GUIA METODOLGICA PARA LA

DETECCIN RPIDA DE
ALGUNOS NCLEOS SECUNDARIOS

Elizabeth Murillo Perea

Jonh Jairo Mendez Arteaga

Departamento de Qumica
Facultad de Ciencias
Universidad del Tolima
Ibagu
2007

JUSTIFICACIN
Los vegetales producen una diversidad de sustancias, producto del
metabolismo secundario (metabolitos secundarios), algunas responsables de la
coloracin y aromas de flores y frutos, otras vinculadas con interacciones
ecolgicas.
Las investigaciones han demostrado que principalmente la
mayora de estos compuestos participan en el mecanismo de defensa de las
plantas, lo que a su vez ha generado una gama de usos y aplicaciones en la
agricultura y en la medicina. Adicionalmente, las mltiples funciones que
presentan en los vegetales permite la bsqueda de nuevos agroqumicos
naturales, como insecticidas, herbicidas, reguladores de crecimiento, etc.
Estrictamente hablando, la FITOQUIMICA estudia los metabolitos secundarios
extrados de las plantas. Para ello esta rama de la qumica ensea cmo aislar
e identificar los principios activos de numerosos vegetales con importante
actividad biolgica, tal es el caso de las plantas medicinales.
En un sentido amplio la FITOQUIMICA se interesa por el conocimiento de la
historia, el comercio, la distribucin y geografa, la botnica, el cultivo,
recoleccin, seleccin, preparacin y preservacin, identificacin y evaluacin
por todo tipo de mtodos, la composicin qumica y el anlisis, la farmacologa
y el uso tradicional de los productos qumicos derivados de los vegetales y sus
derivados, con el propsito de mejorar la salud del hombre u otros animales.
Todo tipo de drogas vegetales y otros productos naturales que tienen valor
comercial por sus usos tecnolgicos, incluyendo una variedad de productos de
uso comercial, entre ellos: colorantes, aromas, condimentos, insecticidas,
herbicidas, antibiticos, extractos alergnicos e inmunizantes biolgicos, etc,
tambin pueden ser estudiados dentro de la disciplina. Por supuesto, se
necesitan prerrequisitos: botnica, qumica orgnica, analtica, bioqumica, etc.
Un punto importante en el conocimiento de las molculas implicadas en la
actividad de las plantas es la determinacin de su estructura y de su
comportamiento. Ello permite comprender la naturaleza y las modalidades de
los mtodos de control, racionalizar los procesos extractivos, a veces prever la
actividad farmacolgica, frecuentemente pronosticar la farmacocintica y la
biodisponibilidad; es preliminar a la sntesis. Estudiar las estructuras
moleculares es tambin comprender su origen.
Por el potencial que representan estos metabolitos, las investigaciones no slo
se han dirigido a la elucidacin de estructuras qumicas y evaluacin de su
actividad biolgica mediante bioensayos, sino hacia la obtencin por cultivo in
vitro.
El propsito de este laboratorio es despertar en el estudiante el inters por el
estudio en el rea de los productos naturales de origen vegetal, proporcionar
los medios adecuados para manejar los procesos de extraccin, purificacin e
identificacin de metabolitos primarios y secundarios en plantas, caracterizar
fsica y qumicamente los ingredientes activos mediante tcnicas usuales en
anlisis orgnico y bioqumico, ampliar los conocimientos de la Qumica

orgnica hacia los productos naturales y conocer sus posibles rutas

biosintticas, complementar las tcnicas de laboratorio con estudios
espectroscpicos caractersticos del metabolito estudiado, incentivar el estudio
qumico de las plantas con fines investigativos suministrando las bases tericas
y tcnicas necesarias para avances en el conocimiento de los constituyentes
activos con inters industrial o bromatolgico.

EVALUACIN FARMACOGNSTICA DEL MATERIAL VEGETAL

1. Toma y preparacin de la muestra

Anotar el sitio, fecha y hora de recoleccin del material vegetal

Anotar la parte del vegetal recolectado, empacar en bolsas negras debidamente

rotuladas para su traslado al laboratorio.

En el laboratorio:

Pesar todo el material recolectado, tal como se trajo del campo (no hacer ningn
tipo de seleccin)

Retirar el material en mal estado (viejo, enfermo, muy joven, etc) o cualquier
materia orgnica que no haga parte del vegetal a estudiar. Pesar este material, se
denominar: MATERIA ORGANICA EXTRAA

Separadamente retirar la arena, piedras, y en general cualquier tipo de material

inorgnico que no haga parte de la muestra vegetal. Pesar este material, se
denominar: MATERIA INORGANICA EXTRAA

Separadamente pesar cada parte del vegetal que ser sometida al anlisis, se
llamar: MUESTRA o DROGA

Secar la droga en estufa a 45 C (24 -48 h) o a temperatura ambiente en un sitio

protegido de la radiacin solar directa, la lluvia, el polvo y animales. Cuidar que
en cualquier caso la temperatura no sobrepase los 50 C.

Triturar la muestra en mortero o molerla en molino elctrico. Si fuera necesario

tamizar a travs de malla de 2 mm.

Empacar en frasco oscuro, tapar, rotular y guardar en sitio fresco hasta su

utilizacin

2. ESTUDIO MORFOLGICO DEL MATERIAL VEGETAL

2.1 Estudio macromorfolgico

Para las hojas tener en cuenta la forma del limbo, borde, pice, base, peciolo,
venacin, consistencia y color.

Para las ramas, ramillas y tallos determinar la consistencia, forma de la pieza,

superficie externa, superficie interna y color de la superficie interna

2.2 Estudio micromorfolgico

Realizar cortes transversales y observar los caracteres anatmicos internos, as como

tambin algunos componentes qumicos como el sber, lignina y celulosa mediante
tcnica de tincin con safranina.
2.3 Determinacin de ndices farmacognsticos en la droga cruda
Determinar parmetros de calidad, tales como:
% de humedad
%de materia orgnica extraa
% de materia inorgnica extraa
% de cenizas
% de cenizas solubles en agua
% de cenizas insolubles en HCl al 10%
3. OBTENCIN DE EXTRACTOS VEGETALES
Solvente. Pueden utilizarse: agua, metanol, etanol, acetato de etilo, diclorometano, ter
o ciclohexano. Su utilizacin depende del inters que se tenga por un tipo de metabolito,
un grupo o el tamizaje completo. En este ltimo caso es recomendable aplicar etanol.
Mtodo de extraccin. Los metabolitos secundarios pueden ser extrados aplicando
cualquiera de los siguientes mtodos: Maceracin, lixiviacin, digestin, infusin, decoccin,
soxhlet y reflujo.
En este curso se aplicar bsicamente el mtodo de MACERACION, cuando el solvente

sea orgnico.
Proporcin: material vegetal: solvente 1: 10
Tiempo de extraccin: 24 horas. Para mayor eficiencia debe renovarse el solvente cada
24 horas hasta observar agotamiento total.
El mtodo de maceracin puede sustituirse por el de PERCOLACION
Para extractos acuosos se sugiere aplicar DECOCCIN (30 minutos).
.
El extracto obtenido por maceracin o por decoccin debe filtrarse, a travs de papel
filtro, y puede concentrarse a presin reducida si se considera necesario.

