G.P. Microbiologia 4

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA

PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
IV CICLO
GUIA DE PRCTICA
DE
MICROBIOLOGIA MDICA
UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MDICA
INDICE
Pgina
Recomendaciones generales
3
Microscopia: estudio y manejo del microscopio
4
Mtodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales
7
Coloracin diferencial de Gram
9
Coloracin diferencial de Ziehl-Neelsen
11
Coloracin especial: coloracin de Leishman y Vago
12
Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales
14
Siembra bacteriana. Medios de aislamiento
17
Metabolismo bacteriano
19
Pruebas de sensibilidad a los antibiticos (antibiograma)
27
Reaccin antgeno anticuerpo: Aglutinacin
29
Fagocitosis
31
Reaccin de Precipitacin
32
Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA
33
Preparacin de Antgenos bacterianos
35
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus
38
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Gnero Streptococcus
40
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram negativos: Genero Neisseria
42
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus
44
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: genero Listeria
46
Estudio microbiolgico de la flora normal de la Secrecin Bucofarngea
48
Aislamiento e Identificacin de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50
Aislamiento e identificacin de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium
52
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona
54
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56
Serologa
Aislamiento e Identificacin de Enterobacterias: Coprocultivo
59
Estudio e Identificacin de Vibrio cholerae
62
Estudio e Identificacin del Genero Leptospira
64
Estudio e Identificacin de Bartonella
66
Estudio e Identificacin de Treponema Prueba de VDRL RPR
67
Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo
68
Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes.
71
Estudio e Identificacin de Hongos Ambientales
74
Estudio e Identificacin de Hongos Dermatofitos
78
Estudio de Hongos Levaduriformes: Observacin de cortes histopatolgicos
81
Estudio de Hongos Dimrficos: Observacin de cortes histopatolgicos
83
ANEXOS: SEMINARIOS:
Gentica Microbiana e Ingeniera Gentica
86
Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunacin
87
Antibiticos y quimioterpicos
88
Enfermedades de transmisin sexual. SIDA
89
Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla
90

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGA MDICA
1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas,
mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores.
2. No se podr ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prcticas, para evitar
contaminaciones
3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que
se tian la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen.
9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones
contrarias Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C
11. Al finalizar el trabajo:
Limpiar con algodn los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden lminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabn.
12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.
El Profesor Responsable del Curso

SIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
PRCTICA N 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I.
OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio
compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjetos
Lminas coloreadas
Suero fisiolgico
Pipeta Pasteur
Plumn indeleble
Papel lente
Tela de felpa(25 cm)
Fibra de pelo y lana
III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:
PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera
Tornillos macro y micromtrico
Revolver
Platina
Condensador
Brazo y Pie
Charnela
PARTE OPTICA
Ocular
Objetivos
Espejo
Lentes de condensador
Diafragma
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1.
2.
3.
4.
Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma.
Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera
Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los
objetivos de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 2
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES

Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:
A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados
colorantes cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de
metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina
(cido).
En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos como el azul de
metileno, cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los
colorantes derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:
A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul
de lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloracin de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los
microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana
Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
7
Colorante Azul de lactofenol

Mechero de Bunsen
Varillas para coloracin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersin
COLORACIN AZUL DE METILENO:
1.
2.
3.
4.
Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 5 minutos
Lavar con agua y dejar secar
Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1.
2.
3.
4.
Colocar una gota de tinta china sobre la lmina portaobjetos

Agregar una gota de la mezcla bacteriana
Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto
Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:

1
2
3
4
Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos

Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
Cubrir con una laminilla cubreobjeto
Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfologa de los microorganismos observados

B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante
es llamado colorante de contraste. Entre los ms usados tenemos la coloracin de Gram y la de
Ziehl Neelsen o tambin llamado cidoalcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, segn la estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no estn entrelazadas; en las Gram positivas la
mayora presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL
Muestra con mezcla de bacterias
Solucin fisiolgica al 0.85%
Lminas portaobjetos
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)

Bicarbonato de sodio
Lugol (mordiente)
Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina bsica (colorante de contraste)
Mechero de Bunsen
Microscopio de luz con objetivo de inmersin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del
frotis.
2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para
obtener una preparacin en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la
llama dbil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solucin
de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta
que no arrastre colorante) mximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.
10

PRACTICA N 3
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido
de lpidos, como el gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cidoalcohol-resistente. Al teirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina bsica
fenicada) que es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a
penetrar en la clula y en esta forma resistir a la decoloracin.
MATERIAL
Lminas con frotices de bacilo tuberculoso
Set de coloracin Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)

Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste)

Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento
por tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
7. Secar y observar con lente de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se
tien de color azul.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
11

PRACTICA N 4
COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con
los colorantes de anilina como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de
microorganismos presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de
microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES
Frotis de sangre con Bartonella
Solucin de colorante Leishman
Agua destilada tamponada

Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
Lavar con agua de cao y dejar secar
Observar con objetivo de inmersin
Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIN DE VAGO
Es utilizado para la coloracin de grmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el
mtodo de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.
12
MATERIALES
Lmina portaobjetos
Palito mondadientes
Set de coloracin de Vago:

Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana
Asa de siembra en aro
Microscopio con lentes de 100X
Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1. En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro
Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando
parte de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
13

PRACTICA N 5
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y
DIFERENCIALES,
INTRODUCCION
Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios
especiales con una determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Segn su utilizacin pueden ser:
simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales.
MATERIALES
Probetas de 100 ml.
Balones de 250 ml.
Tiras de Papel indicador de Ph
Frasco con solucin NaOH (N/10)

Frasco con solucin HCl (N/10)
Pinzas rectas
Bagetas de vidrio
Caldo nutritivo
Extracto de carne
Peptona
Dextrosa
Cloruro de sodio
Agua destilada
pH
14
6.0 gr. de Agar SS deshidratado.
6.5 gr. de Agar TSI.
Tubos de 16x150 mm
Tubos de 13x100 mm
Placas Petri
Frascos estriles
Agua destilada
Tubo con sangre citratada
Caldo peptonado
Peptona
2.0 g
Cloruro de sodio
1.0 g
5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.
Trpodes con malla de Asbesto
Agar simple o Agar nutritivo

Extracto de carne
0.3 g
Peptona
1.0 g
Dextrosa
0.5 g
Cloruro de sodio
0.5 g
Agua destilada
100 ml
Agar
1.5 g
pH
7.0 - 7.4
0.3 g
1.0 g
0.5 g
0.5 g
100 Ml
7.0 - 7.4
Goteros de vidrio
2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons
2.1 gr. de Agar Urea.
1.7 gr. de Caldo MR VP
3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.
PREPARACION
I.
MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter
al calor hasta su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es
cido agregar gota a gota la solucin de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota
solucin de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121C por
15 Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37C por 24 horas. Luego dejar en
refrigeracin hasta su utilizacin.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia,
luego agregar los dems ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH
HCl. Luego envasar y esterilizar a 121C por 15 Minutos y controlar la esterilidad por
incubacin a 37C por 24 horas. Dejar luego en refrigeracin hasta su utilizacin.
II.
MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar
enfriar hasta una temperatura de 45C y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.
Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en
Placas Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en
refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de
80C hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar
control de esterilidad y dejarlo despus en refrigeracin.
III.
MEDIOS SELECTIVOS
3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta
su completa disolucin. Autoclavar a 121 C por 15 Minutos y repartir en placas estriles.
4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al
calor hasta su completa disolucin. Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.
IV.
MEDIOS DIFERENCIALES
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada,
hervir hasta su completa disolucin. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en
autoclave a 121 C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado.
El medio al final tendr un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color
verde.
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin
y autoclavar. Despus adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin;
15
mezclar homogneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio

tendr un color amarillo.
4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de
13x100mm y autoclavar a 121 C por 15 Min.
5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa
disolucin y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121 C por 15 min., y dejar
enfriar los tubos en plano inclinado.
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
16
A.
Los medios de cultivo preparados en cada mesa.
B.
El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C.
Materiales que usaron para la preparacin.

PRACTICA N 6
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un
incremento marcado del nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a
las 24 horas y otras necesitan un perodo ms prolongado para alcanzar su mximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan
cultivos y el resultado de la multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el
cual se pone en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen
varias tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por estra, por dispersinagotamiento, por inoculacin y por puntura.
Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:
FORMA
ELEVACIN
BORDE
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
: Circular, elptica, puntiforme y filamentosa.

: Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
: Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
: Lisa, rugosa, granulada.
: Dimetro en milmetros.
: Cremosa, membranosa y mucoide.
: Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES
Tubos con suero fisiolgico estril
Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
Tubos de 16x150 con Agar nutritivo
Placas con Agar nutritivo
Placas con Agar Mac Conkey
Placas con Agar hipertnico de Chapman
Tubos con Agar Sabouraud
Tubos de16x150 con medio hipertnico de

Chapman
Torundas estriles
Asas de siembra en aro y punta
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.
17
Siembra por dispersin-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la

superficie del medio de cultivo slido que se encuentra en una placa Petri, girar sta unos 45 y
continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-slido, con
ayuda del Asa de siembra en punta, introducindola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculacin: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e
introducirlo hasta el fondo del tubo con medio lquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
B) LECTURA:
Con la ayuda del profesor:
1. El alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de
cultivos sembrados.
2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
PROTOCOLO
METODOS DE SIEMBRA
DESCRIPCION DE LA
SIEMBRA
MEDIO DE CULTIVO
USADO
OBSERVACION DE
COLONIAS
MEDIO DE CULTIVO
USADO
ESTRIA
DISPERSION
AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIN
CARACTERISTICA
DE LA COLONIA
FORMA
ELEVACIN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
18

PRACTICA N 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las
caractersticas de las colonias y morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin
embargo, la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a
nivel de gnero y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que son nicos
para cada especie y sirvan como marcadores de identificacin.
En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la
colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos
e indicadores qumicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos
especficos.
I.
ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un

medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxgeno, un substrato orgnico sirve como el aceptor
final de hidrgeno (electrones). Este trmino de fermentacin se refiere a la utilizacin de
hidratos de carbono como la glucosa los cuales les servirn como fuente de energa y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de
cidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por
el cambio de color en el medio de cultivo de fermentacin (pH- indicador); la presencia de gas
+
(CO2 e H ) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio slido.
A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseado para la diferenciacin de Bacilos Gram negativos, basndose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrgeno
(H2S).
El medio contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10
respectivamente. Para detectar los productos cidos generados se emplea un indicador de pH que
es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes
en este medio pueden ser fundamentalmente tres:
1. Fermentacin de glucosa nicamente.
2. Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.
3. No fermentacin de carbohidratos.
19
Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia
arriba del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado.
Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y
estre la superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.
1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que
se encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la
cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos
generados por la utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo,
por no estar en contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido.
3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo
que el tubo permanece amarillo.
4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin
oxidativa de peptonas, por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza.
+
5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H ), grietas o desplazamiento del medio.
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

2.
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica
valiosa para identificar especies bacterianas que producen cidos fuertes (lctico, actico,
frmico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos
frecuentemente producen suficiente cido despus de una incubacin prolongada, como para
mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto cido lmite del indicador rojo de metilo),
superando el sistema amortiguador del pH del medio.
20
3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El cido pirvico, un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la
glucosa, es metabolizado por algunos microorgansmos produciendo el acetil- metilcarbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la va 2,3- butilenglicol.
La prueba se basa en la conversin del acetil- metil- carbinol en diacetil a travs de la accin
del KOH y Oxgeno atmosfrico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la
accin cataltica del Alfa naftol y Creatinina.
MATERIALES
Cepa bacteriana MR positivo y negativo
Cepa bacteriana VP positivo y negativo
Reactivo Rojo de metilo
Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)
Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1. Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y
negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo
nombre, cuyo rango de viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva
se manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y
0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15
minutos. Es importante aadir los reactivos en el orden especfico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es
observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los
cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretacin falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
II.
ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el
aminocido triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, cido pirvico y
amoniaco(NH3). El indol puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la
aparicin de un color rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de
agregar una solucin que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.
21
MATERIALES
Cepa indol positivo y negativo.

Medio lquido peptonado y/o Medio SIM
Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido).

Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo,
pocos segundos despus de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de
indol y constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el
medio, pero que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecer sin cambio
alguno, siendo esta una prueba negativa.
III.
UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia
Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energa por va distinta de la
fermentacin de los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como nica fuente de
carbono para su metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee
para determinar esta caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que constituye
uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.
PRINCIPIO
La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formacin de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de
Simmons)incluye citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de
amonio como nica fuente de nitrgeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de
amonio, con produccin de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en
hidrxido de amonio(NH4OH), detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de
bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES
Cepa control citrato positivo y negativo.
Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo
la cepa citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas.
22
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio
inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV.
HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

Prueba importante para la identificacin de especies bacterianas que poseen la enzima
ureasa que hidroliza la urea, segn el siguiente esquema:
O
NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------Ureasa
CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3
El amoniaco reacciona en la solucin para dar carbonato de amonio, producindose una

alcalinizacin y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES
Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

Medio Agar urea segn Christensen
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular
en el fondo.
2. Incubar durante 18- 24 horas a 37C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el
medio. Prueba negativa: El medio permanece del color original
V.
PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias.
El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo de los carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente
reaccin:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa
negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).
23
MATERIALES
Cepas Control: S. aureus, Streptococcus Enterococcus
Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3%
Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los
eritrocitos poseen
actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados
falsos positivos.
PRUEBA EN LMINA
a) Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una
colonia bien aislada y transferir l inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya
que puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado
de la prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden
perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en
caso que ocurra inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la
accin. NO DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o
efervescencia son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas
diferentes a la catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas
durante 20- 30, stas no son catalasa positivas.
VI.
PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA

Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn
de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxgeno con formacin
de agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios
facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios estrictos.
En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil
o tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solucin, discos o tiras llamados
comnmente oxidasa).
MATERIAL
Cepa control: sembrada en Agar nutritivo
Reactivo de oxidasa
24
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los
discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un
intenso color azul oscuro.
AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)

Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminocido Lisina
descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de la glucosa, la produccin o no de
gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).
Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin. Se lee la reaccin producida en la

superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH
del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad
al color purpura. Por contener una pequea cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el
fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina
Interpretacin: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:

a) Fermentacin de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminocido slo fermenta
la glucosa: superficie purpura/fondo amarillo.
b) Descarboxilacin de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo
(superficie violeta/fondo amarillo).
c) Desaminacin de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.
d) Produccin de gas: ruptura del medio.
e) Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio.
VII.
PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias
txicas que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar
sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos, segn el tipo de lisis que producen pueden
clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 24 horas a 37 C
25
INTERPRETACIN
Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del
medio debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a
compuestos del tipo de la biliverdina
Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observndose una zona
clara alrededor de la colonia
VIII. PROTOCOLO
PRUEBAS
BIOQUMICAS
MEDIO DE
CULTIVO
TSI
(FermentacinH2S)
VP
VOGESPROSKAUER
MR
ROJO DE
METILO
INDOL
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO
OXIDASA
LIA
(Agar Lisina
Hierro)
HEMOLISINA
26
REACTIVO Y /O
INDICADOR
LECTURA

PRACTICA N 8
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibiticos y quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos:
Mtodo de dilucin
Mtodo de Difusin en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los
antibiticos.
2. Interpretar los resultados del mtodo utilizado.
3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la
concentracin inhibitoria mnima (CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el
crecimiento in vitro bacteriano.
Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en
medio agar al cual se inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24
horas, se puede observar la CIM como la dilucin ms alta en la que no existe crecimiento
macroscpico bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)
Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o
quimioterpicos ms adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en
sembrar la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego
discos de papel filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24
horas, se observan las zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de
antibitico presente en el disco difiere para los distintos frmacos.
MATERIALES
Placas de Agar Mller Hilton o Tripticase soya
27
Tubos con caldo nutritivo
Tubos con Agar semislido
Tubos con cultivo bacteriano
Asas de siembra
Torundas estriles
Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck).
Pinzas
Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4. Incubar a 37C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano
alrededor de los discos, incluyendo el dimetro del disco.
b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el
microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero
puede responder a dosis altas del antibitico.
La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad
de difusin en el Agar.
c) Anotar e interpretar los resultados.
Antimicrobiano
Amikacina
Amoxicilina +
clavulanico
Ampicilina
Cefalotina
Cefotaxima
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cefuroxina
Ciprofloxacin
Cloranfenicol
Gentamicina
Sulfazotrim
Tetraciclina
Tobramicina
Cdigo
Resistente
Gram negativo
AK-MK
14
AM
AMP
CFM
CTX
CAZ
CRO
RBA
CIP
C
GM-GE
SUT
T
NN
13
13
14
14
14
13
14
15
12
12
12
14
12
Sensible
Antimicrobiano
Cdigo
Resistente
Gram positivo
21
17
Ac.nalidixico
NA
18
17
18
23
20
17
18
21
18
15
18
19
15
Cefepima
Ciprofloxacin
Clindamicina
Cloranfeicol
Eritromicina
Gentamicina
Nitrofurantoina
Norfloxacin
Oxacilina
Penicilina
Rifampicina
Sulfazotrim
Tetraciclina
Vancomicina
FEP
CIP
CM-DA
C
E
GM-GE
FD
NOR
AO
P
RIF
SUT
T
V
14
15
14
12
13
12
14
12
10
19
16
12
14
9
Sensible
16
18
21
17
18
18
15
17
17
13
20
20
18
19
12
PROTOCOLO
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica
desarrollada.
28

