REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

MICROBIOLOGA AMBIENTAL
REPORTE DE DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO EN EL SITIO
ALTERADO PRESA BLANCA: COMPUERTA 1 DE ACUERDO A LA
PROY-NMX-AA-042/1-SCFI-2008
NMX-AA-SCFI-1987

cnolgica de Len.

b e r, H a c e r.
PRESENTAN
GRIMALDO MNDEZ JESS ADIR
MARTN DEL CAMPO ORTIZ ISRAEL
PREZ RAMREZ MIRIAM ALEJANDRA
PEDROZA LVAREZ JESS OMAR
RAMREZ RAMREZ MIGUEL ANGEL
QU-301
ASESORA
Dra. ROSA RICO MATA
GENERACIN: 2014-2016
LEN, GUANAJUATO. 24 DE JUNIO DE 2015

ANTECEDENTES DEL SITIO

En el estado de Guanajuato se encuentra el municipio de Len uno de los 46
que conforman el estado.
En dicho municipio se
encuentra la Presa Blanca,
con
una
localizacin
geogrfica 210501.71 N
1014239.60 O; en la
Figura 1 Presa Blanca vista
area se puede apreciar
dicha presa vista desde el
aire a una altura de 3.93 km,
se observa un color verdoso
de agua as como a sus Figura 1 Presa Blanca vista area
alrededores se encuentran
parcelas para sembrados.
Es una presa de aguas negras y residuales donde desembocan todo tipo de
desechos industriales y domsticos, el agua de dicha presa se conduce a travs de
un canal a cielo abierto, hacia las comunidades de Santa Rosa, Plan de Ayala y San
Pedro del Monte y su destino final es para el riego de alfalfa y lechuga, estas aguas
estn fuertemente contaminadas qumica y bacteriolgicamente, al no sufrir ningn
tratamiento de remediacin. El municipio de Len posee parcialmente dos cuencas
hidrolgicas: la del sistema Lerma-Chapala-Santiago, y al de los ros PnucoTames.1
Actualmente en Presa blanca existen ciertos tipos de servicios como los que
se observan en la Tabla 1. Actividades econmicas, se encuentra referenciado a un
rea de influencia de 2 km.
Tabla 1 Actividades Econmicas 2
SEVICIO
Agricultura, cra y explotacin de animales
Minera
Generacin, transmisin y distribucin de energa
elctrica

EXISTENTES
2
2
2

Construccin
industrias manufactureras

10
1200

Informacin por municipios. Acceso y disponibilidad en:

http://proteccioncivil.guanajuato.gob.mx/atlas/sanitario/leon.php
2
Actividades econmicas municipio de Len de los Aldama, Guanajuato. Acceso y disponibilidad en:
http://inegi.com/leon/actividades/economa

Comercio al por mayor

Comercio al por menor
Transportes, correos y almacenamiento
Informacin en medios masivos

575
2475
49

Servicios financieros y de seguros

58

Servicios inmobiliarios y de alquiler de bienes

muebles e instancias
Servicios profesionales, cientficos y tcnicos
Servicios de apoyo a los negocios y manejo de
residuos y desechos

80
58
138

Servicios educativos

121

Servicios de salud y de asistencia social

Servicios de esparcimiento culturales y deportivos, y
otros
Servicios de alojamiento temporal y de preparacin
de alimento
Otros servicios excepto actividades
gubernamentales

126
84

Actividades legislativas, gubernamentales, de

imparticin de justicia.

25

751
972

Fidel Garca Granados, titular de la Direccin de Medio Ambiente de Len,

Guanajuato, menciona que se tiene un problema de contaminacin, Presa Blanca
se ha convertido en un tiradero de desechos industriales, desde lodos de teneras,
hasta llantas y maderas. Ha presentado denuncias dirigidas a la Comisin Nacional
del Agua y la Procuradura federal del Medio Ambiente, pues la zona es de
competencia federal. 3

Transforman presa en tiradero. Acceso y disponibilidad en: http://am.com.mx/leon/local/transforman-lapresa-en-tiradero-5559.html

RELATORIA DEL MUESTREO

El da mircoles 10 de
junio de 2015 se efectu el
muestreo microbiolgico en
Presa
Blanca
Len,
Guanajuato por parte de los
alumnos de grupo QU-301 de
la carrera Qumica rea
Tecnologa Ambiental de la
Universidad Tecnolgica de
Len.
Figura 2 Panormica Presa Blanca