4. Estandarizacin del extracto

Determinar el color, olor caracterstico, el pH, la densidad, el ndice de

refraccin y los slidos totales del extracto obtenido.
Colocar 2 ml del extracto en un tubo de ensayo y observarlo a la luz UV a 366 y
254 nm, colocndolo siempre en posicin horizontal a fin de que la capa del
extracto sea lo ms delgada posible.
Colocar 0.5 ml del extracto en un tubo de ensayo, ajustar el pH entre 6 y 8.
Adicionar 5 gotas del reactivo ninhidrina, calentar 2 minutos en bao mara
hirviendo y observar.
Coloraciones entre azul y violeta son indicativos de la presencia de aminocidos.
Sin embargo, la prolina y la hidroxiprolina dan coloraciones amarillas.

5. REVISIN DE LITERATURA

Revisar literatura especializada del vegetal en estudio en relacin a:

Farmacogeografa (origen geogrfico)
Farmacoetimologa (significado cientfico del nombre tcnico de la familia,
gnero, especie, sinnimo, si lo hay, nombres vernculos del vegetal).
Farmacoetnologa: usos industriales y etnomdicos, incluyendo ritos especiales
utilizados en su aplicacin.
Farmacoergasia: agrotecnia, fenologa, cosecha.

6. GUIA PARA LA DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos son polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas o compuestos que por
hidrlisis se convierten en estos. Son las principales sustancias elaboradas en la
fotosntesis y se almacenan en forma de almidn en cantidades elevadas en las plantas y
en los animales en forma de glucgeno. Existen dos tipos de carbohidratos: simples y
complejos, los primeros son compuestos de una o dos molculas y saben ms dulces ya
que por su tamao pueden empezarse a digerir desde la saliva. de tipo complejo, son
cadenas ms largas de molculas, debido a esto su sabor no es dulce ya que se no se
digieren desde la boca, estos se encuentran en alimentos como pan, arroz, papa, etc.

6.1 Pruebas genricas para detectar carbohidratos

La solucin a estudiar debe tener un pH 6-7. Si la solucin es alcalina se le adiciona
HCl, est cida se le aade acetato o hidrxido de plomo y se filtra.
La presencia de carbohidratos se determina mediante las pruebas genricas de:
a) Antrona: 1-3 mg 0.5 ml de solucin se colocan en un tubo de ensayo; si la muestra
es slida se aade unas gotas de agua para disolverla.
Despus se deja resbalar por las paredes del tubo una solucin recientemente preparada
del reactivo de antrona (2 mg en 2 ml de H2SO4 concentrado)
Se deja reposar 5-15 minutos.
La prueba es positiva si en la interfase aparece un anillo verdoso. El color se extiende
lentamente por el tubo.
b) Molisch: 2-5 mg 0.5 ml de la muestra se colocan en un tubo de ensayo, se le aade
0.5 ml de solucin de -naftol (5 mg en 0.5 ml de etanol). Agitar muy bien.
Posteriormente se deja resbalar por las paredes 1 ml de H2SO4.
Cuando la prueba es positiva aparece un anillo en la interfase. La cimarosa y algunos
desoxiazcares no dan coloracin.
6.2 Determinacin de carbohidratos reductores
Los carbohidratos que reducen los reactivos de Fehling o Benedict (soluciones
alcalinas de iones cpricos, en forma de complejos, con iones tartratos o citratos,
respectivamente) o de Tollen (solucin amoniacal de una sal de plata) se conocen como
azcares reductores. Todos los monosacridos (aldosas y cetosas), y la mayora de los
disacridos, exceptuando la sacarosa, son reductores.

6.2.1 Pruebas de laboratorio

6.2.1.1 Ensayos a la gota
A 1.0 ml de la muestra se le adiciona 1.0 ml del reactivo de Benedict y el doble de
agua destilada.
Calentar la mezcla en bao mara, anotar el tiempo de la reduccin. Precipitado rojoladrillo se considera positivo.
Si el material no reduce Benedict y es soluble en agua, puede ser un oligosacrido no
reductor.
Para averiguarlo calentar la solucin con unas gotas de H2SO4 y repetir la prueba.
Si la prueba es positiva, ensayar otra alcuota con 1.0 ml de reactivo de Barfoed.
Introducir la mezcla en bao de agua hirviendo.
Si en 3-5 minutos no hay formacin de precipitado rojo-ladrillo, no hay monosacridos.
Continuar el calentamiento hasta prueba positiva (mximo 60 minutos).
Si la reaccin fue muy lenta, 2-5 ml de solucin concentrada se mezcla con 5 ml de
HNO3 y se evaporan hasta 2 ml en una cpsula de porcelana.
Se dejan reposar y se ve si hay cristales de cido mcico, lo cual indicara lactosa u otro
oligosacrido que tenga galactosa.
Si la prueba fue positiva, se buscan cetosas con el rectivo de Seliwanoff: en un tubo de
ensayo se coloca 1.0 ml del material de prueba, 1.0 ml de reactivo y 1.0 ml de HCl al 25
%.
Colocar la mezcla en bao mara. Un color rojo cereza, en 2-10 minutos indica cetosas
(por ejemplo fructosa).
Si la prueba fue negativa se averigua si el material da positiva la prueba de cido
mcico.
Si esta es negativa, se hace la prueba del orcinol: calentar en bao mara 3-5 ml del
reactivo y cuando est hirviendo se aaden unas gotas de la muestra.
Si hay pentosas aparece color azul verdoso. Si posteriormente se aade 1-butanol, el
color pasa a la fase butanlica.
Para confirmar la presencia de pentosas, se pone en un tubo de ensayo 1.0 ml de
solucin de muestra y se le aade 1.0 ml de HCl concentrado.
Calentar la mezcla a ebullicin. Sobre la boca del tubo se pone un papel filtro
humedecido con acetato de anilina (1 gota de anilina y una gota de cido actico).
En caso positivo el papel toma un intenso color rojo.
6.3 Determinacin de la presencia de azcares no reductores
A 1.0 ml del extracto agregar 1.0 ml de resorcinol y 1.0 ml de HCl al 25%.
Colocar la mezcla en bao mara. Un color rojo cereza en 2-10 minutos es positivo para
carbohidratos no reductores (sacarosa, melicitosa, rafinosa).

