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DETECCIN RPIDA DE
ALGUNOS NCLEOS SECUNDARIOS
Departamento de Qumica
Facultad de Ciencias
Universidad del Tolima
Ibagu
2007
JUSTIFICACIN
Los vegetales producen una diversidad de sustancias, producto del
metabolismo secundario (metabolitos secundarios), algunas responsables de la
coloracin y aromas de flores y frutos, otras vinculadas con interacciones
ecolgicas.
Las investigaciones han demostrado que principalmente la
mayora de estos compuestos participan en el mecanismo de defensa de las
plantas, lo que a su vez ha generado una gama de usos y aplicaciones en la
agricultura y en la medicina. Adicionalmente, las mltiples funciones que
presentan en los vegetales permite la bsqueda de nuevos agroqumicos
naturales, como insecticidas, herbicidas, reguladores de crecimiento, etc.
Estrictamente hablando, la FITOQUIMICA estudia los metabolitos secundarios
extrados de las plantas. Para ello esta rama de la qumica ensea cmo aislar
e identificar los principios activos de numerosos vegetales con importante
actividad biolgica, tal es el caso de las plantas medicinales.
En un sentido amplio la FITOQUIMICA se interesa por el conocimiento de la
historia, el comercio, la distribucin y geografa, la botnica, el cultivo,
recoleccin, seleccin, preparacin y preservacin, identificacin y evaluacin
por todo tipo de mtodos, la composicin qumica y el anlisis, la farmacologa
y el uso tradicional de los productos qumicos derivados de los vegetales y sus
derivados, con el propsito de mejorar la salud del hombre u otros animales.
Todo tipo de drogas vegetales y otros productos naturales que tienen valor
comercial por sus usos tecnolgicos, incluyendo una variedad de productos de
uso comercial, entre ellos: colorantes, aromas, condimentos, insecticidas,
herbicidas, antibiticos, extractos alergnicos e inmunizantes biolgicos, etc,
tambin pueden ser estudiados dentro de la disciplina. Por supuesto, se
necesitan prerrequisitos: botnica, qumica orgnica, analtica, bioqumica, etc.
Un punto importante en el conocimiento de las molculas implicadas en la
actividad de las plantas es la determinacin de su estructura y de su
comportamiento. Ello permite comprender la naturaleza y las modalidades de
los mtodos de control, racionalizar los procesos extractivos, a veces prever la
actividad farmacolgica, frecuentemente pronosticar la farmacocintica y la
biodisponibilidad; es preliminar a la sntesis. Estudiar las estructuras
moleculares es tambin comprender su origen.
Por el potencial que representan estos metabolitos, las investigaciones no slo
se han dirigido a la elucidacin de estructuras qumicas y evaluacin de su
actividad biolgica mediante bioensayos, sino hacia la obtencin por cultivo in
vitro.
El propsito de este laboratorio es despertar en el estudiante el inters por el
estudio en el rea de los productos naturales de origen vegetal, proporcionar
los medios adecuados para manejar los procesos de extraccin, purificacin e
identificacin de metabolitos primarios y secundarios en plantas, caracterizar
fsica y qumicamente los ingredientes activos mediante tcnicas usuales en
anlisis orgnico y bioqumico, ampliar los conocimientos de la Qumica
En el laboratorio:
Pesar todo el material recolectado, tal como se trajo del campo (no hacer ningn
tipo de seleccin)
Retirar el material en mal estado (viejo, enfermo, muy joven, etc) o cualquier
materia orgnica que no haga parte del vegetal a estudiar. Pesar este material, se
denominar: MATERIA ORGANICA EXTRAA
Separadamente pesar cada parte del vegetal que ser sometida al anlisis, se
llamar: MUESTRA o DROGA
Para las hojas tener en cuenta la forma del limbo, borde, pice, base, peciolo,
venacin, consistencia y color.
sea orgnico.
Proporcin: material vegetal: solvente 1: 10
Tiempo de extraccin: 24 horas. Para mayor eficiencia debe renovarse el solvente cada
24 horas hasta observar agotamiento total.