A las 8:20 de la maana se realiz un Check-list con la

finalidad de revisar y confirmar la existencia y correcto
funcionamiento de equipo y materiales necesarios para
efectuar el muestreo as como preservadores que
mantuvieran en condiciones ptimas las muestras. A las 9:20
de la maana se abandonamos la Universidad con destino a
Presa Blanca, tomando el Boulevard Aeropuerto hasta llegar
al Boulevard Timoteo Lozano por ltimo la avenida Mara
Auxiliadora, recorriendo un total de 25 km en un tiempo
aproximado de 35 minutos.
Siendo las 10:15 se tuvo un reconocimiento de la zona
como se aprecia en la Figura 2. Panormica Presa Blanca.
As como el arribo a la zona de muestreo que se puede Figura 3 Zona de Muestreo: Compuerta 1
observar en Figura 3. Zona de muestreo: Compuerta 1.
Gracias al sitio web Meterored se constat que a las 12:00 de la tarde el clima
era soleado nuboso con una temperatura de 23C con un viento de
11 km/h sin presencia de lluvias un porcentaje de humedad de 69% y una presin
de 1017hPa. 4
Se dio inicio con la recoleccin de 5
muestras puntuales de suelo aledao al cauce de
la compuerta 1 para posteriormente crear una
muestra compuesta de 1.5 kg. Como se puede
observar en Figura 4: Muestreo de suelo
Figura 4 Muestreo de suelo

Se midi el caudal de descarga del agua

proveniente de Presa blanca para

Clima en Len. Acceso y disponibilidad en: http://www.meteored.mx/clima_Leon-America+Norte-MexicoGuanajuato--nxw-22384.html.

despus recolectar 8 muestras puntuales de 500 mL cada una como se puede

observar en Figura 5: Muestreo de agua.
Observando las figuras cabe destacar la
coloracin verdosa y espumosa que presentaba el
agua, se cree que contiene contaminantes
provenientes de descargas ilegales por parte de la
industria leonesa y descargas de aguas residuales, as
como el suelo tena una consistencia limo-arcillosa,
comprobndose al ser moldeado de diferentes
maneras.

Figura 5 Muestreo de agua

El muestreo bacteriolgico fue el ltimo en

realizarse debido a que las muestras tenan un tiempo
limitado, por lo que se realiz una siembra de muestras
in situ en agar rojo bilis violeta previamente preparado
y contenido en cajas Petri.

Dicho muestreo se efectu a las 12:30 del da tomando una muestra simple
de agua, con ayuda de una
jeringa estril se deposit 1 mL
de muestra en el agar
previamente mencionado, la
caja Petri que contena el
medio
y
la
muestra
rpidamente fue colocada en
una hielera para mantener en
buen estado la muestra.
Observar Figura 6 Siembra in
situ agua.
Figura 6 Siembra in situ agua

Figura 7 Siembra in situ suelo

A las 12:40 del da se efectu el muestreo bacteriolgico en suelo, excavando

aproximadamente 3 cm a partir de la superficie con ayuda de un hisopo previamente
esterilizado se coloc la muestra de suelo por estriado en el agar y rpidamente se
guard la caja Petri en la hielera. Observar Figura 7 Siembra insitu suelo.
El muestreo finaliz a las 13:00 del da sin reporte de incidencias, el equipo
se retir al punto de reunin previamente acordado.
El arribo a la Universidad Tecnolgica de Len fue a las 15:20 del da, la Dra.
Rosa Rico Mata recibi 2 muestras debidamente etiquetadas: 1 de agua y 1 de suelo
junto con las 2 cajas Petri que contienen las muestras sembradas, se almacenaron
en la incubadora a una temperatura de 35C 37C por 24 horas para su posterior
anlisis y deteccin de coliformes totales y fecales.

PROCEDIMIENTO: CULTIVO IN SITU

Material:
2 cajas Petri previamente esterilizadas que contengan medio de agar rojo
bilis violeta.
Un hisopo de algodn estril.
Pipeta o jeringa estril
Muestreador de agua
Procedimiento de toma de muestra de suelo y agua:
1. En el sitio de muestreo se acondiciona la zona seleccionada para la toma de
muestra para la siembra en cada una de las matrices en este caso agua y
suelo.
2. Para suelo se escarban 3 cm ya que se requiere muestra superficial y con
una esptula depositar la cantidad suficiente en el recipiente.
3. En agua directamente con un frasco muestreador se sumerge 10 cm debajo
de la superficie inclinndolo en direccin opuesta al flujo se introduce hasta
llenado y se vuelve a verter esto con la finalidad de homogenizar la muestra,
se repite la operacin 2 veces ms y la final se toma como muestra.
Procedimiento de siembra:
Para la siembra que se realizara en situ es necesario llevar acabo las
siguientes actividades:
1. Para la siembra de suelo se homogeniza la muestra y con el hisopo tomamos
muestra y se estra de manera simple por la placa de modo que este quede
esparcido.
2. En la siembra de agua, directamente del frasco muestreador con una jeringa
o pipeta estril tomar 1ml de muestra y se esparce por toda la placa por medio
de movimiento oscilatorio
3. Una vez sembrada la muestra se procede a refrigerar para evitar que el agar
sembrado se derrita y se transporta al laboratorio para incubar a una
temperatura de 35C-37C durante 24 horas y se observa si hay crecimiento