7. PRUEBAS FITOQUMICAS PRELIMINARES

7.1 Determinacin de la presencia de SAPONINAS

Las saponinas tienen accin irritante sobre las clulas a nivel del parnquima pulmonar
se traduce en accin expectorante, sobre las clulas renales accin diurtica y sobre los
glbulos rojos accin hemoltica.
Como norma general las acciones de las drogas con saponinas son: expectorante,
diurtica, depurativa, tnico venoso, disminuye el colesterol. Las saponinas esterodicas
sirven como materia prima en la hemisntesis de hormonas sexuales y corticales.
Aunque se absorben mal en el tracto digestivo, favorecen la absorcin de otros
compuestos: cardiotnicos.
7.1.1 Reconocimiento en el laboratorio
A) Prueba de la espuma
Tomar 1 ml de cada una de las fracciones (polar y apolar) en tubos de ensayo separados,
aadir 9 ml de agua a cada uno. Utilizar 1 ml de esta solucin en un tubo de ensayo
pequeo, agitar vigorosamente por 30 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos.
La espuma sobrenadante indica la presencia de saponinas en la muestra.
La proporcin de saponinas se mide de acuerdo a la altura de la espuma sobrenadante
as:
Altura de menos de 5 mm = no se detectan saponinas
Altura de 5-9 mm = contenido bajo
Altura de 10-14 mm = contenido moderado
Altura mayor de 15 mm = contenido alto
B) Hemlisis
Agregar 1 ml del extracto a probar a 5 ml de solucin de solucin normalizada de glbulos rojos.

Si hay hemlisis es positivo para saponinas.

C) Cromatografa en Capa Delgada (TLC)

f. estacionaria: slica gel G-60

f. mvil: 1. cloroformo-metanol-agua (64:50:10)
2. n-butanol-etanol-amoniaco concentrado (3.5: 1: 2.5)
3. Me2CO-benceno (2.8:0.2)
4. Hexano-AcOEt (1:1)
5. CHCl3 Me2CO (9:1)
6. BAW (4:1:1)

Revelador: Se pueden aplicar tres diferentes mtodos para identificar las

manchas de saponinas:
a) aspersin con cido actico-anisaldehdo
b) tratamiento con nitrato de plata seguido de hidrxido de sodio
c) tratamiento con una suspensin de eritrocitos en buffer isotnico
d) cido sulfrico en metanol, seguida de calentamiento a 110 C por
30 minutos
Identificacin.- La presencia de manchas azules o azules violetas y zonas amarillas al
visible, son indicativo de la existencia de saponinas.
Es preciso combinar los dos ensayos ya que los bisdesmsidos no tienen accin
hemoltica y algunas saponinas presentan actividad hemoltica a diluciones mayores que
presentan la capacidad de formar espumas.
7.2 Reconocimiento de la presencia de POLIFENOLES en general
Los compuestos fenlicos se originan principalmente a travs de dos rutas biosintticas:
la ruta del cido sikmico que conduce, mediante la sntesis de aminocidos aromticos
(fenilalanina, tirosina), a los cidos cinmicos y sus derivados (fenoles sencillos, cidos
fenlicos y derivados, cumarinas, lignanos y derivados del fenilpropano), y la ruta de
los poliacetatos por la cual se originan quinonas, xantonas, orcinoles, algunos se
originan a travs de rutas mixtas que combinan la va del sikimato y del acetato, es el
caso por ejemplo de los flavonoides.
Un grupo especial de polifenoles lo constituyen los taninos.
Los polifenoles son un conjunto heterogneo de molculas que comparten la
caracterstica de poseer en su estructura varios grupos bencnicos sustituidos por
funciones hidroxlicas. Son poderosos antioxidantes que protegen a las LDL del dao
oxidativo, y su accin como antioxidante est relacionada no slo con su estructura
qumica sino que tambin con su localizacin en la partcula.
Pueden actuar como potentes inhibidores de la oxidacin de las LDL por varios
mecanismos: actuando como atrapadores de radicales libres, como agentes quelantes de
iones de metales de transicin, Por sus propiedades de solubilidad pueden localizarse
sobre la superficie de la partcula de LDL, disminuyendo el consumo de los
antioxidantes propios de las LDL como vitamina E y carotenoides, y en algunos casos
regenerando vitamina E oxidada en la partcula de LDL, Por su capacidad de inhibir,
activar o proteger enzimas especficas en el organismo.
Los polifenoles son importantes para la fisiologa de las plantas pues contribuyen a la
resistencia de microorganismos e insectos y ayudan a preservar su integridad por su
continua exposicin a estresantes ambientales, incluyendo radiaciones ultravioletas y
relativamente altas temperaturas
7.2.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.2.1.1 Ensayos a la gota

A) Ensayo con el reactivo de Folin-Ciocalteu

Utilizar dos tubos de ensayo, en uno de ellos colocar 0.5 ml del extracto + 5 gotas del
reactivo + 2 gotas de Na2CO3 al 7.5%. En el segundo tubo colocar slo la mezcla de
reactivos y sustituir el volumen de extracto por agua destilada.
Una coloracin azul es indicativo de polifenoles.
Evaluar los resultados as:
Coloracin amarilla: indica que no se detectaron fenoles
Coloracin verdosa: se detectaron fenoles en baja cantidad
Coloracin azul clara: se detectaron fenoles en cantidad moderada
Coloracin azul intensa: se detectaron fenoles en alta cantidad
Si en la prueba anterior se detectaron polifenoles, aadir unos miligramos de carbonato
de sodio 5 gotas de solucin de NaHCO3 al 20 % al tubo de ensayo donde se realiz la
prueba, agitar y observar cambio de coloracin de rojo a azul.
7.2.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
f. estacionaria: slica gel G o slica gel G F254
f. mvil: BAW 4:1:5
revelador: luz UV