PRACTICA N 9
REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN
La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin antgeno-anticuerpo en

el que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas
pueden ser bacterias, eritrocitos, partculas de ltex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas
en forma natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y
mezclarse con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac
observables a simple vista o con lentes de poco aumento.
AGLUTINACION BACTERIANA
Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana, uno
de los ms simples es la aglutinacin en lmina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla
del antgeno con el suero del paciente en una lmina. Esta tcnica ofrece un mtodo de muestreo
rpido para anlisis de rutina.
MATERIALES
Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas)
Antgeno bacteriano
Suero de paciente
Pipetas serolgicas de 0.2 ml
Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lmina
de vidrio excavada.
2. Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero de un mismo paciente.
3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.
4. Hacer rotar suavemente la lmina por espacio de 2 a 3 minutos.
RESULTADO
La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a
agruparse en la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.
PROTOCOLO:
Realizar una aglutinacin cualitativa y una cuantitativa
29
Aglutinacin cuantitativa
TUBOS
REACTIVOS
ANTISUERO
ANTIGENO
TITULO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
RESULTADO:
Ttulo del suero: .
Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en prctica
30

PRACTICA N 10
FAGOCITOSIS
La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el
englobamiento de partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se
incrementa cuando intervienen anticuerpos especficos o complementos. Entre las clulas
fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos (monocitos libres). A estas
sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la fagocitosis
se les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS IN VITRO
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras
pruebas serolgicas, pero en ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre
total (conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego,
muestras de estas mezclan se colorean.
El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la
sangre.
MATERIAL
Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o

Klebsiella
Tubos
de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sdica al
1%
Una jeringa de 5 ml con aguja N 20
Pipetas Pasteur con perilla de jebe
Lminas portaobjetos
Colorante Wright
Agua tamponada
Bao Mara a 37C
Centrfuga
Gradilla
Microscopio con objetivo de inmersin
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1. Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa.
2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.
3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.
4. Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.
6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de
cada tubo.
7. Realizar los frotices y colorear con Wright:

Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.
Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.
Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao.
Secar y observar con objetivo de inmersin.
RESULTADO
Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados.
31

PRACTICA N 11
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reaccin antgeno- anticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se
mezcla un antgeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona
de equivalencia y visibles por lo general macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin
pueden realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en
el suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se
deja gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antgeno,
procedindose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose la formacin
de un halo circular de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos
precipitantes, anticuerpos antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea
Agar semi-slido en portaobjetos, en el cual se efectan perforaciones, los cuales se llenan con
los elementos reaccionantes (antgeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubacin a
temperatura ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin.
MATERIALES
Suero positive
Antgeno
Lminas de vidrio con Agar noble al 1%
Placas Petri
Pipetas capilares
Lminas preparadas y coloreadas
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.
2. Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar.
3. Colocar las lminas en una cmara hmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitacin que se forman:
Identidad total
: Las bandas de precipitacin se unen.
Identidad parcial
: Se observa un espoln.
No identidad
: Las bandas se cruzan.
32
INMUNOELECTROFORESIS
Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar
componentes sricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los
antgenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su
movilidad en un campo elctrico, luego de una corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una
especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las protenas que han migrado. Luego de
incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.
PRACTICA N 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA

INTRODUCCION
En los ltimos aos se han desarrollado numerosos mtodos para la deteccin de antgenos
virales como de anticuerpos especficos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).
Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacin
o la prueba de Fijacin de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).
Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada
utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromognicos, las que producen una
reaccin de color. Estas pruebas se conocen como Anlisis de Inmunoabsorbencia Ligada a
Enzimas (enzime- linked immunosorbent assay) ELISA.
La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es
necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran nmero de muestras
simultneamente en forma rpida y automatizada.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Anticuerpo en fase slida
Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el
anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura.
Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de captura
Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms usadas son la
peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina.
Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antgeno.
Aadir el sustrato de la enzima.
Observar la presencia de color.
LECTURA
33
El desarrollo de
color puede observarse visualmente o de preferencia con un colormetro o un
espectrofotmetro.
A mayor cantidad de antgeno presente en la muestra, ms intenso ser el color observado.
ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA

(Ensayo Inmunoenzimtico para la deteccin de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia
humana HIV-1 grupo O y HIV-2)
PLACAS CON
GLICO-PROTEINA
DEL VHI
CONJUGADO
SUEROS
OBTENIDOS
DE PACIENTE
CONTROL +
SUSTRATO A
20 ul.
Cromognico
(Ag-Ac color
celeste)
INCUBAR
30 min a
37
(Peroxidasa con Ig
G Antihumana) 5ul
C/ pozo
Buffer Perxido
Hidrogeno 100
ul
INCUBAR
30 min
a 37
CONTROL +
Absorber
CONTROL -
CONTROL -
LAVAR
twin
salino
1/10
(5 veces)
LAVAR
twin
salino
1/10
SECAR
la placa
SECAR
la placa
CONTROL -
PACIENTE
PACIENTE
PACIENTE
(tomado de Wiener lab.)
34
SUSTRATO B
SOLUCION
DE
PARADA

MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 13
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales,
induce la formacin de anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro"
y en presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo especfico, dando
lugar a fenmenos perceptibles.
Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,
hemates, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y
generalmente progresivas con las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra
determinados procesos infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere
inmunidad adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en:
a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos,
etc., en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una
inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de
clasificacin, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las
Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.
I.
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS

FLAGELARES A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.
A.
MATERIAL
35
Cultivo bacteriano en medio slido y en desarrollo confluente

Cultivo bacteriano en medio lquido (caldo nutritivo)
Pipetas graduadas estriles de 5 cc.
Suero fisiolgico estril, repartido en frascos de 100 cc.
Embudos y gasa, estriles para filtrar
Acido fnico concentrado en tubos de 13x100 ml.
Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.
Pipetas de Pasteur, estriles
Escala de MacFarland (tubo N 3)
Pipetas graduadas de 1 ml.
Tubos vacos estriles de 16x150 ml.
B.
Algodn y Alcohol yodado

Agar nutritivo en placas y tubos
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos
bacterianos presentados en medio slido
2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar
3. Filtrar a travs de gasa estril
4. Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
5. Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana
de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una
concentracin de 0.5%.
Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la
ebullicin durante dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto.
6. Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro
tubo de suspensin bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una
concentracin del 0.5%
8
7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x10
grmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de
suero fisiolgico, gotas de cada uno de los antgenos concentrados hasta alcanzar una
turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland.
Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno
y apreciar la turbidez obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro
o determinndola con exactitud mediante un Espectrofotmetro.
El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:
Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1%
Otra de cido sulfrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N
10
0.1 cc.
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
H2SO4 1% 9.9 cc.
9.8
9.7
9.6
9.5
9.4
9.3
9.2
9.1
9.0
1.5 x
10 9
1.8 x
10 9
2.7
2.1 x 2.4 x x
10 9 10 9
9
10
3.0
x
9
10
Cl2Ba 1%
Bacterias
por cc.
36
3.0 x
10
6.0 x
10
9.0 x 1.2 x
10
10
La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al
homogenizarse da una turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de
bario empleado. A cada tubo corresponde una concentracin de grmenes determinada, de
acuerdo a lo sealado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con
la finalidad de controlar su esterilidad
Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.
D. INOCULACION
1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc.,
1.0cc., 1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das.
2. Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.
E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIN (DEMOSTRACION)
37

PRACTICA N 14
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM

POSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,
agrupados generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los
cultivos jvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde fornculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus,
S. epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena
S. aureus produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES
Placas Petri con Agar hipertnico de Chapman (MH) o Manitol salado
Placas Petri con Agar sangre (AS)
Tubos con Caldo plasma
Lminas portaobjetos
Set de colorantes para Gram
Asa de platino en aro
Reactivo Catalasa
PROCEDIMIENTO:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
38
Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar
sangre, por el mtodo de dispersin-agotamiento y con 24- 48 horas de incubacin a 37C
Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las
caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman
(tamao, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una
colonia de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de
la coagulasa)
Realizar la prueba de la Catalasa.
Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y
como indicador de pH el rojo de fenol
Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina
RESULTADOS:
1. Caractersticas macroscpicas de la muestra:
2. Resultado de la coloracin realizada
3. Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus
coagula el plasma.
4. Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin
de burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de
S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.
6. Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre
7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es
sensible y S. saprofiticus resistente.
PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la
colonia, forma que presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.
Complete el cuadro con lo realizado durante la prctica.
CEPAS
BACTERIANAS
TRABAJADAS
39
MH
o
Manitol
salado
AS
(Agar
sangre)
COAGULASA
CATALASA
GRAM
Caracterstica
morfolgica