El mtodo de maceracin puede sustituirse por el de PERCOLACION
Para extractos acuosos se sugiere aplicar DECOCCIN (30 minutos).
.
El extracto obtenido por maceracin o por decoccin debe filtrarse, a travs de papel
filtro, y puede concentrarse a presin reducida si se considera necesario.
5. REVISIN DE LITERATURA
Las saponinas tienen accin irritante sobre las clulas a nivel del parnquima pulmonar
se traduce en accin expectorante, sobre las clulas renales accin diurtica y sobre los
glbulos rojos accin hemoltica.
Como norma general las acciones de las drogas con saponinas son: expectorante,
diurtica, depurativa, tnico venoso, disminuye el colesterol. Las saponinas esterodicas
sirven como materia prima en la hemisntesis de hormonas sexuales y corticales.
Aunque se absorben mal en el tracto digestivo, favorecen la absorcin de otros
compuestos: cardiotnicos.
7.1.1 Reconocimiento en el laboratorio
A) Prueba de la espuma
Tomar 1 ml de cada una de las fracciones (polar y apolar) en tubos de ensayo separados,
aadir 9 ml de agua a cada uno. Utilizar 1 ml de esta solucin en un tubo de ensayo
pequeo, agitar vigorosamente por 30 segundos y dejar en reposo durante 15 minutos.
La espuma sobrenadante indica la presencia de saponinas en la muestra.
La proporcin de saponinas se mide de acuerdo a la altura de la espuma sobrenadante
as:
Altura de menos de 5 mm = no se detectan saponinas
Altura de 5-9 mm = contenido bajo
Altura de 10-14 mm = contenido moderado
Altura mayor de 15 mm = contenido alto
B) Hemlisis
Agregar 1 ml del extracto a probar a 5 ml de solucin de solucin normalizada de glbulos rojos.
Catecol
protectora que permite que los tejidos subyacentes se regeneren. Pueden producir
trastornos al ser eliminados va renal.
Como uso interno se emplean como antidiarrico, disminuye el peristaltismo,
vasoconstrictor a nivel de pequeos vasos (varices, flebitis, hemorroides),
antimicrobiano, antivrico y antifngico, hipoglucemiante. Industrialmente se han
utilizado sus propiedades para curtir pieles, al eliminar el agua de las fibras musculares.
En el mundo vegetal actan como protectores de ellas contra las heridas que sufren,
protegindolas as de los ataques exteriores, bien porque resultan txicos para los
microorganismos o herbvoros, bien porque no son digeribles para estos ltimos.
Alos taninos se les suele clasificar como HIDROLIZABLES o Glicos y taninos
CONDENSADOS o catquicos.
7.3.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.3.1.1 Ensayos a la gota
A) Prueba del cloruro frrico
Depositar 0.5 ml de la fraccin hidroalcohlica en 5 tubos de ensayo pequeos; aadir
en cada caso dos gotas de agua destilada en todos los tubos con lo que se logra un color
amarillo.
Dejar el tubo 1 como testigo, y adicionar gotas de cloruro frrico a los siguientes tubos
as: una gota al tubo 2, dos en el tercero y as sucesivamente hasta llegar al quinto tubo.
La caracterizacin de taninos se hace de acuerdo a la coloracin observada, as:
No hay cambio significativo de color = no se detecta presencia de taninos
Cambio en el color a azul, negro azulado = taninos piroglicos (hidrosolubles)
Cambio de color a verde, azul verdoso, precipitado negro verdoso = taninos de tipo
catecol (condensados).
B) La prueba del cloruro frrico tambin puede realizarse as
Pesar 0.7 g de muestra y colocarlo en un matraz, agregar 200 ml de solucin de
ferricianuro de potasio 0.004 M y agitar fuertemente.
Luego se adicionan 15 ml de solucin de cloruro frrico 0.008 M en cido clorhdrico
0.008 M. Observar los cambios de coloracin y evaluar los resultados as:
Verde claro: baja o nula cantidad de tanino
Verde oscuro: contenido medio de tanino
Azul: alto contenido de tanino
C) Prueba de la gelatina-sal
Utilizar dos tubos de ensayo, en cada uno colocar 0.5 ml del extracto y 1 ml de
solucin de gelatina-sal (solucin de gelatina al 1% en NaCl al 10%).
