MICROSCOPIA

El ser humano posee el sentido de la vista desarrollado. Sin embargo,

no se pueden ver a simple vista cosas que midan menos de una
dcima de milmetro. Y muchos de los avances en qumica, biologa y
medicina no se hubieran logrado si antes no se hubiera inventado el
microscopio.
El microscopio (de micro-, , pequeo, y scopio, ,
observar) es un instrumento que se utiliza para obtener una imagen
aumentada de objetos minsculos o detalles muy pequeos de los
mismos.
1-Cmo se utiliza el microscopio?
El objeto que se quiere observar se coloca en un vidrio transparente
que llamamos portaobjetos, y lo cubrimos con otro vidrio ms fino
que llamamos cubreobjetos.
Una vez conocido el funcionamiento de las partes del microscopio se
tiene que saber que el aumento que nos ofrece un microscopio se
obtiene con la combinacin del objetivo y del ocular. Por ejemplo, si
tenemos un ocular de 15x y un objetivo de 40, el aumento obtenido
es de:
40 x 15 = 600 aumentos.
Primero se tiene que optar una buena posicin, se enciede la fuente
de iluminacin del microscopio luego se coloca la muestra en la
platina del microscopio asegurndonos que enfocamos con el objetivo
menor el cual NOS DA UNA VISION PANORAMICA DE LA MUESTRA. El
enfoque de la muestra se realiza con el tornillo macromtrico, y
despus se afina con el tornillo micromtrico, hasta conseguir una
visin perfecta. Una vez enfocado la muestra, cada vez que se
cambie de objetivo se debe tener cuidado de no tocar la preparacin,
el vidrio se puede romper.
La luminosidad para observar la muestra se regular moviendo el
diafragma hasta conseguir la ms adecuada para cada caso.
Como unidad de medida , en microscopia se utiliza la micra (). Su
equivalencia es:
1 = 1/1000 mm ; por tanto, 1 mm = 1000

Cmo se prepara una observacin microscpica?

Los pasos para la preparacin del tejido son los siguientes:
1. El primer paso es la FIJACION de la muestra que se va a estudiar, es
un proceso para conservar la estructura del tejido mediante la
utilizacin de componentes qumicos. El fijador mas comn es la
formalina que consiste en una solucin acuosa de formaldehdo al
37% en combinacin con otras sustancias qumicas y amortiguadoras.
Con esto se impide la degradacin de la muestra y la destruccin de
los organismos patgenos que hay en esta.
2. El segundo paso es la DESHIDRATACION, luego de la fijacin la
muestra se lava (se deshidrata) en una serie de soluciones
alcohlicas, esto para eliminar el agua que se encuentra presente en
la muestra.
3. El siguiente paso es el ACLARADO donde se extrae el alcohol de la
muestra que se utilizo para deshidratarla, esto se realiza utilizando
solventes orgnicos como tolueno o xileno.
4. El cuarto paso es la INCLUSION de la muestra con parafina fundida,
cuando esta se enfra se forma un bloque llamado taco el cual se
coloca en el microtomo que es una maquina cortadora especial. La
inclusin de la muestra nos permite realizar cortes muy delgados de
esta.
5. El paso siguiente vendra a ser la TINCION de la muestra, despus
de la inclusin se tiene que retirar la parafina que quedo en esta
utilizando solventes orgnicos como xileno y tolueno y la muestra
debe rehidratarse con el uso de una serie de alcoholes de
concentracin decreciente, despus se procede al teido del tejido
con HEMATOXILINA y tambin se lo puede realizar con EOSINA que
son los colorantes mas comunes que existen.
6. Despus se realiza el paso del MONTAJE donde la muestra despus
de su coloracin se hace pasar por tolueno o xileno y por ultimo se la
cubre con un cubreobjetos para que se logre un preparado
permanente.
2- Partes del microscopio
El microscopio tiene dos partes: una ptica, para observar, y otra
mecnica, que sostiene a la primera.

La parte ptica consta de :

Ocular, lente situada cerca del ojo del observador.
Objetivo, lente situada cerca del objeto que se quiere observar.
Diafragma, dispositivo para graduar la entrada de luz.
Condensador, dispositivo para concentrar la luz sobre el objeto.
Foco de luz o espejo, para iluminar el objeto.
La parte mecnica del microscopio consta de:
Columna , parte que sostiene el tubo ptico.
Tubo ptico , donde se encuentra ubicado el ocular.
Revlver , parte mvil que sostiene los objetivos.
Platina , que soporta el portaobjectes.
Pi ,sostiene todo el microscopio.

