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DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Y PRUEBAS DIAGNSTICAS
CAPTULO 4
CAPTULO 4
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diagnstico depende del propsito para el cual se realizan las pruebas (por ejemplo,
diagnstico clnico, estudio epidemiolgico, desarrollo de vacunas), el tipo de
laboratorio y la experiencia y conocimientos tecnicos disponibles, los costos y el
tiempo de recoleccin de las muestras.
Figura 4.1 Lnea de tiempo aproximada de las infecciones primarias y secundarias por el virus del
dengue y los mtodos de diagnstico que se pueden usar para detectar la infeccin
Deteccin de NS1
Viremia
IgM primaria
IgM secundaria
IgG secundaria
ACCESIBILIDAD
MTODOS DIRECTOS
Aislamiento
del virus
Deteccin del
genoma
CONFIANZA
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Deteccin
de NS1
MTODOS INDIRECTOS
Serologa
IgM
Serologa
IgG
CAPTULO 4
Espcimen
Aislamiento viral e
identificacin de
serotipo
Confirmado
1-2 semanas
Sangre total,
suero, tejidos
1-5 das
1 2 das
Tejido, sangre
total, suero,
plasma
Suero
Tejido para
inmunoqumica
Suero, plasma,
sangre total
1-5 das
ELISA IgM
IgM prueba rpida
Probable
1-2 das
30 minutos
7 das o ms
Suero, plasma
sangre total
1-6 das
NA
Despus de 5 das
Costo
95
96
Muy sugestivo
Confirmado
CAPTULO 4
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los cuatro virus del dengue, as como tambin contra flavivirus no relacionados con
el dengue. Esta reaccin cruzada resulta de las clulas B de memoria, las cuales
producen anticuerpos dirigidos a eptopos viriones compartidos por los virus del
dengue. Durante la etapa de convalecencia temprana despus de las infecciones
secuenciales del dengue, el ttulo ms elevado del anticuerpo neutralizador a menudo
est dirigido contra el primer virus infeccioso y no contra el ms reciente. Este
fenmeno se conoce como pecado antignico original" (13).
La desventaja de la PRNT es que su prctica es laboriosa. Una serie de laboratorios
desarrollaron recientemente pruebas de neutralizacin de alto rendimiento que se
pueden usar a gran escala en estudios de vigilancia y pruebas con vacunas. Se
han observado resultados variables en las PRNT practicadas en diferentes laboratorios.
Las variaciones se pueden minimizar si las pruebas se hacen en lneas estndar de
clulas usando las mismas cepas del virus y la misma temperatura y tiempo para
la incubacin del virus con el anticuerpo. El ingreso del virus se debe calcular
detenidamente para evitar la superposicin de placas. Las lneas de clulas de
origen mamfero, tales como las clulas VERO, se recomiendan para la produccin
de virus semilla para ser usados en la PRNT.
La prueba de microneutralizacin se basa en el mismo principio que la PRNT. Existen
mtodos variables. En uno de ellos, en lugar de contar el nmero de placas por
pozo, el antgeno viral se tie usando un anticuerpo etiquetado y la cantidad de
antgeno se mide mediante colorimetra. La prueba puede medir el cido nucleico
usando la PCR. La prueba de microneutralizacin fue diseada para usar cantidades
ms pequeas de reactivos y para analizar mayores cantidades de muestras. En
las pruebas de deteccin del antgeno viral, la propagacin del virus a lo largo de
las clulas no est limitada debido a que en las PRNT que usan capas semislidas,
se debe estandarizar el tiempo despus de la infeccin para evitar que el crecimiento
se mida despus de muchos ciclos de replicacin. Como no todos los virus crecen
a la misma velocidad, los perodos de incubacin son especficos de cada virus.
Al igual que con las PRNT, los anticuerpos medidos por micromtodos en individuos
con infecciones secundarias pueden reaccionar ampliamente con los cuatro virus
del dengue.
