorre no somente por meio da transmisso de
alelos mutantes, mas tambm por meio da herana de uma nova mutao,
espontnea, em um gameta herdado de um genitor no afetado. Isso acontece porque
os distrbios dominantes podem ocorrer quando s um dos membros do par de alelos
em um lcus defeituoso, tenha ele sido herdado de um genitor heterozigoto ou
surgido por meio de uma mutao espontnea no gameta transmitido por um genitor
no-afetado.
Caractersticas da herana autossmica dominante
O fentipo geralmente aparece em todas as geraes, com cada uma das pessoas
afetadas possuindo um genitor afetado. As excees a essa regra so: casos
originados por mutao nova ocorrida no gameta do genitor no afetado, e casos dos
quais no expresso (no penetrante) ou s expresso de modo sutil em uma
pessoa que herdou o alelo mutante;
Qualquer filho de um genitor afetado tem 50% e risco de herdar a o alelo mutante;
Membros fenotipicamente normais das famlias no transmitem o fentipo afetado
para seus filhos; Homens e mulheres tm iguais probabilidades de transmitir o fentipo
para a prole.
Distrbios que apresentam herana autossmica dominante acondroplasia, distrofia
miotnica, doena adulta do rim policstico, doena de Huntington, hipercolesterolemia
familiar, neurofibromatose (tipos 1 e 2), osteognese imperfeita, retinoblastoma,
Sndrome de Marfan.

3.1.3. Herana Autossmica Recessiva:

Um distrbio que apresenta herana autossmica recessiva s se manifesta no estado
homozigoto, sendo os indivduos afetados portadores dos dois alelos mutantes. Com
raras excees, um destes alelos mutantes ter sido herdado de cada um dos
genitores heterozigotos no afetados (portadores). Trs tipos de combinaes podem
levar a uma prole homozigota afetada por uma doena autossmica recessiva. O alelo
recessivo mutante simbolizado como r e o seu alelo dominante como R. Embora
qualquer combinao na qual cada genitor possua ao menos um alelo recessivo possa
produzir descendncia homozigota afetada, a combinao mais comum aquela entre
dois heterozigotos no afetados.
Portador com portador (R/r

x R/r) R/R

Unio parental Prole Risco para a prole

R/r r/r
no afetados afetado
Portador com afetado (R/r

x r/r) R/r

afetado
no afetado
Afetado com afetado (r/r x r/r) S r/r Todos afetados
Quando dois genitores que so ambos portadores tm filhos, em mdia, deles sero
portadores, ser homozigoto afetado e o restante ser homozigoto normal.
Caractersticas da herana autossmica recessiva
Homens e mulheres so igualmente afetados; Em geral, apenas os membros de uma
famlia so afetados; A probabilidade de que um irmo ou irm de um afetado tambm
seja afetado de 1 em 4 (25%).
Distrbios que apresentam herana autossmica recessiva Albinismo ocolocutneo,
alcaptonria, anemia falciforme, doena de Tay-Sachs, fenilcetonria, fibrose cstica,
hemocromatose, galactosemia, e quase todos os erros hereditrios do metabolismo.

3.1.4. Herana Ligada ao X:

Os cromossomos X e Y, que so responsveis pela determinao do sexo, esto
distribudos desigualmente entre homens e mulheres. Por este motivo, os fentipos
determinados pelos genes localizados no cromossomo X apresentam uma distribuio
sexual caracterstica e um padro de herana que geralmente no fcil de identificar.
Acredita-se que aproximadamente 1.100 genes estejam localizados no cromossomo
X, dos quais sabe-se que 40% so associados a fentipos patolgicos.
Uma vez que os homens possuem somente um cromossomo X, enquanto as mulheres
possuem dois, s existem dois gentipos possveis em homens e trs em mulheres
com respeito a um alelo em um lcus ligado ao X. Um homem com um alelo mutante
em um lcus ligado ao X hemizigoto para aquele alelo, enquanto as mulheres podem
ser homozigotas tanto para o alelo do tipo selvagem quanto para o mutante, ou podem
ser heterozigotas.
Por exemplo, se XH for o alelo de tipo selvagem para o gene do fator VIII de
coagulao e um alelo mutante, Xh, provocar a hemofilia A, os gentipos esperados
em homens e mulheres poderiam ser os seguintes:
Gentipos Fentipos
Homens Hemizigotos XH Hemizigotos Xh
No afetados Afetados
Mulheres Homozigotos XH /XH
Heterozigotos XH /Xh Homozigotos Xh /Xh
No afetados No afetados (normalmente) Afetados
Inativao do cromossomo X, Compensao de doses e a Expresso de Genes
ligados ao X A inativao do X um processo fisiolgico normal no qual um
cromossomo X , em grande parte, inativado nas clulas somticas nas mulheres
normais (mas no nos homens normais), igualando, assim, a expresso da maioria
dos genes ligados ao X em ambos os sexos (Teoria de Compensao de Dose). A
relevncia da inativao do X profunda. Ela faz com que as mulheres possuam duas
populaes celulares, uma na qual um dos cromossomos X est ativo e uma outra na

qual o outro cromossomo X est ativo. Ambas as populaes celulares nas mulheres
so prontamente identificadas para alguns distrbios. Por exemplo, na distrofia
muscular de Duchenne, os portadores femininos exibem a tpica expresso mosaica,
permitindo que sejam identificados pela imunocolorao para a distrofina. Dependendo
do padro de inativao aleatria do X dos dois cromossomos X, duas mulheres
heterozigotas para uma doena ligada ao X podem apresentar quadros clnicos muito
diferentes, uma vez que diferem na proporo de clulas que possuem o alelo mutante
no X ativo em um tecido relevante.
3.1.4.1. Herana Recessiva Ligada ao X:
A herana recessiva ligada ao X segue um padro bem definido e facilmente
identificvel.Uma mutao recessiva ligada ao X tipicamente expressa no fentipo
de todos os homens que a receberam, mas somente nas mulheres que so
homozigotas para a mutao. Conseqentemente, os distrbios recessivos ligados ao
X geralmente esto restritos aos homens e raramente so observados em mulheres.
Caractersticas da herana recessiva ligada ao X a incidncia da caracterstica maior
em homens do que em mulheres; as mulheres heterozigotas geralmente no so
afetadas, mas algumas podem expressar a condio com gravidade varivel,
conforme determinada pelo padro de inativao do X;
O gene responsvel pela condio transmitido de um homem afetado para todas as
suas filhas. Qualquer um dos filhos das suas filhas tem 50% de chance de herda-lo;
O alelo mutante geralmente nunca transmitido por um homem afetado para todas as
suas filhas;
O alelo mutante pode ser mantido atravs de uma srie de portadores femininos; se
assim o for, os homens afetados em uma famlia so aparentados atravs das
mulheres.
Distrbios que apresentam herana recessiva ligada ao X daltonismo verdevermelho, distrofia muscular de Duchenne e Becker, Hemofilia (A e B), Sndrome de
Hunter, deficincia de glicose-6-fosfato desidrogenase.
3.1.4.2. Herana Dominante Ligada ao X:

Um fentipo ligado ao X descrito como dominante se for regularmente expresso em

heterozigotos. A herana dominante ligada ao X pode ser imediatamente distinguida
da herana autossmica dominante pela ausncia de transmisso homem a homem, o
que obviamente impossvel para a herana ligada ao X, uma vez que os homens
transmitem o cromossomo Y, no o X, para os seus filhos. Desse modo, a
caracterstica distintiva de um heredograma dominante ligado ao X completamente
penetrante que todas as filhas e nenhum dos filhos dos homens afetados so
acometidos; se qualquer das filhas no for afetada ou qualquer filho estiver afetado, a
herana dever ser autossmica, e no ligada ao X. O padro de herana por via
feminina no diferente do padro autossmico dominante; uma vez que a mulheres
possuem um par de cromossomos X, assim como possuem pares de autossomos,
cada filho de uma mulher afetada tem 50% de chance de herdar a caracterstica,
independente do sexo. Nas mltiplas famlias com uma doena dominante ligada ao X,
a expresso geralmente mais branda nas mulheres, que quase sempre so
homozigotas, porque o alelo mutante est localizado no cromossomo X inativo em
uma proporo das suas clulas. Portanto, a maioria dos distrbios dominantes
ligados ao X so incompletamente dominantes, como o caso da maioria dos
distrbios autossmicos dominantes.
Caractersticas da herana dominante ligada ao X
Os homens afetados com parceiras normais no tm nenhum filho afetado e nenhuma
filha normal; Tanto os descendentes masculinos quanto os femininos das mulheres
portadoras apresentam o risco de 50% de herdarem o fentipo. O padro do
heredograma semelhante ao observado na herana autossmica dominante As
mulheres afetadas so cerca de duas vezes mais comuns do que os homens, mas
nenhuma mulher afetada possui uma expresso mais leve (embora varivel) do
fentipo. Distrbios que apresentam herana dominante ligada ao X sndrome do X
frgil, raquitismo resistente a vitamina D, sndrome de Rett
3.1.5. Herana Ligada ao Y:
Apenas um pequeno nmero de genes foi identificado no cromossomo Y, a maioria
dos quais envolvidos na determinao da masculinidade e manuteno da
espematognese. Eles incluem o SRY (do ingls, Sex determining Region of the Y
chromosome) e DAZ (do ingles, Deleted in Azoospermia). Um distrbio que ligado ao
Y dito apresentando herana holndrica, e transmitido por um homem para todos
os filhos homens e nenhuma das filhas mulheres.
3.1.6. Herana Pseudo-Autossmica:

A herana pseudo-autossmica descreve o padro de herana observado em genes

na regio pseudo-autossmicados cromossomos X e Y que podem ser permutados
regularmente entre os dois cromossomos sexuais. Alelos para genes na regio
pseudo-autossmica podem exibir transmisso homem a homem e, portanto,
mimetizar a herana autossmica, porque podem fazer crossing-over do X para o Y
durante a gametognese masculina e ser passados a diante a partir de um pai para a
sua descendncia masculina. A discondroenteose (baixa estatura e deforminade do
antebrao) um exemplo de condio pseudo-dominante. Maior prevalncia da
doena foi observada no sexo feminino, se comparado ao masculino, sugerindo um
distrbio dominante ligado ao X, mas a presena da transmisso homem a homem
claramente eliminou uma herana estritamente ligada ao X. O gene SHOX,
responsvel por esta condio, est localizado na regio pseudo-autossmica em Xp
e Yp, escapando da inativao do X.
3.1.7. Herana Materna D A mitocondrial:
Sabe-se que alguns heredogramas de doenas hereditrias que poderiam no ser
explicados pela herana mendeliana tpica de genes nucleares so conhecidos por
causarem mutaes do genoma mitocondrial e por manifestarem uma herana
materna. Distrbios provocados por mutaes do DNA mitocondrial demonstram uma
srie de caractersticas incomuns que resultam das peculiaridades da biologia e da
funo mitocondrial.
Mais de 100 rearranjos diferentes e 100 diferentes pontos de mutao que podem
provocar doena humana foram identificados no mtDNA, freqentemente envolvendo
os sistemas nervoso central e musculoesqueltico. As doenas que resultam dessas
mutaes exibem um padro distintivo de herana devido a trs caractersticas
incomuns da mitocndria: segregao replicativa, homoplasmia e heteroplasmia, e
herana materna.
Segregao replicativa A primeira caracterstica singular do cromossomo
mitocondrial a ausncia da segregao firmemente controlada, observada durante a
mitose e meiose dos 46 cromossomos nucleares. Na diviso celular, as mltiplas
cpias do mtDNA em cada uma das mitocndrias de uma clula se replicam e
distribuem aleatoriamente entre as mitocndrias recm-sintetizadas. As mitocndrias,
por sua vez, so distribudas aleatoriamente entre as duas clulas-filhas. Este
processo conhecido como segregao replicativa.
Homoplasmia e heteroplasmia a segunda caracterstica singular da gentica do
mtDNA provm do fato de que a maioria das clulas contm muitas cpias de

molculas de mtDNA. Quando surge uma mutao no mtDNA, inicialmente ela s est
presente em uma das molculas de mtDNA em uma mitocondria. Com a segregao
replicativa, porm, uma mitocndria contendo um mtDNA mutante ir adquirir mltiplas
cpias da molcula mutante. Com a diviso celular, uma clula contendo uma mistura
de mtDNA normal e mutante pode distribuir propores muito diferentes do DNA
mitocondrial mutante e do tipo selvagem s suas clulas-filhas.Uma clula-filha pode,
por acaso, receber mitocndrias que s contm uma populao pura de mtDNA
normal, ou uma populao pura de mtDNA mutante (uma situao conhecida como
homoplasmia). Alternativamente, a clula-filha pode receber uma mistura de
mitocndrias, algumas com algumasa sem mutao (heteroplasmia). Uma vez que a
expresso fenotpica de uma mutao no mtDNA depende das propores relativas a
de mtDNA normal e mutante nas clulas constituintes dos diferentes tecidos, a
penetrncia reduzida, e a expresso varivel e a pleiotropia so todas caractersticas
tpicas dos distrbios mitocondriais.
Herana materna do mtD A A caracterstica determinante da gentica do mtDNA a
herana materna. As mitocndrias dos espermatozides geralmente so eliminadas do
embrio, de modo que o mtDNA herdado da me. Portanto, todos os filhos de uma
mulher que seja homoplasmtica para uma mutao no mtDNA herdaro esta
mutao, enquanto que nenhum dos descendentes de um homem portador da mesma
mutao herdar o DNA defeituoso.A herana materna de uma mutao
homoplasmtica do mtDNA causadora da neuropatia ptica hereditria de Leber est
exemplificada na figura abaixo.

Heredograma da neuropatia pitica de Leber, uma forma de cegueira espontnea

provocada por um defeito no mtDNA. A herana se d atravs da linhagem materna.
Nenhum homem afetado transmite a doena.
A herana materna na presena de heteroplasmia na me est associada a
caractersticas adicionais da gentica do mtDNA que so de significncia mdica. Em
primeiro lugar, o nmero de molculas de mtDNA no interior de ovcitos em
desenvolvimento reduzido antes de ser subseqentemente amplificado at o imenso
total observado nos ovcitos maduros. Esta restrio e subseqente amplificao do
mtDNA durante a ovocitognese so denominados gargalo gentico mitocondrial.
Conseqentemente, a variabilidade na percentagem de molculas mutantes de
mtDNA observadas na descendncia de uma me com heteroplasmia para uma
mutao no mtDNA provm, ao menos em parte, da amostragem de apenas um

subconjunto de mtDNA durante a ovocitognese. Como poderia ser esperado, as

mes com uma elevada proporo de molculas mutantes de mtDNA esto mais
propensas a produzir vulos com uma proporo mais elevada de mtDNA mutante e,
conseqentemente, apresentam maior probabilidade de ter uma prole clinicamente
afetada do que as mes com uma proporo mais baixa. Uma exceo herana
materna ocorre quando a me heteroplasmtica para uma mutao por deleo no
seu mtDNA; por razes desconhecidas, as molculas removidas de mtDNA
geralmente no so transmitidas das mes clinicamente afetadas para os seus filhos.
Embora as mitocndrias sejam, quase sempre, exclusivamente herdadas por meio da
me, pelo menos um exemplo de herana paterna de mtDNA ocorreu em um paciente
com uma miopatia mitocondrial. Conseqentemente, em pacientes com mutaes
aparentemente espordicas no mtDNA, a rara ocorrncia da herana paterna de
mtDNA deve ser considerada.
Caractersticas da herana mitocondrial
Todos os filhos de mulheres homoplasmticas para uma mutao herdaro esta
mutao; os filhos dos homens portadores de uma mutao semelhante nunca o
faro.
As mulheres heteroplasmticas para mutaes de ponto e duplicaes as passaro
para todos os seus filhos. Todavia, a frao de mitocndrias mutantes na prole, e
conseqentemente, o risco e a gravidade da doena, podem variar consideravelmente
dependendo da frao de mitocndrias mutantes nas suas mes, assim como da
probabilidade aleatria operando sobre um pequeno nmero de mitocndrias por
clula no gargalo dos ovcitos. As delees heteroplasmticas geralmente no so
herdadas.
A frao de mitocndrias mutantes nos diferentes tecidos de um indivduo
heteroplasmtico para uma mutao pode variar tremendamente, provocando, assim,
um espectro de doenas entre os membros de uma famlia na qual haja heteroplasmia
para uma mutao mitocondrial. A pleiotropia e a expressividade varivel nos
diferentes membros afetados da famlia so freqentes.
3.1.8. Fatores que Afetam os Padres de Herana:
Mutaes novas: Se uma criana nasceu com uma doena gentica e no h histrico
da doena na famlia, possvel que a criana seja produto de uma mutao nova
(isto especialmente provvel se a doena em questo for autossmica dominante).

