Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

MDULO OPTATIVO:
INTRODUCCIN A LA INVESTIGACIN CIENTFICA EN EL REA BIOMDICA
MICROSCOPA
- Procesamiento de materiales biolgicos
Microscopa ptica
1- Fijacin: Formol 4%
2- Deshidratacin: Series de etanol de concentracin creciente
3- Aclaramiento: xilol
4- Inclusin en parafina
5- Preparacin del taco
6- Corte
7- Desparafinizacin
8- Coloracin: Hematoxilina/Eosina
9- Deshidratacin
10- Aclaramiento
11- Colocacin de cubreobjeto
Microscopa electrnica de transmisin
1- Fijacin: Karnovsky 1,5%
2- Deshidratacin: Series de acetonas
3- Inclusin en resinas: araldita
4- Preparacin del taco
5- Corte
6- Montaje en grillas de nquel
7- Coloracin: Sales de metales pesados: citrato de plomo y acetato de uranilo
Utilidades de la Microscopa Electrnica de Transmisin en la patologa mdica:
Patologa renal
Patologa neuromuscular
Patologa tumoral
Probable contribucin de la Microscopa Electrnica al diagnstico diferencial de:
-Carcinoma, melanoma y sarcoma.
- Adenocarcinoma y mesotelioma.
- Tumores de mediastino anterior: timoma, carcinoide tmico, linfoma y seminoma.
- Tumores de clulas pequeas y redondas: sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma embrionario,
linfoma, tumores neuroectodrmicos.
- Tumores de clulas fusadas de partes blandas.
1

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

- Tumores endocrinos y no-endocrinos.

INMUNOCITOQUMICA
Permite localizar componentes celulares especficos,
mediante una reaccin antgeno- anticuerpo.
Componentes esenciales
Antgeno: sustancia de cualquier constitucin qumica, que introducida a un
organismo por cualquier va, no es reconocida como propia e induce una respuesta
con formacin de anticuerpos.
Anticuerpo (Inmunoglobulina): molcula proteica producida por las clulas
plasmticas en respuesta a un antgeno.
Cada anticuerpo tiene una porcin que se une especficamente a un antgeno.

Para llevar a cabo esta tcnica los anticuerpos estn unidos a molculas trazadoras, que permiten
visualizar el lugar de la reaccin antgeno-anticuerpo.
Las molculas trazadoras pueden ser:
- Fluorocromos (microscopa de fluorescencia)
- Enzimas (microscopa fotnica)
- Metales, como el oro coloidal (microscopa electrnica)

enzimas
Metales

Marcador

fluorocromos

Inmunoglobulina

Ag

Ag

La inmunocitoqumica se puede realizar tanto para microscopa ptica como para microscopa
electrnica de transmisin.
A continuacin se mencionan dos de las tcnicas de immunohistoqumica ms utilizadas en
microscopa fotnica:

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

1- Tcnica de immunoperoxidasa. El trazador enzimtico es la enzima peroxidasa. Puede