PRACTICA N 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El gnero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de
Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej.
Enterococos); G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no
pertenece a ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos adoptando
formas de cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de
la flora normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite
diferenciar algunas especies en base a la hemlisis producida. La hemolisis tipo es incompleta,
los glbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente daados pero no lisados como sucede
en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un
derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El
grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus
pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxgeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten
la diferenciacin de las especies de Streptococcus.
MATERIAL
Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI
Placas con Agar sangre de carnero
Torunda estril y bajalengua
Tubos con Thioglicolato
Tubos con caldo Inulina
Discos de Bacitracina
Discos de Optochin
Solucin de Desoxicolato al 2%
Tubo con ClNa al 6.5%
Lminas portaobjetos
Set de colorantes de Gram- Kopeloff
Asas de Kolle, pinzas
Microscopio, aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce
turbidez o sedimento.
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el mtodo de dispersin y
agotamiento e incubado a 37C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lmina portaobjetos
y colorear por Gram.
40
3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el

disco de Optochin,
4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.
5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.
6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
7. Realizar la prueba de la catalasa
8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas
bacterias de lisarse en presencia de sales biliares
LECTURA
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolticos; S. viridans y S.
pneumoniae son alfa- hemolticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la
Bacitracina y S pneumoniae es sensible a la Optochina
3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de
Agar sangre e incubar a 35C durante 30 minutos. En una reaccin positiva se observa que
las colonias son lisadas (desaparecen)
4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.
5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el
efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y
cido tioglicolato que acta como agente reductor disminuyendo aun ms el potencial de
oxido-reduccin del medio.
6. En la solucin de ClNa al 6.5% , observar que slo desarrolla Enterococo (Grupo D)
7. Todas las especies del gnero Estreptococo son catalasa negativa
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la prctica realizada
IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
SENSIBILIDAD CAMP
ORGANISMO
Hidrlisis
De
Hipu
Escu
rato
lina
Metabo
lismo
de la
Inulina
Desarro
llo en
NaCl
6.5%
Lisis por Bilis
Bacitra
cina
Opto
chin
GRUPO B
S. agalactiae
R*
P*
GRUPO C, F, G
- hemolticos
GRUPO Viridans
R*
N*
R
S
N
N
N
P
N
S. pneumoniae
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable
P*
- hemolticos
GRUPO A
S. pyogenes
41
Desoxi
colato Sodio

PRACTICA N 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los
lados adyacentes aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas
N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el
hombre. En muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien adicionalmente con el
colorante azul de metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate,
que le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una
tensin de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de
7.2 a 7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros
microorganismos morfolgicamente similares.
La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono:
Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el
laboratorio. Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recoleccin correcta de la muestra.
b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio.
c) Seleccin del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES
Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria
42
Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria
Lmina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram
Reactivo de Citocromo- oxidasa
Reactivo de catalasa
Lminas portaobjetos
Set de coloracin de Gram
Colorante de Azul de metileno
Microscopio
Asas de siembra en aro y punta
Solucin de alcohol yodado
Algodn y Xilol.
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares
de bordes continuos, blanco- grisceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si
corresponden a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeas de borde entero,
circulares, translcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el
cambio de color del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la
lmina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de
metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVOCOLONIASTAMAOGRAM
MUESTRA
AGAR THAYER MARTIN
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
OXIDASA
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
43
CATALASA
AZUL DE
METILENO

PRACTICA N 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM
POSITIVOS: GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y
que pueden sobrevivir en el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades
en el hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como
"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y
se encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta
como un bacilo rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las
colonias son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se
agrupan en largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.
MATERIALES
Placas Petri con Agar nutritivo
Placas Petri con Agar sangre
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con Agar semislido
Tubos con gelatina
Lminas para frotices
Set de coloracin de Hiss para cpsula
Set de coloracin de Wirtz Conklin para esporas
Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1)
2)
3)
4)
5)
44
Preparar un frotis
Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
Lavar con agua corriente y secar
Observar al microscopio con lente de inmersin
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)

1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos
(adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersin
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisceo, no hemoltica en las especies
patgenas y - hemolticas en las especies saprofitas.
En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semislido: Se observa un crecimiento en forma de pino
invertido En Gelatina: slo las especies saprofitas producen hidrlisis.
EN LAS LAMINAS COLOREADAS
Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el
centro del bacilo.
Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color prpura y la cpsula de color claro o incoloro.
Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
GENERO BACILLUS
ESPECIE PATGENA
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semislido
Hemolisis
Hidrlisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentacin salicina
Movilidad
45
ESPECIE SAPROFITA

PRACTICA N 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

LISTERIA
INTRODUCCION
El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y
presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V
de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo,
en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patgena es Listeria
monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los
ganglios linfticos, produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces,
desarrolla bien en medios de cultivo comunes.
MATERIAL
Tubos con Caldo nutritivo
Tubos con medios semislidos (Motilidad)
Placas Petri con Agar sangre
Placas Petri con Agar nutritivo
Tubos de 13x100 con:
Agar urea de Christensen
Citrato de Simmons
Caldo rojo de fenol con glucosa
Caldo rojo de fenol con sacarosa
Caldo rojo de fenol con lactosa
Caldo rojo de fenol con manita
Caldo rojo de fenol con salicina
Caldo esculina
Caldo:
MR-
VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.
2. Preparar una lmina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lmina y
laminilla.
46
3. Sembrar en el Tubo con medio semislido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los
diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.
LECTURA
FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.
LAMINAS EN FRESCO : Se observar la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos.
EN CALDO NUTRITIVO: Se observar una turbidez tenue y homognea.

EN AGAR SANGRE
47
: Se observar colonias pequeas con hemlisis tipo Beta.
EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar
MOVILIDAD
GLUCOSA
MR
HEMOLISINA
SACAROSA
VP
CATALASA
LACTOSA
OXIDASA
MANITA
UREA
SALICINA
CITRATO
ESCULINA

PRACTICA N 19
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION

BUCOFARINGEA
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de
forma continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento
dependen de la edad, nutricin y medio ambiente del individuo, por lo que es difcil determinar
la flora normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados;
ejemplo, los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su
tracto gastrointestinal, en los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos
presentan un gran desarrollo de levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)

Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertnico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estriles (2 x tubo)
Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante Gram
48
PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en
los medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y
pruebas de patogenicidad si se requiere.
Caldo plasma en tubo
- Disco de Bacitracina
- Disco de Optochin
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.
49

PRACTICA N 20
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOLRESISTENTES

GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este gnero esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfologa bacilar,
poseen un alto contenido de lpidos complejos en su estructura qumica y se desarrollan lentamente
en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patgenas para el hombre y los animales, as como especies saprofitas en el
aire, en el agua y en la tierra.
Las especies patgenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis,
que puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localizacin pulmonar, renal y
digestiva los mas frecuentes y el esputo es el espcimen clnico ms comn para establecer el
diagnstico especfico a travs de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis,
Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor
frecuencia, tambin, son patgenos.
MATERIALES
Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo
Lminas portaobjetos nuevas y desengrasadas
Lminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis
Lminas con extensin de otros tipos de Micobacterias
Set de colorante de Gram
Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)
Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
50
Observar los caracteres macroscpicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.

Tomar una partcula mucopurulenta del esputo y hacer una extensin homognea sobre la
lmina portaobjetos nueva.
Fijar la preparacin.
Realizar una coloracin con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de ZiehlNeelsen porque no son cidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares
rojos en un fondo azul.
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda
la longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar
los resultados, segn el siguiente cuadro:
Negativo
: No se observan bacilos en 100 campos.
Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
Positivo (+++) : Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y
permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en
grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I: Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas.
Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo:
M. scrofulaceum
GRUPO III: No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso. Son
no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y
M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos.

GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.
51

PRACTICA N 21
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO
CORYNEBACTERIUM
INTRODUCCION
El gnero Corynebacterium comprende un grupo heterogneo de bacterias en el cual se
incluyen especies comensales y patgenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las caractersticas comunes del gnero son:
1) Bacilos pleomrficos Grampositivos, No forman esporas
2) Las clulas se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposicin en
letras chinas,
3) Aerobios o anaerobios facultativos,
4) Catalasa positivos,
5) Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infeccin aguda,
contagiosa y febril, caracterizada por inflamacin local y formacin de una seudomembrana en la
orofaringe, adems del dao al corazn y nervios perifricos por accin de una exotoxina (toxina
difterica). Es propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vas
respiratorias superiores.
El gnero se divide en tres grupos:
Grupo I : Corinebacterias parsitas y patgenas para el hombre y animales;
Grupo II : Corinebacterias fitopatgenas, y;
Grupo III : Corinebacterias no patgenas.
Algunas de las especies ms frecuentemente halladas en el laboratorio clnico son: C.diphtheriae,
C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y
C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enrgicamente sobre cualquier lesin
inflamatoria, adems del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
MATERIAL
de Corynebacterium
diphtheriae en caldo
Cepa
enriquecido
con
Agar Urea Christensen en plano
Tubos
inclinado
Placa con Agar chocolate telurito de potasio
Caldo Rojo de fenol + Maltosa
Asas de siembra
Lminas portaobjetos
Aceite de inmersin
Microscopio
Placa con Agar sangre
Tubo de
13x100 con medio Pai en plano
inclinado
Set de colorante de Gram
52
Set de colorante de Albert
Caldo Rojo de fenol + Glucosa
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el inculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el mtodo de
dispersin agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai
por estras. Incubar por 48 horas a 37C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el mtodo de Albert.
4. Bioqumica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el
caldo Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los grnulos metacromticos conocidos tambin como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se
tien de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy dbilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solucin A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, cido actico,
alcohol etlico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solucin B de Albert (yodo metlico, yoduro de potasio, agua destilada) por
1 minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
LECTURA
En la coloracin Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados
en sus extremos como mazos, pleomrficos

(en forma de pera, huso) o
ensanchados
dispuestos paralelamente, o en forma de letras chinas.
En la coloracin Albert observar la bacteria color verde y los grnulos de color azul oscuro
el cultivo en Agar chocolate telurito

de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos) observar
En
los tres tipos de bacilos diftricos:
a) Tipo gravis: colonias grandes grisceas.

b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.
c) Tipo intermedius: colonias pequeas, lisas o rugosas con centro negro.
En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeas, convexas, con
bordes enteros,
color crema o blanco grisceas, slo las colonias Tipo mitis producen beta
hemolisis.
BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae

Hemolisis: Beta (slo el Tipo mitis)
Catalasa : Positivo
Movilidad: Negativa
Urea* : Negativa
Nitrato : Positivo
53
Gelatina : Negativo
Sacarosa : Negativo
Glucosa : Negativo
Maltosa : Positivo
Lactosa : Negativo

PRACTICA N 22
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:

GENERO PSEUDOMONAS
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con
flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cpsula, no forman esporas, no son
exigentes para su desarrollo In Vitro.
Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana,
principalmente quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados
bronquiales, esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar
infecciones con riesgo de vida fatales.
La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P.
aeruginosa, la mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y
desarrollan bien a 42C.
MATERIAL
Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.
Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150
Agar nutritivo en Placa Petri
Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150
Agar semi-slido en tubo de 13 x 100
Medio TSI
Reactivo de Oxidasa
Frasco con cloroformo
Set de colorantes Gram
Lminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de
Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas
conocidas.
3. Incubar a 37C por 24- 48 horas.
54
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeos, Gram negativos.
CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento
de color verdoso y un olor caracterstico.
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa en el
medio de oxidacin- fermentacin (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el
Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la
piocianina.
PROTOCOLO
CARACTERSTICAS
MICROORGANISMOS
Pseudomona aeruginosa
Crecimiento en Mac Conkey
Reacciones en TSI
Difusin de Pigmento en Agar nutritivo
Prueba de Citocromo- oxidasa
Solubilidad Cloroformo- piocianina
Crecimiento Agar nutritivo
Agar semislido
55

PRACTICA N 23
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

BRUCELLA
HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeos, usualmente cocobacilares, inmviles no formadores de esporas.
Son Gram negativos y necesitan una tincin prolongada con la fucsina bsica de por lo menos 2
minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tincin convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o Fiebre Malta es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicacin y desarrollo in vitro es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificacin de especies se utiliza una serie bioqumica para observar la produccin de
H2S, hidrlisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002
% y requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, lquido cefalorraqudeo, mdula sea o
biopsias de ganglios linfticos e hgado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (slido + lquido) de Ruiz- Castaeda. La
incubacin debe hacerse en una atmsfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37C. Las colonias aparecen
entre el 4 al 5 da, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 das antes de ser descartado
como negativo.
II: SEROLOGIA
Para el diagnstico serolgico se utilizan las tcnicas de:
1. Aglutinacin rpida en placa
2. Aglutinacin lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinacin del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
56
MATERIAL
Tubo con cepa de Brucella
Frascos con medio de Ruiz- Castaeda
Muestra de sangre total de paciente
Agar fucsina en placa
Agar Thionina en placa

Suero positivo y suero control negativo
Antgeno estandarizado de Brucella
Lminas excavadas
Pipetas de 0.2 ml
Palito mondadientes
Lminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castaeda, e
incubar por 4 a 5 das a 37C. Se debe esperar hasta 30 das para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el mtodo de
Gram, siguiendo las recomendaciones sealadas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer crculo de la 2da.
Lnea de la lmina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lmina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alcuota de suero aadir una gota de antgeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotacin, con ayuda de un palito mondadientes empezando por
el suero negativo y la dilucin ms alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lmina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos ms.
6. A los 8 minutos no ms, observar la presencia de grumos (aglutinacin) que indica una
reaccin positiva antgeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
57
INTERPRETACION
SUERO
0.08
0.04
0.02
0.01
0.005
ANTIGENO
+
+
+
+
+
DILUCION / TITULO
0.03
0.03
0.03
0.03
0.03
25
50
100
200
400
+
++
+++
++++
+++++
DIFERENCIACION BIOQUIMICA
ESPECIES
DE
BRUCELLA
PRUEBAS DE DIFERENCIACION
Crecimiento en
Husped
Preferido
Necesidad Produccin Hidrlisis

CO2 (5%) de H2S
de Urea
Fucsina
Thionina
0.002 % 0.002 %
B.abortus
Bovino
++
Dbil
B.melitensis
Cabra, oveja
Dbil
B.suis
Cerdos
Fuerte
B.canis
Perros
Fuerte
58

PRACTICA N 24
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias
(Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y
aerobios, algunos de los cuales son patgenos para el
Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante
el COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad,
para el aislamiento del agente patgeno bacteriano.
La mayora de las Enterobacterias tienen una accin invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisin es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en
determinadas condiciones patgena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite
causar infecciones en el tracto gastrointestinal as como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxignico (ECET) es la causa comn de la "Diarrea del viajero" y produce en el
organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonizacin; la E.coli enteroinvasiva
(ECEI) y la E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cpsula producen infecciones
oportunistas en el husped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infeccin ms comunes, es difcil distinguir entre colonizacin e
infeccin y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo mvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre
y causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B C.
El gnero Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmviles, causan la
Disentera bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales
y fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.
El gnero Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, mviles con
flagelos peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de
infecciones urinarias, heridas crnicas adquiridas generalmente en el hospital.
59
MATERIALES
Muestra de heces.
Placas Petri con Agar Mac Conkey
Placas Petri con Agar SS
Placas con Agar Manitol
Tubos con Agar Sabouraud
Tubos con medio TSI, LIA
Tubos con caldo peptonado
Tubos con Citrato de Simmons
Tubos con caldo MR-VP
Frasco con Lugol
Reactivo para Citocromo-oxidasa

Reactivo de Kovacks (prueba de indol)
Reactivo para Rojo de metilo
Lminas portaobjeto y cubreobjeto
Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidrxido de Potasio al 40%)
Juego de colorantes para Gram
Material bsico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscpico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de
sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscpico de la muestra con Lugol y suero fisiolgico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de
solucin salina.
b) Tomar una asada de la suspensin de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey,
Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciacin bioqumica: TSI, LIA,
Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la
Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro
en las colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar
las caractersticas.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma
el medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilacin y desaminacin de la Lisina y
produccin de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilacin de la lisina se eleva el pH del
medio debido a la produccin de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color prpura)
[indicador prpura de bromocresol]
60
EN CALDO PEPTONADO, observar la produccin de Indol por las bacterias, al agregar el

reactivo de Kovac tornndose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornar de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato
como fuente de energa y alcaliniza el medio. (Formacin de Hidrxido de amonio). Positivo
(color azul), negativo (color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le aade el Rojo de metilo. Cuando
hay produccin de cidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color
amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma despus de 15 minutos cuando se
le aade alfa-naftol y KOH por la produccin de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo),
negativo (color amarillo). PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del
reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son
productoras de la enzima en caso contrario no habr ningn cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.
CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay
movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUMICA
TSI
(glucosa, sacarosa
lactosa,SH2 )
Especies
LIA
Cp
Ct
Lisina
Indol
Citrat
o
MR-VP Oxidasa
Ac.
Sup
Ac.
Fon
Ga
s
SH2
+ -
- +
Escherichia coli
Klebsiella
Salmonella typhi
Shigella
Proteus
61