PROCEDIMIENTO PRUEBA PRESUNTIVAS PARA LA

IDENTIFICACIN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Fundamento
El mtodo se basa en la inoculacin de alcuotas de muestra, en una serie
de tubos que contengan un medio de cultivo lquido conteniendo lactosa (caldo
lactosado).
tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubacin para verificar la turbidez
en los tubos y la produccin de gas. Estos cambios se producen debido a que los
organismos coliformes fecales (termotolerantes), que son bacilos aerobios o
anaerobios facultativos, Gram negativos, no esporulados que se caracterizan por
poseer la enzima beta-glactosidasa la cual acta cuando estos se desarrollan a 44.0
1 C, lo cual fermenta la lactosa y el manitol produciendo cido lctico y gas como
CO2 e H2. Esta produccin de cido se ve reflejada en el cambio de color si es que
hay indicador de pH y la produccin de gas se ve en el aire contenido dentro de la
campana Durham, tambin se puede observar una turbidez en el contenido del tubo
la cual es producida por el crecimiento de las bacterias.
El Indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido
triptfano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptfano (presente en el medio) con produccin de Indol.

Materiales, reactivos y equipo

Preparacin del medio de cultivo caldo lactosado
18 Campanas de fermentacin Durham
18 Tubos de ensaye de cristal refractario de 15mm x 150 mm con tapn de
baquelita, aluminio o algodn.
2 Esptula
2 Piceta
3 Charola de pesado
2 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
2 Agitador de vidrio
Balanza analtica
Autoclave
Caldo lactosado
Agua destilada
1 Gradilla

Preparacin de muestras e inoculacin del medio

1 Esptula
1 Piceta
2 Pipetas 10 mL
2 Perillas
2 Probetas de 100 mL
2 Asas bacteriolgicas
1 Mechero
Incubadora

PRUEBA PRESUNTIVA
Procedimiento
Para la confirmacin de presencia de coliformes en agua y suelo es necesario
primero sembrar muestras de agua y suelo en cajas Petri con agar rojo bilis violeta
de manera que el suelo se siembre con un isopo estril y el agua con una jeringa 1
mL, ambos en el sitio de muestreo que se preservaran a 4 C.

Medios de aislamiento presuntivo

TABLA 1. CONTENIDO Y MTODO DE PREPARACIN PARA EL CALDO
LACTOSADO.
Medio
utilizado

Marca y
contenido de
producto

Contenido

Mtodo de preparacin

Frmula preparada para

1000 mL de agua
purificada.
BD BIOXON
Caldo
lactosado CONT.
450 g

-Peptona de gelatina
5.0 g
-Extracto de carne
3.0 g
-Lactosa
g
-pH final 6.9 0.2.

Suspender 13 g del polvo en

un litro de agua purificada.
Disolver y distribuir en tubos
con campana Durham.
Esterilizar a 121C de 12 a
15 minutos.

5.0

Conociendo que se prepararan 9 tubos para la muestra de suelo y 9 para la muestra

de agua.

Procedimiento de anlisis
1. Preparacin del medio
1.1. Verificar la preparacin que viene establecida en el frasco del medio.
1.2. El volumen que se preparara de caldo se determina de acuerdo a las
proporciones de ensayo que se desean analizar.
TABLA 2. PROPORCIONES DE ENSAYO PARA LA DISTRIBUCIN DE MUESTRA EN
LOS TUBOS.