Isto , o gene transmitido por um dos genitores sofreu alterao no DNA, resultando
em uma mutao de um alelo normal para um causador de doena. Os genes neste
lcus nas outras clulas germinativas do genitor seriam normais. Neste caso, o risco
de recorrncia para a prole subseqente do genitor no elevado acima do da
populao em geral. Entretanto, a prole da criana afetada pode ter um risco de
ocorrncia substancialmente elevado. Uma grande proporo dos casos observados
de muitas doenas autossmicas dominantes resulta de mutaes novas. Por
exemplo, estima-se que 7/8 de todos os casos de acondroplasia so devidos a
mutaes novas, enquanto que apenas 1/8 so transmitidas por pacientes
acondroplsicos. Isto ocorre principalmente porque a doena tende a limitar o
potencial de reproduo.
Mosaicismo germinativo: Ocasionalmente, duas ou mais pessoas da prole
apresentaro uma doena autossmica dominante quando no h histrico familiar da
doena. Como a mutao um evento raro, improvvel que isso seja devido a vrias
mutaes na mesma famlia. O mecanismo mais provvel como responsvel
chamado mosaicismo germinativo. Durante o desenvolvimento embrionrio de um dos
genitores, ocorreu uma mutao que afetou toa ou parte da linhagem germinativa, mas
poucas ou nenhuma das clulas somticas do embrio. Assim, o genitor tem a
mutao em sua linhagem germinativa, mas de fato no expressa a doena. Como
resultado, ele (ou ela) pode transmitir a mutao para vrios descendentes. Este
fenmeno, embora relativamente raro, pode ter efeitos significativos nos riscos de
recorrncia, quando ele ocorre. Exemplos de doenas com mosaicismo germinativo
so: acondroplasia, neurofibromatose tipo 1, DMD e hemofilia A.
Idade atrasada de manifestao: Enquanto algumas doenas genticas se expressam
ao nascimento, ou logo aps, muitas outras no so aparentes seno j na vida
adulta. Isto conhecido como idade atrasada de manifestao. O atraso na idade de
incio reduz assim a seleo natural contra um gene de doena, aumentando a sua
freqncia na populao.
Penetrncia reduzida: a probabilidade de que um gene venha, de fato, a possuir uma
expresso fenotpica. Quando a freqncia de expresso de um fentipo de menos
de 100% - ou seja, quando alguns falham completamente em express-los -, diz-se
que o gene exibe uma penetrncia reduzida. A penetrncia um conceito de tudo-ounada. a percentagem de pessoas com um gentipo predisponente que so
afetadas, pelo menos em alguma medida. Estudos familiares mostraram que cerca de
10% dos portadores obrigatrios do gene de suscetibilidade ao retinoblastoma no
possuem a doena. Neste caso, a penetrncia do gene dita ser de 90%.

Expressividade varivel: A expressividade varivel refere-se a intensidade da

expresso do fentipo da doena. As causas da expressividade varivel em geral no
so conhecidas. Efeitos ambientais podem s vezes ser responsveis: na ausncia de
um determinado fator ambiental, o gene se expressa com gravidade diminuda ou
nenhuma. Uma outra causa possvel a interao de outros genes, chamados de
genes modificadores, com o gene da doena. Finalmente, a medida que a base
molecular da mutao torna-se melhor compreendida, fica claro que alguns casos de
expressividade varivel so devidos a tipos diferentes de mutaes (alelos diferentes)
no mesmo lcus de doena. Isto se chama heterogeneidade allica.
Pleiotropia e Heterogeneidade: Os genes que exercem efeitos em mltiplos aspectos
da fisiologia ou anatomia so pleiotrpicos. A pleiotropia uma caracterstica comum
de genes humanos. A sndrome de Marfan (acometimento de olhos, esqueleto e
sistema cardiovascular), a Fibrose Cstica (acometimento das glndulas sudorparas,
pulmes, pncreas) osteognese imperfeita (ossos, dentes e esclera so afetados) e o
albinismo (distrbios na pigmentao e no desenvolvimento da fibra ptica) so
exemplos clssicos de doenas hereditrias com efeitos pleiotrpicos.
Do mesmo modo que um gene pode ter mltiplos efeitos, um nico fentipo de doena
pode ser causado por mutaes em diferentes loci em diferentes famlias. A causa do
mesmo fentipo de doena por mutaes em loci distintos chamada de
heterogeneidade de lcus.
Imprinting genmico: Alguns genes de doenas podem-se expressar diferentemente
quando herdados de um sexo versus o outro. Isto o imprinting genmico. Ele est
associado, e possivelmente causado, pela metilao do DNA.
Antecipao e Expanso de repetio: A antecipao refere-se a uma expresso mais
cedo e mais grave de uma doena. A expanso de repeties de DNA tem sido
demonstrada causando antecipao em algumas doenas humanas (ex.: doenas
neuromusculares e neurodegenerativas). Estas doenas podem ser classificadas em
grupos, dependendo do tamanho da expanso, local da repetio, conseqncias
fenotpicas da expanso, efeito da mutao e genitor no qual ocorreu tipicamente a
grande expanso.
3.2. Anomalias Cromossmicas:
As anomalias cromossmicas so responsveis por uma proporo significativa das
doenas genticas, ocorrendo em aproximadamente um em cada 150 nativivos. Elas
so as causas conhecidas que levam tanto ao retardo mental quanto perda

gestacional. As anomalias cromossmicas so vistas em 50% dos abortos

espontneos do primeiro trimestre e 20% do segundo trimestre. Assim, elas so uma
importante causa de morbidade e de mortalidade.
As anomalias cromossmicas so classificadas em dois grupos: Numrica (quando a
quantidade de cromossomo est aumentada ou diminuda), e Estrutural (quando o
cromossomo apresenta alguma anormalidade na sua estrutura).
Clinicamente, o resultado de uma anomalia cromossmica depende de ocorrer alguma
perda ou ganho de material cromossmico e, com base nisso, as anomalias
cromossmicas podem ser classificadas como balanceadas ou no balanceadas. As
anomalias cromossmicas so no-balanceadas quase sempre tm um efeito adverso
no crescimento e desenvolvimento. Em contrapartida, os rearranjos balanceados
geralmente no tm efeito na pessoa na qual esto presentes, a menos que o
funcionamento de um gene importante tenha sido perturbado por dano em um dos
pontos de quebra do cromossomo. Entretanto, a importncia de se reconhecerem os
rearranjos balanceados est em sua capacidade de causar problemas em futuras
geraes, se um filho herdar um complemento cromossmico no balanceado de um
genitor balanceado.
3.2.1. Anomalias Cromossmicas umricas: 3.2.1.1. Anomalias cromossmicas
numricas do tipo poliploidia
A poliploidia, definida como a presena de um ou mais conjuntos haplides de
cromossomos, raramente vista em humanos. As condies poliplides que foram
observadas em humanos so a triploidia (69 cromossomos em cada ncleo celular ou
3n) e a tetraploidia (92 cromossomos em cada ncleo celular ou 4n). Os cromossomos
adicionais codificam uma grande quantidade de produto gnico excedente, causando
mltiplas anomalias, tais como defeitos cardacos e do SNC.
A poliploidia vista em apenas 1 em 10.0 nativivos, mas essa anormalidade numrica
responde por uma taxa estimada de 15% das anomalias cromossmicas que ocorrem
na concepo. Assim, a grande maioria das concepes poliplides
espontaneamente abortada, e aquelas que sobrevivem at o nascimento tipicamente
morrem logo aps o parto. A causa mais comum da poliploidia a fertilizao de um
ovcito por dois espermatozides (dispermia). O zigoto resultante recebe 23
cromossomos do ovcito e 23 cromossomos de cada um dos dois espermatozides. A
triploidia tambm pode ser causada pela fuso de um ovcito com um glbulo polar,
cada um com 23 cromossomos, e pela subseqente fertilizao por um

espermatozide. A falha meitica, na qual um ovcito ou espermatozide diplide

produzido tambm pode causar um zigoto triplide.
A tetraploidia muito mais rara do que a triploidia, tanto na concepo quanto entre os
nascidos vivos. Os raros casos de tetraploidia conhecidos so provenientes de abortos
espontneos. A tetraploidia pode ser causada por uma falha mittica no incio do
desenvolvimento embrionrio, na qual todos os cromossomos duplicados migram para
uma das clulas-filhas. A tetraploidia tambm pode resultar da fuso de dois zigotos
diplides.
3.2.1.2. Anomalias cromossmicas numricas do tipo aneuploidia
A aneuploidia refere-se a perda ou ganho de um ou mais cromossomos, e assim
podem ser classificadas como monossomias (2n-1) ou trissomia (2n +1). A causa mais
comum de aneuploidia a no-disjuno, a falha de um par de cromossomos em se
separar normalmente durante a meiose. A no-disjuno pode ocorrer durante a
meiose I ou a meiose I e as suas conseqncias so:
Efeitos da no-disjuno na Meiose I metade dos gametas produzidos apresentar
duas cpias do cromossomo (n+1), enquanto que a outra metade no possuir
nenhum (n-1).
Efeitos da no-disjuno na Meiose I metades dos gametas produzidos possuir a
quantidade normal de cromossomos (n), possuir duas cpias do cromossomo
(n+1), e no possuir nenhum (n-1).
3.2.1.2.1. Aneuploidia de Cromossomos Autossomos Monossomia de cromossomos
autossmicos - a monossomia de qualquer cromossomo autossomo incompatvel
com a vida.
Trissomia do cromossomo 21 (sndrome de Down) a trissomia do 21 (caritipo 47, X
+21 ou 47, XY+21), que causa a sndrome de Down, vista em aproximadamente
1/800 a 1.0 nativivos, fazendo dela a condio aneuploide mais comum compatvel
com a sobrevivncia a termo. Os problemas clnicos mais significativos incluem
retardo mental, obstruo do trato gastrointestinal, defeitos cardacos congnitos,
infeco respiratria e leucemia. Os homens com sndrome de Down so quase
sempre estreis; foram relatados apenas dois casos nos quais homens com Down se
reproduziram. Muitas mulheres com esta condio podem ter filhos, embora
aproximadamente 40% no ovulem. Como a reproduo muito incomum, quase
todos os casos de trissomia do 21 podem ser considerados mutaes novas (por no-

disjuno ou por translocao). O cromossomo 21 extra de origem materna em

aproximadamente 90% dos casos. Mosaicismo visto em 2% a 4% dos casos de
sndrome de Down, e freqentemente acompanhado de um fentipo mais brando.
Trissomia dos cromossomos 13 e 18 A trissomia do cromossomo 13 ou Sndrome de
Patau (47, X +13 ou 47, XY+13), vista em cerca de 1/10.0 nascidos, e a trissomia do
18 ou Sndrome de Edwards (47, X +18 ou 47, XY+18), com prevalncia de 1/6.0
nativivos, so algumas vezes compatveis com a vida a termo, embora 95% ou mais
dos fetos afetados sejam abortados espontaneamente. Essas trissomias so muito
menos comuns ao nascimento do que a trissomia do 21, e elas possuem um fentipo
mais seriamente afetado, com 95% de mortalidade durante o primeiro ano de vida.
Assim, como na trissomia do 21, existe um efeito da idade materna importante, e a
mo contribui com o cromossomo extre em aproximadamente 90% dos casos.
3.2.1.2.2. Aneuploidia de Cromossomos Sexuais
Entre os bebs nativivos, cerca de 1/400 meninos e 1/650 meninas possuem alguma
forma de aneuploidia dos cromossomos sexuais. Principalmente devido inativao
do cromossomo X, as conseqncias dessas classes de aneuploidia so menos
severas do que aquelas das aneuploidia autossmicas.
Monossomia do cromossomo X (Sndrome de Turner) esta sndrome, que afeta
preferencialmente as mulheres, comumente causada por um caritipo 45, X. As
principais caractersticas clnicas descritas para esta sndrome so: baixa estatura,
infantilismos sexual, pescoo largo e alado, trax largo e em forma de escudo e
comprometimento cardaco. Mulheres com o diagnstico de Turner apresentam uma
considervel variabilidade quanto ao grau de comprometimento clnico. Este fato foi
associado presena de variaes citogenticas, tais como: o caritipo 45,X,
normalmente relacionado a um maior nmero de alteraes clnicas; e o caritipo
mosaico (45, X/46, X), observado preferencialmente em pacientes com sintomas mais
brandos. Ainda, grande parte das concepes 45, X perdida na fase pr-natal, e
entre aquelas que sobrevivem a termo so na maioria mosaicos cromossmicos. Com
base nestas observaes, provvel que a presena de algumas clulas normais no
feto mosaico contribua para o aumento de sua sobrevida.
Sndrome de Klinefelter esta sndrome est associada ao caritipo 47, XXY e vista
em aproximadamente 1/500 a 1/1.0 nascimentos masculinos. Embora a sndrome de
Klinefelter seja uma causa comum de hipogonadismo primrio no homem, o fentipo
menos marcante do que aquele das sndromes descritas at agora. Homens com a
sndrome de Klinefelter tendem a ser mais altos do que a mdia, com braos e pernas

desproporcionalmente longos. O exame clnico de pacientes ps-pberes revela

testculos pequenos (menos de 10ml) e a maioria dos homens com sndrome de
Klinefelter estril como resultado da atrofia dos tbulos seminferos. Os nveis de
testosterona em adolescentes e adultos so baixos. A ginecomastia vista em
aproximadamente 1/3 dos homens afetados, e leva a um risco aumentado de cncer
de mama. O risco pode ser reduzido por mastectomia. Os plos no corpo so
tipicamente esparsos nos homens ps-pberes, e a massa muscular tende a ser
reduzida. Alm disso, existe uma predisposio para incapacidade de aprendizado e
reduo do QI.
Trissomia do Cromossomo X o caritipo 47, X ocorre em aproximadamente 1/1.0
mulheres e normalmente tem conseqncias benignas. Anomalias fsicas claras so
vistas raramente, mas essas mulheres algumas vezes sofrem de esterilidade,
irregularidade menstrual ou retardo mental leve. Aproximadamente 90% dos casos so
resultado de no-disjuno na me e, assim como as outras trissomias, a incidncia
aumenta entre a prole de mulheres mais velhas. Tambm foram detectadas mulheres
com 4, 5 ou at mais cromossomos X. Cada cromossomo X adicional acompanhado
por retardo mental aumentado e anomalias fsicas.
Sndrome 47, XYY a ocorrncia deste caritipo de 1/1.0 homens. Os portadores
desta sndrome tendem a ser mais altos do que a mdia e possuem uma reduo de
10 a 15 pontos no QI e poucos problemas fsicos.
3.2.2. Anomalias Cromossmicas Estruturais:
As anomalias estruturais dos cromossomos podem ser no-balanceadas (quando o
rearranjo causa um ganho ou perda de material cromossmico) ou balanceadas
(quando o rearranjo no produz uma perda ou um ganho de material cromossmico).
Ao contrrio da aneuploidia e da poliploidia, anomalias estruturais balanceadas
freqentemente no produzem conseqncias srias para a sade. Entretanto, as
anomalias estruturais nobalanceadas podem comprometer o desenvolvimento do
indivduo portador e de sua prole.
3.2.2.1. Anomalia cromossmica estrutural do tipo translocao
Uma translocao o intercambio de material gentico entre cromossomos no
homlogos. Translocaes balanceadas representam uma das aberraes
cromossmicas mais comuns nos seres humanos, ocorrendo em 1/500 a 1.0. Existem
dois tipos bsicos de translocaes, denominadas translocaes recprocas e
translocaes balanceadas.