7.3 Determinacin de la presencia de TANINOS

Catecol

Los taninos son compuestos polifenlicos muy astringentes debido a su capacidad de

union a protenas, de gusto muy amargo, muy sensibles a la oxidacin especialmente en
medio cido. Se emplean como cicatrizantes ya que al unirse a la piel forman una capa

protectora que permite que los tejidos subyacentes se regeneren. Pueden producir
trastornos al ser eliminados va renal.
Como uso interno se emplean como antidiarrico, disminuye el peristaltismo,
vasoconstrictor a nivel de pequeos vasos (varices, flebitis, hemorroides),
antimicrobiano, antivrico y antifngico, hipoglucemiante. Industrialmente se han
utilizado sus propiedades para curtir pieles, al eliminar el agua de las fibras musculares.
En el mundo vegetal actan como protectores de ellas contra las heridas que sufren,
protegindolas as de los ataques exteriores, bien porque resultan txicos para los
microorganismos o herbvoros, bien porque no son digeribles para estos ltimos.
Alos taninos se les suele clasificar como HIDROLIZABLES o Glicos y taninos
CONDENSADOS o catquicos.
7.3.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.3.1.1 Ensayos a la gota
A) Prueba del cloruro frrico
Depositar 0.5 ml de la fraccin hidroalcohlica en 5 tubos de ensayo pequeos; aadir
en cada caso dos gotas de agua destilada en todos los tubos con lo que se logra un color
amarillo.
Dejar el tubo 1 como testigo, y adicionar gotas de cloruro frrico a los siguientes tubos
as: una gota al tubo 2, dos en el tercero y as sucesivamente hasta llegar al quinto tubo.
La caracterizacin de taninos se hace de acuerdo a la coloracin observada, as:
No hay cambio significativo de color = no se detecta presencia de taninos
Cambio en el color a azul, negro azulado = taninos piroglicos (hidrosolubles)
Cambio de color a verde, azul verdoso, precipitado negro verdoso = taninos de tipo
catecol (condensados).
B) La prueba del cloruro frrico tambin puede realizarse as
Pesar 0.7 g de muestra y colocarlo en un matraz, agregar 200 ml de solucin de
ferricianuro de potasio 0.004 M y agitar fuertemente.
Luego se adicionan 15 ml de solucin de cloruro frrico 0.008 M en cido clorhdrico
0.008 M. Observar los cambios de coloracin y evaluar los resultados as:
Verde claro: baja o nula cantidad de tanino
Verde oscuro: contenido medio de tanino
Azul: alto contenido de tanino
C) Prueba de la gelatina-sal
Utilizar dos tubos de ensayo, en cada uno colocar 0.5 ml del extracto y 1 ml de
solucin de gelatina-sal (solucin de gelatina al 1% en NaCl al 10%).
El otro tubo servir de testigo, adicionar en l 0.5 ml del reactivo de gelatina-sal.
De esta forma precipitan todos los taninos e incluso los pseudotaninos a altas
concentraciones.
Si hay formacin de precipitado agregar 0.5 ml de rea 10 M. A la solucin resultante
adicionar 2-3 gotas de cloruro frrico. Evaluar el resultado asi:

Coloraciones verdes: confirma la prueba para taninos condensados

Coloraciones azules: confirma la presencia de taninos hidrolizables
Si se detectaron taninos y la prueba de la espuma le dio negativa, indica que los taninos
impiden observar la presencia de saponinas, se recomienda entonces realizar la marcha
completa: ANALISIS DE TANINOS Y DE SAPONINAS.
D. Diferenciacin entre taninos condensados e hidrolizables
A) 0.5 ml del extracto colocados en un tubo de ensayo, se mezclan con 0.5 ml de etanol,
agitar y agregar solucin de sulfato de magnesio al 30%.
Evaluar los resultados as:
Los taninos catquicos (condensados) son completamente precipitados.
Los taninos piroglicos (hidrolizables) no lo son sino parcialmente, pero el lquido
filtrado es bastante decolorado.
E) Prueba para taninos hidrolizables
0.5 ml del extracto + 0.5 ml de etanol, disolver y aadir unos miligramos de nitrito de
sodio y unas gotas de cido actico.
Al inicio se observa color rosado que posteriormente pasa a caf.
F) Prueba para taninos condensados
Utilizar 2 ml del extracto, aadir 1 ml de butanol, agitar bien y separar la capa orgnica
(superior). Aadir a la capa orgnica 0.5 ml de [HCl] , calentar suavemente con
mechero de alcohol o simplemente con un encendedor de cigarrillos ( 37 C).
Una coloracin roja es indicativo de taninos condensados o proantocianidinas.
Si se agregan unos miligramos de Na2CO3 o unas gotas de NaHCO3 al 20%, se debe
observar coloracin azul.

7.4 Determinacin de la presencia de FLAVONOIDES

Los flavonoides o bioflavonoides son pigmentos vegetales no nitrogenados.

Comprenden un grupo de compuestos polifenlicos ampliamente distribuidos en las
frutas y en los vegetales, as como en el t negro, el caf, el chocolate, la cerveza y el
vino rojo. Pueden aparecer desde simples molculas fenlicas hasta compuestos muy
polimerizados con pesos moleculares superiores a los 30. 000 Da. Existen 13 subclases
de flavonoides con un total de ms de 5 000 compuestos, 10 todos presentando un

esqueleto hidrocarbonado del tipo C6-C3-C6 (difenilpropano) derivado del cido

shiqumico y de 3 restos de acetato.
No son considerados por los nutricionistas como vitaminas, sin embargo los flavonoides
actan protegiendo la salud: limitan la accin de los radicales libres (oxidantes)
reduciendo el riesgo de cncer y enfermedades cardacas, mejoran los sntomas alrgicos y
de artritis, aumentan la actividad de la vit.C, refuerzan los vasos sanguneos, bloquean la
progresin de las cataratas y la degeneracin macular, evitan las tufaradas de calor en la
menopausia y combaten otros sntomas.

