GUIA PREVIA

Aplicaciones
Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los
campos de la ciencia donde la estructura y la organizacin
microscpica es importante, incorporndose con xito a
investigaciones dentro del rea de la Qumica (en el estudio
de cristales), la Fsica (en la investigacin de las propiedades
fsicas de los materiales), la Geologa (en el anlisis de la
composicin mineralgica de algunas rocas) y en el campo
de la Biologa (en el estudio de estructuras microscpicas de
la materia viva.
Se utiliza en laboratorios de histologa y anatoma patolgica,
donde la microscopa permite determinadas aplicaciones
diagnsticas como el diagnstico de certeza del cncer,
numerosas

estructuras

cristalinas,

pigmentos,

lpidos,

protenas, depsitos seos, depsitos de amiloide entre otras.

1. TIPOS DE MICROSCOPA:
1.1 Microscopa ptica normal (de campo brillante
coloreado): El material a
observar se colorea con colorantes especficos que
aumentan el contraste y revelan
detalles que no aprecian de otra manera.

1.1.1 Microscopa de campo brillante: el material se

observa sin coloracin. La luz
pasa directamente y se aprecian detalles que estn
naturalmente coloreados.
El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy
intensa en forma de un cono
hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de
visin del objetivo se encuentra en
la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que
se refleja en el objeto. Por ello las
porciones claras del espcimen aparecen como un
fondo oscuro y los objetos
minsculos que se estn analizando aparecen como
una luz brillante sobre el fondo. Esta
forma de iluminacin se utiliza para analizar
elementos biolgicos transparentes y sin
manchas, invisibles con iluminacin normal.
1.1.2 Microscopa en contraste de fase: se usa
principalmente para aumentar el
contraste entre las partes claras y oscuras de las
clulas sin colorear. Es ideal para
especimenes delgados, o clulas aisladas. El
microscopio de fase ilumina el espcimen
con un cono hueco de luz, como en el microscopio en
campo oscuro. Sin embargo en el
microscopio de fase el cono de luz es ms estrecho y
entra en el campo de visin del

objetivo, que contiene un dispositivo en forma de

anillo que reduce la intensidad de la
luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la
longitud de onda. Este tipo de
iluminacin provoca variaciones minsculas en el
ndice de refraccin de un espcimen
transparente, hacindolo visible. Este tipo de
microscopio es muy til a la hora de
examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con
frecuencia en biologa y medicina
1.1.3 Nomarski, microscopa diferencial de contraste
de interferencia (DIC). Utiliza
dos rayos de luz polarizada y las imgenes
combinadas aparecen como si la clula
estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue
diseado para observar relieves de
especimenes muy difciles de manejar, es muy
utilizado en los tratamientos de
fertilizacin in-vitro actuales. DIC se usa cuando el
espcimen es muy grueso para usar
contraste de fases
11.2 Microscopa de fluorescencia: una sustancia
natural en las clulas o un colorante
fluorescente aplicado al corte es estimulado por un
haz de luz, emitiendo parte1.2 Microscopa de
fluorescencia: una sustancia natural en las clulas o
un colorante

fluorescente aplicado al corte es estimulado por un

haz de luz, emitiendo parte de la
energa absorbida como rayas luminosas: esto se
conoce como fluorescencia. La luz
fluorescente de mayor longitud de onda se observa
como si viniera directamente del
colorante.
Microscopio de fluorescencia:
Microscopio que incorpora una lmpara especial, que
acta emitiendo una luz
excitadora de los fluorocromos, con los que se tien
las muestras a observar, y que
posee adems un filtro especial, que permite el paso
de la luz emitida por el
fluorocromo.
1.3 Un microscopio confocal es un microscopio capaz
de obtener imgenes
tridimensionales de la clula. Se basa en un principio
similar al de un microscopio de
fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas
confocales (uno antes de la muestra y otro
despus) capaces de enfocar la iluminacin en un
nico punto de la muestra. Se utiliza
un lser como fuente luminosa, y con l se va
barriendo la muestra por todo su
volumen, plano a plano, creando muchas imgenes
bidimensionales que un ordenador

interpreta, generando finalmente una imagen

tridimensional del objeto.
Para observar preparaciones con este microscopio es
necesario teirlas con sustancias
fluorescentes o marcarlas con sustancias conjugadas
con fluorocromos, como los
anticuerpos.
Un microscopio compuesto tiene ms de una lente objetiva.
Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para
examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan
finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o
ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a
simple vista

El sistema mecnico est constituido por una palanca

que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos
a observar.

El sistema de iluminacin comprende un conjunto de

instrumentos, dispuestos de tal manera que producen las
ranuras de luz.

El sistema ptico comprende las partes del microscopio

que permiten un aumento de los objetos que se pretenden
observar mediante filtros llamados "de antigel
subsecuente".

El pie y soporte: contiene la base sobre la que se

apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o
bien es rectangular.