emplearse en tcnica con anticuerpos marcados (tcnica directa o indirecta) o con
anticuerpos sin marcar (tcnica peroxidasa/anti-peroxidasa: PAP).
2- Mtodo de avidina-biotina.
Entre las aplicaciones de la inmunocitoqumica se encuentra:
- Identificacin celular.
- Inmunotipificacin tumoral y pronstico.
- Morfometra.
CITOMETRA DE FLUJO (CMF)
FUNDAMENTOS
Tcnica de anlisis celular multiparamtrico basada en hacer pasar una suspensin de
partculas (generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser
focalizado
Los citmetros de flujo analizan clulas en suspensin que interfieren de forma individual
con una fuente de luz. La interseccin de cada clula con la luz lser provoca la emisin de una
serie de seales luminosas que permite diferenciar poblaciones celulares dentro de la muestra
analizada, por su tamao relativo, por sus granulaciones o bien por su reactividad con
fluorocromos. Es un mtodo de lectura rpido, que permite analizar un elevado nmero de clulas
y proporciona un registro computarizado de los resultados. La citometra de flujo permite la
determinacin de antgenos celulares de superficie, y por tanto, tiene utilidad en la determinacn
de inmunotipos de leucemias agudas y sindromes linfoproliferativos crnicos. As mismo,
permite la cuantificacin del ADN y la determinacin de la actividad proliferativa de la poblacin
celular. La cuantificacin de ARN celular se aplica al recuento de reticulocitos. La citometra de
flujo se ha beneficiado de los avances ocurridos en los ltimos aos en informtica, electrnica,
ptica y tecnologa laser. As mismo, la produccin de nuevos anticuerpos monoclonales con
diferentes fluorocromos y los nuevos procedimientos de tincin en citoqumica han permitido
ampliar las reas de estudio en diagnstico clnico e investigacin biomdica. Actualmente, esta
tecnologa ha pasado de ser una herramienta til en investigacin bsica a ser empleada en la
prctica habitual de muchos laboratorios de hematologa y anatoma patolgica.
CUANDO EMPLEAR LA CDF?

La CMF se puede emplear para estudiar caractersticas estructurales y funcionales de

clulas o partculas en suspensin.
Las aplicaciones fundamentales de esta tcnica se dan en biologa y medicina
Permite la identificacin de antgenos celulares
mediante tcnicas de
inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.

QU ES UN CITMETRO DE FLUJO?
3

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Es un aparato que es capaz de medir componentes y propiedades celulares (partculas biolgicas)

que fluyen en suspensin.
Es esencial disponer de una suspensin de clulas o partculas individuales.
Las clulas o partculas son marcadas por colorantes fluorescentes que son capaces de excitarse
con una fuente luminosa de alta energa
EMPLEOS DE LA CDF EN BIOMEDICINA:

Recuento celular,
Frmula leucocitaria,
Recuento reticulocitario,
Anlisis de mdula sea,
Estudios de cintica celular,
Estudio de subpoblaciones linfocitarias,
Tipologa tisular,
Estimulacin linfocitaria,
Diagnstico/pronstico de procesos neoplsicos,
Monitorear tratamiento en oncologa,
Diagnstico bacteriano y vrico,
Sensibilidad a antibiticos,
Cariotipo,
Diagnstico de portador,
Diagnstico prenatal.

MTODOS DE DETECCIN DE APOPTOSIS

MECANISMOS DE MUERTE CELULAR (Clsicos)
Necrosis
Apoptosis
Mecanismo pasivo consecuencia
Proceso activo y organizado
de una lesin severa (hipertermia,
determinado genticamente
hipoxia, toxinas, etc)
Culmina con la fragmentacin
Conduce a la lisis celular
celular y fagocitosis de restos
Afecta grupos celulares contiguos
celulares
Generalmente acompaada de
Afecta clulas aisladas
reaccin inflamatoria
No se acompaa de reaccin
inflamatoria

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

APOPTOSIS
Eventos morfolgicos y bioqumicos
Disminucin del tamao celular
Condensacin del citoplasma
Fragmentacin nuclear
Formacin de cuerpos apoptticos
Fagocitosis
Externalizacin de la fosfatidilserina
Divisin intranucleosomal
Divisin del ADN en 50-300 kb
Deteccin de Protenas que participan en el proceso
apopttico
Deteccin de actividad Enzimtica

Tcnicas de deteccin
Microscopa Electrnica
Microscopa Fotnica
Citometra de Flujo
Tcnica de TUNEL
Electroforesis del ADN en gel de
agarosa
Inmunohistoqumica
Western blot
ELISA

TCNICA DE TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling)

TUNEL Es uno de los mtodos ms utilizados.
Consiste en la incorporacin de nucletidos marcados a extremos OH 3` de las cadenas simples
del ADN mediante una transferasa terminal (desoxynucleotidil transferasa
Dichos polmeros se ponen de manifiesto mediante microscopa de fluorescencia o se pueden
detectar por tcnicas inmunohistoqumicas.