7.4.1 Reconocimiento en el laboratorio

7.4.1.1 Ensayos a la gota
A) Prueba de Shinoda
1 ml del extracto + 0.5 g de limaduras o polvo de Mg y gota a gota [ HCl ] hasta que
termine el desprendimiento de hidrgeno.
Observar durante 10 minutos los cambios de color.
Coloraciones rosada, roja, violeta, anaranjada es positiva para sustancias que posean en
su estructura el ncleo de la - benzopirona, tales como: flavonas, flavonoles,
flavanonas, flavanonoles, xantonas. Isoflvonas, chalconas y auronas no dan coloracin.
El siguiente interpretacin podra ser una ayuda en el anlisis de los resultados
obtenidos en la prueba de Shinoda, sin embargo no debe tomarse como absoluto o
definitivo:
Flavonas y flavonoles dan coloracin amarillo a rojo; flavanonoles rojo a magenta;
flavanonas rojo, magenta, violeta, azul.
7.4.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
A) CP: f. estacionaria: papel para cromatografa
f. mvil: BAW (4:1:5, 5:4:1 6:1:2 n-butanol-cido actico 50:7saturado con
agua) Forestal (agua-HOAc-HCl conc. 30:10:3)
Revelador: UV y vapores de amoniaco
B) CCD: muestra: utilizar el extracto metanlico crudo
f. estacionaria: slica gel GF254
f. mvil: 1. n- butanol-cido actico-agua (6:1:2 4:1:5)
2. acetato de etilo-cido frmico-cido actico-agua (100:11:2:7)
Revelador:
a) anlisis a la luz visible antes y despus de exponer el cromatograma a los
vapores de NH3
b) anlisis a la luz UV (366 nm) antes y despus de exponer el cromatograma a
los vapores de NH3
c) anlisis despus de asperjar con solucin metanlica al 5 % de AlCl3, primero
al visible y despus con luz UV (366 nm).

Interpretacin:
Antocianinas: rojo, azul o prpura (dependiendo del pH) y de la absorcin al UV
Flavonoles y flaconas: amarillo o marfil.
C) Tambin puede usarse
f. estacionaria: slica gel GF254
f. mvil: acetato de etilo-cido frmico-agua (8:1:1)
Revelador:
Rociar la placa con una mezcla preparada con 15 ml de solucin de
cido brico al 30% en agua y 5 ml de solucin de cido oxlico al
10% en agua destilada.
Llevar a la estufa 10 minutos y luego observar al UV
Se observan manchas fluorescentes.

7.5 Determinacin de la presencia de FENILPROPANOIDES

Los fenilpropanos son sustancias naturales ampliamente distribuidas en los vegetales

caracterizadas por un anillo aromtico unido a una cadena de 3 carbonos y derivados
biosintticamente del cido shiqumico, son constituyentes principales de algunos aceites
esenciales, tales como el de clavo, canela, ans, algunas albahacas, etc.

A su vez los aceites esenciales son fracciones lquidas voltiles, generalmente

destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del
aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmtica (perfumes y
aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacutica
(saborizantes); todo lo cual evidencia la importancia de los fenilpropanos.
7.5.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.5.1.1 Ensayos a la gota

Manejar 3 tubos de ensayo y utilizarlos as:

-Colocar en el primero 1 ml del extracto etanlico a ensayar (testigo).
-En el segundo adicionar 1 ml del extracto etanlico a ensayar + 2 ml de HCl 0.5 N,
aadir 2 ml de solucin acuosa de nitrito de sodio al 10% (reactivo de Arnow) y
finalmente agregar 2 ml de solucin acuosa de NaOH 2N.
-En el tercer tubo agregar toda la mezcla de reactivos sin la muestra (testigo)
Interpretacin: El reactivo de Arnow en presencia de fenilpropanoides, presenta
coloracin naranja y despus de la adicin de la soda se genera un rosado prpura.
7.5.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)

f. estacionaria: slica gel

f. mvil: n-hexano-cloroformo 3:2
revelador: vainillina al 1% em H2SO4 al 5%, seguido de calor
Interpretacin:
Rf y color de algunos fenilpropanoides:
-Safrol 0.74 0.86 - Gris
-Estragol 0.72 - Rosado
-Anetol 0.69 - Rojo
-Miristicina 0.50 0.71 Pardo
-Apiol 0.39 0.41 Pardo Pardo
-Timol 0.38 - Rojo
-Eugenol 0.20 0.31 Pardo
-Isoeugenol 0.29 0.27 Rojo Amarillo
-Metileugenol - 0.42 - Rojo pardo
-Metilisoeugenol - 0.42 - Prpura
-Elemicina - 0.27 Amarillo

7.6 Determinacin de la presencia de ANTRAQUINONAS

4a, 9a- dihidroantraquinona;

9,10Antracenediona;
9,10-Antraquinona

Este grupo de metabolitos es el ms numeroso de las quinonas naturales y son la base y

fuente de una importante cantidad de colorantes. Son compuestos aromticos
polihidroxilados ms o menos metilados, cuando hay sustituyentes en la posicin C-2 o
en C-3, el estado de oxidacin del tomo de carbono puede variar y ser CH3, -CH2OH,
-CHO, -COOH o formar grupos ms complejos.
Por ejemplo, la 9,10 antraquinona es de color amarillo claro y cuando est sustituda por
grupos auxocrmicos, en una o ms de sus ocho posiciones disponibles, especialmente

en las cuatro posiciones alfa, se produce un incremento en la intensidad del color, el

cual se desplaza al rojo intenso fuete hasta el negro.
Las antraquinonas naturales se encuentran libres y al estado de combinaciones
glicosdicas. Las propiedades tintreas y laxantes de algunas plantas superiores, estn
relacionadas con su contenido de antraquinonas alfa-hidroxiladas.

7.6.1 Reconocimiento en el laboratorio

7.6.1.1 Ensayos a la gota
A) Reaccin de Borntrger
Hervir una parte del extracto durante 5 minutos con 10 ml de KOH al 5% y 1 ml de
H2O2 al 6%.
Filtrar y acidular el filtrado con 10 gotas de cido actico.
Extraer con 10 ml de benceno. La capa bencnica (superior) se pone amarilla, se separa
Unos 5 ml de la solucin bencnica se agitan con 2.5 ml de NaOH al 10%.
Las antraquinonas colorean de rojo la capa alcalina.
B) Puede tambin utilizarse este procedimiento:
Colocar en un tubo de ensayo 0.20 g de planta y adicionar 5 ml de cloroformo,
agitar, dejar 15 min en reposo.
Recoger la fase clorofrmica y dividirla en dos tubos de ensayo.
En el 1er. tubo agregar 1 ml de solucin de NaOH al 5% en agua (Reaccin de
Borntraeger).
Interpretacin: Coloracin rojiza en la fase acuosa, indica presencia de antraquinonas
En el 2 tubo, adicionar 1 ml de solucin de acetato de magnesio al 0.5% en
metanol.
Coloracin roja indica presencia de antraquinonas libres.

