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TITULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA
ASESORA
Dra. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 1 de julio de 2015
Fecha de trmino: 10 de julio de 2015
Nombre
Martnez Chiquito Josu Neftal de Jess
Cargo
Responsable
Administrador
Laboratorista 1
Laboratorista 2
Laboratorista 3
GENERACIN: 2014-2016
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Ubicacin
/coordenadas GPS
Universidad
Tecnolgica de Len
Blvd. Universidad
tecnolgica de
len #225 col san
Carlos CP.37670 /
101 34' 45.08"
W, 21 3' 43.05"
N
2. Evidencia fotogrfica del sitio
Fecha: 7 de Julio 2015
Hora: 15:33 hrs
SITIO DE
MUESTREO
Color: Caf
Olor: Desagradable
pH:7.6
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
Es importante conocer las especies de microorganismo que participan en el proceso de la degradacin de la
materia orgnica en una planta de tratamiento de agua residual, con la finalidad de saber la funcin que estas
bacterias realizan en el sitio de estudio.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Composicin)
1) Agar Mc. Conkey
Gelatina digerida por
enzimas pancreticas: 17g
Casena digerida por
enzimas pancreticas: 1.5g
tejido animal digerida por
enzimas pancreticas: 1.5g
Lactosa: 10g
Sales biliares: 1.5g
Cloruro de sodio: 5g
Rojo neutro: 0.03g
Violeta cristal: 0.001g
Agar: 13.5g
2) Agar sangre
Peptonas 20
Extracto de levadura 3.5
Digerido trptico de corazn de res 3
Almidn de maz 1
Cloruro sdico 5
Colistina 0.01
cido nalidixico 0.015
Agar 15
Sangre de carnero, desfibrinada 5%
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Imagen
Imagen
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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)
Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar
Material
Equipo
2 Caja Petri
1 Autoclave
1 charola de pesado
1 Esptula
1 Campana de flujo
1 Matraz Erlenmeyer
laminar
1 Probeta
1 Asa de platino
1 Balanza analtica
1 Mechero bunsen
Reactivos
Preparacin de medios de cultivo:
1) Pesar aproximadamente 1.5g de agar Mc Conkey en una charola de pesado.
1 Agar
Conkey
2) En un matraz Erlenmeyer disolver
1.5gMac
de agar
mc conkey en 30 mL de agua destilada.
3) Someter el matraz Erlenmeyer a esterilizacin en la autoclave a 115 C durante 15 min.
4) Dejar el matraz Erlenmeyer enfriar a una temperatura que se pueda soportar para el uso inmediato.
5) En la campana de flujo laminar verter el agar Mac Conkey en una caja Petri estril.
6) Dejar solidificar para su uso.
Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, seleccin de la colonia y resiembra):
Siembra
1. Seleccionar el lugar a analizar, del cual se tomara la muestra.
2. Se realizara una asada con un asa previamente esterilizada en el sitio de estudio.
3. Se abrir cuidadosamente la caja Petri, tratando de abrirla lo menos posible, en la caja Petri con el medio de
cultivo, se esparcir el contenido de la asa en la caja Petri, e inmediatamente se cerrara.
Seleccin de la colonia
1. Para la seleccin de la colonia, se escoger una la cual este separada de las dems.
2. En la parte de debajo de la caja Petri sealar la colonia que se escogi para evitar confusin.
Resiembra
1. Dividir en cuadrantes el medio de cultivo puro de aislamiento dependiendo el nmero de colonias que se
desea aislar de las dems.
2. Encender un mechero bunsen y abrir la caja Petri cerca de la llama
3. Con un asa estril recolectar la colonia seleccionada.
4. Cerrar la caja Petri
5. Resembrar en el nuevo medio de cultivo.
6. Extender formando estras (ver figura 1) sobre la superficie del
medio selectivo.
7. Esterilizar un asa de platino con el mechero bunsen.
8. De la ltima estra realizada tomar una pequea parte y extender
formando estras sobre la superficie de otro sector del medio
selectivo (Repetir dependiendo el nmero de sectores en el que se
dividi la caja Petri).
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Bacterias
Tincin de Gram
Tincin Hiss
Capsula
Motilidad
Tincin negativa
Catalasa
TSI
+
-
Citrato
Indol
Rojo de metilo
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FOTO 1
FOTO 2
FOTO 3
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FOTO 2
FOTO 2
FOTO 3
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Medio de cultivo
utilizado
Resultado
obtenido
(positivo/negativo)
N/A
Negativo
Evidencia fotogrfica
1.Tincin de Gram
Fundamento de la prueba
Prueba con la que es posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para as poder estudiarlas y clasificarlas
La tcnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen los cuales tien la
pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado del colorante. Despus de eso
puede que el colorante permanezca en la pared bacteriana o que se haya desprendido. En el primer caso
permanecera el color morado, y se tratara de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendra un
color rosado, y seran Gram negativas.
2.Motilidad
Medio SIM
Negativo
Fundamento de la prueba
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3.-
Capsula
N/A
Positivo
Fundamento de la prueba
La capsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes
naturales, consiste en una acumulacin de material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la
pared celular.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se
colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia
utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y
que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la
presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.
4.-
Citrato
Citrato de
Simmons
Positivo
Fundamento de la prueba
Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono para el
metabolismo y crecimiento, provocando alcalinizarse por el CO2 que se genera, el cual se combina con el agua
y el sodio para formar Carbonato un producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio
de color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador: azul de bromotimol, amarillo a
pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye citrato como nica fuente de carbono y fosfato de amonio
como nica fuente de nitrgeno.