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Cortes histolgicos

Cultivos celulares

Desparafinar
Hidratar

Fijar

Digerir
enzimticamente con
Proteinasa K

Permeabilizar

Incubar con nucletidos marcados y enzima

Transferasa Terminal
Incubar con anticuerpo conjugado con
peroxidasa
Adicionar el substrato (DAB)
Analizar las muestras

Ventajas
Permite determinar presencia de
fragmentacin del ADN en clulas
individuales (cuantitativa)

Desventajas
En algunos procesos de necrosis
puede haber degradacin del ADN
dejando extremos 3 libres

Se han desarrollado kits que facilitan

su utilizacin
ELECTROFORESIS DEL ADN
Se basa en la extraccin y purificacin de las molculas de ADN, las cuales son separadas por su
tamao, en un gel de agarosa sometido a un campo elctrico
Extraccin del ADN
Lisis y homogeneizacin de la muestra
Digestin con Proteinasa K
Digestin del ARN con ARNasa
Remocin de protenas residuales por precipitacin y centrifugacin
Recuperacin del ADN del sobrenadante por precipitacin con isoproterenol
Lavado del ADN con etanol
Siembra del ADN
Corrida Electrofortica (Buffer que contiene Bromuro de Etidio)
Transiluminacin

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Ventajas
La degradacin del ADN en patrn
de escalera ocurre en forma
especfica
Mtodo confiable

Desventajas
Aparece en un proceso tardo
Algunas estirpes celulares no
presentan este tipo de degradacin
(epiteliales)
Es posible perder fragmentos
pequeos de ADN

CITOMETRA DE FLUJO
Mtodo que permite medir componentes y propiedades de clulas que fluyen en una suspensin
celular.
Deteccin de molculas involucradas en apoptosis: ( Fas, Bcl-2, citocromo c, caspasa 3
) se utilizan anticuerpos acoplados a algn fluorocromo.
Degradacin del ADN: las clulas apoptticas presentan menos contenido de ADN,
debido a la degradacin por endonucleasas ( se utilizan fluorocromos que se intercalan en
la molcula de ADN)
Cambios en la simetra de la membrana plasmtica: mediante la incorporacin de
anexina (molcula con gran afinidad por la fosfatidilserina y que no difunde) . Con
yoduro de propidio puede verse la integridad de la membrana plasmtica.
Ventajas
Deteccin de apoptosis temprana y
tarda
Cuantitativo
Conocer la integridad de las membranas

Desventajas
Requiere clulas ntegras

CULTIVOS CELULARES
Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento
de las clulas "in vitro", manteniendo al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y
genticas.
Aplicaciones del cultivo de tejido
La tcnica de cultivo celular permite el estudio de mltiples fenmenos celulares:
a. Actividad intracelular
b. Flujo intracelular
c. Ecologa celular
d. Interacciones celulares

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Las tcnicas de cultivo celular permiten la produccin de vacunas antivirales, investigacin del
cncer, produccin de protenas como interfern, insulina, hormona de crecimiento para usos
teraputicos, mantenimiento y produccin de tejidos para transplante.
Ventajas y desventajas de los cultivos celulares
VENTAJAS

DESVENTAJAS

Control preciso y fino del medio ambiente

Homogeneidad de la muestra
Motivaciones ticas.

Sensibilidad de la tcnica
Alto costo
Inestabilidad
Validez del modelo "in vitro"

Tipos de cultivos de tejidos

Dependiendo del grado de preservacin de la estructura del tejido o del rgano de origen y de su
duracin hablaremos de diferentes tipos de cultivos: celulares, organotpicos y explantes.
I) Cultivos celulares.
Se cultivan clulas aisladas, por lo que es necesario realizar una disgregacin celular ya sea por medios
enzimticos o mecnicos, para romper las uniones intercelulares y con la matriz extracelular.
Los cultivos celulares pueden ser
Primarios