7.6.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)

f. estacionaria: slica gel
f. mvil: a) acetato de etilo- n-hexano (8:2)
b) acetato de etilo:metanol:agua. (100:17:13).
c) n-propanol:acetato de etilo:agua. (40:40:30).
Revelador:
1. Sin tratamiento qumico:
UV-365 nm.
Interpretacin: Todas las antraquinonas dan fluorescencia amarilla o rojo-marrn.
2.Con tratamiento qumico.
a) solucin de hidrxido de potasio (Reaccin de Borntrger).
Interpretacin: Antraquinonas: rojo en el visible.
Antronas y antranoles: amarillo en el visible y fluorescencia amarilla en
UV-365 nm.

7.7 Determinacin de la presencia de TERPENOS/ESTEROIDES

Los terpenos forman una amplsima y muy diversa familia de sustancias naturales,
producidos de manera primaria por una gran variedad de plantas, particularmente las
conferas y algunos insectos. Cuando los terpenos son modificados qumicamente ya sea
por oxidacin o reacomodo del esqueleto carbonado los compuestos resultantes son
referidos generalmente como Terpenoides algunos autores usan invariablemente el
trmino terpeno para incluir a todos los terpenoides, unos y otros son los principales
constituyentes de los aceites esenciales de muchos tipos de plantas y flores.
Tradicionalmente se han considerado derivados del 2-metil-butadieno ms conocido
como isopreno. Esta llamada regla del isopreno ha permitido clasificarlos y
estudiarlos, pero realmente los terpenos no derivan del isopreno ya que ste nunca se ha
encontrado como producto natural. El verdadero precursor de los terpenos es el cido
mevalnico, el cual proviene del acetil coenzima A.
Desde el punto de vista farmacutico, los grupos de principios activos de naturaleza
terpnica ms interesantes son: monoterpenos y sesquiterpenos constituyentes de los
aceites esenciales, derivados de monoterpenos correspondiente a los iridoides, lactonas
sesquiterpnicas que forman parte de los principios amargos, algunos diterpenos que
poseen actividades farmacolgicas de aplicacin a la teraputica y por ltimo,
triterpenos y esteroides entre los que se encuentran las saponinas y los hetersidos
cardiotnicos.
7.7.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.7.1.1 Ensayos a la gota
A) Reaccin de Lieberman-Burchard

Colocar 1 ml del extracto en un crisol; evaporar casi hasta sequedad, dejar enfriar y
adicionar 3-4 gotas de cloroformo.
Repartir la mezcla en dos tubos de ensayo, secar al aire, en uno de los tubos adicionar
gotas de anhdrido actico seguido por una gota de cido sulfrico concentrado, el otro
se deja de testigo.
Los cambios de color interpretarlos as:
Azul o verde = esteroides
Rojo, rosado o violeta = triterpenos
Amarillo plido = esteroides o triterpenos saturados
B) Reaccin de Salkowski
0.5 ml del extracto se mezcla con 1 ml de cloroformo, dejar deslizar por la paredes del
tubo con sumo cuidado 1 ml de cido sulfrico del 85%.
Interpretacin: Formacin de colores amarillo o rojo se considera positivo.
Si en la interfase se forma color azul, verde o violado caracterstica de los carotenoides,
sirve para distinguirlos de otros pigmentos naturales, como las antocianinas
C) Prueba de Tortelli-Jaffe
0.5 ml de la muestra se mezcla 0.2 ml de cido actico y 2 gotas de cloroformo. Sobre
esta mezcla se deja caer con cuidado 0.1 ml de una solucin al 2% de bromo en
cloroformo.
Si hay esteroides con un doble enlace terciarios efectivo o potencial, se forma una zona
verde en la interfase.
7.7.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
A) BIDIMENSIONAL

f. estacionaria: slica gel G-60

f. mvil: solvente 1. hexano-acetona (80:20)
solvente 2. hexano-ter etlico-cido actico 75:25:1
Revelador: -Lieberman Burchard
-cido sulfrico al 5% en etanol seguido de calentamiento en estufa
-CoCl2 al 2% en cido sulfrico al 10% y luego calor,
-vainillina etanlica al 1% seguida de pulverizacin con cido
clorhdrico y calor
-vainillina al 1% en H2SO4 al 5% seguido de calor
Interpretacin: manchas de diversidad de colores (verdes, rojos, rosados, azules,
amarillos, etc) son indicativos de la presencia de estos
metabolitos.
A) CCD UNIDIRECCIONAL: f. estacionaria: slica gel G-60
f. mvil: ter de petrleo-AcOEt (9:1, 8:2, 7:3 1:1)
Revelador: los mismos de la cromatografa bidimensional
Interpretacin: manchas de diversidad de colores (verdes, rojos, rosados, azules,
amarillos, etc) son indicativos de la presencia de estos metabolitos

7.8 Determinacin de la presencia IRIDOIDES

Bajo la denominacin de iridoides se agrupan una serie de monoterpenos bicclicos (C10)

derivados biosintticamente del monoterpeno geraniol, que presentan como estructura
bsica comn un ciclopentapirano denominado iridano, por haberse detectado la
primera vez en unas hormigas pertenecientes al gnero Iridomirmex. Estos compuestos
pueden encontrarse como estructuras abiertas (secoiridoides) o cerradas (iridoides)
generalmente en forma heterosdica, mayoritariamente como glucsidos.
La mayora se presentan como hetersidos; algunos estn libres y como compuestos
dmeros. Hay muchos seco-iridoides en los que el anillo del pirano est abierto y en
algunos de ellos, el oxgeno del anillo pirnico est reemplazado por nitrgeno. Son
marcadores quimiotaxonmicos del orden Tubiflorae
Existen una serie de plantas que se emplean por sus propiedades farmacolgicas
precisamente porque algunos de sus principios activos son de naturaleza iridodica.
Entre las mas importantes destacan la valeriana y la genciana de los cuales se utilizan
los rganos subterrneos y, las hojas de olivo.
7.8.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.8.1.1 Ensayos a la gota
Utilizar tres tubos de ensayo de la siguiente forma:
- En el primero colocar 0.5 ml del extracto etanlico (testigo)
-Colocar en el segundo tubo 0.5 ml del extracto etanlico, mezclar con 3 ml de
vainillina
(4% p/v en metanol) y con 1.5 ml de HCl concentrado. La muestra se protege de la luz
durante 1-2 horas.
-En el tercer tubo se adicionan los reactivos sin la muestra