Proporciones
de ensayo
A1
A2
A3
A4
A5

1 volumen de
muestra
3 tubos con 10 mL
5 tubos con 10 mL
1 matraz con 10 mL
5 matraz con 100 mL
1 matraz con 10 mL

2 volumen de
muestra
3 tubos con 1 mL
5 tubos con 1 mL
5 tubos con 1 mL
1 tubo con 10 mL
5 tubos con 1 mL

3 volumen de
muestra
3 tubos con 0.1 mL
5 tubos con 0.1 mL
1 tubo con 1 mL
5 tubos con 0.1 mL

1.3. Posteriormente preparar el medio a doble concentracin y colocar la cantidad

correspondiente de acuerdo a las proporciones de ensayo, en este caso se
prepararn 9 tubos para la muestra de suelo y 9 tubos para la muestra de agua,
utilizando material previamente estril. El medio a doble concentracin se
agrega solo a los 6 tubos (3 para anlisis en agua y 3 de suelo) que llevan 10
mL de muestra y 10 mL de medio, y el resto de los tubos llevan el medio en
concentracin normal.
1.4. Colocar una campana Durham a cada uno de los tubos sin excepcin de manera
que estas se encuentren invertidas y al fondo de su tubo.
1.5. Poner un tapn de algodn con capucha de aluminio a cada tubo para
introducirlos en la autoclave durante 15 minutos a 15 lb de presin y 121C o a
la olla de presin durante 15 minutos, contando el tiempo despus de que
alcanza una temperatura alrededor de 120C.
1.6. Una vez fuera de la autoclave u olla de presin dejar enfriar a temperatura
ambiente.
2. Inoculacin e incubacin de tubos
2.1
Homogeneizar las muestras de agua y suelo agitndolas cuidadosamente.
Realizar diluciones de las muestras si es necesario.

2.2
Tomar con pipetas diferentes las cantidades de muestra de agua y suelo
requeridas para cada tubo de caldo lactosado y completar un volumen de 20 mL.
2.3
Tapar los tubos con sus respectivas capuchas y poner en la incubadora a
una temperatura de entre 35-37 C durante 18-48 horas.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA DETERMINAR COLIFORMES
TOTALES
Fundamento:
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo bilis
verde brillante el cual es un medio selectivo que solo permite el desarrollo de
aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante.
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
37C durante 48 hr.

METODOLOGA PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS

Caldo verde bilis brillante
TABLA 2. CONTENIID Y MTODO DE PREPARACIN PARA EL CALDO
VERDE BILIS BRILLANTE
Medio
utilizado

Caldo
verde
bilis
brillante

Marca y
contenido de
producto

BD BIOXON
CONT.
450 g

Contenido

Mtodo de preparacin

Frmula preparada para Disolver 40 gramos del medio

1000
mL
de
agua deshidratado en un litro de
purificada.
agua destilada. Agitando
frecuentemente para disolver
-Bilis de Buey
20.0 el producto, dispense en
g
tubos con campanas Durham.
-Lactosa
10.0 Esterilizar a 121c durante 15
g
minutos.
-peptona de Gelatina 10.0
g
-Verde Brillante
13.3
g

10

NOTA: En base a la cantidad de tubos presuntivos que resultaron positivos en los

tubos que contenan caldo lactosado, preparar la cantidad necesaria de caldo verde
bilis brillante para realizar las pruebas confirmativas, adicionando 10 mL de caldo
a cada tubo con su respectiva campana Durham invertida, una vez preparado los
tubos necesarios de caldo verde bilis brillante se procede a realizar la siembra de
estos.
Desarrollo de la prueba
Una vez sembrados los tubos presuntivos en caldo lactosado con muestras
de agua y suelo se procede a detectar la produccin de gas de CO 2 e H2 dentro
de las campanas Durham.
1.
Si hay produccin de gas dentro de la campana Durham se tendr que
resembrar de cada tubo con caldo lactosado positivo a otro tubo con caldo verde
bilis brillante previamente esterilizado, (si no hay produccin de gas dentro de la
campan Durham no es necesario realizar los siguientes pasos ya que la prueba
presuntiva es negativa).
2.
Antes de realizar la siembra primero esterilizaremos nuestra rea de trabaj
con alcohol etlico al 70%, dejaremos que se seque por completo.
NOTA: Durante la siembra todos los integrantes deben de utilizar su EPP
necesario para resguardar su salud ya que se desea confirmar la presencia de
organismos coliformes totales y termotolerantes.
3.
Realizaremos nuestra siembra de la siguiente manera:
Primero encenderemos nuestro mechero bunsen, esterilizaremos nuestra asa de
nicromo en el mechero, una vez esterilizada el asa se introducir a un tubo con
caldo lactosado que resulto positivo, se agitara en todas direcciones por el tubo
y se retirara, cerraremos rpidamente el tubo, despus introduciremos el asa de
nicromo a un tubo que contenga caldo verde bilis brillante y de igual manera la
agitaremos dentro del CVBB, cerraremos nuestro tubo y lo llevaremos a incubar.
NOTA: Todo el procedimiento se debe de realizar en un permetro no mayor a 30
cm del mechero Bunsen.
4.
Una vez sembrados los tubos con aproximadamente 0.1 mL de muestra
recolectada del tubo con caldo lactosado que resulto positivo, incubaremos los
tubos durante 48 horas a una temperatura de 37c, pasadas las 48 horas
deberemos de observar si nuevamente hay produccin de gases dentro de la
campana Durham e interpretaremos los resultados de la siguiente manera:

11

Interpretacin de resultados:
Si se observa turbidez y produccin de CO2 e H2: La prueba se considera
POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para posteriormente hacer
el clculo del NMP.
Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando se observe
turbidez: estos se consideran NEGATIVOS.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES

TERMOTORELANTES Y E. COLI. PRESUNTIVA
Fundamento:
En la fase confirmativa se detecta a un grupo de coliformes fecales, el cual
est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con
produccin de gas a las 48 hr de incubacin a 44 C. Este grupo no incluye una
especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli.
Desarrollo de la prueba:
1.
A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva en los tubos con caldo lactosado, inocular con una asada otro tubo
con caldo verde bilis brillante.
2.
incubar durante 24 horas a 44 C. y despus de este perodo, observar
presencia de turbidez y gas (CO2). Posteriormente se reportaran los resultados.
Interpretacin de resultados:
Si se observa turbidez y produccin de CO2 e H2: La prueba se considera
POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para posteriormente hacer
el clculo del NMP.
Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando se observe
turbidez: estos se consideran NEGATIVOS

12

PUEBA DEL INDOL

METODOLOGA PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS Y REACTIVOS
Agua peptona
1. Pesar 0.4 gramos de peptona y 0.1 gramos de cloruro de sodio (NaCl)
transferirlos a un matraz Erlenmeyer de 250 mL y adicionar 20 mL de agua
destilada.
2. Distribuir 10 mL a cada tubo con una pipeta de 10 mL.
3. Tapar los 2 tubos y llevar a esterilizar en la autoclave a 121 c durante 15 min
a 15 libras de presin.
Reactivo de Kovacs:
Disolver 5.0 gr de dimetilaminobenzaldehdo (C6H4 [H (CH3)2] CHO) en 75
mL de Alcohol amlico (CH3 (CH2) 4CH) libre de bases orgnicas. Aadir 85
mL de cido clorhdrico concentrado (HCl) con cuidado, proteger de la luz y
almacenar a (4C).
Desarrollo de la prueba
1. Si nuevamente hay produccin de gas dentro de las campanas Durham
contenidas en los tubos con el agar verde bilis brillante incubados se procede
a realizar de nuevo otra siembra en un tubo con agua peptonada pero solo
se elegir un tubo de cada matriz.
2. A el tubo que resulto positivo las pruebas confirmativas tanto de la matriz
de agua y suelo y se eligi para realizarle la prueba del Indol se le
introducir un asa de nicromo previamente esterilizada con el mechero, se
resembrara en otro tubo con agua peptonada y se incubara a 44c durante
24 horas.
3. Pasadas las 24 horas retiraremos el tubo de la incubadora y le aadiremos
de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
4. posteriormente se observara el desarrollo de un anillo de color rojo en la
superficie, agitaremos suavemente y notaremos la presencia de Indol en
caso de ser positiva. Si no se nota la presencia del anillo de color rojizo en
la superficie la prueba es negativa.

13

PRUEBA DE LA OXIDASA
Fundamento
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La
reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo oxidasa que
activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que
produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno
acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de
electrones.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de
Neisseria (+). Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las
enterobacterias. Tambin se usa en algunos casos para diferenciar gnero y
especie de otras bacterias
METODOLOGA PARA LA PREPARACIN DE REACTIVOS
Disolver 0.1 gr de Clorihidrato de tetrametil-p-fenilendiamina en 1000 mL de agua
destilada
Desarrollo de la prueba
1. Llevar a cabo la prueba con subcultivos puros de los organismos
fermentadores de lactosa, crecidos en medio nutriente de agar, como sigue:
2. Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.
3. Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa recientemente preparado en
un papel filtro en una caja de Petri.
4. Con una barra de vidrio o un asa de alambre de platino (no de nicromel),
colocar parte del cultivo en el papel filtro preparado.
5. Esperar 5-10 segundos y observar la coloracin.

Interpretacin de resultados:
La prueba se considera POSITIVA si la coloracin se produce a los 5-10
segundos.
De lo contrario la prueba se considera como NEGATIVA.

14