Lneas celulares

Forma de crecimiento de los cultivos celulares

Una suspensin celular se puede cultivar como

monocapa
adherida a una superficie

en suspensin.
en el medio de cultivo

II) Cultivo de rganos (Organotpicos)

Implica que la arquitectura caracterstica (con estructura tridimensional) del tejido 'in vivo' se conserva
al menos en parte. Para ello el rgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que
puede liberar los desechos.
III) Explantes
Se cultivan fragmentos de tejidos o de rganos adheridos a una superficie.
Equipo necesario para un cultivo celular
1. Sistemas de esterilizacin
La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no slo al medio en que se realiza el
trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios lquidos

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

o slidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con ste en algn momento de su
manipulacin
- Equipos de filtracin.
- Autoclave
- Estufa
2. Cabina de Flujo Laminar
Su funcin es la de mantener un rea libre de partculas, especialmente de posibles contaminantes
(bacterias, hongos) que puedan acceder al cultivo.
3. Incubador
Un incubador dispone de:
1. dispositivos de control de temperatura.
2. dispositivo de inyeccin de una mezcla de aire y CO2 en la proporcin deseada.
3. dispositivo de control de la humedad ambiente.
4. dispositivo de recircularizacin de aire.
Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosfrica y niveles de CO2 son
caractersticos de cada tipo celular.
4. Bao termostatizado
5. Microscopio invertido de contraste de fase
El control morfolgico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio de contraste de
fase. La fuente de iluminacin y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un
microscopio ptico convencional.
Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captacin de imgenes, fotogrfico o
de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.
6. Otros instrumentos: centrfugas, equipo de purificacin de agua, balanzas, pH-metro.

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

ELISA y WESTERN BLOT: mtodos de inmunodeteccin de antgenos sin preservacin de

la estructura del tejido
MATERIAL BIOLGICO

TEJIDO

CLULAS

HOMOGENATO
Centrifugacin (eliminacin de ncleos, algunas
organelas, restos celulares)

PROTENAS

TOTALES
- Absorbancia UV (280 y 205 nm)

ESPECFICAS
ELISA

Western Blot

- Mtodos colorimtricos (VIS)

Deteccin de la
protena en la
muestra con
anticuerpo
especfico, sin
necesidad de
separacin previa.
Mtodo
Cuantitativo

1- Separacin de protenas
en la muestra por
electroforesis.
2- Transferencia a un
soporte slido
3- Deteccin de protena
especfica con anticuerpo
especfico.
Mtodo
Semicuantitativo

ESPECTROFOTMETRO

10

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Definicin
La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo in vitro en el cual se
produce la sntesis enzimtica de un fragmento de ADN especfico, en pocas horas.
Etapas de la reaccin
Las etapas de la reaccin son 4:
DESNATURALIZACION INICIAL: Esta etapa consiste de un calentamiento de la muestra a
95 C, para que se produzca la desnaturalizacin de todas las cadenas de ADN.
CICLADO: Esta etapa es la reaccin propiamente dicha. Consiste de 3 subetapas:
Desnaturalizacin (95 C)
separacin de las cadenas de ADN
Annealling (56-70 C)
unin de los primers a la molcula de ADN

1 ciclo

Extensin (72 C)
se produce mediante el agregado de dNTPs

11

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

EXTENSION FINAL: Esta etapa consiste de una extensin final a 72 C para que la reaccin
se complete.
Reactivos
Muestra (Template DNA): Esta contiene la regin del fragmento a ser amplificado
Buffer (Tris, NH4+ y/o K+): le brinda a la polimerasa un ambiente qumico conveniente
Cloruro de Magnesio (Cl2Mg): Ayuda a la polimerasa en su funcin
Par de primers (oligonucletidos): determinan el comienzo y el final de la regin a ser
amplificada
dNTPs (deoxinucletidos trifosfato): a partir de los cuales la polimerasa construye el nuevo
fragmento de ADN
DNA Polimerasa (Usualmente Taq)