Interpretacin: La presencia de iridoides produce una coloracin azul

7.9 Determinacin de la presencia de ALCALOIDES

Se incluyen en este grupo a los compuestos nitrogenados, que se comportan como

bases frente a los cidos, formando sales. En su gran mayora son de origen natural,
sobre todo del reino vegetal, aunque se encuentren algunos semisintticos y otros
exclusivamente sintticos.
A pesar de su distinta estructura, poseen propiedades fisiolgicas y toxicolgicas que se
ejercen fundamentalmente sobre el sistema nervioso central, con predominio en alguno
de sus niveles. Por estas razones pueden ser usados como frmacos. El uso prolongado
de alguno de estos de estos compuestos produce en el hombre acostumbramiento, que
constituyen verdaderas toxicomanas, con dependencia fsica y psquica y un aumento
de la tolerancia.
La mayor parte de los alcaloides se encuentran en las plantas dicotiledneas en forma de
sales (malatos, tanatos, citratos, etc.). A excepcin de algunos como la nicotina, que son
lquidos, los restantes son slidos, poseen sabor amargo y reaccin alcalina. Insolubles
generalmente en el agua, lo son ms en el ter y fcilmente solubles en el alcohol. Con
los cidos forman sales y con ciertos cuerpos dan reacciones, coloreadas o no, pero
caractersticas. Tienen por lo comn, carcter de aminas terciarias, y son en su mayor
parte venenos muy violentos; como antdoto se emplea, entre otros, infusiones de t
muy cargadas; el tanino de la infusin precipita el alcaloide e impide su asimilacin en
el tubo digestivo.
7.9.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.9.1.1 Ensayos a la gota
A) Llevar a sequedad, 30 ml del extracto etanlico de la planta, adicionar 5 ml de
HCl (10%) y calentar por 10 min.
Enfriar, filtrar, dividir el filtrado en tres tubos de ensayo y agregar unas gotas de los
reactivos de reconocimiento: Dragendorff, Mayer y Wagner. Una leve turbidez o
precipitado (rojo a naranja, blanco a crema y marrn) evidencia la posible presencia de
los mismos.
Para mayor claridad utilice 4 tubos testigos as:
1. para colocar 1 ml del extracto a probar
2. para colocar 1 ml del reactivo de Dragendorff
3. para colocar 1 ml del reactivo de Mayer
4. para colocar 1 ml del reactivo de Wagner
Compare lo obtenido en los dos sets de tubos.

B) Puede tambin aplicarse la siguiente metodologa:

Tomar 3 ml de extracto concentrado. Evaporar el solvente, utilizando bao mara, casi
hasta sequedad para obtener un mnimo residuo.
Extraer con 5-7 ml de HCl al 5%, luego alcalinizar la mezcla con 2 ml de NaOH al
20%.
Posteriormente, se extrae primero con 10 ml de CHCl3 y etiquetar la fraccin
clorofrmica como 1.1.
Colocar de nuevo el residuo acuoso-alcalino en el embudo de separacin y extraer con
CHCl3/EtOH 3:2, separar esta fraccin y etiquetarla como 1.2.
Concentrar las fracciones 1.1 y 1.2 por separado en bao mara.
Extraer por separado cada fraccin con HCl al 5% y filtrar. Con el filtrado hacer las
pruebas para alcaloides mencionadas en el literal (A).
7.9.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
Calentar 20 mg del extracto etanlico de la planta con una mezcla de EtOH-CHCl3
(1:1).Utilizar el producto para realizar la CCD
f. estacionaria: Slica gel G
f. mvil:
a) CHCl3-MeOH. (9:1)
b) CHCl3-AcOEt. (8:2)
c) AcOEt:MeOH:H2O. (100:13.5:10).
Revelador: reactivo de Dragendorff.
Interpretacin: manchas de color rojo a naranja se toma como positivo

7.10 Determinacin de la presencia de CARDIOTNICOS

Este grupo de compuestos son derivados del ncleo esteroideo general o ncleo
ciclopentanoperhidrofenantreno al cual pertenecen el colesterol y los cidos biliares. las
hormonas sexuales, las hormonas corticoadrenales y la vitamina D.

Una caracterstica que los diferencia es que los glicsidos cardacos aparte de tener una
o ms molculas de azcar en el carbono 3 del ncleo esteroideo contienen un anillo
lactnico incrustado al cabono 17.
Los glicsidos cardiacos son sustancias obtenidas de Digitalis, Strophantus y otras
plantas, y que se emplean en la insuficiencia cardaca congestiva. Aumentan la fuerza
de la contraccin cardaca sin acrecentar significativamente otros parmetros, pero son
muy txicos en altas dosis. Su mecanismo de accin generalmente implica la inhibicin
de la bomba de sodio y potasio, siendo
7.10.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.10.1.1 Ensayos a la gota
A 10 ml del extracto etanlico de la planta adicionar 5 ml de solucin de acetato de
plomo al 10% y 4 ml de agua destilada.
Calentar la mezcla a bao Mara durante 10 min. Filtrar.
Agitar el filtrado con 20 ml de CHCl3, separar la capa clorofrmica en 6 tubos
de ensayo, llevar a sequedad.
Adicionar:
Al primer tubo 1 ml de reactivo de Baljet [mezclar volmenes iguales de: snl A
(solucin etanlica de cido pcrico al 1%) y sln B (NaOH al 10% en agua).
Coloracin roja, naranja-rojiza o violeta con cardenlidos.
Al segundo 1 ml de reactivo de Kedde (Volmenes iguales de Sln A: cido 3,5dinitrobenzoico al 2% en metanol y Sln. B: KOH al 5.7% en agua).
Coloracin rosa o azul-violeta al visible indican cardenlidos, los bufadienlidos no
reaccionan. El color se atena en pocos minutos.
Al tercero: 1 ml de solucin al 1% de m-dinitrobenceno en etanol al 50% y
enseguida se aaden 2-3 gotas de solucin de NaOH al 20% en agua (reactivo
de Raymond-Marthoud) para identificar el anillo lactnico de los cardenlidos
Coloraciones violeta o azul.
En el cuarto realizar la reaccin de Keller-Kiliani. (5 ml de cido actico glacial,
1 gota de cloruro frrico al 5% en metanol y 1-2 gotas de cido sulfrico concentrado)
En uno o dos minutos se observan coloraciones intensas.
En el quinto realizar la reaccin de Liebermann-Burchard (1 mg de
muestra/pocas gotas de HOAc + 3 ml Ac2O/H2SO4 (50:1)).
Coloracin verde, azul verdoso, va rojo al azul identifica el ncleo esferoidal
En el sexto realizar la reaccin de Salkowaki para identificar el ncleo
esferoidal (0.5 ml del extracto se mezcla con 1 ml de cloroformo, dejar deslizar
por la paredes del tubo con sumo cuidado 1 ml de cido sulfrico del 85%).
Coloracin amarilla-rojo sangre se toma como positivo.
7.10.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
f. estacionaria: Slica gel 60F254
f. mvil:
a) Acetato de etilo:metanol:agua. (100:13.5:10).
b) Cloroformo:metanol:agua (65:35:10). fase inferior.
Revelador:
a) especficas para anillo -lactona. (cardenlidos).