Translocaes recprocas as translocaes recprocas acontecem quando ocorrem

quebras em dois cromossomos diferentes e os segmentos cromossmicos so
mutuamente intercambiado. Os cromossomos resultantes so denominados
cromossomos derivados. O portador de uma translocao recproca normalmente no
afetado porque possui um complemento normal do material gentico. Entretanto, a
prole do portador pode ser normal, pode portar a translocao ou ter duplicaes ou
delees de material gentico.
Translocaes robertsonianas nesta classe de translocao, os braos curtos de
dois cromossomos acrocntricos (13, 14, 15, 21 e 2) so perdidos e os braos longos
se fundem no centrmero para formar um nico cromossomo. Esse tipo de
translocao confinado aos cromossomos acrocntricos porque o brao curto
desses cromossomos muito pequeno e no contem material gentico essencial.
Quando uma translocao robertsoniana ocorre, os braos curtos so normalmente
perdidos durante as divises celulares subseqentes. Como os portadores da
translocao robertsoniana no perdem materiais genticos essencial, eles so
fenotipicamente normais, mas possuem apenas 45 cromossomos em cada clula.
Suas proles, entretanto, podem herdar um brao longo ausente ou extra de um
cromossomo acrocntricos.
Delees uma deleo causada por uma quebra cromossmica e subseqente
perda de material genmico. Uma nica quebra levando a perda que inclui a ponta do
cromossomo denominada deleo terminal. Quando ocorrem duas quebras e o
material genmico entre elas perdido, ocorre uma deleo intersticial. As delees
visveis microscopicamente geralmente envolvem a perda de muitos genes, e as
conseqncias de se perder essa quantidade de material gentico, mesmo sendo de
apenas um membro do par de cromossomos, podem ser severas. Um exemplo bem
conhecido de sndrome de deleo cromossmica a sndrome de cri-du-chat (do
francs, miado de gato) que se refere ao choro caracterstico das crianas com esta
sndrome. Esse choro normalmente se torna menos bvio medida que a criana
cresce, tornado o diagnstico clnico mais difcil aps os dois anos de idade. A
sndrome de cri-du-chat causada por uma deleo do brao curto distal do
cromossomo 5: o caritipo 46, X, Del (5p). Vista em aproximadamente 1/50.0
nativivos, ela tambm caracterizada por retardo mental (QI em torno de 35),
microcefalia, e uma aparncia facial caracterstica. A sobrevivncia at a vida adulta j
foi observada, mas no comum.
Duplicaes uma trissomia parcial, ou duplicao, de material gentico pode ser
vista na prole de indivduos que portam uma translocao recproca. Duplicaes
podem tambm ser causadas por crossing desigual durante a meiose, como descrito
para os loci da viso em cores ligados ao X e para a doena de Charcot-Marie-Tooth.

As duplicaes tendem a produzir conseqncias menos srias do que as delees,

novamente ilustrando o princpio de que a perda de material genmico mais sria do
que o seu excesso.
Cromossomo em anel as delees algumas vezes ocorrem em ambas as
extremidades de um cromossomo. Nestes casos, ass terminaes remanescentes do
cromossomo podem ento se fundir, formando um cromossomo em anel. Se o
cromossomo em anel inclui o centrmero, ele pode freqentemente continuar atravs
da diviso celular, mas sua estrutura pode criar dificuldades. Os cromossomos em
anel so freqentemente perdidos, resultando em monossomia para o cromossomo
pelo menos em algumas clulas (i.e., pode ser visto mosaicismo para o cromossomo
em anel). Cromossomos em anel foram descritos em pelo menos um caso para cada
um dos cromossomos humanos.
Inverses uma inverso o resultado de duas quebras, em um cromossomo, e
posterior reinsero do fragmento perdido em seu stio original, mas na ordem
invertida. Se a inverso inclui o centrmero, ela denominada inverso pericntrica.
Inverses que no envolvem o centrmero so denominadas inverses paracntricas.
Assim como as translocaes recprocas, as inverses so um arranjo estrutural
balanceado. Conseqentemente, elas raramente produzem doenas no portador da
inverso. As inverses podem interferir com a meiose, entretanto, produzindo
anomalias cromossmicas na prole dos portadores da inverso. Como os
cromossomos devem se alinhar em perfeita ordem durante a prfase I, um
cromossomo com uma inverso deve formar uma laa para se alinhar com seu
homlogo normal. O crossing dentro dessa ala pode resultar em duplicaes ou
delees nos cromossomos das clulas-filhas. Assim, a prole de indivduos portadores
de inverses freqentemente possu5 we delees cromossmicas ou duplicaes.
Estima-se que 1/1.0 pessoas porte uma inverso e esteja, dessa forma, em risco de
produzir gametas com duplicaes ou delees.
Isocromossomo algumas vezes um cromossomo se divide ao longo do eixo
perpendicular ao seu eixo normal de diviso. O resultado um isocromossomo, um
cromossomo que tem duas cpias de um brao e nenhuma cpia do outro. A maioria
dos isocromossomos observados em nativivos envolve o cromossomo X, e indivduos
com isocromossomos Xq (46, X,i[Xq]) normalmente possuem caractersticas da
sndrome de Turner. O isocromossomo 18q, que produz uma cpia extra do brao
longo do cromossomo 18, foi observado em bebs com a sndrome de Edwards.
Embora a maioria dos isocromossomos parea ser formada por falhas na diviso, eles
tambm podem ser criados por translocaes robertsonianas de cromossomos
acrocntricos homlogos (ex.: translocao robetsoniana dos dois braos longos do
cromossomo 21).

3.3. Herana Polignica:

O termo multifatorial atribudo ao modo de transmisso apresentado por um grande
nmero de distrbios que possuem agregao famlia, mas que no esto de acordo
com o padro reconhecido de herana monognica. Estes distrbios incluem vrias
malformaes congnitas comuns (fenda labial e palatina, defeitos de fechamento do
tubo neural) e distrbios desenvolvidos na vida adulta (diabetes, doena arterial
coronariana, hipertenso). O mecanismo gentico envolve a interao de inmeros
genes, cada um com efeito discreto (polignico), com fatores ambiental.
3.3.1 Identificao de um distrbio multifatorial
Por definio, os distrbios multifatoriais tm um componente familial que no pode
ser explicado por herana mendeliana simples, e conseqentemente no h mtodos
estatsticos capazes de detectar com segurana o risco de recorrncia do carter
numa famlia. Diante disso, tornase importante o rastreamento de caractersticas que
permitam predizer se um distrbio possui ou no um componente gentico importante.
Para tanto, utiliza-se abordagem, tais como e estudo de agregao familiar e de
concordncia entre gmeos.
3.3.1.1. Agregao famlia
Doenas de herana complexa normalmente demonstram agregao familiar porque
mais provvel que os parentes de um indivduo afetado tenham os mesmos alelos que
predispem s doenas em comum com a pessoa afetada do que com indivduos no
relacionados. A agregao familiar de uma doena pode ser medida por meio da
comparao da freqncia da doena nos parentes do probando afetado com a
freqncia
(prevalncia) na populao geral. A razo do risco relativo r definida como:
geralapopulaoadadoenanprevalenci
aafetadadeumapessoosparentesadadoenanprevalenci r=
O valor de r a medida da agregao familiar que depende do risco de recorrncia
da doena na famlia e da prevalncia na populao; quanto maior o r, maior a
agregao familiar. A prevalncia da populao faz parte do calculo porque, pois
quanto mais comum for a doena, maior a probabilidade da agregao ser apenas

uma coincidncia e menor a probabilidade de ser resultante do compartilhamento de

alelos que predispem a doena.
A anlise da taxa de concordncia em gmeos pode dar uma valiosa informao sobre
a contribuio relativa de genes e ambiente em causar um determinado distrbio. Os
gmeos so denominados de concordantes se ambos forem afetados ou no
afetados; eles so discordantes se apenas um for afetado. Aproximadamente um tero
dos gmeos so monozigticos (MZ); os restantes dois teros so dizigticos (DZ). Os
gmeos MZ surgem de um nico zigoto fertilizado, que se dividiu em dois, e, portanto
so geneticamente idnticos. Os gmeos DZ surgem quando dois ovcitos so
fertilizados por dois espermatozides diferentes; e portanto, compartilham em mdia
50% de seus genes.
Se uma condio exclusivamente gentica, as taxas de concordncia geralmente
so de100% em gmeos MZ,mas muito menos em gmeos DZ. Se uma condio for
multifatorial, ento a taxa de concordncia maior nos gmeos MZ que nos gmeos
DZ, mas raramente to alta quanto 100%. Finalmente, se um distrbio
exclusivamente de origem ambiental, ento a taxa de concordncia em MZ e DZ ser
aproximadamente igual.
3.3.2. Abordagens para encontrar genes de suscetibilidade
A identificao de genes que contribuem para distrbios multifatoriais uma rea de
intensa atividade, que visa identificar genes que tenham um papel importante para o
aumento da suscetibilidade de distrbios comuns da vida adulta de modo a
desenvolver testes para a sua deteco prclnica e novos enfoques com base
gentica para a sua preveno e tratamento. Infelizmente, os progressos tm sido
desanimadores, aponto de, aps mais de uma dcada de grandes investimentos e
pesquisa, s terem sido identificados alguns genes de suscetibilidade de doenas
multifatoriais. Para tanto, foram aplicadas trs estratgias principais: anlise de
ligao, estudos de associao e desequilbrio de ligao.
3.3.2.1. Anlise de ligao
O mtodo mais comumente usado envolve a anlise de pares de irmos afetados mais
freqentemente do que seria esperado pelo acaso (figura 2). Em mdia, os pares de
irmos seriam esperados compartilhando, 2, 1 ou 0 alelos em um determinado lcus
em uma proporo de 1:2:1. Se identificado um lcus no qual um grande nmero de
pares de irmos com um determinado distrbio apresenta desvio estatstico

significativo desta proporo, ento isto indica que os alelos neste lcus, ou em um
lcus adjacente ligado, esto de algum modo implicados em causar a doena.

Figura 2: A lgica do uso de pares de irmos afetados na anlise de ligao

Em um estudo tpico, uma amostra com pelo menos 200 pares de irmos afetados
seria analisada juntamente com seus pais e cerca de 300 loci igualmente espaados
usando-se um painel de microssatlites polimrficos (SNPs).Isto gera uma
probabilidade significativa de se detectar ligao. Anlise matemtica feita usandose os programas de computao, tais como MAPMARKER/SIBS ou GENEHUNTER.
Este tipo de anlise de ligao, nomeada de escaneamento total do genoma (GWAs),
uma poderosa ferramenta na deteco de loci candidatos suscetibilidade.
Entretanto, os dados obtidos precisam ser validados em diferentes populaes com o
intuito de eliminar possveis resultados do tipo falso-positivo. Sendo assim, o passo
seguinte utilizar estratgias de estudos de associao e de desequilbrio de ligao.
3.3.2.2. Estudos de associao
Os estudos de ligao envolvem a anlise de um grande painel de marcadores, tais
como os SNPs, em geral usando-se a tecnologia de microarranjos numa amostra
numerosa. Esta abordagem visa detectar associaes, estatisticamente significativas,
entre um ou mais marcadores e a doena multifatorial sob investigao. A
desvantagem deste mtodo que uma associao aparente pode de fato no ser
causualmente relevante devido aos seguintes fatores:
A associao espria devido a um erro estatstico. Se um nmero suficientemente
grande de marcadores analisado, possvel que, apenas por acaso, um ou mais
apresentem uma aparente associao estatstica com a doena;
A associao pode ser espria devido a estratificao a populao. Isto significa que
tanto o distrbio quanto o alelo aparentemente associado so comuns na populao
que est sendo estudada;
3.3.2.3. Desequilbrio de ligao

Uma vez que tenha sido feita a localizao aproximada com base na anlise de
ligao ou estudos de associao, a etapa seguinte geralmente envolve uma tentativa
de situar a regio candidata usando-se a abordagem de desequilbrio de ligao. A
lgica desse enfoque baseada na hiptese de que a maioria dos membros afetados
da populao em estudo compartilhariam um mesmo segmento genmico curto,
equivalente a um hapltipo em comum, circundado por alelos de suscetibilidade.
Assim, uma vez identificada a(s) regio(es) de interesse, esta(s) (so) analisada(s)
usando-se marcadores polimrficos (geralmente SNPs) a fim de estreitar a regio de
interesse, para ento tentar identificar de genes candidatos. Infelizmente, este
processo no fcil, uma vez que: 1) grupos tnicos ou populaes diferentes podem
desenvolver a mesma doena por motivos totalmente diferentes e, portanto, ter fatores
genticos de risco distintos; e 2) em populaes heterogenias provvel que muitos
alelos de suscetibilidade estejam presentes, o que dificulta a deteco de eventos de
desequilbrio de ligao.
3.3.3. Exemplos de distrbios multifatoriais:
Doena de Alzheimer esta doena a causa mais comum de demncia senil e prsenil, com uma prevalncia de cerca de 20% em pessoas com mais de 80 anos de
idade. Na maioria das famlias acometidas, observa-se que um padro de herana
multifatorial. Estudos por anlise de ligao, realizados em famlias com casos da
doena, permitiram a deteco de um lcus polimrficos no cromossomo 19 associado
doena. A presena de alelos de risco no gene da apolipoprotena E (ApoE) est
freqentemente aumentada em pacientes com o diagnstico de Alzheimer a ponto de
que as chances dos portadores dos alelos de risco vir a desenvolver a doena de
cerca de 35% para os homens e 50% para as mulheres. Estudos de ligao sugerem
que ainda existam quatro outros genes que conferem suscetibilidade a doena.
Diabetes mellitus tipo 1 esta forma relativamente rara, com prevalncia de 1/200,
geralmente se apresenta na infncia ou no incio da idade adulta. Esta doena
causada pela destruio das clulas pancreticas que produzem insulina. Tanto os
estudos familiais quanto de gmeos so consistentes com a herana multifatorial. O
risco de recorrncia para irmos e prole da pessoa afetada de 5-6%. As taxas de
concordncia em gmeos MZ e DZ so de aproximadamente 30-49% e de 5-10%,
respectivamente. A pesquisa de genes de suscetibilidade identificou dois loci definidos.
O primeiro o lcus IDDM1, onde se situa o gene HLA, que contribui com 30-40% da
suscetibilidade total. Cerca de 95% das pessoas afetadas e portadoras tm o antgeno
HLA-DR3 e/ou HLA-DR4, enquanto que eles so encontrados em apenas 50% da
populao geral. O segundo lcus, IDDM2, inclui o gene de insulina no cromossomo 1,
juntamente com a regio que contem vrias cpias de seqncias microssatlites

repetida de 14pb. Um curto nmero de repetio confere suscetibilidade diabetes

tipo 1, provavelmente reduzindo a expresso do gene da insulina.
Diabetes mellitus tipo 2 a diabetes tipo 2 afeta aproximadamente 5% dos adultos
aps os 45 anos. Os riscos para parentes em primeiro grau so de 10-15%, ou seja,
duas a trs vezes o risco da populao geral, e a taxa de concordncia para gmeos
MZ de 90%; logo, a evidencia em favor de uma etiologia gentica forte. O
progresso em encontrar genes que contribuem para a forma comum de manifestao
tardia do diabetes tem sido lento. Os estudos de ligao e associao identificaram
mais de 20 loci diferentes, mas freqentemente os achados originais no foram
replicados com estudos subseqentes dando resultados conflitantes.
MDULO 4: GE TICA DO C CER
O cncer um importante problema de sade pblica mundial devido a sua elevada
taxa de mortalidade. Dados da Organizao Pan-Americana da Sade (OPAS, 2002)
indicaram que o cncer responsvel por mais de 15% de todas as causas de morte
no mundo tanto em pases desenvolvidos, quanto em desenvolvimento. No Brasil, um
levantamento feito realizado em 2003 pelo Ministrio da Sade mostrou que o cncer
ataca mais de um tero da populao brasileira. O cncer, se no tratado,
invariavelmente fatal. O diagnstico precoce e o tratamento imediato so vitais, assim
como a identificao de pessoas com risco aumentado de cncer, antes do seu
desenvolvimento, constitui-se um importante objetivo da pesquisa do cncer.
O cncer uma coleo de doenas que compartilham a caracterstica comum de
crescimento celular incontrolado. Vrios eventos-chave precisam ocorrer para as
clulas escaparem das restries que evitam a proliferao incontrolada, tais como: 1)
sinais adicionais de crescimento dever ser produzidos e processados e as clulas
devem tornar-se resistentes aos sinais que normalmente inibem o crescimento; 2)
como estas caractersticas anormais tipicamente levariam ao processo de morte
celular programada (apoptose), as clulas devem de alguma forma invalidar este
processo; 3) a massa de clulas crescentes (tumor) requer nutrio, ento um novo
abastecimento sanguneo deve ser obtido pela angiognese (formao de novos
vasos sanguneos); 4) sinais inibitrios adicionais devem ser superados para que o
tumor atinja um estado maligno, tornando-o capaz de invadir os tecidos prximos e se
espalhar (metstase) para locais mais distantes no corpo. A capacidade de invadir e
de formar metstase distingue as neoplasias malignas das benignas.
4.1.Mecanismos bsicos de controle da proliferao celular:

Um componente da regulao celular mediado por sinais externos que chegam as

clulas pelos fatores de crescimento (fatores de crescimentos derivados de plaquetas,
fatores de crescimento epidermais, hormnios esterides) produzidos por outras
clulas. Cada fator de crescimento interage com um receptor de crescimento
especfico situado na superfcie da clula. A ligao de um fator de crescimento ativa o
receptor, disparando molculas que enviam mensagens para o ncleo da clula em
um processo chamado de transduo de sinal. As molculas transportadoras deste
sinal incluem cinases proticas, tais como tirosina cinase src, a cinase protica ativada
por mitgeno (mapK) e a cinase jun (junK), que podem alterar a atividade de protenas
alvo atravs de sua fosforilao. O estgio final da via de transduo de sinal a
regulao da transcrio de DNA no ncleo. Os componentes da cascata de
transduo de sinal interagem com fatores de transcrio nuclear que regulam a
atividade de genes especficos cujos produtos proticos influenciam o crescimento
celular e a proliferao. Os genes que codificam estes fatores de transcrio incluem
MYC, FOS e JUN.
Depois de vrios ciclos de diviso celular, as clulas normalmente recebem sinais que
as dizem para pararem o crescimento e se diferenciarem em clulas especializadas.
Os sinais podem vir de polipeptdeos, de hormnios esterides, do contato direto com
clulas adjacentes, ou de programas internos que definem o nmero de divises
celulares permitidas. Os sinais so transduzidos at o ncleo da clula receptora.
Nesse caso, por meio da alterao dos padres de transcrio dos genes que
governam os padres do ciclo celular, eles reprimem genes que promovem a diviso
celular e induzem genes que inibem a entrada no ciclo de diviso celular.
mudanas envolve mutaes, e a necessidade de mltiplas alteraes molecular foi
caracterizada como multi-evento (multi-hit) da carcinognese
Uma clula tumoral pode emergir a partir de uma populao de clulas em
crescimento por meio do acmulo de mutaes nestes genes regulatrios. Ainda que
estas mutaes ocorram apenas raramente, estas clulas podem deixar de responder
aos sinais de diferenciao e continuarem a se dividir ao invs de entrarem no
programa de diferenciao normal. Mais ainda, o cncer parece ser quase sempre
resultado de uma srie de eventos progressivos que aumentam a extenso da
desregulao dentro da linhagem celular. Finalmente, emerge uma clula cujos
descendentes se multiplicam sem os controles apropriados Mudanas adicionais do a
estas clulas capacidade de invadirem tecidos adjacentes e formarem metstase.
Cada uma destas
4.2. Classes de genes envolvidos no desenvolvimento do cncer:

O desenvolvimento do cncer (carcinognese) resulta de mutaes em genes que

regulam a proliferao celular e a morte celular programada. Os genes nos quais as
mutaes causam cncer so classificados em duas categorias: os oncogenes e os
genes supressores tumorais (genes de manuteno e genes de controle).
O catlogo de genes envolvidos no cncer inclui tambm genes que so transcritos
em RNAs no-traduzidos a partir dos quais microRNAs (miRNAs) reguladores so
gerados. Existem pelo menos 250 miRNAs no genoma humano que realizam a
inibio mediada por RNA da expresso de seus genesalvo codificadores de
protenas, ou por induzirem a degradao dos seus mRNAs-alvo ou por bloquearem
sua traduo. Aproximadamente, 10% dos miRNAs so encontrados hiperexpressos
ou inibidos em vrios tumores, que so referidos como oncomirs. A hiperexpresso de
alguns miRNAs pode suprimir a expresso de genes-alvo supressores de tumores,
enquanto que a perda de funo de outros miRNAs pode permitir a hiperexpresso de
oncogenes que eles regulam. Como cada miRNA pode regular at 200 genes-alvo
diferentes, a hiperexpresso ou a perda de funo dos miRNAs pode ter amplos
efeitos oncognicos porque muitos genes estaro desregulados.
Um oncogene um proto-oncogene mutante cuja funo ou expresso alterada
resulta na estimulao anormal da diviso e proliferao celular. As mutaes
responsveis pela ativao de um oncogene podem promover o ganho de funo na
seqncia que codifica os elementos reguladores ou ainda um aumento do nmero de
cpias genmicas, levando a uma funo heterecrnica ou ectpica desregulada do
produto do oncogene. Os oncogenes tm um efeito dominante em nvel celular; isto ,
quando ele ativado ou hiperexpresso, um nico alelo mutante suficiente para iniciar
a mudana no fentipo de uma clula, de normal para maligno.
Os oncogenes ativados codificam protenas que agem muitas etapas na via que
controla o crescimento celular, tais como: 1) fatores de crescimento que estimulam a
diviso celular (ex. SIS); 2) receptores (ex: ERBB, FMS) e protenas citoplasmticas
que traduzem esses sinais (ex. famlia RAS e ABL); 3) protenas nucleares ligantes a
DNA e fatores de transcrio que respondem aos sinais traduzidos (MYC e JUN); e 4)
protenas que impedem a morte celular programada (temolerase e protenas
antiapoptticas).
4.2.1.1.Ativao de Oncogenes:
A ativao de oncogenes compreende um ganho de funo que pode ser quantitativo
(aumento de produo de um produto inalterado) ou qualitativo (sntese de um produto
sutilmente modificado em conseqncia de uma mutao ou sntese de um produto

novo por um gene quimrico criado por rearranjo cromossmico). Essas mudanas
so dominantes e normalmente afetam um s alelo do gene.
Ativao do Oncogene por amplificao gnica: A amplificao gnica um fenmeno
caracterizado pela presena de mltiplas cpias normais de um gene ou de um
segmento genmico na clula, resultando no aumento do nvel da expresso gnica. A
amplificao gnica comum em muitos cnceres, incluindo neuroblastoma,
gliobastomas e cncer colorretal. Os segmentos amplificados do DNA so
prontamente detectados por tcnicas de citogentica molecular (hibridizao genmica
comparativa) ou convencional (bandeamento cromossmico). Neste ltimo caso, a
amplificao gnica pode se apresentar como cromossomos acessrios muito
pequenos (diminutos duplos) ou como regies de colorao homognea (regies
genmica que normalmente no so bandeadas e contm mltiplas cpias
amplificadas de um segmento particular de DNA). Como e por que os diminutos duplos
ou as regies de colorao homognea ocorrem ainda pouco compreendido, mas
sabe-se que as regies amplificadas incluem cpias extras e normais de protooncogenes, tais como os genes que codificam myc, ras e o receptor de crescimento
epitelial, que estimulam o crescimento celular ou bloqueiam a apoptose, ou ambos.
Ativao do Oncogene por mutaes pontuais: O gene H-RAS pertence a uma famlia
de genes que codificam protenas envolvidas na transduo de sinais dos receptores
acoplados protenas G. Um sinal do receptor desencadeia a ligao da GTP
protena RAS e o complexo GTP-RAS retransmite o sinal na clula. A protena RAS
tem atividade de GTPase, logo o complexo GTP-RAS convertido rapidamente em
GDP-RAS inativo. Mutaes pontuais especficas nos genes RAS so encontradas
freqentemente nas clulas de vrios tumores, como os de cncer de colo, de pulmo,
de mama e de bexiga. Elas levam substituio de aminocidos, que fazem diminuir a
atividade de GTPase da protena RAS. Em conseqncia, o sinal de GTP-RAS
inativado mais lentamente e a resposta celular ao sinal do receptor se torna excessiva.
O RAS mutante estimula o crescimento da linhagem celular, transformando-a, portanto
em um tumor.
Ativao do Oncogene por translocaes cromossmicas: Nem sempre os oncogenes
so resultados de uma mutao do DNA. Em alguns casos, um oncogene ativado
por uma mutao cromossmica, geralmente atravs de translocao. Mais de 40
translocaes cromossmicas oncognicas foram descritas, principalmente em
leucemias espordicas e linfomas.Em alguns casos, os pontos de quebra das
translocaes so dentro de introns de dois genes, fusionando dois genes em um
gene anormal que codifica uma protena quimrica com novas propriedades
oncognicas. O exemplo mais bem conhecido a translocao entre os cromossomos
9 e 2 que observada na leucemia meilide crnica. Neste caso, a translocao move

o proto-oncogene ABL (gene da tirosina quinase) da sua posio normal no

cromossomo 9q para a regio de grupo de ponto de quebra do gene BCR (do ingls
breakpoint cluster region) no cromossomo 22q. A justaposio permite a sntese de
uma protena quimrica que maior do que a protena abl normal e que tem a
atividade da tirosina quinase aumentada. O aumento da atividade da tirosina quinase
da nova protena codificada pelo gene quimrico constitui-se no evento primrio que
causa a leucemia mielide crnica. Uma nova e altamente eficiente terapia para a
leucemia mielide crnica foi desenvolvida com a droga imatinibe e baseada na
inibio dessa atividade da tirosina quinase quimrica.
Em outros, a translocao ativa um oncogene colocando-o em seguida a um forte
promotor constitutivo, que pertence a outro gene. Dois exemplos bem conhecidos so
a translocao entre os cromossomos 8 e 14 no linfoma de Burkitt e a translocao
envolvendo o cromossomo18 no linfoma de clulas B.
Na maioria dos tumores do linfoma de Burkitt, o proto-oncogene MYC translocado de
sua posio cromossmica normal em 8q24 para uma posio distal no lcus da
cadeia pesada da imunoglobulina em 14q32. Citogeneticamente, essa mutao vista
como uma translocao 8;14 aparentemente balanceada. Entretanto, a translocao
coloca o acentuador ou outras seqncias de ativao transcricional, normalmente
associadas a genes da imunoglobulina, perto do gene MYC. O efeito dessa
translocao a expresso desregulada do gene MYC, que resulta em crescimento
celular descontrolado. A protena myc um fator de transcrio com efeitos potentes
na expresso de vrios genes envolvidos na proliferao celular como tambm na
expresso da telomerase.
O primeiro gene apopttico implicado no cncer foi identificado no linfoma espordico
de clula B. Em quase todos os linfomas de clula B do tipo folicular, um gene, o
BCL2, localizado em 18q21, foi encontrado ativado por uma translocao
cromossmica t(14;18) que colocou o gene sob um forte promotor e acentuador do
gene da cadeia pesada de imunoglobulina, localizado em14q32. A protena codificada
pelo BCL2 uma protena de membrana interna mitocondrial com potentes efeitos
antiapoptticos nas clulas B. A expresso prolongada e inapropriada desse gene,
ativada pelo promotor da imunoglobulina, resulta em expanso macia de clulas B,
no por causa da proliferao aumentada, mas porque a apoptose normal dessas
clulas est inibida.
4.2.2. Genes Supressores Tumorais (GST):
Enquanto as protenas codificadas pelos oncogenes promovem o cncer, as mutaes
nos genes supressores de tumor contribuem para a malignidade por um mecanismo
diferente, isto , atravs da perda de funo de ambos os alelos de um gene. Os GSTs

so altamente heterogneos. Alguns suprimem realmente os tumores por regulares o

ciclo celular ou por causarem a inibio do crescimento pelo contato clula-clula; os
GSTs desse tipo so denominados de genes de controle porque eles regulam
diretamente o crescimento celular. Os GSTs de controle codificam: 1) os reguladores
de vrios pontos de checagem do ciclo celular (RB1, TP53); e 2) mediadores da morte
celular programada (DCC, VHL). Outros GSTs, os de manuteno, esto envolvidos
no reparo de danos ao DNA e na manuteno da integridade genmica. A perda de
ambos os alelos de genes que esto envolvidos no reparo de danos ao DNA ou
quebras cromossmicas leva diretamente ao cncer, pois permite que mutaes
secundrias adicionais se acumulem ou em proto-oncogenes ou em outros GSTs. Os
GSTs de manuteno codificam: 1) protenas responsveis pela deteco e pelo
reparo das mutaes (BRCA1 e BRCA2); 2) protenas envolvidas na disjuno e
normal dos cromossomos durante a mitose; e 3) componentes da maquinaria da morte
celular programada.
4.2.2.1.Genes de Regulao do ciclo celular (gatekeepers):
Gene Supressor Tumoral RB1- O produto do gene RB1 uma fotoprotena que
hipofosforilada e depois hiperfosforilada em diferentes estgios do ciclo celular. No seu
estado hiperfosforilado, bloqueia a progresso do ciclo celular no limite entre as fases
G1 e S, inibindo assim, a entrada na fase S pela liberao de fatores que promovem a
sntese de DNA. medida que a Rb1 se torna progressivamente mais fosforilada,
libera seus parceiros de ligao protena, permitindo a entrada da clula na fase S;
durante o curso do ciclo celular, a Rb1 , ento, progressivamente defosforilada, o que
permite que ela funcione novamente como bloqueio de entrada para a fase S do
prximo ciclo celular. A perda do gene Rb1 priva as clulas de um importante ponto
mittico de checagem e permite a proliferao descontrolada. O gene Rb1 , portanto,
um tpico GST de regulao. digno de nota que o Rb1 mutado em grande nmero
de linhagens celulares derivadas de certos outros tumores durante sua progresso.
Gene Supressor Tumoral TP53 - A protena p53 uma protena de ligao ao DNA
que parece ser um componente importante da resposta celular aos danos no DNA.
Alm de ser um fator de transcrio que ativa a transcrio de genes que cessa a
diviso celular e permite o reparo de danos ao genoma, a TP53 parece, tambm, estar
envolvida na induo de apoptose de clulas que tenham sofrido danos irreparveis
ao DNA. Portanto, a perda de funo da TP53 permite que clulas com o DNA
danificado sobrevivam e se dividam, propagando, assim, as mutaes potencialmente
oncognicas. O gene TP53 pode, portanto, ser considerado tambm um GST de
regulao.
Gene Supressor Tumoral F1: A inspeo de seqncias do gene da neurofibromina
(NF1) e seus produtos proticos demonstraram uma homologia significativa com as

protenas que ativam a atividade da GTPase do produto do oncogene RAS. Esse

achado sugere fortemente, que p produto do NF1 normal interage com um membro
desconhecido da famlia do gene RAS para regulara atividade proliferativa em clulas
normais.O gene mutante NF1 falha na regulao do crescimento em clulas normais,
a partir das quais se originam os neurofibromas observados em pacientes com
neurofibromatose tipo 1, levando a um crescimento inapropriado e a formao de
tumores.
Mutaes somticas de perda de funo foram encontradas em NF1 em vrios
tumores, incluindo cncer colorretal, melanoma, e neuroblastoma. As mutaes na
linhagem germinativa em NF1 causam a neurofibromatose tipo1.
4.2.2.2.GTS de Manuteno (caretakers): genes que atuam em mecanismos de reparo
do D A
Existem vrios sistemas complexos para reparar danos no DNA, decorrentes de
agentes mutagnicos extrnsecos (radiao ionizante, luz ultravioleta, agentes
qumicos mutagnicos) ou por erros intrnsecos na replicao do DNA. Estes sistemas
usam vrias famlias de enzimas para desenrolar a dupla hlice (helicases), remover o
DNA anormal (endonucleases e exonucleases), sintetizar um novo seguimento de
DNA (polimerase) e unir os novos filamentos (DNA ligases). Erros em qualquer um
destes sistemas podem levar ao acmulo de mutaes em oncogenes e genes
supressores tumorais, levando por sua vez formao de tumores. Processos
relevantes conhecidos como associados a sndromes especficas de predisposio ao
cncer incluem a exciso de nucleotdeos, reparo de quebras bifilamentares, e o
reparo de pares de bases mal pareadas.
Impedimento de exciso de nucleotdeos: O reparo por exciso de nucleotdeos
envolve uma via que comea com a deselicoidizao da cromatina, seguido da
exciso de nucleotdeos no filamento danificado, e completado pela sntese e
integrao do novo DNA pela DNA polimerase e DNA ligase. A capacidade reduzida ou
ausente do reparo global do genoma ou do reparo ps-replicao representa a perda
das funes necessrias para a manuteno da integridade do genoma, e resulta em
acmulo de mutaes oncognicas. As neoplasias cutneas de pacientes com o
xeroderma pigmentoso possuem um nvel elevado de mutaes de oncogenes e de
GSTs, do que os tumores da populao normal, e tais mutaes parecem ser
altamente especficas do UV.
Reparo prejudicado de quebra bifilamentar:O reparo de quebras bifilamentares, como
pode ocorrer por radiao ionizante, envolve um processo complicado e no
totalmente compreendido, onde o ciclo celular parado para permitir que um
complexo multiproteico inicie e complete de reparo. O complexo multiproteico inclui as

protenas ATM, BRCA1 e BRCA2, reconhecidamente envolvidas com sndromes de

predisposio ao cncer.
ATM atua na parada do ciclo celular e na ativao do complexo protico de reparo
bifilamentar. A ocorrncia de mutaes no gene da ATM causa a ataxia telangiectasia.
BRCA1 e BRCA2 atuam no reparo de quebras bifilamentares pelos processos de
recombinao homloga e ligao das pontas dos filamentos de DNA quebrados. As
mutaes heterozigotas nos genes que codificam BRCA1 e BRCA2 causam cncer
hereditrio de mama e ovrio, enquanto que mutaes homozigotas no BRCA2
causam a anemia de Fanconi.
4.2.3.Inativao dos GSTs:
A existncia de mutaes no GSTs, levando ao cncer, foi proposta originalmente em
1960 para explicar por que certos tumores podem ocorrer em ambas as formas,
hereditria e espordica. Por exemplo, foi sugerido que a forma hereditria do cncer
infantil de retina (retinoblastoma), podia ser iniciada quando uma clula, em uma
pessoa heterozigota para a mutao na linhagem germinativa em um gene supressor
de tumor retinoblastoma, o qual necessrio para impedir o desenvolvimento do
cncer, sofre uma segunda mutao, um evento somtico, que inativa o outro alelo.
Como conseqncia desse segundo evento somtico, a clula perde a funo de
ambos os alelos, originando um tumor. A perda do alelo normal em um tumor
chamada de perda de heterozigose (LOH, do ingls loss of heterozigosity). O segundo
evento em geral uma mutao somtica, embora a perda de funo sem mutao,
tal como ocorre com o silenciamento transcricional, tenha sido tambm observada em
algumas clulas cancerosas. Na forma espordica do retinoblastoma, ambos os alelos
esto tambm inativados, mas nesse caso, a inativao resulta de dois eventos
somticos que ocorreram na mesma clula.
O modelo dos dois eventos amplamente aceito como uma explicao para muitos
cnceres familiares alm do retinoblastoma, incluindo a polipose de clon familiar, o
cncer de mama familiar, a neurofibromatose tipo 1 (NF1), e a sndrome de LiFraumeni.
Os mecanismos genticos responsveis pela inativao dos genes supressores
tumorais so: 1) deleo, refletida na perda de heterozigose; 2) mutaes pontuais; 3)
converso gnica; e 4) metilao do DNA.
Converso gnica: um evento raro no qual um membro do par de alelos
heterozigotos torna-se idntico ao seu homlogo, possivelmente devido a formao de
um heteroduplex entre os dois alelos com o subseqente reparo das bases mal
pareadas.