 Tornillo macromtrico, que permite desplazamientos rpidos de

las lentes.
Tornillo micromtrico, que permite desplazamientos suaves de
las lentes.
4- Formacin de imgenes en el microscopio
Cuando se forma la imagen en el foco, la luz emergente del ocular, en
forma de rayos paralelos, forma una imagen invertida en el infinito. La
lente del ocular agranda esta imagen y vuelve a invertirla, con lo que
percibimos la imagen en su posicin normal, pero aumentada.
5- Importancia de la luz
La luz o la iluminacin es una de las claves de la buena microscopia.
El sistema de iluminacin de un microscopio es de considerable
importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La
luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin para
que la imagen se traslade de forma adecuada al objetivo y llegue con
la mayor calidad posible al ojo del observador a travs del ocular. En
los microscopios antiguos, la fuente de luz era externa, y se utilizaba
un espejo, situado en el propio microscopio, para reflejar esa luz
externa hacia la preparacin y los objetivos. Actualmente se utiliza un
sistema de lentes, incorporado al propio microscopio, llamado
condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el
plano del foco de la luz y elegirse una posicin que consiga el foco
preciso. El condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla
el dimetro del crculo de luz que pasa por el sistema.
Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad
de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por
el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma
iris es demasiado grande, parte de la luz pasar no slo al objetivo
sino tambin alrededor de l, y no se utilizar. Si la luz es demasiado
brillante, no deber reducirse alterando la posicin del condensador o
del diafragma iris sino usando filtros de neutralizacin, o
disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir lo suficiente
en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena
microscopa, especialmente a los mayores aumentos.
5- Tipos de luz para el microscopio:

En la microscopia ptica encontramos la utilizacin de la luz normal

sea la que puede provenir de una lmpara ubicado en la subplatina.
Esta luz atraviesa unas lentes de cristal para asi observarse los
detalles de la muestra.
Por otro lado en los microscopios electrnicos (microscopia
electrnica) se utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz.
Un filamento de tungsteno calentado puede una fuente que emite
electrones (ctodo), estos son atrados hacia un nodo, una diferencia
elctrica entre estos dos componentes (catodo y anodo) imparte un
voltaje de aceleracin de entre 20000 y 200000 voltios a los
electrones, con lo que se genera un haz. Este haz de electrones
atraviesa luego una serie de lentes electromagnticos que cumplen la
misma funcin que las lentes de cristal de un microscopio ptico.
6- Tipos de microscopios y Tipos de energa
Dependiendo de la fuente energtica que utilizan, se reconocen dos
tipos de microscopios:
1.Microscopio ptico o fotnico, utiliza la luz como fuente
energtica.
2. Microscopio electrnico, emplea un haz de electrones.
Ambos tipos de microscopios permiten la observacin gracias a su
capacidad de aumento (la cantidad de veces que se incrementa el
tamao de la imagen del objeto observado) y de resolucin
(capacidad del microscopio que permite distinguir como separadas
dos estructuras que se encuentran muy prximas).
1. Microscopios pticos o fotnicos: este tipo de microscopios
utiliza la luz como fuente de energa y las propiedades de los lentes
pticos que permiten aumentar el tamao de los objetos observados.
El microscopio ptico ms simple es la lente convexa doble con una
distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta
quince veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos que
disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos
mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto
por encima de las 2000 veces.
Dentro de los microscopios fotnicos existen varios tipos, distinguidos
por pequeas diferencias, aunque el principio bsico de

funcionamiento es el mismo:
Microscopio de campo claro o compuesto: Es el microscopio
ms comnmente usado, consiste en dos sistemas de lentes, el
objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo
cerrado. El objetivo est compuesto de varias lentes que crean una
imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los
microscopios estn dispuestas de forma que el objetivo se encuentra
en el punto focal del ocular. El aumento total del microscopio depende
de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. La muestra
que se va a observar debe ser teida con algn colorante que permita
hacerla destacar sobre el fondo claro o brillante que proviene de la
fuente luminosa.
. Microscopio de contraste de fase:Este tipo de microscopio
permite el examen de tejidos y clulas sin necesidad de teirlos y es
de especial utilidad para estudiar clulas vivas.
. Microscopio de campo oscuro:Utiliza un haz enfocado de luz muy
intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen.
El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo
oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por
un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las
porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que
las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y
dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que
conecta el espcimen con la pupila del observador. Esta forma de
iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos
transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin
fijar la muestra, es decir, sin matarla.
. Microscopio de fluorescencia: Es utilizado para la deteccin de
molculas con fluorescencia natural como algunos neurotransmisores
y la vitamina A.
. Microscopio confocal de barrido: Permite La visualizacin de una
muestra biolgica en tres dimensiones, este tipo de microscopio
combina los componentes de un microscopio ptico de campo claro
con un sistema de barrido para disecar pticamente una muestra,
literalmente se puede disecar capa por capa todo el espesor de la
muestra.
. Microscopio de polarizacin: Son microscopios a los que se les han
aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el