Aplicaciones
Deteccin de mutaciones
Screening de enfermedades hereditarias (desordenes genticos heredados)
Diagnostico de enfermedades infecciosas
Clonacin de genes
Perfil gentico utilizando microsatlites
Medicina forense
Estudio de especies salvajes
Test de paternidad
Produccin de gran cantidad de ADN para secuenciacin o de secuencias especificas de
ADN para utilizar como sonda

Tipos de PCR
SSCP-PCR (single strand conformational polymorphims PCR): Se utiliza para detectar
mutaciones
Touchdown PCR: Evita, parcialmente, el annealling no especifico de los primers y por ende
la amplificacin inespecfica
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR): Permite ver expresin de genes
Real Time-PCR (PCR en tiempo real): Permite ver en tiempo real la acumulacin de
producto
MICROARRAY ( BIOCHIPS )
FUNDAMENTO
La tecnologa microarray permite el anlisis comparativo y simultneo de cmo se expresan
cientos de genes en un solo experimento
GENERALIDADES

12

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Son micromatrices (soporte de silicona, vidrio, plstico o membrana de nylon) donde

existen miles de sondas de material gentico las cuales tienen una secuencia conocida.
Se fabrican a partir de:
- Cadenas de oligonucletidos
- Una coleccin purificada de DNAs
- Protenas
- Tejidos
SECUENCIA DE EVENTOS EN UN ESTUDIO COMPARATIVO DE EXPRESIN
GNICA
1- Eleccin de la poblacin celular a estudiar.
Objetivos:
A- Estudios comparativos de genes especficos
de tejidos
B- Estudios de defectos genes reguladores en el
cncer
C- Respuestas celulares al ambiente
D- Variaciones del ciclo celular
2- Extraccin del mRNA y Transcripcin Reversa
- Objetivo: Comparar la cantidad de diferentes
mRNA presentes en 2 poblaciones celulares
seleccionadas.
- Se realiza una trascripcin reversa de mRNA a
cDNA que es una forma ms estable.
3- Marcacin de los cDNA.
Empleo de molculas fluorescentes:
Rojo: Rodamina
Verde: Fuorescena
4- Hibridacin al DNA del Biochip o Microarray.
5- Escaneo del array hibridado. Revelado mediante:
1- Escner ptico
2- Microscopio lser confocal
6- Interpretacin de la imagen escaneada.
Mediante el empleo de software comerciales y gratuitos
APLICACIONES

13

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

en biomedicina
en la clnica
en la industria farmacutica

en biotecnologa
VENTAJAS
- Permite generar un volumen importante de datos que luego se analizan, interpretan y renen en
una base informtica.
- Acelerar descubrimientos biolgicos
- Encontrar genes con objetivos teraputicos
- Clasificar enfermedades basndose en genes
PERSPECTIVAS DE DESARROLLO EN INDUSTRIAS FARMACUTICAS
Desarrollar nuevas herramientas de diagnstico micromatriciales en las reas siguientes:
- genotipado del VIH-1 para detectar mutaciones de resistencia,
- resecuenciacin del gen p53 en el cncer,
- prediccin del riesgo de cncer colorrectal,
- fibrosis cstica,
- genotipado del virus del papiloma humano (HPV). (La infeccin por el HPV es la
primera causa de cncer cervical.)
Estas micromatrices aportarn informacin sobre la dotacin gentica de una persona o revelarn
caractersticas distintivas de la enfermedad o el agente infeccioso, cuyo conocimiento influir en
la eleccin y la duracin del tratamiento.
HIBRIDIZACION IN SITU
Es un tcnica mediante la cual se estudia la distribucin y densidad de un gen o molcula de
ARNm en una clula o un tejido, utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena.
Hibridizacin: Es un proceso en el cual dos cadenas complementarias de cidonucleico forman
una doble hlice durante un perodo de tiempo.
En general, la hibridacin puede hacerse sobre soportes slidos (filtros de nylon o nitrocelulosa),
en solucin (in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ). Se pueden utilizar
sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como se necesita proteccin y manipulacin
especiales , no son de eleccin para su uso rutinario. Las tcnicas no-isotpicas o colorimtricas
son ms rpidas y permiten una localizacin ms precisa de la reaccin. Las sondas marcadas sin
elementos radioactivos son ms estables y ms baratas. La sensibilidad es igual o levemente
inferior a la de los mtodos isotpicos. Se han utilizado sondas marcadas con biotina y
digoxigenina.
14