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Tabla 4.3 Ventajas y limitaciones de los mtodos de diagnstico del dengue (9)
Indicaciones
Pruebas Diagnsticas
Limitaciones
La ms sensible y especfica
Es posible identificar el serotipo
Aparicin temprana (preanticuerpo), con oportunidad
de impactar en el manejo del
paciente
Aislamiento en cultivo de
clulas e identificacin
usando
inmunofluorescencia
Especfico
Es posible identificar el serotipo
usando anticuerpos especficos
Requiere experiencia e
instalaciones para el cultivo de
la clula y microscopa
fluorescente
Toma ms de 1 semana
No es posible diferenciar entre
la infeccin primaria y la
secundaria
Deteccin de antgenos
en muestras clnicas
Fcil de realizar
La oportunidad para el
diagnstico temprano puede
impactar en el tratamiento del
paciente
Pruebas serolgicas:
Pruebas IgM
Seroconversin: aumento
de cuatro veces en los
ttulos IgG por IH o ELISA
entre las muestras de la
fase aguda y la de
convalecencia
Vigilancia e
Deteccin de IgM
identificacin de
brotes;
Vigilancia de la
efectividad de
Aislamiento viral y
las intervenciones deteccin de ARN
Confirmar casos
Identificar serotipos
CAPTULO 4
Ventajas
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100
Todas las pruebas para la deteccin de cido nucleico comprenden tres pasos
bsicos: extraccin y purificacin del cido nucleico, amplificacin del cido
nucleico, y deteccin y caracterizacin del producto amplificado. La extraccin y
purificacin del ARN viral de la muestra se pueden realizar mediante mtodos
tradicionales de separacin de fases lquidas (por ejemplo, fenol, cloroformo), pero
se han ido reemplazado gradualmente con los kits comerciales basados en slice
(abalorios o columnas), que son ms reproducibles y rpidos, especialmente porque
se pueden automatizar usando sistemas robticos. Muchos laboratorios utilizan una
prueba de RT-PCR anidada, usando cebadores universales para el dengue
CAPTULO 4
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Para la captura de anticuerpos IgM por MAC-ELISA, la IgM total en los sueros de
los pacientes se captura mediante anticuerpos especficos para la cadena anti-
(especficos para IgM humana) revestidos en un microplato. Los antgenos especficos
del dengue, de uno a cuatro serotipos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4), estn
ligados a los anticuerpos IgM anti-dengue capturados y son detectados mediante
anticuerpos monoclonales o policlonales del dengue, directa o indirectamente
conjugados con una enzima que transforma un substrato sin color en productos con
color. La densidad ptica se mide mediante espectrofotmetro.
El suero, la sangre en papel de filtro y la saliva, pero no la orina, se pueden usar
para la deteccin de IgM si las muestras se toman dentro de un perodo apropiado
(cinco das o ms despus de la aparicin de la fiebre). Las muestras de suero se
pueden analizar en una dilucin individual o en mltiples diluciones. La mayora
de los antgenos usados para esta prueba se derivan de la protena de envoltura,
usualmente, sobrenadantes de cultivos celulares infectados con el virus o preparaciones
del cerebro de ratones lactantes. La prueba MAC-ELISA tiene buena sensibilidad y
especificidad pero slo cuando se usa cinco das o ms despus de la aparicin
de la fiebre. Hay diferentes kits comerciales disponibles (ELISA o pruebas rpidas),
pero tienen sensibilidad y especificidad variables. Una red de laboratorios de
WHO/TDR/PDVI evalu recientemente las pruebas ELISA comerciales y las pruebas
diagnsticas rpidas de primera generacin, y encontraron que la prueba ELISA
generalmente tiene un mejor rendimiento que las pruebas rpidas.