Metilao do D A: A inativao de GSTs pode tambm ser causada por uma mudana
no estrutural decorrente da hipermetilao de regies de controle da expresso
gnica (promotor). A hipermetilao dos dinucleotdeos CpG presentes em regies
regulatrias de genes supressores tumorais um achado comum em muitos tumores,
e existem evidencias que este mecanismo epigentico seja o responsvel pela
inativao dos genes CDKN2A, VHL, RB1 e MLH1.
MDULO 5 GE TICA DE DOE AS I FECCIOSAS
A variabilidade gentica humana na resistncia/suscetibilidade a infeces um
processo complexo e influenciado por mltiplos genes. Em principio, podemos
distinguir dois tipos diferentes de variao na resistncia a patgenos infecciosos: uma
resistncia natural primria, dependente de fatores genticos que influenciam a
adeso de agentes infecciosos s clulas do hospedeiro e sua subseqente
penetrao intracelular, e uma resistncia secundria, dependente na maior parte da
ao do sistema imunolgico.
5.1. Pesquisa de genes de suscetibilidade a doenas infecciosas.
Uma primeira questo a ser abordada na pesquisa de mecanismos genticos
associados suscetibilidade seria a procura de indivduos geneticamente resistentes
que no se infectam e/ou no desenvolvem a doena mesmo compartilhando o
mesmo ambiente com indivduos infectados e que teoricamente constituem um foco de
infeco.
Um segundo indicador da existncia de fatores genticos na suscetibilidade a doenas
a maior concordncia em gmeos monozigticos do que em gmeos dizigticos. Um
exemplo disso proporcionado por estudos sobre a tuberculose em grupos de
gmeos mono- e dizigticos. Enquanto 87,2% de monozigticos eram concordantes
em relao tuberculose, entre dizigticos a concordncia era de s 25,6%.
Outro aspecto de importncia na procura de determinantes genticos da
suscetibilidade o estudo das correlaes intrafamiliares. Cabello et al (1995)
trabalhando sobre residentes em zonas endmicas da leishmaniose visceral (LV)
verificaram a no existncia de correlao para a LV entre os pais (pai x me), porem
correlaes significativas foram observadas nas comparaes pais x filhos e entre
pares de irmos; sabendo que o compartilhamento de genes entre os pais
relativamente baixo (dependendo das freqncias populacionais), mas que a
correlao gentica entre pais e filhos e entre irmos de aproximadamente e ,
respectivamente, os resultados da agregao familiar antes observados so
evidencias claras da existncia de mecanismos genticos na infeco pela LV.

5.2. Estratgias utilizadas na deteco de componentes genticos envolvidos na

manifestao da doena:
As estratgias adotadas na disseco do componente gentico de doenas complexas
esto as anlises de agregao familial de casos, os estudos comparativos de taxas
de concordncia da ocorrncia da doena entre gmeos mono e dizigticos, e as
anlises de segregao complexa, que visam descrever o modo de herana gentica
que melhor explica as observaes em um conjunto de pedigrees.
5.2.1. Estudos de ligao - Estudos de ligao so estudos de mapeamento gentico,
cujo objetivo localizar genes responsveis por determinado efeito no intervalo
cromossmico mais estreito possvel. Esses estudos, embora poderosos no
mapeamento de genes exercendo efeito gentico moderado a intenso, no tm poder
de resoluo para implicar um nico gene tipicamente, estudos de ligao terminam
localizando o gene em questo em um intervalo genmico contendo dezenas de
genes. O resultado desse tipo de estudo normalmente expresso em LOD escores;
um LOD escore igual ou superior a 3,0 indica significncia estatstica, e a regio
genmica encontrada passa a ser tratada como regio candidata a abrigar o gene que
est se procurando identificar.
5.2.2. Estudos de associao - Os estudos de associao, em seu formato mais
simples, baseiam-se na comparao das freqncias allicas de um marcador
gentico entre os indivduos afetados e no afetados. Determinado alelo
considerado associado com o fentipo estudado quando ocorre com freqncia
diferente entre indivduos afetados em comparao com um grupo controle de no
afetados. Estudos de associao tm alto poder de deteco de efeitos genticos
moderados a fracos e geralmente so utilizados ou na anlise de genes candidatos,
ou como seqncia complementar de estudos de ligao, com o objetivo de se
identificar com preciso, em regio genmica candidata, o gene responsvel pelo
efeito detectado.
5.3. Genes candidatos para a suscetibilidade a doenas infecciosas:
Fator de necrose tumoral alfa (T F-) o TNF- um potente imunomediador e
uma citocina pr-inlamatria que tem sido associada patognese de numerosas
doenas humanas. O gene responsvel por esta citocina encontra-se dentro do
principal complexo de histocompatibilidade (cromossomo 6p21.3); devido sua
atividade biolgica, tem se tornado alvo de procura de polimorfismos dentro deste
gene que podem contribuir para a associao desta regio do genoma com um
nmero considervel de doenas infecciosas e auto-imunes. Polimorfismos no
promotor do gene o

TNF- tem sido associados com a suscetibilidade a doenas meningoccica,

hansenase, Hepatite B, Hepatite C, HIV-1, leishimaniose tegumentar, malria,
tuberculose e choque sptico. A quantidade de TNF no soro apareceu elevada em
todos estes estudos o que, juntamente com a associao gentica, sugere que os
nveis elevados de TNF tm um papel patognico. Estas consideraes estiveram na
base de intervenes teraputicas que, utilizando uma grande variedade de
compostos anti-TNF, tiveram por objetivo controlar a severidade das doenas citadas.
Lecitina ligada a manose (MBL) - uma protena srica que tem um papel importante
na imunidade inata. O MBL liga-se a acares, sobretudo N- acetilglucosamina e
manose, existentes superfcie dos microrganismos e facilita a sua opsonizao pelos
macrfagos. Ativa tambm o sistema complemento por intermdio de duas proteases
de serina que lhe esto associadas. Mutaes que inativam o gene da MBL so
freqentes em muitas populaes. Alteraes de um nico aminocido so
encontradas nos cdons 52, 54 ou 57, cada uma das quais leva a uma reduo
substancial na concentrao de MBL nos heterozigticos. Os homozigticos ou
heterozigticos combinados para estes variantes tm uma quantidade muito baixa de
MBL no soro, ou no tm MBL. Mutaes no promotor do gene tm tambm efeito,
embora menos marcado, na quantidade de MBL srica. As associaes entre as
mutaes no gene da MBL e as doenas bacterianas tm sido pouco claras. No
entanto, estudos recentes indicam que os indivduos homozigticos para alteraes
nos cdons da MBL podem ser mais susceptveis a doena invasiva provocada por
bactrias encapsuladas, sobretudo pelo Streptococcus pneumoneae
Slc11a1 (previamente denominado RAMP1) - Algumas alteraes de seqncia no
gene Slc11a1 tm sido associadas com susceptibilidade para tuberculose pulmonar
severa na frica Ocidental. A funo do produto deste gene desconhecida, mas est
presente apenas nos macrfagos na membrana dos fagolisossomas em que o M.
tuberculosis se multiplica. O gene Slc11a1 homlogo ao recentemente descrito gene
NRAMP2, que codifica para um transportador de ons bivalentes que pode influenciar
as concentraes intracelulares de ferro e, assim, a multiplicao micobacteriana.
Receptor de Vitamina D (VDR) - A forma ativa da vitamina D, vitamina D3, tem
simultaneamente funes imuno-regulatrias e um papel importante no metabolismo
do clcio. O receptor da vitamina D3 expresso nos macrfagos e linfcitos ativados,
e a presena da vitamina D3 leva a um aumento da ativao dos macrfagos e a uma
alterao no perfil de secreo de citocinas por parte dos linfcitos. A variao
gentica no receptor da vitamina D tem sido associada com resistncia tuberculose
e infeco persistente pelo vrus da hepatite B.
Antgeno Leucocitrio Humano (HLA) - O papel fundamental do HLA na iniciao e
regulao das respostas imunitrias, juntamente com as suas caractersticas

polimrficas, motivou numerosos estudos da sua influncia na susceptibilidade s

doenas infecciosas. O HLA-DR2, um HLA da classe I, nas populaes Asiticas,
predispe em geral para o desenvolvimento da hansenase per se. No entanto,
estudos efetuados em populaes indianas demonstraram que o HLA-DR2 est
simultaneamente associado com, e geneticamente ligado hansenase tuberculoide.
Em algumas populaes asiticas, mas no noutros continentes, o mesmo tipo de
HLA tem sido associado com susceptibilidade tuberculose. Desconhece-se o
mecanismo envolvido nestas associaes de susceptibilidade, mas especula-se que o
HLA-DR2 pode influenciar o tipo de resposta imunitria desenvolvida, levando a uma
resposta humoral mais forte porem, a respostas celulares protetoras mais fracas
contra os antgenos micobacterianos.
5.4. Bases genticas de doenas infecciosas
5.3.1. Aspectos genticos do vrus da imunodeficincia adquirida (HIV) algumas
linhagens deste vrus entram nas clulas T helper por via de um receptor de clula T
que normalmente se liga a uma citocina. Uma vez dentro da clula, o HIV insere seu
material gentico no ncleo e se utiliza da maquinaria celular para se replicar. A
destruio das clulas T helper leva a uma grave imunodeficincia secundria.
Recentemente, foi demonstrado que indivduos homozigticos para uma deleo de
32pb no gene que codifica o receptor de citocina (CMKBR5) so resistentes infeco
de HIV. Este deleo especialmente comum nas populaes do leste europeu, onde
a freqncia do gene atinge 0,16. A anlise de desequilbrio de ligao na regio
cromossmica que contem CMKBR5 indica que a deleo surgiu nestas populaes
h poucos anos. Como o HIV s se originou h algumas dcadas, alta freqncia
gnica no Leste europeu deve ser devida a alguma outra fora evolutiva ou talvez
deriva gnica. Evidentemente, haveria uma forte seleo a favor desta mutao nas
populaes hoje muito expostas ao HIV, e a deleo eventualmente aumentaria de
freqncia nestas populaes.
Aspectos genticos da Malria o primeiro exemplo concreto sobre a relao entre
fatores genticos e o desenvolvimento de uma doena foi dada pela interao de
polimorfismos da cadeia da hemoglobina, a anemia sicmica e a malria provocada
pelo Plasmodium falciparum. Pauline t al (1949) mostraram que uma anemia
hereditria, comum em americanos de ascendncia africana, podia ser caracterizada
atravs da corrida eletrofortica da hemoglobina. Os indivduos infectados
apresentavam uma hemoglobina anormal de mobilidade eletrofortica mais lenta do
que a hemoglobina normal. Esta hemoglobina denominada S (do ingls slow) um
produto da substituio de um cido glutmico por uma valina na posio 6 da cadeia
da hemoglobina. Os indivduos que carregavam essa hemoglobina podem
apresentar duas formas da doena: a) uma anemia leve, porem com a caracterstica
de que seus glbulos vermelhos adotam uma forma de foice quando submetidos a

uma baixa tenso de oxignio; estes indivduos so heterozigotos para o gene S e so

capazes de sintetizar ambas, uma hemoglobina normal (A) junto com uma
hemoglobina anormal (S); b) a forma severa da anemia, pela condio homozigota S,
que devido a seus efeitos pleiotrpicos apresenta uma serie de manifestaes
mrbidas que pode leva-los a morte. O polimorfismo da cadeia das hemoglobinas
tem uma interao extremamente significativa com a malria: os eritrcitos dos
indivduos normais para a hemoglobina (homozigotos A) constituem um meio
apropriado para o desenvolvimento do P. falciparum, portanto esses indivduos
tornam-se suscetveis malria; j os eritrcitos dos heterozigotos AS diminuem o
desenvolvimento do parasita e conseqentemente apresentam uma anemia leve
associada a uma malria tambm leve. Por outro lado, no caso dos homozigotos S, os
parasitas no se estabelece, porem estes indivduos apresentam a forma severa da
anemia. Em outras palavras, a hemoglobina S em estado heterozigtico proporciona
alguma proteo contra a malria causada pelo P. falciparum. Temos, ento, um
exemplo clssico de um polimorfismo gentico sendo mantido por seleo a favor dos
heterozigotos, fenmeno este denominado de heterose, onde ambos os alelos so
favorecidos pela seleo. Ainda em relao a malria, deve-se mencionar que tanto as
talassemias como a deficincia glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD) tambm tem
sido sugerida como protetores contra a malria.
Esquitossomose vrios estudos epidemiolgicos realizados em indivduos que vivem
em reas onde o Schistosoma mansoni endmico sugerem o envolvimento de
fatores genticos na suscetibilidade infeco por este parasita.Observaes
anteriores de que a alta intensidade de infeces e reinfeces est agregada dentro
de famlias, e no distribudas ao acaso, suportam a hiptese da existncia de um
gene que influencia a intensidade da infeco. Atravs de anlises de ligao
utilizando 1 famlias brasileiras e 246 microssatlites como marcadores, o principal
loco envolvido na suscetibilidade foi mapeado em 5q31-3. Esta regio contem vrios
genes envolvidos na regulao da resposta imune, e que so crticos na proteo
contra o S. mansoni, como as interleucinas IL3, IL4. IL5 e IL13.
Hansenase - Hansenase pode ser brevemente definida como doena infecciosa
crnica causada pelo Mycobacterium leprae que afeta primariamente apele e o
sistema nervoso perifrico. A hansenase doena de manifestao clnica espectral.
Segundo Ridley e Jopling, os plos desse espectro so ocupados de um lado pela
forma mais localizada denominada tuberculide, associada a resposta imunolgica do
tipo Th1 (celular), e do outro pela forma virchowiana (assim denominada no Brasil em
substituio ao termo lepromatosada classificao original), sistmica, e associada a
resposta imunolgica do tipo Th2 (humoral), com trs formas clnicas intermedirias ou
borderline. Hoje, amplamente aceita a noo de que conjuntos diferentes de genes
modificam a susceptibilidade doena em pelo menos dois momentos distintos,a
saber: (i) no controle da infeco per se, isto , a doena independentemente de sua