El otro tubo servir de testigo, adicionar en l 0.5 ml del reactivo de gelatina-sal.
De esta forma precipitan todos los taninos e incluso los pseudotaninos a altas
concentraciones.
Si hay formacin de precipitado agregar 0.5 ml de rea 10 M. A la solucin resultante
adicionar 2-3 gotas de cloruro frrico. Evaluar el resultado asi:
Interpretacin:
Antocianinas: rojo, azul o prpura (dependiendo del pH) y de la absorcin al UV
Flavonoles y flaconas: amarillo o marfil.
C) Tambin puede usarse
f. estacionaria: slica gel GF254
f. mvil: acetato de etilo-cido frmico-agua (8:1:1)
Revelador:
Rociar la placa con una mezcla preparada con 15 ml de solucin de
cido brico al 30% en agua y 5 ml de solucin de cido oxlico al
10% en agua destilada.
Llevar a la estufa 10 minutos y luego observar al UV
Se observan manchas fluorescentes.
Los terpenos forman una amplsima y muy diversa familia de sustancias naturales,
producidos de manera primaria por una gran variedad de plantas, particularmente las
conferas y algunos insectos. Cuando los terpenos son modificados qumicamente ya sea
por oxidacin o reacomodo del esqueleto carbonado los compuestos resultantes son
referidos generalmente como Terpenoides algunos autores usan invariablemente el
trmino terpeno para incluir a todos los terpenoides, unos y otros son los principales
constituyentes de los aceites esenciales de muchos tipos de plantas y flores.
Tradicionalmente se han considerado derivados del 2-metil-butadieno ms conocido
como isopreno. Esta llamada regla del isopreno ha permitido clasificarlos y
estudiarlos, pero realmente los terpenos no derivan del isopreno ya que ste nunca se ha
encontrado como producto natural. El verdadero precursor de los terpenos es el cido
mevalnico, el cual proviene del acetil coenzima A.
Desde el punto de vista farmacutico, los grupos de principios activos de naturaleza
terpnica ms interesantes son: monoterpenos y sesquiterpenos constituyentes de los
aceites esenciales, derivados de monoterpenos correspondiente a los iridoides, lactonas
sesquiterpnicas que forman parte de los principios amargos, algunos diterpenos que
poseen actividades farmacolgicas de aplicacin a la teraputica y por ltimo,
triterpenos y esteroides entre los que se encuentran las saponinas y los hetersidos
cardiotnicos.
7.7.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.7.1.1 Ensayos a la gota
A) Reaccin de Lieberman-Burchard
Colocar 1 ml del extracto en un crisol; evaporar casi hasta sequedad, dejar enfriar y
adicionar 3-4 gotas de cloroformo.
Repartir la mezcla en dos tubos de ensayo, secar al aire, en uno de los tubos adicionar
gotas de anhdrido actico seguido por una gota de cido sulfrico concentrado, el otro
se deja de testigo.
Los cambios de color interpretarlos as:
Azul o verde = esteroides
Rojo, rosado o violeta = triterpenos
Amarillo plido = esteroides o triterpenos saturados
B) Reaccin de Salkowski
0.5 ml del extracto se mezcla con 1 ml de cloroformo, dejar deslizar por la paredes del
tubo con sumo cuidado 1 ml de cido sulfrico del 85%.
Interpretacin: Formacin de colores amarillo o rojo se considera positivo.
Si en la interfase se forma color azul, verde o violado caracterstica de los carotenoides,
sirve para distinguirlos de otros pigmentos naturales, como las antocianinas
C) Prueba de Tortelli-Jaffe
0.5 ml de la muestra se mezcla 0.2 ml de cido actico y 2 gotas de cloroformo. Sobre
esta mezcla se deja caer con cuidado 0.1 ml de una solucin al 2% de bromo en
cloroformo.
Si hay esteroides con un doble enlace terciarios efectivo o potencial, se forma una zona
verde en la interfase.
