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PRODUCTOS
AGROINDUSTRIALES
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO
ENZIMTICO PURO
PROFESOR:
ALEXANDER
ALUMNA:
ELIZABETH
CICLO:
HORARIO:
LABORATORIO N06
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO
ENZIMTICO PURO
I.
INTRODUCCIN
Como es bien sabido, las enzimas son protena. Polmeros de residuos amino acdicos unidos
mediante enlaces peptdicos, que tiene la funcin de ser catalizadores de las reacciones qumicas del
metabolismo celular. La produccin de enzimas, de actividades especficas, es seguida por una
purificacin y una estandarizacin del producto. En la formulacin del producto se agregan diversos
excipientes (otras protenas y azcares, por ejemplo). Por lo que un preparado enzimtico comercial
no es 100% puro .De manera de cuantificar la enzima presente en una formulacin comercial se
realizan determinaciones de su actividad enzimtica y del contenido de protenas.
II.
OBJETIVOS
III.
FUNDAMENTO TERICO
vr = k. [reactivos]n
vr = k. [A]
k1 [A] = k 1 [B]
Este principio nos permite llegar fcilmente a una reaccin entre las constantes de velocidad y de
equilibrio:
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN: ENERGA DE
ACTIVACIN
Las velocidades de reaccin son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las
reacciones biomoleculares, un aumento de 10 C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para
explicar este hecho se postul que al acrecentar la temperatura aumenta la fraccin de molculas
capaces de tener una energa suficiente para alcanzar un estado activado que luego se transforme
en producto de la reaccin por formacin o ruptura de enlaces qumicos.
Se admite que las nicas molculas que reaccionan son aquellas que al chocar llevan consigo una
energa mayor que un cierto valor mnimo. A este valor de energa necesaria se lo denomina energa
de activacin y es un factor de suma importancia para determinar la magnitud de la velocidad de
reaccin.
(Simplificando)
Si reordenamos la ecuacin tendremos que:
[S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]
Esto significa que la concentracin del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el
valor de km de la enzima.
La expresin de Michelis Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son
ms tiles para la expresin de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los
recprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuacin.
Esta expresin conocida con el nombre de ecuacin Lineweaver Burk, corresponde a una recta de
ecuacin:
y = a.m + b
Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando grficamente (al
lado) obtendremos una grfica del tipo lineal.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS
Indica el mximo potencial cataltico de una enzima y est dado por la velocidad inicial de la
reaccin
La velocidad de reaccin se mide, cuantificando la evolucin del producto o del sustrato de
reaccin en el tiempo, pero este ltimo es ms dificultoso ya que se utiliza en exceso y las
saturantes de sustrato.
La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de enzima que permite catalizar 1
utilizada en la reaccin.
IV.
MATERIALES Y MTODOS
A. Materiales y Equipos
Materiales
Pulpa
(Extraccin de amilasa)
Solucin yodada.
de
papaya
20g
PEC
HCl 0.1N
Sustrato almidn
Agua destilada
Gradillas
Balanza analtica
Bao mara
Centrfuga
Espectrofotmetro.
Equipos
Matraces
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml
Probeta de 200 ml
Tubos de ensayo.
Mortero
Piln.
B. Metodologa
C. Preparacin del Preparado Enzimtico Puro (PEC)
blanco.
Agregamos 0.1mL de PEC al tubo blanco y 0.1 ml al tubo problema.
Llevar a incubacin 35C por 5 minutos, ambos tubos
Se agregar 2.5 ml de HCl 0.1N a los dos tubos.
Se agregar 0.1 ml de solucin de iodo a los dos tubos.
Preparar los tubos blanco, 1; 2; 3; 4 y 5del mismo modo que el tubo problema
Agregar 0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 ml de solucin de almidn (400ppm) en cada uno de
respectivamente.
Agregar 2.5 ml de HCl 0.1N a cada uno de los tubos respectivamente.
Agregar solcuion iodada 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1 a todos los tubos.
Dejar reposar por tiempo de 5 minutos y llevar a medir la observancia a una longitud de
V.
J.
K.
L.
M.
N.
0,
0,
0,
0,
P.
BL
Q.
M
R.
M
S.
M
T.
M
U.
M
W.
0.
X.
0.
Y.
1.
Z.
1.
AA.
2.
AB.
2.
AD.
3.
AE.
2.
AF.
2.
AG.
1.
AH.
1.
AI.
0.
AK.
2.
AL.
2.
AM.
2.
AN.
2.
AO.
2.
AP.
2.
I.
AQ. Sol.
AR.
AS.
AT.
AU.
AV.
AW.
Yodad
0.
0.
0.
0.
0.
0.
a
AX.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
AY.Tabla 1. Cantidad de almidn y Absorbancia para la obtencin de Curva de
Calibracin
AZ.
CANTIDA
D DE
ALMIDN
BB.
0
BD.
0.2
BF. 0.4
BH.
0.6
BA.
ABSOR
BANCIA
BC.
BE.
0.322
BG.
0.519
BI. 0.755
BK.
1.018
BL.1
BM.
1.281
BN.
1.4
1.3
f(x) = 1.25x + 0.03
R = 1
1.2
1.1
1
0.9
0.8
0.7
Absorbancia
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95 1 1.05
Almidn (mg)
BO.
BQ.
BS.
T
BT.
BU.
BV.
BW.
AL
BX.
BY.
usc
us
BSO
BS
LMI
MID
RBA
OR
NCI
BA
HIDR
NC
RE
OLIZ
IA
SID
ADO
CO
UA
(mg)
EG
ID
g)
A
BZ.
B
(m
CA.
0
.001
CC.
CB.
CG.
P
CH. 0
.116
0
.11
5
0
.07
217
321
6
CD. 0.9
27826
784
CE.
0.0
4
6
3
9
1
3
3
9
CF.
46.
CM.
.
CN.
CO.
Segn VanDer (1975); la Curva de Calibracin esta dado con datos reales, los grficos
que se obtienen no son tan ideales, pero esta situacin no es un obstculo ya que dentro
de ciertos valores es posible trazar la recta ms probable que une una serie de puntos, con
el uso de los programas de clculo de las computadoras. Hay que advertir que una
respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de concentraciones posibles sino dentro de
un conjunto de valores que dependen de numerosos factores dependientes del mtodo de
medicin. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita solamente a la determinacin de
un elemento o compuesto qumico sino que tiene mltiples aplicaciones. Lo e4xpuesot por
el autor se verifica en la figura 1, donde vemos la linealidad de la lnea recta de la cantidad
de almidn con la Absorbancia ya que como dice el autor sta curva est dada por una
serie de factores.
CR.
CONCLUSIONES
CS.
Se desarroll la curva patrn de calibracin donde el coeficiente de determinacin es de
99.69%.
Se lleg a determinar la actividad enzimtica en unidades usc (Unidad Street Close), en la
cual la absorbancia corregida se obtiene disminuyndole la absorbancia del tubo Blanco; a
la vez sirve para llevarla a la grfica y hallar la cantidad de almidn residual que queda en
VII.
CU. DORAN, P. (1998). Principios de Ingeniera de los bioprocesos. Editorial acribia SA. Zaragoza
DI.