forma de manifestao clnica; e (i), uma vez o indivduo infectado, na definio da

diferentes formas clnicas da doena (figura).
Representao esquemtica do espectro clnico da hansenase, sugerindo a
participao de conjuntos diferentes de genes no controle das duas etapas da
patognese da doena infeco per se e manifestao clnica
Gene MBL: A lectina ligante de manose (MBL) liga-se a resduos de manose e Nacetilglicosamina presentes na superfcie de bactrias e fungos, o que resulta em
ativao do Sistema Complemento, opsonizao e fagocitose. Entretanto, alelos
relacionados com baixa produo desta molcula possuem elevada freqncia em
diversas populaes sugerindo uma vantagem evolutiva destes. No caso da
hansenase, cujo agente etiolgico um parasita intracelular obrigatrio que depende
da fagocitose para penetrar nas clulas do hospedeiro a reduo nos nveis de MBL
poderia conferir proteo contra a doena. De fato, Dornelles et al. relataram que
baixos nveis de MBL conferem proteo contra a hansenase virchowiana, mas no
tuberculide. Fitness et al. compararam a freqncia do polimorfismo 239G/A (G57E)
no exon 1 do gene MBL2 entre pacientes com hansenase e controles e no
encontraram associao alguma. Cabe ressaltar que este SNP no leva a diminuio
na expresso da protena. Messias-Reason et al., por sua vez, verificaram diferenas
na freqncia de polimorfismos no exon 1 do gene MBL2 entre pacientes e controles,
alm disso, uma menor freqncia de gentipos/hapltipos relacionados com baixa
produo de MBL foi encontrada nos pacientes virchowianos em comparao com
tuberculides. Esses dados sugerem que SNPs capazes de influenciar os nveis de
expresso de MBL tem papel relevante na ocorrncia e forma clnica da doena.
Genes Fator de ecrose Tumoral (T F) e Linfotoxina-a (LTA) - proximidade com a regio
gnica do HLA, classicamente envolvida com a hansenase, e a relevncia do TNF em
doenas infecciosas tem levado a um grande interesse sobre o papel de alteraes do
gene do TNF na etiopatogenia das infeces. Na hansenase, o TNF atua na ativao
de macrfagos estimulando a atividade micobactericida destes e a apresentao de
antgenos via MHC de classe I, mas tambm contribui para a ocorrncia de danos
neurais. A regulao da produo desta citocina parece ter forte influncia gentica, o
que pode determinar a susceptibilidade a doenas. Nesse contexto, Sarno et al.
sugerem que polimorfismos no gene TNF devem estar associados com dano neural
causado pela resposta inflamatria na hansenase. Assim, polimorfismos de base
nica na regio promotora do gene do TNF, com potencial para alterao desta
protena, tm sido de interesse na investigao dos determinantes da susceptibilidade
gentica para hansenase. Um polimorfismo na posio -308 da regio promotora do
gene TNF apresentou significativa associao com a hansenase per se. Tambm foi
encontrada associao entre o alelo TNF2 deste SNP (-308A) e hansenase
multibacilar em estudos indiano e tailands. Contrariamente, em estudos brasileiros

este alelo foi associado com resistncia a esta forma clnica de hansenase. J Leve
et al. no encontraram associao de SNPs no gene TNF com a hansenase
estudando famlias multiplex na Polinsia Francesa. A implicao funcional deste
polimorfismo ainda controversa; alguns estudos indicam que a presena do alelo A
resulta em maior produo desta citocina, enquanto outros no indicam relevncia
funcional do mesmo. Ainda nesta regio, localiza-se o gene LTA, que codifica uma
quimiocina com mltiplos efeitos na regulao do sistema imune. Shaw et al.
estudando famlias brasileiras no verificaram correlao do SNP LTA+252A/G isolado
com hansenase. Entretanto, em anlise estendida, encontraram associao com
hansenase deste SNP em hapltipos formados com TNF-308, o que foi replicado em
estudo com a populao brasileira
Gene HLA: A regio 6p21 do cromossomo 6 humano, que abrange os genes do
Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I e I (HLA) e o do fator de
necrose tumoral (TNF) e linfotoxina- (LTA), tem sido associada com a ocorrncia de
hansenase em diversos estudos, uma vez que a segregao dos hapltipos de HLA
parentais no se d de modo aleatrio entre filhos saudveis e queles acometidos
pelas formas tuberculide e virchowiana. Estudos familiares tm apontado para a
associao das regies gnicas do HLA com a hansenase per se. O refinamento
destes estudos levou a associao dos loci HLA-DQB1, HLA-DQA1 e HLA-DRB1 com
a doena, assim como forte ligao da regio 6p21.32/HLA-DQ3 foi identificada. Todd
et al. e Hegazy et al. associaram HLA-DR2 e HLA-DQw1 com a ocorrncia de
hansenase per se. Semelhante associao de HLA-DR2 foi previamente observada
no Japo. Na populao chinesa por outro lado, no houve associao de HLA-DR2
com a doena. Com relao s formas clnicas HLA-DR2, HLA-DR3 e HLA-DQw1, j
foram relacionados com a hansenase tuberculide. Enquanto DR2, DRw8, DQw1
foram associados com a forma virchowiana. Os genes altamente variveis
relacionados cadeia MHC de classe I A (MICA) e B (MICB) tambm tm sido
associados hansenase. Essas protenas so expressas durante a apresentao de
antgenos e funcionam como co-estimulatrias para a ativao de linfcitos T ,
linfcitos T CD8+ e clulas NK. Entre os chineses HLAB e MICA-A estiveram
relacionados com proteo contra a forma multibacilar da hansenase; enquanto na
ndia, Tosh et al. relataram associao de HLA-DRB1 e MICA*5A5.1 com a doena per
se. O gene TAP2, tambm localizado na regio 6p21, codifica a cadeia 2 da protena
transportadora associada ao processamento antignico (TAP) que atua na
translocao de peptdeos do citosol para o retculo endoplasmtico e na ligao de
peptdeos ao MHC de classe I. So relatados vrios polimorfismos deste gene que em
combinao originam diferentes alelos (AH) os quais podem diferir quanto
capacidade de apresentar antgenos via MHC de classe I. Rajalingam et al estudaram
a implicao destes SNPs na hansenase e observaram que a freqncia do alelo
TAP2-B estava significativamente aumentada na hansenase tuberculide e

especialmente entre os pacientes com HLADR1. Contudo, devido estreita

proximidade do gene TAP2 com a regio do HLA, esses resultados devem ser
observados com cautela, uma vez que podem decorrer de desequilbrio de ligao
com alelos HLA. Esses dados em conjunto indicam que a regio do genoma humano
codificadora das molculas do HLA est fortemente associada ocorrncia da
hansenase, entretanto, o alelo associado varia de acordo com cada populao em
funo da distino do background gentico.
Assim como outras doenas infecciosas, a hansenase possui carter complexo e
polignico, ou seja, a associao de alteraes em diversas regies genmicas deve
compor um perfil de susceptibilidade. Nesse contexto, os dados ora disponveis acerca
das variaes genticas que devem contribuir para a susceptibilidade doena
revelam que, isoladamente, estas associaes so discretas. Adicionalmente, nem
todas estas associaes so replicadas em diferentes populaes o que sugere que
cada uma destas deve possuir um perfil gentico de susceptibilidade distinto e, ainda,
aponta para possveis equvocos associados aos desenhos dos estudos, como, por
exemplo, na seleo de controles.
MODULO 6 MUTAO, REPARO E RECOMBI AO DO D A 6.1. MUTAO:
6.1.1. Categorias de Mutao Humana: A mutao definida como uma mudana na
seqncia de nucleotdeos ou no arranjo do DNA, e assim so classificadas em trs
categorias:
Mutaes genmicas: so alteraes no nmero de cromossomos intactos
(aneuploidias) que surgem de erros na segregao cromossmica, durante a meiose
ou mitose.
Mutaes cromossmicas: so mudanas envolvendo apenas uma parte de um
cromossomo, tais como duplicaes, delees, inverses e translocaes, as quais
podem ocorrer espontaneamente ou resultar de segregao anormal de cromossomos
translocados durante a meiose;
Mutaes gnicas: so mudanas da seqncia do DNA dos genomas nucleares ou
mitocondriais, variando desde uma pequena mudana, como um nico nucleotdeo,
at alteraes que podem afetar milhes de pares de bases. As mutaes gnicas so
decorrentes de falhas nos processos de replicao ou de reparo do DNA.
codificadora pode levar a perda completa da expresso gnica ou formao de uma
variante protica com propriedades alterada

Uma mutao genmica que deleta ou duplica um cromossomo inteiro pode alterar os
nveis de expresso de centenas ou milhares de genes. De modo semelhante, uma
mutao cromossmica que deleta ou duplica grandes pores de um ou mais
cromossomos tambm pode afetar a expresso de centenas de genes. Mesmo uma
pequena mutao gnica pode ter grandes efeitos fenotpicos, dependendo de qual
gene tenha sido afetado e de qual efeito a alterao tenha sobre a expresso do
mesmo. Uma mutao gnica consistindo em uma mudana de um nico nucleotdeo
na seqncia
Algumas alteraes no DNA, entretanto, no tm efeito fenotpico. Uma translocao
ou inverso cromossmica pode no afetar a poro crtica do genoma e pode no ter
quaisquer efeitos fenotpicos. Uma mutao dentro de um gene pode no ter efeito, ou
porque a mudana no altera a seqncia primria do aminocido de um polipeptdio
(mutao silenciosa) ou porque a mudana no alterara as propriedades funcionais da
protena (mutao neutra). Nem todas as mutaes, portanto, tem conseqncias
clnicas.
Todos os trs tipos de mutao ocorrem com freqncia aprecivel em muitas
diferentes clulas. Se uma mutao ocorre no DNA das clulas que iro fornecer a
populao da linhagem germinativa, a mutao pode ser passada para as geraes
futuras. Em contraste, mutaes somticas ocorrem por acaso em apenas um
subgrupo de clulas em certos tecidos e resultam em mosaicismo somtico, como
visto, por exemplo, em muitas situaes de cncer. As mutaes somticas no
podem ser transmitidas prxima gerao.
6.1.2. Tipos de Mutaes Humanas 6.1.2.1. Mutao por substituio de nucleotdeos:
Mutao de Sentido Trocado este tipo de mutao reconhecido quando a
substituio de um nico nucleotdeo (ou mutao de ponto) em uma seqncia de
DNA capaz de alterar o cdigo em uma trinca de bases, e assim causar a
substituio de um aminocido por outro no produto gnico. Em muitos distrbios, tais
como as hemoglobinopatias, so derivados de mutaes de sentido trocado.
Mutao Sem Sentido ou Mutao de Trmino de Cadeia este classe identificada
quando uma mutao pontual no DNA causa, na seqncia do mRNA, a substituio
do cdon normal por um dos trs cdons terminais. Como conseqncias da formao
de um cdon de parada prematuro, o mRNA carregando a mutao freqentemente
instvel, e no possvel a sua traduo; e mesmo que o mRNA esteja estvel o
bastante para ser traduzido, a protena gerada ser truncada e normalmente to
instvel que ser rapidamente degradada. Uma mutao de ponto no apenas pode

criar um cdon de termino prematuro, como tambm pode destruir um cdon de

trmino e permitir que a traduo continue at que o prximo cdon de trmino seja
atingido. Igualmente, uma mutao criar uma protena com aminocidos adicionais
em seus terminais carboxila que poder comprometer qualquer funo fornecida pela
regio 3-UTR posterior ao cdon de terminao normal.
Mutaes no Processamento do R A o mecanismo normal pelo qual os mRNAs
transcritos inicialmente so convertidos em mRNAs maduros requer uma srie de
modificaes, incluindo o cap 5, a poliadenilao e recomposio. Todas essas
etapas na maturao do mRNA dependem de seqncias especficas dentro do
mRNA. No caso da recomposio, a remoo dos introns e conseqente unio dos
exons requer seqncias especficas dentro e prximas das junes exon-intron (local
doador 5) ou intron-xon (local receptor de 3). As mutaes que afetam estas bases
requeridas em cada ponto doador ou receptora interferem na recomposio normal de
RNA naquele local. Uma segunda classe de mutaes no processamento do RNA
envolve substituies de base no intron que criam locais doadores ou aceptores
alternativos que competem com os locais normais durante o processamento do RNA.
Assim, pelo menos uma proporo do mRNA maduro, em tais casos, pode conter
seqncias de intron impropriamente recompostas.

Mutaes no encadeamento podem parecer por alterao das sequncias

conservadas dos stios doador e receptor de encadeamento ou por ativao de stios
de encadeamento ocultos.
6.1.2.2. Mutao por deleo/insero:
As mutaes tambm podem ser causadas pela insero, inverso, fuso ou deleo
de seqncias de DNA. Algumas delees e inseres envolvem apenas alguns
poucos nucleotdeos e em geral so mais facilmente detectadas pelo seqenciamento
de nucleotdeos. Em outros casos, um seguimento substancial de um gene ou um

gene inteiro deletado, invertido, duplicado ou translocado. Nestes casos, as

mutaes so normalmente detectadas pelas tcnicas de biologia molecular (ex.:
transferncia de Souther blotting, reao em cadeia da polimerase) ou citogentica
(ex.:bandeamento cromossmico, hibridizao in situ por fluorescncia, cariotipagem
espectral).
Mutaes na matriz de leitura Quando o nmero de bases envolvidas no
mltiplo de trs, a mutao altera a leitura da traduo a partir do ponto de mutao,
resultando numa uma protena com sequncia de aminocidos diferentes do
esperado. Quando o nmero de bases envolvidas multiplo de trs, a mutao resulta
numa protena com a adio ou falta de aminocidos.

Mutao por seqncias de transposio a insero de seqncia LINE, como

descrito em alguns poucos pacientes no relacionados portadores da hemofilia A, com
diversos quilibases de tamanho foi encontrada inserida em um exon no gene do fator
VIII, interrompendo a seqncia de codificao e inativando o gene. Este achado
sugere que pelo menos algumas das 850.0 cpias da famlia LINE no genoma humano
so capazes de causar doenas por mutagnese insercional.
As mutaes em distrbios como a doena de Huntington e a Sndrome do X-frgil
envolvem a amplificao de seqncias compostas por 3 nucleotdeos. Nessas
doenas, a repetio de um nico trinucleotdeo, localizado na regio de codificao
(no caso da doena de Huntington) ou na regio transcrita, mas no traduzida de um
gene (no caso da sndrome do X-frgil), pode se expandir durante a gametognese, na
qual referida como uma mutao dinmica, e interfere com a expresso gnica
normal. Uma repetio na regio de codificao ir gerar um produto protico anormal,
enquanto a expanso repetida em partes transcritas, mas no traduzidas de um gene,
pode interferir com a transcrio, processamento do mRNA ou traduo. As mutaes
dinmicas ainda no so completamente compreendidas, porm acredita-se, que
durante a replicao a DNA polimerase deslize pelos filamentos que esto sendo
sintetizado, aumentando assim um aumento da seqncia bsica de repetio. Este
fenmeno descrito como slippage.