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Tipos de tcnicas de hibridacin:

Tcnica isotpica radioactiva (sondas marcadas con: 32P, 35S, 3H).

Tcnica no isotpica o no radioactiva. (sondas marcadas con: digoxigenina, peroxidasa,

biotina etc).

Tipos de sondas

ADN de simple cadena: Son ms largas de 200-500 pb.

ADN de doble cadena: Necesitan ser desnaturalizados
hibridizacin.

Probes de ARN: Son ms estables.

antes

de

la

La hibridacin in situ se utiliza primordialmente en la deteccin de bajo nmero de copias de

virus, en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como agentes carcingenos (HPV,
HBV, EBV).
Hibridacin in situ Fluorescente
(FISH : Fluorescent In Situ Hybridization)
La FISH es una nueva tecnologa que utiliza sondas de DNA marcadas con fluorescencia para
detectar o confirmar anomalas gnicas o cromosmicas que generalmente estn ms all del
poder de resolucin de la citogentica de rutina. Primero, la muestra de DNA (cromosomas
metafsicos o ncleos en interfase) se desnaturaliza, proceso que separa las hebras
complementarias de la estructura en doble hlice del DNA. A la muestra desnaturalizada se le
aade entonces la sonda de inters, marcada con fluorescencia, que se hibridar al DNA de la
muestra en el sitio diana, en el proceso denominado templado, donde se vuelve a formar una
doble hlice. La seal de la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y la
muestra de DNA se clasifica segn la presencia o ausencia de la seal.
FISH de Metafase
La FISH puede usarse sobre clulas en metafase para detectar microdeleciones especficas ms
all de la resolucin de la citogentica de rutina o para identificar material extra de origen
desconocido. Puede tambin ser de ayuda en casos donde es difcil determinar mediante la
citogentica de rutina si un cromosoma tiene una delecin simple o est implicado en una
reorganizacin sutil o compleja. Adems, la FISH de metafase puede detectar algunos de los
reordenamientos especficos que se observan en ciertos cnceres. El nmero de sndromes de
microdelecin diagnosticados por FISH est aumentando con rapidez. La sensibilidad de estos
ensayos es en todos los casos mejor que la de la citogentica de rutina, pero depende del
sndrome en concreto. En algunos, la sonda es especfica para el gen defectuoso, como en el
Sndrome de Williams, donde se ha encontrado una delecin en el gen de la elastina en el 96% de
los pacientes con diagnstico confirmado. En otros sndromes como el de PraderWilli/Angelman, la etiologa es heterognea y las microdeleciones slo forman una parte de los
casos (60%).

15

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Sndromes de Microdelecin Actualmente Diagnosticables mediante FISH

Sndrome del maullido (cri-du-chat)

Sndrome de Kallman

Sndrome de Miller-Dieker

Sndrome de Williams

Sndrome de Smith-Magenis

Sndrome de Wolf-Hirschhorn

Deficiencia de esteroide-sulfatasa

Sndrome de Prader-Willi/Angelman

Sndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen

FISH de Interfase
La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de uno o
varios cromosomas, as como para detectar algunas reorganizaciones especficas que son
caractersticas de ciertos cnceres. La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede
realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento
de las clulas.
Un buen ejemplo es el ensayo de Prueba de Aneuploida, que se realiza sobre clulas del fluido
amnitico cuando hay una fuerte indicacin clnica de una de las trisomas ms comunes. Se
desnaturalizan los ncleos de la muestra, se hibridan con sondas especficas para los cromosomas
13, 18, 21, X e Y, y los resultados se obtienen comnmente en 24 horas. La prueba de aneuploida
suele incluir tambin una citogentica de rutina para confirmar los resultados o detectar cualquier
anomala no detectada por la FISH de interfase.