7.7.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
A) BIDIMENSIONAL
Este grupo de compuestos son derivados del ncleo esteroideo general o ncleo
ciclopentanoperhidrofenantreno al cual pertenecen el colesterol y los cidos biliares. las
hormonas sexuales, las hormonas corticoadrenales y la vitamina D.
Una caracterstica que los diferencia es que los glicsidos cardacos aparte de tener una
o ms molculas de azcar en el carbono 3 del ncleo esteroideo contienen un anillo
lactnico incrustado al cabono 17.
Los glicsidos cardiacos son sustancias obtenidas de Digitalis, Strophantus y otras
plantas, y que se emplean en la insuficiencia cardaca congestiva. Aumentan la fuerza
de la contraccin cardaca sin acrecentar significativamente otros parmetros, pero son
muy txicos en altas dosis. Su mecanismo de accin generalmente implica la inhibicin
de la bomba de sodio y potasio, siendo
7.10.1 Reconocimiento en el laboratorio
7.10.1.1 Ensayos a la gota
A 10 ml del extracto etanlico de la planta adicionar 5 ml de solucin de acetato de
plomo al 10% y 4 ml de agua destilada.
Calentar la mezcla a bao Mara durante 10 min. Filtrar.
Agitar el filtrado con 20 ml de CHCl3, separar la capa clorofrmica en 6 tubos
de ensayo, llevar a sequedad.
Adicionar:
Al primer tubo 1 ml de reactivo de Baljet [mezclar volmenes iguales de: snl A
(solucin etanlica de cido pcrico al 1%) y sln B (NaOH al 10% en agua).
Coloracin roja, naranja-rojiza o violeta con cardenlidos.
Al segundo 1 ml de reactivo de Kedde (Volmenes iguales de Sln A: cido 3,5dinitrobenzoico al 2% en metanol y Sln. B: KOH al 5.7% en agua).
Coloracin rosa o azul-violeta al visible indican cardenlidos, los bufadienlidos no
reaccionan. El color se atena en pocos minutos.
Al tercero: 1 ml de solucin al 1% de m-dinitrobenceno en etanol al 50% y
enseguida se aaden 2-3 gotas de solucin de NaOH al 20% en agua (reactivo
de Raymond-Marthoud) para identificar el anillo lactnico de los cardenlidos
Coloraciones violeta o azul.
En el cuarto realizar la reaccin de Keller-Kiliani. (5 ml de cido actico glacial,
1 gota de cloruro frrico al 5% en metanol y 1-2 gotas de cido sulfrico concentrado)
En uno o dos minutos se observan coloraciones intensas.
En el quinto realizar la reaccin de Liebermann-Burchard (1 mg de
muestra/pocas gotas de HOAc + 3 ml Ac2O/H2SO4 (50:1)).
Coloracin verde, azul verdoso, va rojo al azul identifica el ncleo esferoidal
En el sexto realizar la reaccin de Salkowaki para identificar el ncleo
esferoidal (0.5 ml del extracto se mezcla con 1 ml de cloroformo, dejar deslizar
por la paredes del tubo con sumo cuidado 1 ml de cido sulfrico del 85%).
Coloracin amarilla-rojo sangre se toma como positivo.
7.10.1.2 Cromatografa de capa delgada (TLC)
f. estacionaria: Slica gel 60F254
f. mvil:
a) Acetato de etilo:metanol:agua. (100:13.5:10).
b) Cloroformo:metanol:agua (65:35:10). fase inferior.
Revelador:
a) especficas para anillo -lactona. (cardenlidos).
- reactivo de Kedde.
- reactivo de Baljet (solucin alcalina de cido pcrico).
- reactivo de Raymond (soluciones alcalinas de m-dinitrobenceno).
b) mtodos de deteccin general.
- reactivo tricloruro de antimonio.
Se asperjan los cromatofolios con el reactivo. Se calienta a 100 C por 6 minutos, luego
se observa inmediatamente al UV-365nm.
Interpretacin: Se distinguen diferentes colores segn la estructura.
7.11 Determinacin de la presencia de CUMARINAS
Cumarina
Aflatoxina B1