PRACTICA N 25
ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
gneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El gnero Vibrio comprende muchas especies
siendo las de importancia mdica Vibrio cholerae, causante del clera epidmico; V.
parahaemolyticus, causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia,
infecciones en heridas cutneas, celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa,
infeccin de heridas cutneas, tejidos blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en
parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy mviles, poseen un flagelo polar, no forman
esporas, sin cpsula, aerobios y oxidasa positivo.
La ltima pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,
citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus
Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubo con Caldo peptonado
Tubo con MR-VP
Tubo con Citrato de Simmons
Desoxicolato de sodio al 0.5
% Lminas portaobjetos
Microscopios
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de dimetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente,
circulares, de color amarillo (resultado de la utilizacin del citrato y formacin de cidos a
partir de la utilizacin de la sacarosa)
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto
62
verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva)

2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la
sacarosa, no produce H2 S.
3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol
4. En el medio LIA observar si hay decarboxilacin de la Lisina.
5. En el medio MR- VP detectar la produccin del acetil-metil-carbinol
6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formacin o no de hidrxido de amonio
7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
8. Realizar la prueba de la cuerda positiva, colocando una gota de la solucin de
Desoxicolato sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una
colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensin viscosa al retirar
el asa como una cuerda larga que se torna mas pegajosa despus de 60 segundos mas.
9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioqumicos sembrados.
PROTOCOLO
MEDIOS
Vibrio cholerae
Vibrio parahaemolyticus
TSI
Acidez en superficie y profundidad
Acidez superficie y
profundidad
LIA
Positiva por descarboxilacin de la

Lisina
Positiva
VP
10- 50% cepas es positivo
Negativo
MR
Negativo
Negativo
Indol
Positivo
Positivo
Citrato
Negativo
Negativo
Urea
Negativo
Negativo
Oxidasa
Positiva
Positivo
Catalasa
Positiva
Positiva
Prueba de la cuerda
Positiva
Negativo
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la prctica
2. Realizar las pruebas bioqumicas correspondientes.
63

PRACTICA N 26
ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente
unidas, muy mviles, con una longitud de 6 a 20 m y 0.1 m de dimetro, sus extremos
semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El gnero Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales;
comprende 6 especies patgenas Leptospira interrogans con 18 variantes serolgicas, L. noguchi,
L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares
saprofitos comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus
propiedades antignicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la
endonucleasa de restriccin o la composicin de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribucin mundial. Los reservorios naturales son los
roedores y una gran variedad de animales silvestres y domsticos, los cuales eliminan con la
orina el agente etiolgico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de
transmisin puede ser directo (orina, rganos de animales infectados) o indirecto (a travs del
agua o material contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a travs de lesiones
de la piel y mucosas incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por mtodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloracin de Kiktenko, ya que toman dbilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales lquidos, semislidos y slidos enriquecidos con suero de conejo
o carnero al 8-10%, a una temperatura ptima de 28 30C, en un periodo de incubacin de 510 das, en condiciones de aerobiosis.
Para el diagnstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:

1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clnicas (sangre, lquido
cefalorraqudeo, orina) en medios de cultivo o inoculacin en hmster o cobayo.
2. Evidencia sexolgica en sueros pareados con incremento cudruple del ttulo de
diagnstico inicial de 1:100
64
MATERIAL
Cultivo de Leptospira en medio semislido de Fletcher- modificado
Lamina control coloreada por el mtodo de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de
Congo.
Microscopio.
LECTURA
En el medio semislido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en
todo el tubo y la formacin de un anillo a unos milmetros de la superficie del medio
En la coloracin de Kiktenko las Leptospiras se tien de un color rosado- violeta en fondo
incoloro, presentndose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C S, generalmente con
los extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas.
En la observacin al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un
collar de perlas son muy mviles, realizan movimientos de translacin, rotacin y al
rededor de su eje.
RESULTADOS
1. Caractersticas del cultivo observado.
2. Realiza esquema de la observacin en las lminas coloreadas
65
UNIVERSIDADPRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

PRACTICA N 27
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la
Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrin y se transmite a travs de la picadura de un
insecto alado hematfago conocido como Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su
tamao vara entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de dimetro, presenta flagelos unipolares
en nmero de 1 a 10. En los cultivos jvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta),
y en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por
los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura ptima de 29C en medios
enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifsico con sangre y
plasma, durante un periodo de incubacin de 5- 10 das. Su crecimiento es lento por lo general
semanas, enturbia el medio con sedimento y a veces se observa pelculas o tmpanos en la
superficie de la parte lquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemtica de la enfermedad, de las
lesiones eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemtica) usando el agar de
fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden
realizar pruebas serolgicas (aglutinaciones, fijacin de complemento, Elisa, etc.), por
Infeccin de los hemates humanos por Bartonella (Danza de los hemates) e Inhibicin del
movimiento de los hemates por accin de anticuerpos especficos antibartonella
MATERIAL
Frotices coloreados por Leishman, Wrigth Giemsa procedentes de
cultivo. Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
Cortes histolgicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIN
Observar al microscopio las lminas coloreadas y apreciar la morfologa y tincin de
Bartonella. En las lminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en
forma aislada. En los cultivos observar la turbidez del medio, la formacin de sedimento y la
formacin de pelculas o tmpanos
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
66

PRACTICA N 28
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE TREPONEMA PRUEBA DE VDRL RPR
INTRODUCCIN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogneo de microorganismos espirilares
mviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres
gneros de microorganismos patgenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la
sfilis, T. pertenue, produce el pin, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis
produce la fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que
origina infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho
y 5 a 15 m de largo, son mviles y giran constantemente, no se tien bien con los colorantes de
anilina y es difcil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (lquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas mviles
caractersticas.
2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
3. Pruebas serolgicas para sfilis, estas pueden usar antgenos treponmicos o antgenos no
treponmicos (cardiolipina purificada del corazn de buey)
4. Prueba de Floculacin (VDRL), el antgeno VDRL es una solucin alcohlica que contiene
0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en
que las partculas del antgeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y
en enfermos se combina con la reagina de la sfilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA
dirigidos contra algunos antgenos).
MATERIALES
Suero problema
Antgeno VDRL
Laminas excavadas
Pipetasgraduadas
PROCEDIMIENTO
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (bao Mara a 56C x 30) sobre la lamina
excavada
Aadir una gota del antgeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formacin de floculos cuando la
reaccin es positiva.
RESULTADOS
N (No reactivo)
RD (Reactivo dbil)
R (Reactivo)
67
........................
........................
.......................
Ausencia de floculos
Floculos pequeos
Floculos medianos y grandes

PRACTICA N 29
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
INTRODUCCION
El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes
patgenos causantes de una infeccin urinaria.
Para la obtencin de muestras debe considerarse:
La recoleccin debe ser con un mnimo de contaminacin
Establecer el momento ptimo para la recoleccin, con el objeto de tener la mejor
probabilidad de recuperar microorganismos causales.
Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las tcnicas de cultivo necesarias.
Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administracin de antibiticos.
Normalmente la orina es estril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de
contaminacin por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:
1. Si existe menos de 10,000 grmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la
muestra negativa.
2. Cuando la orina tiene ms de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infeccin urinaria.
3. Si el nmero de grmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y ser
necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin
para lograr recuentos de colonias exactos, luego se deber identificarlas y realizar el
Antibiograma correspondiente.
MATERIAL
Muestra de orina patolgica
Sedimento de orina
Agar Mac Conkey, Medio hipertnico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en
placas Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea
de Christensen.
Tubos con 9.9 ml de Suero fisiolgico
0.85% Pipetas de 1 ml. estriles
Placas Petri, vacas estriles
68
Bocal con desinfectante

Microscopio
Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen
Serie de colorantes de Gram
Lminas portaobjetos y laminillas
PROCEDIMIENTO
PRIMER DIA:
A. Estudio de las caractersticas macroscpicas
Describir el aspecto de la orina:
Color (amarillo, oscuro, castao o incoloro)
Sealar si la orina es clara o turbia.
B. Estudio de las caractersticas microscpicas

1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lmina y laminilla al
microscopio con objetivos de 10X y 40X
2. Realizar un frotis y colorear por el mtodo de Gram y Ziehl- Neelsen
C. Siembra de la muestra de orina:

1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersin agotamiento en las
placas con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud
2. Mtodo de dilucin: Preparar una dilucin de la orina de la siguiente manera.
a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo
con suero fisiolgico 0.85% estril. Mezclar bien.
b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri
vacas estriles.
c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar
nutritivo licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla
homognea.
d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37C por 18- 24 horas.
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales
anormales, leucocitos, levaduras, parsitos, espermatozoides, clulas epiteliales, cilindros.
2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y
Gram negativas, y por el mtodo de Ziehl- Neelsen las bacterias cido alcohol resistentes(en
caso de infeccin por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el
crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de
69
colonias resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia

de levaduras.
2. En la siembra por dilucin, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el
nmero de colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.
3. Se deber seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar
suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioqumica
respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de
Christensen. Incubar a 37C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deber ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad
Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se
prepara una suspensin en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentracin Mnima
Inhibitoria (MIC) del antibitico cuya finalidad es orientar en la teraputica y la concentracin
del antibitico alcanzado en el suero o en foco de infeccin.
El mtodo de disco-difusin estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el
laboratorio, para dicha determinacin (MIC).
REPORTE FINAL
Disear el protocolo correspondiente, sealando:
1. La observacin macroscpica y microscpica de la muestra clnica.
2. Las caractersticas del desarrollo bacteriano, y los principios bioqumicos en cada uno de los
medios selectivos empleados.
3. Los resultados del comportamiento bioqumico.
4. La determinacin del agente patgeno causante de la infeccin urinaria.
5. Determinacin cuantitativo nmero de UFC por ml.
Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)
70

PRACTICA N 30
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES
LACTANTES.
OBSERVACION DE LMINAS COLOREADAS
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los
animales, de las plantas y tambin de las bacterias (bacterifagos).
En este captulo analizaremos solamente los virus que producen patologa en el ser humano;
debido a sus caractersticas especiales como son su pequeo tamao y su parasitismo intracelular
obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de
las enfermedades producidas por ellos ya se conocan desde la antigedad (viruela, rabia,
hepatitis, etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el
crecimiento y multiplicacin deben necesariamente utilizar los sistemas de las clula que
parasitan y por ello se denominan parsitos intracelulares obligados.
En los ltimos aos, se han desarrollado mtodos de diagnstico rpido para la mayora de las
infecciones virales as como drogas antivirales especficas para muchos virus.
Se emplean mtodos directos para el diagnstico de los virus, y dado que estos solo se replican
en el interior de las clulas vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de mtodos
especiales en el laboratorio de virologa, tales como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayora de los virus pueden multiplicarse
en cultivo de clulas apropiadas.
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amnitica, cavidad alantoidea y
saco vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hmsters, monos)
d) Serologa o demostracin de anticuerpos frente al virus.
e) Demostracin directa del virus o de antgenos vricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRCTICA
El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigacin mdica y epidemiologa y
constituye un mtodo muy extendido para el diagnstico de la infeccin.
Por lo tanto estas prcticas nos orientan a conocer los diversos mtodos de aislamiento directo o
indirecto para demostrar los efectos citopticos de los diferentes virus y sus formas como se
deben evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.
METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO:
71
A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.
Muchos de los virus y rickettsias patgenas para el hombre y los animales pueden propagarse en
las clulas vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrin de huevos
embrionados de gallina. Estas tcnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y
desde entonces estn siendo ampliamente usadas.
Las vas de inoculacin y la edad del embrin a usar dependen del agente viral que va a ser
inoculado.
MATERIALES
Huevos embrionados de 7-9 das.
Huevos embrionados de 10-12 das.
Jeringas de tuberculina con aguja N 25 x y 22 x 2.
Colorante Fucsina al 1% con agua destilada
Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada
Frascos con Alcohol yodado
Algodn
Ovoscopio
Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados
Equipo de diseccin (Pinzas, tijeras curvas, guantes)
INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA

a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 das.
b) Hacer un pequeo orificio con el punzn en la zona marcada de huevos embrionados.
c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente en ngulo de
45 e inocular 0.2 ml. de colorante.
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubacin a 33-35C por
2-4 das, luego cosechar y observar.
INOCULACION POR VIA AMNIOTICA
a) Marcar la cmara de aire y la posicin del embrin de 10-12 das.
b) Limpiar con alcohol yodado un rea de la cmara de aire que est situada por encima del
embrin y hacer una perforacin rectangular de 0.5 cm, con el punzn.
c) Deja caer una gota de suero fisiolgico o aceite mineral estril, para visualizar una zona no
vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
d) Con una pinza curva introducir a travs de esta rea, coger hacia arriba la membrana
amnitica, formando una pequea tienda en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la
solucin de Azul de metileno o del inoculo problema.
e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 3335C por 2-4 das (sujeto a la muestra: Influenza)
INOCULACION DEL SACO VITELINO
a) Limpiar con alcohol yodado, la porcin de la cscara que cubre la cmara de aire del huevo
embrionado de 6-7 das.
b) Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire.
c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la
72
aguja verticalmente a travs de la cmara de aire, hasta 35 mm de

profundidad. d) Sellar la abertura
COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGN LAS CAVIDADES INOCULADAS)
a) Comprobar que el embrin este vivo. Enfriar a 4C los huevos embrionados por algunas
horas (2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones.
b) Cortar la cscara que cubre la cmara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes.
c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localizacin del
Azul de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculacin (Membrana alantoidea, amnitica,
corioalantoidea y saco vitelino).
d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amnitico y realizar las
pruebas de diagnstico correspondientes segn la investigacin solicitada
D. INOCULACIN EN RATONES LACTANTES:
Se utilizaran ratones lactantes y las vas de inoculacin sern:
Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutnea y Nasal.
E. OBSERVACIN DE LAMINAS COLOREADAS:
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de
inclusin (Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el ncleo o en el
citoplasma y su localizacin es especfica de la enfermedad viral.
Se considera estos cuerpos de inclusin (efecto citopatico) como conglomerados de virus
asociados a productos de reaccin de la clula infectada.
OBSERVACIN DE LMINAS:
1. Cultivo de clulas normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tie de rosado
el citoplasma.
2. Rabia: corte histolgico de cerebro. Coloracin HE. Observar inclusiones eosinofilas
intracitoplasmticas denominadas corpsculos de negri.
3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de clulas humanas (HEP-2), observar la degeneracin
celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del ncleo hacia el
borde de la clula.
4. Herpes simple en cultivos de clulas: Observar las clulas gigantes polinucleadas, las
inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusin intranuclear basfila en
ojos de lechuza rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basfilo).
6. Adenovirus en cultivo de clulas HEP-2: Observar la agrupacin de clulas en racimo y las
inclusiones basfilas intranucleares.
PROTOCOLO
Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.
73
74

PRACTICA N 31
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS AMBIENTALES
INTRODUCCION
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a
expensas de la materia inerte existente, la mayora se encuentra como saprofito, otros pueden ser
causantes de inducir hipersensibilidad as como tambin ser responsables de infecciones. Entre
los hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus,
Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula
MATERIALES
Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium,

Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,
Rhodotorula y Helmintosporium.
Lminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
Microscopios
PROCEDIMIENTO
1. Estudie las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio areo, aspecto de la colonia, produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscpico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las caractersticas
microscpicas de cada uno de los hongos preparados en las lminas con azul de lactofenol.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego vara de acuerdo a la especie en: amarillo, verde
azufrado, marrn o negro.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas que forman conidiforos no tabicados que se
ensanchan en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas
y de donde salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas con conidiforos ramificados en cuyo extremo se
hallan los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
Fusarium
Colonias de micelio areo algodonoso de color rosado violeta en la superficie.
75
Microscpicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidiforos, macroconidias

septadas y alargadas, fusiformes.
Rhizopus
Colonias de micelio areo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisceo.
Microscpicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos
esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se
encuentran las esporas.
Cephalosporium
Colonias de micelio areo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.
Microscpicamente presentan hifas septadas, conidiforos cortos que dan origen a conidias
hialinas agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, despus se torna de color negro en el centro, con la periferia
elevada de color gris.
Microscpicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre
conidiforos cortos y nudosos
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscpicamente se observa clulas ovoides o redondeadas con o sin yema.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica.
76
77

PRACTICA N 32
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS DERMATOFITOS