La columna o brazo: llamada tambin asa, es una

pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior
mediante unabisagra, permitiendo la inclinacin del tubo
para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan
los espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por
el extremo inferior se adapta al pie.
El caon
tiene forma cilndrica . El caon se encuentra en la
parte superior de la columna, enfoca el objeto
mediante un sistema de cremalleras, las cuales
permiten que el tubo se mueva mediante los
tornillos.
El tornillo macromtrico o macroscpico: girando
este tornillo, asciende o desciende el tubo del
microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a
un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos
permiten el enfoque rpido de la preparacin.
El tornillo micromtrico o microscpico: mediante el
ajuste fino con movimiento casi imperceptible que
produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el
enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva
acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001
mm, que se utiliza para precisar sus movimientos y
puede medir el espesor de los objetos.
La platina: es una pieza metlica plana en la que se
coloca el objeto que se va a observar. Presenta un
orificio, en el eje ptico del tubo, que permite el paso de
los rayos luminosos a la preparacin. La platina puede
ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos
puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales
puede centrarse o producir movimientos circulares.

 Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para

sujetar el objeto. Se encuentran en la platina.
El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios
en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revlver,
los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en
posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido de un
pin que lo fija.

Sistema ptico[editar]
Es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes
mediante el conjunto de lentes que lo componen. Est
formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta
una imagen de la muestra que el ocular luego ampla.
El ocular: se encuentra situado en la parte superior del
tubo. Su nombre se debe a la cercana de la pieza con
el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la
imagen formada por el objetivo. Los oculares son
intercambiables y sus poderes de aumento van desde
5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias
mayores a 20X y otros que poseen
una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad
de medir el tamao del objeto observado.
Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria
denominada revlver y producen el aumento de las
imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se
hallan cerca de la preparacin que se examina. Los

objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos:

objetivos secos y objetivos de inmersin.

Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de

colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin.
En la cara externa llevan una serie de ndices que
indican el aumento que producen, la abertura
numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un
objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17,
significa que el objetivo es planacromtico, su
aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada
para una longitud de tubo de 160 mm. El nmero de
objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a
que se destina. Los aumentos de los objetivos secos
ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X,
40X y 60X.

El objetivo de inmersin est compuesto por un

complicado sistema de lentes. Para observar a travs
de este objetivo es necesario colocar una gota de
aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de
manera que la lente frontal entre en contacto con el
aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son
de 100X y se distingue por uno o dos crculos o
anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Sistema de iluminacin[editar]
Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o
artificial de tal manera que ilumine la preparacin u objeto
que se va a observar en el microscopio de la manera
adecuada. Comprende los siguientes elementos:
Fuente de iluminacin: se trata clsicamente de una
lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en
versiones ms modernas con leds. Por delante de ella

se sita un condensador (una lente convergente) e,

idealmente, un diafragma de campo, que permite
controlar el dimetro de la parte de la preparacin que
queda iluminada, para evitar que exceda el campo de
observacin produciendo luces parsitas.
El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est
construida dentro del microscopio y ya alineada con el
sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios
modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra
plana. Goza de movimientos en todas las direcciones.
La cara cncava se emplea de preferencia con
iluminacin artificial, y la plana, para natural (luz solar).
Los modelos ms modernos no poseen espejos sino
una lmpara que cumple la misma funcin que el
espejo.
Condensador: est formado por un sistema de lentes,
cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre
el plano de la preparacin, formando un cono de luz con
el mismo ngulo que el del campo del objetivo. El
condensador se sita debajo de la platina y su lente
superior es generalmente planoconvexa, quedando la
cara superior plana en contacto con la preparacin
cuando se usan objetivos de gran abertura (los de
mayor ampliacin); existen condensadores de
inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio
entre esa lente superior y la preparacin. La abertura
numrica mxima del condensador debe ser al menos
igual que la del objetivo empleado, o no se lograr
aprovechar todo su poder separador. El condensador
puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de
cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso
con objetivos de poca potencia.

 Diafragma: el condensador est provisto de un

diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la
del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular,
para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo
ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la
resolucin del sistema ptico.
ENFOQUE DEL MICROSCOPIO

Los pasos a seguir para la perfecta utilizacin del microscopio

son las siguientes:
1.- Enchufar el microscopio al transformador y ste a la red
(NUNCA
ENCHUFAR
EL
MICROSCOPIO
DIRCTAMENTE A LA RED. SIEMPRE QUE NO SE EST
MIRANDO POR EL MICROSCOPIO HAY QUE APAGAR
LA LUZ).
2.- Colocar la preparacin sobre la platina de forma que la
estructura a observar quede en el orificio central de la platina.
3.- Poner el objetivo de menor aumento cuyo amplio campo
visual facilita el hallazgo de estructuras importantes.
4.- Subir la pletina accionando el tornillo macromtrico y
mirando la preparacin desde fuera hasta alcanzar el tope
superior. En ningn caso tocar la preparacin con los objetivos.
5.- Mirando por los oculares, bajar lentamente la platina
con el tornillo macromtrico hasta conseguir ver el objeto lo
ms ntido posible.
6.- Ajustar el enfoque con el tornillo micromtrico hasta
verlo claramente.
7.- Para observar la preparacin a mayores aumentos
cambiar de objetivo con un simple giro del revolver (SIN
MOVER EN NINGN CASO EL TORNILLO MACRO). Las
pequeas varisaciones que observeis en el enfoque se producen
al cambiar de objetivo y se corrigen con el micro.