otro entre la muestra y el observador). El material que se usa para

ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol, dejando pasar
nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada). Esta
luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, segn
que los dos nicoles estn paralelos o cruzados.
2. Microscopios electrnicos: La potencia amplificadora de un
microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz
visible, dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho
menor que la de la luz. El microscopio electrnico utiliza electrones
para iluminar un objeto, pudiendo mostrar estructuras mucho ms
pequeas. La longitud ms corta de la luz visible es de alrededor de
4000 ngstroms (un ngstroms es 0,0000000001 metros); la longitud
de onda que se utilizan en los microscopios electrnicos es de
alrededor de 0,5 ngstroms.
Los principios bsicos de los microscopios electrnicos son similares a
los microscopios fotnicos, las diferencias estn dadas en la ya
mencionada fuente de luz (electrones) y en el tipo de lente, ya que
los electrnicos emplean lentes electromagnticas. La gran diferencia
de los dos tipos de microscopios es la potencia que tiene cada cual,
ya que el microscopio ptico es capaz de aumentar unas 2000 veces,
con una resolucin de 0,2 micrones (0,0001 mm) mientras que el
electrnico aumenta hasta unas 1000000 veces, con una resolucin
de 0.1 nanmetros (0,0000001 mm).
Todos los microscopios electrnicos cuentan con varios elementos
bsicos. Disponen de un can de electrones que emite los electrones
que chocan contra la muestra, creando una imagen aumentada. Se
utilizan lentes electromagnticas para crear campos que dirigen y
enfocan el haz de electrones, junto con un sistema de vaco al interior
del microscopio, para que las molculas de aire no desven los
electrones.
TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRONICOS:
Microscopio electrnico de transmisin
es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un
objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio
ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo
caracterstico de este microscopio es el uso de una muestra ultrafina
y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la
muestra.

Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un

objeto hasta un milln de veces.
Microscopio electrnico de barrido
es aquel que utiliza un haz de electrones en lugar de un haz
de luz para formar una imagen. Tiene una gran profundidad de
campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la
muestra. Tambin produce imgenes de alta resolucin, que significa
que caractersticas espacialmente cercanas en la muestra pueden ser
examinadas a una alta magnificacin. La preparacin de las muestras
es relativamente fcil pues la mayora de MEB slo requieren que
estas sean conductoras.
La diferencia entre el MET y el MEB es que en este ltimo el haz de
electrones no atraviesa la muestra sino que explora su superficie
(barre).
TERCER TIPO DE MICROSCOPIO DE RECIENTE APARICION QUE
A DEMOSTRADO SER UTIL PARA LOS ESTUDIOS BIOLOGICOS:
Microscopa de Fuerza Atmica
La microscopa de fuerza atmica se basa en la interaccin entre una
punta muy fina y la superficie de la muestra. Se trata de provocar un
desplazamiento relativo entre punta y muestra mediante un barrido
finobasado en materiales piezoelctricos. Manteniendo la interaccin
punta - muestra constante, se obtienen mapas tridimensionales
de resolucin nanomtrica en los tres ejes. El uso de puntas
especiales con propiedades elctricas, trmicas o mecnicas permite
asimismo la caracterizacin de la muestra con respecto a estas
interacciones. Un gran nmero de aplicaciones derivadas de esta
tcnica se basan en la manipulacin de la muestra con estas puntas,
como por ejemplo nanolitografa o estiramiento ("pulling") de
protenas.

INDICES DE REFRACCION

Material

ndice de refraccin

Vaco

Aire (*)

1,0002926

Agua

1,3330

Acetaldehdo

1,35

Solucin de azcar (30%)

1,38

1-butanol (a 20 C)

1,399

Glicerina

1,473

Heptanol (a 25 C)

1,423

Solucin de azcar (80%)

1,52

Benceno (a 20 C)

1,501

Metanol (a 20 C)

1,329

Cuarzo

1,544

Vidrio (corriente)

1,52

Disulfuro de carbono

1,6295

Cloruro de sodio

1,544

Diamante

2,42