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

La tecnologa del DNA recombinante o ingeniera gentica es un trmino general que engloba
todos aquellos protocolos experimentales que conducen a la transferencia de informacin
gentica (DNA) desde un organismo a otro.
Un experimento de DNA recombinante generalmente sigue el siguiente formato:
1.- El DNA (DNA clonado, DNA insertado, DNA diana, DNA extrao) de un organismo donador
se extrae, se rompe enzimticamente (corta, digiere) y se junta (liga, une) a otro DNA (vector de
clonacin) para formar una nueva molcula de DNA recombinado
2.- Esta construccin vector de clonacin-DNA insertado se transfiere y mantiene dentro de una
clula hospedadora. La introduccin del DNA en la clula hospedadora se denomina
transformacin (bacterias) o tranfeccin (clulas eucariotas).

16

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

3.- Aquellas clulas que han tomado la construccin de DNA (clulas transformadas o
transfectadas) se identifican y seleccionan (separan) de aquellas que no contienen la construccin.

ANIMALES TRANSGNICOS
Un animal transgnico es el resultado de insertar un gen forneo (transgen) en su genoma, con el
fin de modificar alguna caracterstica del animal.
Son utilizados para:

Estudiar enfermedades y contribuir al desarrollo de tratamientos ms efectivos.

Producir productos biolgicos tiles.

Conseguir rganos que puedan utilizarse en transplantes.

Primer paso:
Identificar y aislar el gen que se desea insertar en el genoma del animal con el fin que manifieste
un carcter determinado o que produzca la sntesis de una protena.
Segundo paso:
Introducir el gen , para ello existen diferentes mtodos:

Microinyeccin de ADN en el proncleo de un zigoto.

Transferencia del gen empleando retrovirus como vectores.

Transformacin de clulas madre embrionarias.

Aplicacin clinica:
- Esta tcnica es utilizada para crear modelos de enfermedades humanas con el fin de
investigar nuevos tratamientos. Existen modelos transgnicos para el cancer, fibrosis qustica,
artritis reumatoide y Alzheimer.
- Producir rganos para trasplantes, con el fin que no exista rechazo por el sistema
inmunolgico del paciente. Para ello se inserta un gen que expresa una protena humana en la
superficie de las clulas del animal de modo que dichas clulas no sean reconocidas por el
sistema inmune humano.
- Animales transgnicos como biorreactores para la sntesis de protenas de alto valor
(protenas teraputicas): Las "granjas farmacuticas" o "granjas moleculares.
17

Mtodos de estudio de las clulas y sus componentes

Desventajas:
- Bajo porcentaje de animales que incorporan el transgen en el lugar correcto.
- Preocupacin que los transplantes de animales a humanos permitan a unvirus animal
infectar al hombre.
ANIMALES KNOCKOUT
Animales "knockout" son aquellos en los que un gen normal es reemplazado por uno que produce
una protena no funcional. La herramienta esencial para la aplicacin de esta tcnica deriva del
empleo de las clulas embrionarias troncales (clulas ES) o multipotentes
El primer paso del proceso de generacin de un ratn knockout consiste en la eliminacin de uno
de las dos copias del gen seleccionado en las clulas ES.
Aplicacin clinica:
- Fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la tcnica de Knockout, el gen
de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.
- Se han desarrollado modelos animales (ratones) knockout deficientes en una determinada
proteasa de potencial relevancia en el cncer.
Desventajas :
- Bajo porcentaje de animales que incorporan el transgen en el lugar correcto.
- La deficiencia en un gen puede llegar a generar anomalas importantes provocando retraso
en el crecimiento, envejecimiento acelerado y muerteprematura.

18