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Discusin

En esta prctica de la extraccin de material gentico nosotros la


realizamos por medio de la tcnica de fenol/cloroformo al modelo de
estudio Rotavirus el cual posee de RNA segmentado de doble cadena,
rodeado por una doble cubierta proteica. As como otros virus que tiene
genoma de RNA segmentado es el de la influenza porcina el cual tiene
polaridad negativa (1) El Rotavirus es uno de los nuevos patgenos
importantes en la salud pblica debido a que ocasiona gastroenteritis.
Los datos obtenidos del estudio de la biologa molecular del virus
permitirn enfocar el problema de las diarreas virales con enfoques ms
imaginativos. Existen diversas tcnicas para la extraccin de material
gentico entre ellas Salting-out, CHELEX y la que nosotros utilizamos
Fenol/Cloroformo
la cual es considerada una tcnica orgnica
(solventes). (2) En donde el fenol sirve de manera que desnaturaliza las
protenas contaminantes de la muestra y el cloroformo permite que todo
el fenol pueda ser lavado, separacin en 2 fases. As como se observ en
la prctica despus de realizar el mtodo de extraccin; en donde
tomamos la fase acuosa sin llegar a la interfase. Posteriormente
realizamos la tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida 10%. (3)
El cual es un mtodo analtico, en donde se permite buena visualizacin
de las bandas durante tiempo prolongado; este tipo de geles se forman
por la polimerizacin vinlica del monmero acrilamida CH2=CH-CO-NH2
y del monmero entrecruzador N,N-metilen-bis-acrilamida CH2 = CHCO - NH - CH2- NH - CO - CH = CH2. Y despus de la realizacin de
electroforesis se inici la tincin de Nitrato de Plata en donde se
desmonto el gel de la cmara de electroforesis y se deposit en un
recipiente de plstico para aadir las diferentes soluciones; por lo que
nosotros observamos bandas de segmento corto y largo; as como
bandas ms teidas debido a que hay mayor concentracin de material
gentico (RNA). (3) Existen diversos factores que influyen en una buena
separacin; tales como el pH, fuerza inica, gradiente de potencial,
tiempo decorrida, concentraciones de acrilamida y bisacrilamida, etc. Se
puede decir que al observar nuestro gel de poliacrilamida con las bandas
de segmento corto y largo es positivo a Rotavirus tipo A; ya que al
consultarlo en la literatura este presenta segmentos distribuidos en 4
regiones de RNA lo cual es atribuido al Rotavirus tipo A.

Conclusin
Realizamos exitosamente la extraccin de material gentico por medio
de la tcnica de Fenol/Cloroformo por medio del modelo de estudio
Rotavirus. La cual es muy utilizada ya que permite una ptima
visualizacin del material gentico; e importante para el estudio de
infecciones denominadas gastroenteritis.

Bibliografa
1. Olivas E. Evangelina. Manual de laboratorio de Microbiologa
Bsica, primera edicin, 2001. Pg. 33
2. Armendriz Borunda, Juan Socorro, Biologa Molecular, MC Graw
Hill editores, primera edicin, 2013, pg. 110
3. Garca Prez, Electroforesis en geles de poliacrilamida:
fundamentos, Actualidad e importancia, UNIV DIAG 20001,
laboratorios Batera, Ciudad de La Habana pp. 35-36

Resultados

Cuestionario
1-Determina el papel de cada una de las soluciones utilizadas durante la
extraccin de RNA por el mtodo Fenol/Cloroformo
CLOROFORMO: Cloroformo afina la interfase y disuelve lpidos, y el
alcohol isoamlico reduce espum
TRIS: ampn Tris-EDTA (TE): es un inhibidor de nucleasas y un buen
tampn para la conservacin del ADN. El EDTA inhibe la PCR a
concentraciones superiores a 1mM.
FENOL: desnaturaliza las protenas contaminantes de la muestra
(proteasas, nucleasas...); disminuye el rendimiento de la PCR a
concentraciones del 0,2% y al 0,5% la inhibe completamente.
ETANOL: Etanol e isopropanol: precipitan los cidos nucleicos. Tienen
efectos inhibitorios a concentraciones superiores al 1%
Agua mili Q: Agua ultra pura, grado laboratorio, utilizada en la prctica
para la resuspensin de la muestra, evitando que tuviera riesgo de
contaminacin por el grado de pureza con el que cuenta.

2-Menciona otros mtodos de purificacin de cidos nucleicos

Cromatografa: premiacin sobre gel, intercambio inico, adsorcin


selectiva o unin por afinidad
Centrifugacin: La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de
purificacin eficaz. As, por ejemplo, la ultra centrifugacin en gradientes
autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando
mucho tiempo para purificar plsmidos.
Separacin por afinidad: Esta tcnica en fase slida simplifica la
purificacin de los cidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de
centrifugacin, extraccin orgnica y separacin de fases por una
operacin de separacin magntica, nica y rpida.
3- Por qu durante la tincin de nitrato de plata se lleva a cabo un paso
fotosensible?
Para el revelado de las bandas del genoma del Rotavirus, ya que el
nitrato de plata es una sal muy sensible a la luz y oxigeno por lo que a
largas exposiciones cambia de un color blanco-grisceo a negro lo que
nos permite observar con mejor detalle la conformacin y tamao de
estas bandas.
4-Menciona otros mtodos de cuantificacin de material gentico y la
importancia de su calidad
Cuantificacin de ADN por espectrofotometra: Una caracterstica del
ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar
su concentracin mediante espectrofotometra. Cuando la longitud de la
celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la
densidad ptica (DO). Para estimar la pureza del ADN se considera la
proporcin de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Una proporcin de 1.8
es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor indican
la presencia de protenas
5- Menciona una tcnica de biologa molecular que se podra utilizar una
vez obtenido el material gentico purificado.
PCR
6- Cul es el nivel de bioseguridad de virus influenza A y Rotavirus?
A raz de la posible inhalacin de aerosoles y la patogenicidad de los
virus de la influenza A (H7N9) en los seres humanos observados hasta la
fecha, es obligatorio el uso de proteccin respiratoria cuando se realizan
actividades de bioseguridad de nivel 3 (BSL-3) o cuando se prev la
formacin de aerosoles.

Rotavirus. Nivel de contencin para trabajar en un laboratorio de nivel


de bioseguridad 2 (microorganismos de grupo de riesgo 2 y 3)