CAPTULO 4
La reaccin cruzada con otros flavivirus circulantes, tales como encefalitis japonesa,
encefalitis de Saint Louis y fiebre amarilla, no parece ser un problema, pero se
obtuvieron algunos falsos positivos en los sueros de pacientes con malaria, leptospirosis
e infeccin previa de dengue (10). Se deben tener en cuenta estas limitaciones cuando
se usen pruebas en regiones donde estos patgenos circulan concomitantemente. Se
recomienda que las pruebas sean evaluadas contra un panel de sueros de enfermedades
relevantes en una regin en particular, antes de ser distribuidas al mercado. No es
posible usar pruebas de IgM para identificar los serotipos del dengue, ya que estos
anticuerpos presentan amplia reaccin cruzada, incluso despus de infecciones
primarias. Recientemente, algunos autores han descrito un MAC-ELISA (figura 4.3)
que podra permitir la determinacin de serotipos, pero se requieren mayores
evaluaciones (19).
Figura 4.3 Principio de una prueba MAC-ELISA
Espectrofotmetro
Sustrato sin
color
IgM especfico no
relacionado con el
dengue
Sustrato con
color
Anti-dengue
Ab conjugado
con enzima
antgeno
DEN
IgM del
paciente
Cadena
Anti-
Microplato
103
como en saliva, los dos mtodos se pueden realizar juntos para ayudar a interpretar
la serologa del dengue (22, 23). Este mtodo no se usa con mucha frecuencia y
requiere evaluacin adicional.
4.3.4.5 Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin
CAPTULO 4
Inhibicin de
hemaglutinacin
= resultado positivo
Hemaglutinacin
= resultado negativo
Eritrocitos
Antgenos del
virus del
dengue
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En la fiebre del dengue se puede observar una cada por debajo de 100 000 por
L en el conteo de plaquetas, pero esta es una caracterstica constante en la fiebre
por dengue hemorrgico. Generalmente, se observa trombocitopenia en el perodo
entre el da 3 y el da 8 despus de la aparicin de la enfermedad.
La hemoconcentracin, calculada por un aumento del 20% o ms en el hematocrito
en comparacin con los valores de la fase de convalecencia, sugiere hipovolemia
debido a aumento de la permeabilidad vascular y extravasacin de plasma.
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Se han analizado otros mtodos, pero todava estn en las primeras etapas de
desarrollo y evaluacin. Por ejemplo, las tcnicas basadas en luminiscencia se estn
volviendo cada vez ms populares, debido a su alta sensibilidad, amplio rango
dinmico e instrumentacin relativamente econmica.
CAPTULO 4
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Centros de atencin
primaria
Centros
distritales
Centro de referencia
- Cultivo de virus
- Deteccin de antgenos:
ELISA
Pruebas rpidas
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- Serologa
ELISA
Pruebas rpidas
Funciones
- Capacitacin y supervisin
- Garanta de calidad
- Actividades de vigilancia
- Investigaciones de los brotes
- Referencia de muestras
problemticas
- Investigacin de muestras
problemticas
+
+
Tabla 4.5 Diagnstico de dengue por laboratorio: ejemplos de buenas y malas prcticas
Buenas prcticas
Malas prcticas
3. Asuntos de laboratorio
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4.8 REFERENCIAS
1. Vorndam V, Kuno G. Laboratory diagnosis of dengue virus infections. In: Gubler
DJ, Kuno G, eds. Dengue and dengue hemorrhagic fever. New York, CAB International,
1997, 313333.
2. Innis B et al. An enzyme-linked immunosorbent assay to characterize dengue
infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate. American Journal
of Tropical Medicine and Hygiene, 1989, 40:418427.
3. PAHO. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas: guidelines for
prevention and control. Washington, DC, Pan American Health Organization, 1994
(Scientific Publication No. 548).
4. WHO. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control,
2nd ed. Geneva, World Health Organization, 1997.
5. Chanama S et al. Analysis of specific IgM responses in secondary dengue virus
infections: levels and positive rates in comparison with primary infections. Journal
of Clinical Virology, 2004, 31:185189.
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6. Kuno G, Gomez I, Gubler DJ. An ELISA procedure for the diagnosis of dengue
infections. Journal of Virological Methods, 1991, 33:101113.
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