6.1.3. Conseqncias moleculares das mutaes:

bom pensar nas mutaes em termos de seus efeitos sobre o produto protico. De
maneira geral, as mutaes podem resultar em GANHO DE FUNO ou em PERDA
DE FUNO do produto protico.
Mutaes de ganho de funo - ocasionalmente resultam em um produto protico
completamente novo, mas comumente, resultam em hiperexpresso do produto ou em
expresso inapropriada (no tecido errado ou no estgio errado do desenvolvimento).
As mutaes de ganho de funo produzem um distrbio DOMINANTE.
Mutaes de perda de funo - so em geral vistas nas doenas recessivas. Aqui,
uma mutao que resulta na perda de 50% do produto protico, mas os 50% restantes
so suficientes para o funcionamento normal. Portanto o heterozigoto no afetado.
Em alguns casos, entretanto, 50% do produto protico no so suficientes para o
funcionamento normal (HAPLOINSUFICINCIA), podendo resultar um distrbio
dominante. Como muitos distrbios envolvendo a haploinsuficincia, os homozigotos
so gravemente afetados quando comparados com os heterozigotos. As mutaes de
perda de funo so em geral vistas nas doenas recessivas.
6.1.4. Nomenclatura para as mutaes:
A posio da mutao designada como estando no DNA genmico, numa seqncia
de cDNA ou no DNA mitocondrial, pelo prefixo g., c. ou m., respectivamente.
Uma mudana no nucleotdeo notada primeiro pelo nmero daquela base, o
nucleotdeo original, o smbolo > e o novo nucleotdeo naquela posio. No DNA, os
smbolos dos nucleotdeos so maisculos; no mRNA eles so em minsculos.
Exemplo: g.1166A>C (mutao no DNA)
Os nucleotdeos em um intron (referidos pela sigla IVS) so contados como +1, +2, e
assim por diante, onde +1 a constante G do GT no stio doador da ligao 5, ou
como 1, -2, e assim por diante, contagem regressiva da altamente invarivel G do
stio aceptor de unio AG 3. Exemplos: g.IVS33+2T>A, g.IVS33-2T>A
Pequenas delees so indicadas pelos nmeros dos nucleotdeos deletados,
separados por sublinhado (_), seguido pelo termo del, e depois os nucleotdeos reais
deletados. Exemplo: c.1524_1427delCGTA

Pequenas inseres so designadas por ins aps dois nucleotdeos entre os quais
ocorreu a insero, seguida pelo novo nucleotdeo inserido. Exemplo:
c.1277_1278insTTAC
Uma mutao espontnea ou sem sentido pode ser descrita ao nvel da protena pela
doao do aminocido correto, a posio daquele resduo, e o aminocido que
substituiu o normal. Ex: Glu6Val
As mutaes na seqncia do DNA podem ocorrer de forma espontnea (mutao
espontnea) ou induzida (mutao induzida). No primeiro caso, as mutaes so
decorrentes de erros cometidos ela DNA polimerase, durante o processo de replicao
do DNA. O surgimento de mutaes espontneas ocorre quando DNA polimerase
insere uma base incorreta que no pode formar pontes de hidrognio com a base no
filamento parentalmolde. As mutaes espontneas tambm podem surgir como
conseqncia de mudanas tautomricas nas bases dos nucleotdeos. Cada uma das
quatro bases nitrogenadas capaz de existir em uma forma rara, isomrica alternativa
(tautmero), tendo propriedades diferentes de pontes de hidrognio. As raras formas
imino (A*) e citosina (C*) fazem pares de bases com citosinas e adenina,
respectivamente, enquanto que as raras formas enol de timina (T*) e guanina (G*)
fazem pontes de hidrognio com guanina e timina, respectivamente. Uma base pode
ser incorporada em sua forma normal e ento sofrer uma mudana tautomrica aps a
incorporao. Durante a rodada subseqente de replicao do DNA, a presena de
um destes tautmeros raros no molde pode resultar na incorporao de uma base
incorreta na molcula-filha de DNA (um processo similar ocorre quando agentes
mutagnicos chamados de anlogos de bases sofrem tautomerizao).
Depurinao refere-se a quebra de ligaes N-glicoslica entre a base (neste caso
uma purina) e a desoxirribose do nucleotdeo, com a perda subseqente da base
nitrogenada. A menos que tal dano seja reparado antes da replicao do DNA, h uma
grande probabilidade de que surja uma mutao, pois o stio apurnico no tem a
informao necessria para especificar a insero da base complementar correta n o
novo filamento de DNA. Se a DNA polimerase atingir o stio apurnico antes que o
reparo tenha ocorrido, a replicao pode parar e/ou uma base incorreta pode ser
inserida no novo filamento de DNA em oposio ao sitio apurnico. Novamente,
existem mecanismos especficos de reparo envolvendo enzimas chamadas de
ENDONUCLEASES AP (AP = apurnico) para lidar com tal dano.
A desaminao um outro processo que origina mutaes. Esta mutao
caracterizada pela perda do grupo amino presente na citosina. Esta, por sua vez,
transforma-se em uracila. Aps uma rodada de replicao, esta mutao leva a

substituio do par original G-C por um A-U, que se tornar ento um par A-T aps
outra rodada de replicao.
J as mutaes induzidas so causadas por agentes conhecidos coletivamente como
mutgenos. Os mutgenos de principal destaque so:
Radiao ionizante (raios-X): ons eletricamente carregados quando situados dentro
ou prximos de molculas de DNA podem promover reaes qumicas que mudam as
bases do DNA. A radiao ionizante tambm pode quebrar a DNA unifilamenar ou
bifilamentar. Esta forma de radiao pode atingir todas as clulas do corpo, inclusive
as da linhagem germinativa;
Radiao no-ionizante (raios U.V.): esta classe de radiao forma ligaes covalentes
entre bases pirimidnicas adjacentes (citosina ou timina). Estes dmeros de pirimidina
so incapazes de se parear apropriadamente com purinas durante a replicao do
DNA. Isto resulta em uma substituio de pares de bases. Como a radiao UV
absorvida pela epiderme, no atinge a linhagem germinativa, mas pode causar cncer
de pele.
Anlogos de bases: podem substituir uma base verdadeira do DNA durante a
replicao. O anlogo no exatamente igual base que substitui, de modo que pode
causar erros de pareamento durante as replicaes subseqentes.
6.2. RECOMBI AO
Uma importante propriedade do DNA das clulas a sua capacidade de sofrer
rearranjos, que podem ocasionar desde novas combinaes entre os genes presentes
em qualquer genoma individual at alteraes qualitativas e quantitativas na
expresso desses genes. Trata-se de uma fonte de variao gentica fundamental
para permitir que os organismos evoluam em resposta a mudanas ambientais. Esses
rearranjos do DNA so realizados pela recombinao gentica. Duas amplas classes
de recombinao so comumente reconhecidas: a recombinao geral e a stioespecfica. Na recombinao geral (ou recombinao homloga), a troca gentica
envolve seqncias homlogas (complementares) de DNA. Um dos exemplos mais
importantes desse tipo de troca entre cromossomos homlogos (denominado
crossingover) acontece na meiose. O crossing-over ocorre entre cromossomos
altamente relacionados nos estgios iniciais de desenvolvimento de vulos e
espermatozides. Na recombinao stio especfica no necessria homologia
extensa do DNA. Nesse caso, as trocas ocorridas so curtas. Seqncias especficas

de nucleotdeos so reconhecidas por uma enzima de recombinao stio-especfica

que altera a posio relativa das seqncias de nucleotdeos nos genomas.
6.2.1. Recombinao geral
Esse tipo de recombinao pode ocorrer em qualquer local ao longo de 2 molculas
complementares de DNA. O principal resultado desse processo sempre o mesmo:
duas molculas de DNA homlogas sobrepem-se e trocam partes (crossing-over),
isto , suas hlices duplas quebram-se e as duas extremidades quebradas unem-se
com suas parceiras opostas para formar, novamente, duas hlices intactas, cada uma
composta por partes das 2 molculas de DNA iniciais.O stio de troca pode ocorrer em
qualquer lugar da seqncia homloga de nucleotdeos das 2 molculas de DNA
envolvidas. Uma fita de uma das molculas faz pareamento de bases com uma das
fitas da outra molcula, criando a juno alternativa (staggered joint), usualmente
chamada de juno heterodplex, entre as duas diferentes hlices duplas.
No h alterao nas seqncias de nucleotdeos no stio de troca; a quebra e os
eventos de re-ligao ocorrem de uma forma to precisa que no h perda, ganho ou
alterao de um nico nucleotdeo. A freqncia de recombinao no constante ao
longo de todo o genoma e influenciado por efeitos tanto globais quanto locais ( X ,
e dentro do mesmo genoma). A recombinao necessita de um mecanismo que
permita que um dplex interaja com outro dplex homlogo (fitas simples envolvidas).
O mecanismo utilizado provm do modo pelo qual os cidos nuclicos reconhecem um
ao outro (complementaridade). Um pareamento extensivo de bases entre dois dplices
homlogos s poder ocorrer se um corte primeiramente feito em um deles,
deixando a fita livre para os eventos de desenrolamento e enrolamento necessrios
formao de um heterodplex com a outra molcula de DNA. Portanto, qualquer
evento de troca requer pelo menos duas clivagens, uma em cada uma das fitas das
hlices duplas que iro interagir. Finalmente, cada uma das quatro fitas deve ser
clivada para permitir que cada uma seja ligada a uma parceira diferente. Na
recombinao geral, esses eventos s ocorrem quando duas hlices de DNA dividem
uma extensa regio de homologia. Acredita-se que qualquer evento que resulte em
quebras na cadeia de DNA estimule o incio de um processo de crossing-over. Por
isso, por exemplo, radiao UV aumenta a freqncia de crossing-over na clula, ao
criar quebras na fita dupla ou regies de fita simples do DNA.
6.2.1.1. Enzimas e mecanismos moleculares da recombinao gentica
A ao de conectar 2 molculas de DNA de fita dupla o ponto principal do processo
de recombinao. A troca recproca entre as extremidades livres cria uma conexo

entre os dois dplices, que formam uma molcula unida. O ponto no qual uma fita de
DNA cruza de um ponto para outro chamado de juno recombinante. Uma
caracterstica importante de uma juno recombinante a sua capacidade de moverse ao longo do dplex. Tal mobilidade chamada de migrao da ramificao. O ponto
de ramificao pode migrar em ambas as direes, medida que uma fita deslocada
pela outra. Quando a molcula unida rota um dplex em relao ao outro, isso pode
ser visualizado em um plano como uma estrutura de Holliday.
A molcula unida, formada pela troca de fitas, deve ser resolvida em dois dplices
separados. A resoluo necessita de um par de clivagens adicional. Se os cortes
forem feitos no par de fitas que no foram originalmente clivadas (o par de fitas que
no iniciou a troca), todas as 4 fitas originais so clivadas. Isso resulta em molculas
de DNA recombinantes combinadas. Se as mesmas duas fitas envolvidas nas
clivagens originais forem clivadas novamente, as outras duas fitas permanecero
intactas. As clivagens liberam os dplices parentais, os quais permanecem intactos,
salvo que cada um possuir um vestgio do evento de recombinao, na forma de uma
regio de heterodplex. Esses recombinantes so chamados de recombinantes
remendados.
Protena RecA - RecA possui um papel central na recombinao, atuando tanto como
uma protena estrutural como em reaes catalticas. Essa enzima capaz de parear
duas molculas de DNA homlogas e catalisar as reaes de trocas de fitas, levando
formao do heterodplex de DNA.RecA reconhece especificamente DNA de fita
simples e anela esse segmento a uma seqncia complementar de um dplex
homlogo, substituindo, simultaneamente, a fita original complementar pela nova fita.
Se ATP est presente, a protena RecA do filamento pode, ento, ir desenrolando
sucessivamente diferentes partes do dplex, na tentativa de anelar o filamento de fita
simples a uma regio desenrolada. Uma vez que uma pequena poro corretamente
pareada, usando como molde a cadeia intacta, a energia do ATP direciona a reao de
pareamento at o final. A protena RecA deslocada quando a nova molcula de DNA
hbrida formada. A protena RecA possui um papel central na regulao da
recombinao gentica, na reparao do DNA e na mutagnese induzida por
UV.Estudos demonstraram que a protena RecA ATPase DNA-dependente. No
entanto, a reao de troca de fitas isoenergtica (para cada par de bases quebrado,
outro par formado) e ocorre mesmo na ausncia de ATP.A protena RecA pode atuar
guiando a formao de uma hlice com quatro fitas, composta pelas duas molculas
de DNA, acelerando o processo de troca de fitas e permitindo que a juno se mova
ao longo de toda a regio do dplex.
Enzimas Acessrias

Protenas RecBCD - Complexo protico com potentes atividades nuclesica, de

helicase e de ATPase. Uma carcterstica importante dessas protenas que iniciam o
processo de desenrolamento e degradao do DNA somente em uma molcula que
contenha uma extremidade livre. Tambm foi demonstrado que o complexo RecBCD
promove a recombinao com maior freqncia em cadeias de DNA que contm o
chamado stio chi, com seqncia 5-GCTGGTGG-3. Quando essa seqncia
reconhecida, uma atividade endonuclesica especfica de RecBCD cliva uma das fitas
de DNA em uma regio prxima ao stio chi. O reconhecimento desse stio faz com
que a subunidade RecD dissocie-se do complexo ou torne-se inativa, ficando o
complexo apenas com sua atividade de helicase.
Outras enzimas
RuvA e RuvB: reconhece junes Holliday, e atua como helicase RecG: helicase
RuvC: endonuclease, reconhece junes Holliday (tetranucleotdeo ATTG): direciona a
resoluo SSB: protegem o segmento de fita simples da degradao por nucleases
at que o processo de pareamento homlogo inicie; DNA polimerase: preenche as
lacunas deixadas quando 2 molculas de DNA recombinantes so clivadas
separadamente. DNA ligase: une os fragmentos deixados pela DNA-polimerase.
6.2.2. Recombinao stio-especfica
Pela sua natureza, o crossing-over geralmente preserva a ordem das seqncias de
DNA em cromossomos homlogos. Em casos excepcionais, no entanto, as clulas
tambm utilizam um elaborado processo recombinacional de regulao, que tem como
conseqncia o rearranjo de seqncias atravs da recombinao direta entre stios
especiais. Segmentos de DNA podem ser movidos pela recombinao stio-especfica,
resultando, freqentemente, na expresso de diferentes genes ou grupos de genes. A
recombinao stio-especfica no envolve extensa homologia entre as seqncias de
DNA, como ocorre no crossing-over. Ela necessita apenas que as seqncias de
ligao sejam localizadas por enzimas especializadas, que catalisam a quebra e a
reunio das molculas. Esse tipo de recombinao iniciado por processos
reguladores que tornam as enzimas corretas disponveis. Na recombinao stioespecfica conservativa, uma molcula de DNA clivada em ambas as fitas em dois
locais especficos e as extremidades so religadas s suas novas parceiras. O
primeiro passo na recombinao stio-especfica a ligao de protenas
(recombinases) a alguns ou a todos os elementos de reconhecimento de um ou ambos
os stios que iro recombinar. Depois disso, esses stios fazem uma sinapse (ou troca
de fitas). No necessria homologia entre as partes recombinantes nessa etapa. A
complexidade dos sistemas de recombinao stio-especfica varia muito, e cada

sistema tem uma recombinase especfica que reconhece as seqncias de DNA.

Freqentemente, a regio codificadora dessa recombinase est relacionada com seus
stios de reconhecimento e, algumas vezes, com um elemento reforador (enhancer)
recombinacional.
6.2.3 Consequncias moleculares da recombinao (figura2):
Converso gnica interlcus a transferncia no recproca de informao de
sequncia entre um par de DNA no-allicas; Converso gnica interallica a
transferncia no recproca de informao de sequncias allicas.
Ambos os mecanismos ocorrem quando uma sequncia do par de sequncia atuantes
como doadora, permanece inalterada. A outra sequncia de DNA, a receptora,
modificada, tendo alguma ou toda a sua sequncia substituda pela sequncia copiada
da doadora. A troca de seqncias , portanto, direcionada; a seqncia receptora
modificada pela seqncia doadora, mas no ocorre a maneira inversa.

Figura2: Converso gnica envolve uma troca de sequncias no recproca entre

genes allicos e no-allicos.
O DNA nas clulas sofre uma ampla srie de danos:
Bases pricas so perdidas pela fisso espontnea das ligaes base-acar;
Citosinas e ocasionalmente adeninas, so desaminadas espontaneamente para
produzir uracila e hipoxantina, respectivamente; Espcies de oxignio reativas nas
clulas atacam os anis das purinas e pirimidinas; A luz ultravioleta faz com que
timinas adjacentes formem um dmero quimicamente estvel; Erros na replicao do
DNA resultam na incorporao de uma base mal pareada; A radiao ionizante causa
quebras nas fitas simples e duplas; Erros na replicao ou na recombinao deixam
quebras nas fitas do DNA.

Todas essas leses devem ser reparadas para a clula sobreviver. A importncia de
sistemas de reparao eficientes destacada por doenas graves que afetam
pessoas com deficincias nos sistemas de reparao. A reparao do DNA
freqentemente envolve a simples eliminao da mudana que causou a leso. Quase
sempre uma fita de DNA contendo o(s) nucleotdeos(s) danificado(s) removida e a
lacuna preenchida atravs de re-sntese. Existem ao menos cinco tipos principais de
reparao do DNA nas clulas humanas:
6.3.1. Reparo por reverso direta: O mecanismo mais simples de reparo de bases
alteradas restaura-las ao normal sem uma grande cirurgia na molcula de DNA. No
caso dos dmeros de pirimidina formados no DNA por luz UV, esta reverso mediada
pela enzima fotoliase (ativada por luz visvel). A fotoliase corta os dmeros de
pirimidina gerando pirimidinas intactas. Outro exemplo de reverso direta a
metiltransferase, uma enzima que reconhece O6 metil guanina no DNA e remove o
grupo metil agressor. Nessa reao, a guanina normal do DNA restaurada e a
enzima inativada.
6.3.2. Reparo por Exciso de Base: Este procedimento utiliza enzimas glicosidases
para remover bases anormais. Uma endonuclease, AP- endonuclease, corta o
arcabouo de acar-fosfato na posio da base perdida. Uns poucos nucleotdeos da
dita de DNA so retirados por exonucleases, a lacuna preenchida por re-sntese, e o
corte remanescente fechado pela DNA ligase-I. O mesmo processo utilizado para
reparar depurinaes espontneas. interessante ressaltar que no se conhece
nenhuma doena humana causada por falha neste mecanismo de reparo do DNA.
Talvez qualquer defeito desse tipo seja letal, uma vez que este mecanismo
responsvel pela correo de um grande nmero de leses no DNA.
6.3.3. Reparo por Exciso de ucleotdeo: Remove dmeros de timina e grandes
aductos qumicos. O mecanismo de ao deste processo envolve a protena XPA, que
reconhece o DNA danificado e liga-se a ele ou por ligao a RPA (protena que se liga
a fita simples). O complexo DNA-XPARPA recruta o fator de transcrio TFIIH (um
complexo multiproteico que inclui as protenas XPB e XPD). As protenas XPB e XPD
so helicases e atuam na abertura das fitas de DNA, um seguimento com cerca de 30
nucleotdeos de extenso. Em seguida, dois cortes so feitos na cadeia de acarfosfato da fita danificada. XPF+ERCC1 cortam as extremidades 5, e XPG corta a
extremidade 3.Em seguida, a DNA polimerase , juntamente com o fator de replicao
C e a subunidade DPE2 sintetizam DNA para preencher a lacuna. Por fim, a DNA
ligase une as lacunas. Defeitos neste mecanismo de reparo causam a doena
autossmica recessiva Xeroderma pigmentar (XP) Pacientes XP so extremamente
sensveis luz UV, peles expostas ao sol desenvolvem milhares de sardas, muitas das
quais progridem para o cncer de pele.