El medio incluye citrato de sodio, un anin como fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente
de nitrgeno. Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la
coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema
enzimtico si la intervencin de la coenzima A. esta enzima se denomina citrasa o citrato desmolasa.
C4H4O5+ C4H6O2
C3H4O3 + CO2
pH bsico:
citrato
CO2+ CH2O2+ 2 C2H4O2
pH acido:
2 piruvato
acetato+ CO2+ lactato
2 piruvato
acetona+ 2CO2
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5.-
Negativo
Fundamento de la prueba
Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol)
a partir de la fermentacin d ela glucosa. Los productos neutros formados en la presencia de oxigeno
atmosfrico, alcalisis (Hidrxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el color
producido en la reaccin. El Alfa naftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo.
6.-
Indol
Medio SIM
Negativo
Fundamento de la prueba
EL indol es uno de los productos de la degradacin del aminocido triptfano que se encuentran en los caldos
de triptona; por su base nutritiva, permite el desarrollo de diversas especies bacterianas, adems debido a su
alto contenido de triptofano, es un buen sustrato.
El reactivo de Kovacs para detectar la produccin de indol, producido debido a la fermentacin de las bacterias
con el medio lactosado.
H2O+triptfano
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7.-
Fermentacin de glucosa
/ Rojo de metilo
Caldo RM/VP
Positivo
Fundamento de la prueba
Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de
la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad amortadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la
produccin de cido( La formacin de acetona y butilenglicol es una va alternativa del metabolismo del cido
pirvico).
La prueba de rojo de metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la concentracin de
iones hidrgeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa (figura 2).
8.-
Catalasa
Negativo
N/A
Fundamento de la prueba
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica que la prueba es
positiva.
2H2O2
2H2O + O2
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9.-
Deteccin de Sulfuro
Negativo
Medio SIM
Fundamento de la prueba
La proteolisis de las protenas en aminocidos (aa.) individuales, algunas especies bacterianas son capaces de
liberar azufre enzimticamente de los diferentes aa. Que las contienen, produciendo el gas cido sulfhdrico
(SH2). La peptona, cistena y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan
distintos compuestos o aa. que contienen azufre para producir SH2. La enzima responsable de sta actividad es
la cisteinasa.
Primera etapa:
La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reaccin de reduccin que da un sulfito y un
sulfato.
Este es un proceso de respiracin anaerbica donde el tomo de azufre sirve como aceptor de electrones para
la oxidacin de los sustratos orgnicos. El tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una
fuente de azufre para el organismo.
Segunda etapa:
El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato frrico de amonio para producir un precipitado negro
insoluble, sulfuro ferroso.
Bacteria (medio cido) + tiosulfato de sodio
SH2 + iones frricos
gas SH2
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10.-
Fermentacin de
Triple azcar de A/A
glucosa
Fermentacin de hierro
lactosa
Fermentacin de
sacarosa
Produccin
de
cido sulfhdrico
Fundamento de la prueba
Utilizacin de glucosa sola: Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una
reaccin alcalina en la superficie (roja) sobre un fondo cido (amarillo, k/a) debido a que realizan una
degradacin aerbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dixido de carbono.
Despus de 18 a 24 horas de incubacin como la concentracin de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos
empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberacin de amoniaco y
produciendo un pH alcalino (rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo,
como no hay oxgeno, se realiza una degradacin anaerbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el
pH disminuye quedando el pH cido (amarillo).
Utilizacin de lactosa y/o sacarosa: Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la
lactosa resultando una reaccin cida en la superficie (amarilla) y cida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso
despus de 18 a 24 hrs como la concentracin de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces ms que la de la glucosa
presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en la superficie. En el
caso de usar sacarosa la reaccin sera la misma.
Produccin de cido sulfhdrico: La produccin de H2S se manifiesta por la aparicin de un precipitado color
negro debido a la reduccin de la sal de hierro presente en el medio.
Fermentaciones:
Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K/K). No fermentacin de hidratos de carbono. Caracterstico de
bacterias no fermentadoras como Pseudomonas aeruginosa.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K/A). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada. Caracterstico
de bacterias no fermentadoras de lactosa como especies de Shigella.
Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negra)
(K/A/H2S). Glucosa fermentada, lactosa no fermentada; produccin de H2S. Caracterstico de bacterias no
fermentadoras de lactosa y productoras de H2S como: Salmonella, Arizona, Citrobacter y algunas especies de
Proteus.y.
Pico de flauta cido / profundidad cida (A/A). Glucosa y lactosa fermentadas. Caracterstico de coliformes que
fermentan lactosa como: Escherichia coli y grupo Klebsiella- Enterobacter. Anaranjado (color inicial del medio) a
amarillo indica fermentacin.
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Reacciones:
Lactosa Beta galactosidasa glucosa + galactosa
Glucosa o galactosa
CO2+H2O+energia anaerobio
Ciclo de krebs
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Cabe destacar el beneficio de la Klebsiella pneumoniae en los suelos, gracias a la fijacin del nitrgeno, el cual
es necesario para el procesamiento de protenas en races y suelos, separando los tomos de nitrgenos
convirtiendo dos tomos separados de nitrgeno N1 cada tomo de N1 se junta con tres tomos de hidrogeno,
volviendo se amoniaco y luego amonio, despus las bacterias nitrificantes procesan el amonio oxidndolo a
nitritos y luego en nitratos para poder ser absorbidos por las plantas.
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