INTRODUCCION
Los dermatofitos son organismos queratinfilos que invaden las estructuras queratinizadas del
cuerpo como la piel, pelo y uas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los
invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones ms
comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del gnero Trichophyton, Microsporum
y Epidermophyton, as como tambin Malassezia furfur que es causante de la Tia versicolor
o Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce ndulos en el tallo
piloso de los cabellos, barba y bigote.
Por su hbitat pueden clasificarse en: Zooflicos (Microsporum canis), Geoflicos
(Microsporum gypseum), y Antropoflicos (Epidermophyton).
MATERIALES
Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E. floccosum.
Lmina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.
Lminas preparadas de M. furfur en hidrxido de potasio al 20%.
Lminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.
Material bsico de laboratorio(xilol, algodn, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia , produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos
preparados en lminas.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.
Trichophyton rubrum
Colonias de micelio areo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un
pigmento de color prpura.
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias ssiles piriformes, a veces puede
observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
78
Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un
pigmento amarillo- pardusco.
Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esfricas agrupadas,
pueden presentar hifas en espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con
pigmentacin amarillo- castao al reverso.
Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en
raquetas septadas, pueden observarse macroconidios.
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.
Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en nmero
de 4-6, rara vez se observan microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con
pequeas excrecencias en la superficie, pueden tambin observarse microconidias y clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia furfur (Pityrosporum)
Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas
agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnstico se da por el
examen directo de la muestra
Piedraia hortai
Los ndulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro
que envuelven completamente el tallo piloso.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica
79
80

PRACTICA N 33
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las
cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues
cutneos. Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida
albicans y otras especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crnicas en la piel
o mucosas, aparato genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus
neoformans pueden causar infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutneas; en el hombre
la infeccin primaria es casi siempre pulmonar.
MATERIALES
Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.
Lminas de Candida albicans en Agar harina de maz.
Lminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.
Cortes histolgicos con C. albicans y Cr. neoformans.
Material bsico de laboratorio (xilol, algodn, alcohol)
Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y
consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las caractersticas que presentan cada especie de los hongos en el
Agar harina de maz, tinta china y en los cortes histolgicos.
CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES
Candida albicans
Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.
En el Agar- almidn- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que tipifican a Candida
albicans.
En los cortes histopatolgicos

observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las lesiones rodeadas de
una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
81
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color
ocre, de aspecto mucoide
viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las lminas con tinta china se aprecia
la cpsula como un halo brillante entre el borde de la levadura y el
fondo oscuro dado por la tinta china.
En los cortes histopatolgicos, se observan como levaduras a lo largo de los
vasos en las lesiones, las cuales
comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltracin celular.
82

PRACTICA N 34
ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.
OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION
Los hongos dimrficos, son hongos causantes de infecciones mucocutneas y/o sistmicas en el
hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporgena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en
su fase de levadura en tejidos infectados.
Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infeccin crnica, granulomatosa de la piel,
mucosa, ganglios y vsceras. Es ms frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporgena, que se desarrolla
principalmente sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza),
excremento de murcilagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma
benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos
animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales
contaminados con el hongo. La infeccin esta localizada preferentemente en los ganglios linfticos
MATERIALES
Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.
Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol

Cortes histolgicos infectados por estos hongos.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.
2. Observar las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS
Paracoccidioides brasiliensis
En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histolgicos, se presentan como clulas
esfricas u ovaladas de 10 a 80 micras de dimetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio areo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscpicamente se observan filamentos hialinos, tabicados
con microconidias esfricas o piriformes.
83
En Agar Infusin cerebro corazn (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige
claro. Microscpicamente se observan clulas esfricas.
Histoplasma capsulatum
En frotices o cortes histolgicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas
en los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeas, redondas u ovaladas de 1-3
micras de dimetro.
En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscpicamente
se observan hifas tabicadas con escasa produccin de microconidias y gran cantidad de
macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa Clamidospora tuberculada.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeas de aspecto membranoso rugoso, color marrn
claro. Microscpicamente, se observan como clulas ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeas, blanquecinas presentando
posteriormente un aspecto hmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de
crema a negro.
Microscpicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidiforos en cuyo extremo se
encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan clulas en
gemacin ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
PROTOCOLO
Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
84
85

SEMINARIO-I
GENETICA MICROBIANA E INGENIERIA GENTICA
(Organizacin de los genes. Transferencia del DNA. Mutacin. Expresin gnica

e Ingeniera gentica)
TEMA 1
: ORGANIZACIN DE LOS GENES (ADN PROCARIOTICO)
TEMA 2 : TRANSFERENCIA E INTERCAMBIO DE LA INFORMACIN

GENETICA BACTERIANA.
TEMA 3
: MUTACIN Y SUS CONSECUENCIAS
TEMA 4 : EXPRESIN GNICA E INGENIERIA GENTICA Y SUS

APLICACIONES EN LA MEDICINA.
OBSERVACIONES A TENER EN CUENTA:

PRESENTACIN EN POWER- POINT Y TRPTICO
EXPOSICIN: CADA TEMA 10-15 MINUTOS
LUGAR: AULA DE CLASES TERICAS
HORA: EN HORAS DE PRCTICAS
PASO AL FINAL DE LA EXPOSICIN
Profesor Responsable del Curso

86

SEMINARIO II
VACUNAS ANTIMICROBIANAS. PROGRAMA DE VACUNACIN

(Tipos de vacunas. Requisitos de una buena vacuna)
TEMA 1: TIPOS DE VACUNAS Y CONSECUENCIAS PATOLGICAS DE

LA VACUNACIN.
TEMA 2: OBJETIVOS DE LA VACUNACIN Y REQUISITOS DE UNA

BUENA VACUNA.
TEMA 3: PRACTICAS DE VACUNACIN ACTUAL Y MEDIDAS DE CONTROL
TEMA 4: CONSECUENCIAS PATOLGICAS DE LA VACUNACIN
TEMA 5: PROGRAMAS DE VACUNACIN
87

SEMINARIO - III
ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS
(Mecanismos bsicos de actividad y resistencia a los antibiticos)
TEMA 1: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS

1.1: Inhibidores de la Sntesis de la pared celular
1.2: Inhibidores de la Sntesis de protenas
1.3: Inhibidores de la Sntesis de cidos nucleicos
1.4. Inhibidores de la funcin de la membrana citoplasmtica
TEMA 2: RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS

2.1: Gentica de la resistencia
2.2: Mecanismos de resistencia
TEMA 3: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS Y ANTITUBERCULOSTTICOS
3.1. Mecanismos bsicos de actividad

3.2. Mecanismos de resistencia
TEMA 4: CLASES DE AGENTES ANTIVIRALES

4.1: Mecanismos bsicos de actividad
TEMA 5: CLASES DE AGENTES ANTIMICTICOS

5.1: Mecanismos bsicos de actividad

88

SEMINARIO - IV
ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL:

(ETS) Y SIDA
1. SFILIS CONGNITA. FASES DE LA ENFERMEDAD. DIAGNSTICO

SEROLGICO.
2. PAPILOMAVIRUS
3. VIRUS DE LA HEPATITIS B
4. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH):

A)
ETIOPATOGENIA DEL SIDA Y ESTRUCTURA DEL VIH
B)
ASPECTOS GENERALES DEL CURSO DE LA INFECCIN POR VIH
C)
EPIDEMIOLOGA. TRATAMIENTO Y PREVENCIN
89

SEMINARIO - V
ARBOVIRUS. DENGUE Y FIEBRE AMARILLA
TEMA 1: FIEBRE AMARILLA

a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA
TEMA 2: FIEBRE AMARILLA

a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA
b) PREVENCIN Y CONTROL
TEMA 3: DENGUE
a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA
TEMA 4: DENGUE
a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA
b) PREVENCIN Y CONTROL
90

G.P. Microbiologia 4

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FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA

UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

El Profesor Responsable del Curso

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

III. PARTES DEL MICROSCOPIO

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES

Colorante Azul de lactofenol

Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

Colocar una gota de tinta china sobre la lmina portaobjetos

COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:

Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

Muestra con mezcla de bacterias

Solucin fisiolgica al 0.85%

Asa bacteriolgica de Kolle en aro

Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:

Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)

Varillas para coloracin

Microscopio de luz con objetivo de inmersin

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

Lminas con frotices de bacilo tuberculoso

Set de coloracin Ziehl-Neelsen:

Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)

Azul de metileno (colorante de contraste)

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

Frotis de sangre con Bartonella

Solucin de colorante Leishman

Agua destilada tamponada

Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

Solucin fisiolgica al 0.85%

Set de coloracin de Vago:

Asa de siembra en aro

Microscopio con lentes de 100X

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

Probetas de 100 ml.

Balones de 250 ml.

Tiras de Papel indicador de Ph

Frasco con solucin NaOH (N/10)

6.0 gr. de Agar SS deshidratado.

6.5 gr. de Agar TSI.

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

Trpodes con malla de Asbesto

Agar simple o Agar nutritivo

2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons

2.1 gr. de Agar Urea.

1.7 gr. de Caldo MR VP

3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

mezclar homogneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio

Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

El color que presentan cada medio de cultivo preparado.