6.3.4. Reparao Posterior a Replicao: Este procedimento necessrio para corrigir

quebras nas fitas duplas. O mecanismo usual processo semelhante converso
gnica (reparao por recombinao), em que uma fita simples de um cromossomo
homlogo invade a hlice do DNA danificado. Os genes humanos envolvidos nesta
rota incluem BLM (mutado na sndrome de Bloom), e os genes de suscetibilidade ao
cncer de mama (BRCA2 talvez o BRCA1).
6.3.5. Reparo por mau pareamento: Este mecanismo corrige pares de bases mal
pareadas, causados por erros ocorridos durante a replicao do DNA. Estes erros,
normalmente, so reconhecidos e corrigidos pela funo de edio das polimerases.
No caso de uma base ocasionalmente incorporada erradamente no ser percebida
durante a edio, um segundo sistema de correo, chamado de reparo de mau
pareamento, existe para lidar com tais bases pareadas erradamente. No reparo de
mau pareamento, um par de bases no ligadas por pontes de hidrognio
reconhecido como incorreto, e um seguimento polinucleotdico removido, removendo
assim um membro do par incorreto.
MDULO 7 CITOGE TICA CLSSICA E MOLECULAR
7.1. Cromossomo Humano:
O complemento cromossomo humano normal, ou caritipo, consiste em 46
cromossomos, sendo 4 autossomos e 2 cromossomos sexuais, X nas mulheres e XY
nos homens. Os cromossomos so divididos morfologicamente em metacntrico,
submetacntrico e acroscntrico, dependendo da posio do centrmero. Os
cromossomos acrocntricos possuem o brao curto pequeno, que consistem em
satlite com um pednculo. Eles contm vrias centenas de cpias de genes
codificadores de RNA ribossmico. Ao contrrio, de quase todo o resto do material
cromossmico, a perda destes satlites, como ocorre na translocao robertsoniana,
no tem significado clnico. Note que estes satlites no tem nada a ver com
microssatlites ou minissatlites.
Com base no tamanho individual e posio dos centrmeros, os cromossomos foram
originalmente divididos em sete grupos: A (1-3), B (4-5), C (6-12 e X), D (13-15), E (1618), F (19-20), G (21, 2 e Y). Eles so numerados em ordem decrescente de tamanho,
e representados aos pares. Geralmente os cromossomos so mostrados como eles
aparecem na metfase da mitose, quando eles consistem em duas cromtides-irms
unidas pelo centrmero. Estas cromtides surgiram como resultado da sntese de DNA
antes de clulas entrarem na fase mittica.

Normalmente metade dos cromossomos de uma pessoa so herdados de cada um

dos genitores, e metade de seu conjunto gentico ser transmitido para cada filho. Um
conjunto nico de 23 cromossomos constitui um complemento haplide: o total normal
de 46 cromossomos vistos em todas as clulas somticas representa o complemento
diplide. Os pares de cromossomos so chamados de homlogos.
7.1.1. Composio do Cromossomo Humano:
Cada cromossomo constitudo por uma molcula longa de DNA, associada a
diversas protenas. As protenas associadas ao DNA classificam-se em duas grandes
categorias: protenas histonas que interagem diretamente com a fibra de DNA, e
protenas no-histonas. O complexo formado por DNA, histonas e protenas nohistonas chama-se cromatina. Logo, a cromatina o material que compem os
cromossomos.
cromatina a aparncia de colar de contas
As histonas so fundamentais no enrolamento da cromatina. Trata-se de protenas
com uma alta proporo de lisina e arginina, quer dizer, de aminocidos carregados
positivamente. Isto contribui para a unio das histonas s molculas de DNA, nas
quais predominam as cargas negativas. Existem cinco classes de histonas, chamadas
de H1, H2A, H2B, H3 e H4. A H1, da qual existem 6 subtipos, contem cerca de 220
aminocidos, enquanto que os subtipos restantes possuem entre 103 e 135
aminocidos cada um. Estes ltimos recebem a denominao de histonas
nucleossmica, porque a molcula de DNA se enrola em tono delas, para formas os
nucleossomos, que constituem as unidades bsicas do enrolamento cromatnico. Em
cada nucleossomo, as histonas nucleossmicas se associam para formar uma
estrutura octamrica, composta por dois H2A, dois H2B, dois H3 e dois H4. Ao redor
deste octmero de histonas, o DNA d aproximadamente duas voltas e meia. Visto
que cada volta equivale a 83 pares de nucleotdeos, o segmento de DNA associado ao
nucleossomo contm, no total, 146 pares de bases. Os nucleossomos se encontram
separados entre si por uma poro de DNA espaadores, de comprimento varivel
(20-60 pares de bases). A alternncia de nucleossomo e segmento espaador d a
A cromatina normalmente classificada como eucromatina (regio do DNA que
apresenta genes ativos, ou seja, genes que esto continuamente sendo traduzidos) e
heterocromatina (regio do DNA que no possui genes ativos, e que parecer funes
estruturais durante o ciclo celular). Podem ainda distinguir-se dois tipos de
heterocromatina: 1) Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como
protenas e que se encontra localizada volta do centrmero (contem geralmente
sequncias repetitivas); 2) Heterocromatina facultativa, que, por vezes, transcrita em

outros tipos celulares, consequentemente a sua quantidade varia dependendo da

atividade transcricional da clula.
7.1.2. Estrutura do Cromossomo Humano: Em cada cromossomo existem estruturas
que so imprescindveis para a replicao, isto , para a duplicao do DNA. So as
seguintes:
Centrmero, ou constrio primria, o ponto no qual as cromtides-irmes se
juntam e onde os microtbulos se ligam para separar as cromtides na meiose. Em
humanos, os centrmeros consistem em seqncias de repeties em tandem com
171 pb, classificadas como satlite, estrutura que participa da diviso das duas
cpias cromossmicas geradas como conseqncia da replicao do DNA.
Telmero so as seqncias terminais dos cromossomos
7.1.3. veis de Compactao do Cromossomo Humano:
Durante o ciclo celular, os cromossomos passam por um estgio ordenado de
condensao e descondensao. No entanto, quando os cromossomos esto no seu
estado mais descondensado, em um estgio do ciclo celular denominado interfase, o
DNA acondicionado na cromatina est substancialmente mais condensado se
estivesse como uma dupla hlice normal. Isto ocorre porque para caber no pequeno
espao que o ncleo lhe oferece, o genoma precisa estar num estgio primrio de
compactao. Os estgios de compactao que, a partir de uma molcula de DNA,
ocorre a formao de um cromossomo esto destacados a seguir:
Primeiramente, o DNA se enrola ao redor de um octmero de protenas (histonas) para
formar o nucleossomo. Cerca de 140 a 150 bases de DNA se enrolam ao redor de
cada cerne de histonas, e de 20 a 60 bases formam um elemento espaador antes do
complexo nucleossmico seguinte. Em seguida, os nucleossomos se enrolam sobre si
e geram uma estrutura helicoidal chamada de solenide, de 30nm de dimetro. Cada
volta do solenide contem cerca de 6 nucleossomos. Tanto estes como os futuros
enrolamentos dependem das histonas H1, que, alm disso, estabilizariam as fibras de
30nm. A contnua compactao do DNA gera a formao de estruturas em forma de
lao ou alas de diferentes comprimentos, ancorados em um eixo constitudos por
protenas no-histonas. O conjunto de eixos protico compe vrias armaes ou
arcabouos, de modo que, em cada base de cada lao, as pores do cada DNA
associadas a cada um destes eixos levam o nome SAR (do ingls, scaffold associated
regions). Os extremos dos laos se acham firmemente unidos aos eixos proticos,
porem no se sabe ainda como as SAR se sujeitam a eles. O resultado final desta

helicoidizao e da organizao em alas que o DNA, quando no seu estado

mximo de compactao assume a forma denominada de cromossomo.
7.2.N omenclatura de cromossomos
situado numa regio adjacente ao telmero
Um sistema padro para denominar os cromossomos foi estabelecido em 1971. Cada
cromossomo tem braos curtos (p) e longo (q) separados pelo centrmero. Cada
brao dividido em regies numeradas a partir do centrmero para a extremidade
(ex.: p1, p2, etc), e cada regio subdividida em bandas (ex.: p1.1, p1.12, etc),
novamente numerando do centrmero para a extremidade. Os termos proximal e distal
so usados com relao ao local em um ponto do cromossomo. Proximal indica que
um lcus est na metade do cromossomo adjacente ao centrmero, enquanto que o
distal indica que est
7.3. Indicao clnica para anlise citogentica:
A anlise cromossmica indicada como um procedimento diagnstico de rotina para
uma srie de fentipos especfico encontrados na prtica mdica. Alm disso, tambm
existem situaes clnicas no especficas que indicam a necessidade de anlise
cromossmica.
Problemas precoces de crescimento e desenvolvimento a falta ou o retardo do
desenvolvimento, malformaes mltiplas, baixa estatura, genitlia ambgua e retardo
mental so achados freqentes em crianas como anomalias cromossmicas. A
menos que haja um diagnstico no-cromossmico definitivo, a anlise cromossmica
deve ser realizada nos pacientes que se apresentam com uma combinao de tais
fatores.
atimorto e morte pr-natal a incidncia de anomalias cromossmicas mais elevada
entre os natimortos (aproximadamente 10%) do que entre os nativivos
(aproximadamente 0.7%). Ela tambm elevada entre as crianas que falecem no
perodo neonatal (cerca de 10%). A anlise cromossmica deveria ser realizada em
todos os natimortos e bitos neonatais que possam apresentar uma base citogentica
a fim de identificar uma possvel causa ou alternativa, ou descartar uma anomalia
cromossmica como motivo para a perda. Em tais casos, a cariotipagem essencial
para a consulta gentica, podendo fornecer importantes informaes para o
diagnstico pr-natal em futuras gestaes.

Problemas de fertilidade os estudos cromossmicos esto indicados para mulheres

que apresentam amenorria e para casais com histria de infertilidade ou abortos
recorrentes. A anomalia cromossmica observada em um dos genitores em cerca de
3-6% dos casos nos quais existe infertilidade ou dois ou mais abortos.
Gestao em uma mulher em idade avanada existe o risco aumentado de
anomalias cromossmicas nos fetos concebidos por mulheres com mais de 35 anos. A
anlise cromossmica fetal deveria ser oferecida como parte da rotina dos cuidados
pr-natais nessas gestaes.
7.4. Mtodos de Anlise Cromossmica
Os 24 cromossomos encontrados no genoma humano podem ser prontamente
identificados citologicamente por uma srie de procedimentos especficos de
colorao. Estes procedimentos tambm so teis no diagnstico de diversos
transtornos cromossmicos, tais como: translocaes, delees, inverses e
duplicaes cromossmicas. As tcnicas de bndeamento cromossmico
rotineiramente utilizadas so:
7.4.1. Tcnicas de citogentica clssica
Os cromossomos so estudados coletando-se um tecido vivo (geralmente sangue),
cultivando-se o tecido pelo tempo apropriado (em geral de 48 a 72 horas para
linfcitos), adicionando-se colchicina para produzir o bloqueio metafsico, isolando-se
as clulas e colocando-as em uma lmina, rompendo a membrana nuclear com uma
soluo salina hipotnica, corando com um corante especfico de cromossomos e
fotografando as metfases de cromossomos na lmina.As fotografias so ento
recortadas e os 2 pres de cromossomos autossomos so dispostos de acordo como
seu tamanho, ficando os cromossomos sexuais a direita. Esta arrumao dos
cromossomos denominada caritipo.
Bandeamento G - Os cromossomos so tratados inicialmente com tripsina (para
desnaturar as protenas) e depois submetidos colorao pelo Giemsa. As bandas G,
que aparecem escuras, contm DNA rico em regies AT. Este o mtodo de colorao
comumente utilizado em laboratrios de anlise citogentcia.
Bandeamento Q - Quando os cromossomos so tratados com quinacrina, desenvolve
um padro especfico de bandas escuras intercaladas com outras brilhantes (Q), que
so de fcil identificao em um microscpio de fluorescncia. As bandas Q coincidem

quase que exatamente com as bandas G, de modo que tambm so ricas em

seqncias AT.
Bandeamento R - Neste caso, os cromossomos so submetidos ao calor antes da
colorao pelo Giemsa, o que resulta num padro de bandas escuras (bandas R) e
claras, ao contrrio do obtido com os bandeamentos G e Q. A anlise molecular das
bandas R mostra uma maior proporo de seqncias C-G.
Bandeamento C - Este mtodo cora de maneira especfica quelas pores da
cromatina que permanecem, tambm, condensadas na interfase, como por exemplo, a
heterocromatina constitutiva dos centrmeros.
Padro de banda de alta resoluo - Este tipo de padro de bandas obtido atravs
de tcnicas de padro de bandas G ou R para corar os cromossomos que foram
obtidos em um estgio inicial da mitose (prfase ou prmetafase), quando eles ainda
se encontram em um estado relativamente no condensado. O padro de bandas de
alta resoluo especialmente til quando se suspeita de anomalia estrutural sutil de
um cromossomo.
7.4.2. Tcnicas de citogentica molecular
Hibridizao in situ com fluorescncia (FISH) - Esta tcnica permite examinar a
presena ou ausncia de uma seqncia especfica de DNA ou para avaliar o nmero
ou a organizao de um cromossomo ou de uma regio cromossmica. O princpio
bsico consiste em adicionar um corante fluorescente a uma sonda de DNA, de modo
que, quando a sonda marcada hibridiza-se a seu cromossomo complementar em uma
disperso metafsica, ele fluoresce se visto sob luz ultravioleta. As sondas
normalmente utilizadas so de seqncias genmicas nicas, que iro hibridizar-se a
uma regio complementar no cromossomo. Estas sondas de seqncias nicas so
extremamente teis para detectar anomalias sub-microscpicas tais como as
microdelees.
Cariotipagem espectral (SKY) - A tcnica de FISH foi ampliada usando-se sondas
mltiplas, cada uma marcada com uma cor diferente, de modo que vrias anomalias
numricas ou estruturais podem ser testadas simultaneamente na mesma clula. Alm
disso, novas tcnicas como a cariotipagem espectral, usando combinaes variadas
de cinco sondas fluorescentes diferentes em conjunto com cmeras especiais e
programas de processamento de imagens, de modo que cada cromossomo corado
de um modo nico (pintado) para pronta identificao. Tais imagens so
especialmente teis na identificao de rearranjos cromossmicos.

Hibridizao genmica comparativa (CGH) - Esta extenso da tecnologia FISH pode

ser usada para demonstrar a presena de grandes delees cromossmicas ou
duplicaes em tecidos como tumores slidos que no podem ser submetidos
anlise cromossmica convencional. Essencialmente a CGH envolve a hibridizao
competitiva de uma mistura de DNA-teste da amostra diagnstica e o DNA normal de
uma amostra controle com cromossomos metafsicos humanos normais. O DNA-teste
marcado com um corante verde e o DNA controle com um corante vermelho. Se a
amostra de teste contiver mais ou menos DNA de uma determinada regio
cromossmica que o DNA-controle, isto revelado por um aumento ou diminuio da
proporo verde para vermelho, conforme revelado pela imagem processada pelo
computador. A complexidade tecnolgica deste mtodo, acoplada a seu custo, significa
qeu seu uso tende a ser limitado aos estudos das anomalias cromossmicas de
tumores.