- reactivo de Kedde.
- reactivo de Baljet (solucin alcalina de cido pcrico).
- reactivo de Raymond (soluciones alcalinas de m-dinitrobenceno).
b) mtodos de deteccin general.
- reactivo tricloruro de antimonio.
Se asperjan los cromatofolios con el reactivo. Se calienta a 100 C por 6 minutos, luego
se observa inmediatamente al UV-365nm.
Interpretacin: Se distinguen diferentes colores segn la estructura.
7.11 Determinacin de la presencia de CUMARINAS

Cumarina

Aflatoxina B1

Con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios activos

fenlicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en comn una estructura
qumica de 2H-1-benzopiran-2-ona, denominada cumarina.
Prcticamente todas las cumarinas, a excepcin de la cumarina propiamente dicha,
poseen un sustituyente hidroxlico en posicin 7 ya sea libre, como sucede en la
umbeliferona, o combinado (metilo, azcares, etc.). Las cumarinas sencillas pueden
poseer adems hidroxilos adicionales tambin libres o combinados.
Es frecuente, que sobre el anillo cumarnico bsico, generalmente hidroxilado en C-7, se
siten sobre los carbonos 6 u 8 radicales isoprenlicos de 5, 10 o ms raramente de 15
tomos de carbono, que por su alta reactividad pueden originar anillos adicionales de
tipo furnico o pirnico. A este grupo de cumarinas isopreniladas se les conoce en
conjunto como cumarinas complejas debido a la gran variabilidad qumica de sus
estructuras.
Como grupo, su inters farmacolgico no es muy grande, sin embargo se debe
mencionar sus efectos sobre el sistema vascular tanto en territorio arterial como venoso
y su utilidad en el tratamiento de algunas alteraciones de la piel como por ejemplo la
psoriasis debido a sus propiedades fotosensibilizantes. Las cumarinas deprimen la
sntesis heptica de los factores esenciales para la coagulacin sangunea dependientes
de vitamina K (II (protrombina), VII, IX y X)., razn por la cual se les utiliza como
anticoagulantes y rodenticidas.
7.11.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.11.1.1 Ensayos a la gota
A) En un tubo de ensayo colocar 2 ml del extracto etanlico de la planta, tapar

con papel de filtro impregnado en solucin diluida de NaOH y llevar a Bao de

agua a 100C por algunos minutos.
Remover el papel de filtro y examinarlo bajo luz UV, siendo la fluorescencia
amarilla indicativa de la presencia de cumarinas.
7.11.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
f. estacionaria: Slica gel 60F254.
f. mvil: a) Tolueno:ter (1:1, saturado con cido actico al 10%).
Se agitan, por 5 min, en un embudo separador, 50 ml de tolueno, 50
ml de
ter y 50 ml de cido actico al 10%. Se separan las capas y se
utiliza la capa orgnica.
b) acetato de etilo.
Revelador:
1) Sin tratamiento qumico:
Interpretacin: UV-365 nm. Intensa fluorescencia:azul, marrn, o azul-verdosa.
2) Con tratamiento qumico:
- Reactivo hidrxido de potasio.
Interpretacin: Las zonas que muestran fluorescencia azul se intensifican asperjando
con solucin de KOH al 5% en EtOH.

7.12 Determinacin de la presencia de LACTONAS TERPENICAS

Las lactonas sesquiterpnicas poseen un esqueleto carbonado de 15 tomos de carbono,

que tericamente deriva de la unin de tres fragmentos de isopreno (2-metil-1,3butadieno), cabeza-cola, y algunos productos de transposicin; parte del esqueleto es un
anillo de metilbutenlido.
Son sustancias amargas, de farmacologa poco estudiada pero provenientes de plantas
usualmente reportadas como medicinales, por lo que es probable que sean los agentes
medicinales.

7.12.1 Reconocimiento en el laboratorio

Pesar 3 g del extracto crudo y concentrar en bao mara.

Extraer el extracto concentrado con 10 ml de acetato de plomo al 5%, a 60 C por 15

minutos.
Al finalizar este tiempo filtrar y aadir al filtrado 2 gotas de cido actico concentrado,
luego extraer con 15 ml de CHCl3, agitando lentamente para evitar que se formen
emulsiones. Concentrar hasta sequedad y agregar 1 ml de EtOH-CH2Cl2 1:1.
Realizar CCD con la mezcla anterior realizar varias cromatografas, as:
1. f. estacionaria: slica gel G
f. mvil: CHCl3-acetona (90:10)
Revelador: vainillina al 1% en cido sulfrico al 5%
Interpretacin: Manchas de diversos colores (rojo, azules, verdes, etc) son indicativo
de la estructura terpnica.
2 . f. estacionaria: slica gel
f. mvil: diclorometano-metanol-agua (87: 12: 1)
revelador: Asperjar primero con m-dinitrobenceno al 2% en EtOH, dejar
secar
Asperjar por segunda vez con NaOH al 5% en EtOH del 50%
Llevar a la estufa (110 C) al menos 6 minutos.
Interpretacin: Si la lactona tiene en su estrutura una -lactona ,insaturada, se revelan manchas violetas con Rf alto (> 0.5 ).