8.- Para observar otros campos, desplazar la preparacin

moviendo los tornillos de la platina.

Para cambiar la preparacin:

- Bajar la platina.
Colocar el objetivo de menor aumento
Quitar la preparacin y colocar la siguiente

Para desconectar el microscopio, adems de los tres pasos

anteriores:

Apagar y desenchufar el transformador de la red

Tapar el microscopio con su funda
ILUMINACION DE KOHLER
La iluminacin Khler elimina la iluminacin dispareja en el
campo de observacin para que todas las partes de la fuente
de luz contribuyan a la iluminacin del espcimen. Existen
dos tipos de iluminacin Khler, un mtodo en el cual la luz es
transmitida a travs del espcimen (transmitida) y otro
mtodo cuando la luz es reflejada desde el espcimen
(incidente). La iluminacin Khler transmitida es usada para
especimenes transparentes o semitransparentes, mientras
que la iluminacin Khler incidente es til para objetivos como
el metal, los cuales no transmiten luz.
La iluminacin Khler requiere un lente colector en o cercano
a la caseta lmpara que pueda ser ajustado para enfocar la
imagen del filamento de la lmpara al frente del plano focal
del condensador donde se posiciona el diafragma de
apertura.
1.

1
Encuentra el aumento o el nmero impreso en el lente ocular
del microscopio compuesto. El lente ocular es la pieza por

dnde miras. Normalmente, el lente tiene una magnificacin

de 10x.
2.

2
Busca el aumento impreso en el lente objetivo del microscopio
que usas. El lente del objetivo est justo por encima de la
diapositiva o de la muestra que observas con el microscopio.
Muchos microscopios tienen mltiples lentes objetivos que
giran, proporcionando diferentes aumentos. Los aumentos
objetivos ms comunes son lentes de 4x, 10x, 40x y 100x.

3.

3
Multiplica el aumento del lente ocular por el aumento del
lente objetivo para determinar el aumento total. Si el lente
ocular es de 10x y el lente del objetivo es 10x, por ejemplo,
entonces el aumento total es de 100x. La ecuacin es:
magnificacin ocular x aumento del objetivo = aumento total.
El poder de resolucin est determinado en parte por la
longitud de onda de la radiacin empleada para iluminar el
espcimen y es inversamente proporcional a la misma, es
decir, a menor longitud de onda, mayor poder de resolucin.
El haz de electrones puede tener longitudes de onda
variables, las cuales influyen en el lmite de resolucin que a
su vez depender del voltaje empleado para acelerar los
electrones

Distancia frontal: distancia entre el objeto

observado y la lente del objetivo utilizado, cuando se
encuentra bien enfocada la muestra. Es inversamente
proporcional al aumento.

 Poder de resolucin (PR): capacidad de los lentes

de mostrar separados con nitidez dos puntos. Si el PR
es mayor quiere decir que la distancia que separa
estos dos puntos es menor. Por lo tanto da una
imagen ms detallada.

Objetivos secos y objetivos de inmersin:

Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio
interpuesto entre el cubre-objeto de la lmina histolgica y la
lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio
interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy
diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por
el contrario, en los objetivos denominados de inmersin el
medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del
objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms
prximo al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada
(n=1,33) o mejor an aceite de cedro, que posee un ndice de
refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la
disminucin o eliminacin de la refraccin de los rayos
luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la
luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que en
los objetivos secos, est disminuida. El empleo de la
inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y
permite mayor resolucin gracias a la captura de una mayor
cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-5)
y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.
CUIDADOS DEL MICROSCOPIO
1. Para transportar el microscopio deben utilizarse siempre
las dos manos, sujetndolo por el brazo con una mano y por
el pie con la palma de la otra.

2. Una vez colocado el microscopio en su sitio, no debe

moverse hasta que finalice la prctica. Cuando se vaya a
cambiar de observador se debe mover l y no el microscopio.
3. Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del
microscopio.
4. Nunca poner los dedos en las lentes del ocular ni del
objetivo. Si se ensucian dichas lentes se limpiarn con un
pao suave de algodn, sin utilizar ningn disolvente.
5. No sacar de su sitio el ocular ni los objetivos, a no ser que
vayan a ser sustituidos, en cuyo caso la operacin debe
realizarse lo ms rpidamente posible, para evitar la entrada
de polvo.
6. Asegurarse de que el portaobjetos est bien seco cuando va
a ser colocado sobre la platina.
7. Al enfocar, sobre todo con los objetivos de mayor
aumento, hay que evitar que el extremo del objetivo choque
con la preparacin. Para ello acercaremos el objetivo a la
preparacin mirando lateralmente y luego, mirando ya a
travs del ocular, enfocamos alejando el objetivo.