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Sumario
Burkholderia fungorum FLU100 oxida simultneamente
cualquier mezcla de tolueno, benceno y monohalogen
bencenos a (3-sustituido) con catecoles
una selectividad de casi el 100%. Metabolismo ms
producido a travs de las enzimas de las vas de escisin orto
con la mineralizacin completa. Durante la transformacin
de 3-metilcatecol, 4-carboximetil-2metilbut-2-en-4-olida (2-metil-2-enelactone, 2-ML)
acumulada transitoriamente, siendo an ms mineralizada
slo despus de una fase de retardo de 2 h en el caso de las clulas preadultos
Introduccin
Debido al uso generalizado de alquilo, as como halgeno
bencenos como reactivos y disolventes en la industria qumica,
pertenecen al top ten de las ms frecuentes que aparecen
Harayama, 1994). Por ltimo, la transformacin de tolueno para 3,4dihidroxibenzoato a travs de p-cresol y 4-hidroxibenzoato
Tambin se ha descrito (Richardson y Gibson, 1984;
Escudos et al., 1989; Kaphammer et al., 1990; Yen et al.,
1.991). Posteriormente, methylcatechols suelen ser mineralizada
por extradiol (meta) la escisin del anillo (Hou et al., 1977;
Taeger et al., 1988; Reineke, 1998).
Mientras que la mineralizacin de alquilarse o halogenado
aromticos como sustratos nicos es no crtica con la mayora
bacterias, mezclas de esos compuestos son difcilmente biodegradable,
basado preferentemente en la incompatibilidad de
itinerarios individuales con potencial de formacin de reactivo
intermedios en caso de la va de escisin meta
(Klecka y Gibson, 1981; Knackmu, 1981; Bartels
et al., 1984; Rojo et al., 1987; Pettigrew et al., 1991). Slo
unas pocas cepas son capaces de hacer frente a sustituido clorocatecoles travs de la va de escisin de meta. No obstante, en
la mayora de estas cepas, la inactivacin de la meta
pyrocatechase solamente se compensa parcialmente por la reactivacin
o caro continuar la sntesis de novo (Oldenhuis
et al., 1989; Haigler et al., 1992; Arensdorf y Focht,
1994; 1995; Hollender et al., 1994; 1997; Wieser et al.,
1994; Heiss et al., 1997; Marte et al., 1997; 1,999;
Franck-Mokross y Schmidt, 1998; Kaschabek
et al., 1998; Riegert et al., 1998; 1,999; Gbel et al.,
2004).
mineralizado despus de una fase de latencia que dura unos pocos horas.
Consistentemente, esta cepa no fue capaz de mineralizar
tolueno.
Hemos descrito previamente la cepa Burkholderia
fungorum FLU100 poder mineralizar todas monohalogenado
bencenos, benceno y tolueno como pura
sustancias por una va de escisin orto (Strunk, 2000;
2007; Dobslaw, 2003; Strunk et al., 2006; Strunk y
Engesser, 2013). Hemos postulado 2-ML como intermedio de
la va de degradacin tolueno.
En el presente artculo, mostramos los datos claramente demostrando
2-ML como el principal producto intermedio en la produccin
degradacin de tolueno por escisin orto modificado
enzimas as como la capacidad de la cepa para FLU100
degradar mezclas de benceno, tolueno y monohalogen
bencenos simultneamente. Para nuestro conocimiento,
esta es la primera descripcin de una funcional, no ingenieril
orto va para la degradacin total de
tolueno.
Resultados y discusin
La degradacin simultnea de mezclas de
compuestos aromticos
Fungorum Burkholderia FLU100 fue capaz de degradar cualquier
mezcla de los compuestos aromticos benceno, tolueno,
fluorobenceno, clorobenceno, bromobenceno, as como
GRAFICA
Identificacin de 3-metilcatecol y 2-metil-cis /
cido como otros intermedios cis-mucnico del tolueno
va de degradacin
Catecoles correspondientes se formaron fuera de la
intermedios diendiol por deshidrogenacin utilizando viable
las clulas (Fig. 1). La identificacin se realiz utilizando una
cromatgrafo de gases con un espectrmetro de masas como detector
(GC-MS) y el anlisis del concentrado orgnico
fase despus de una extraccin con acetato de etilo tres veces
as como la metilacin de la fase orgnica con
diazometano. Para tolueno, 3-metilcatecol (antes
metilacin) y 2-metoxi-3-metilfenol (despus de
metilacin) se identificaron mediante el uso disponible comercialmente
compuestos estndar (informacin de apoyo
Tabla S4).
Los catecoles de los seis sustratos se escindieron por una
orto va escote y sin actividad de escisin meta
fue observado. Medicin de la absoluta y relativa
actividades de conversin de clulas enteras, as como el crudo
1995; Reineke, 1998; Moiseeva et al., 2.002), 2cido methylmuconic como intermedio de tolueno no puede ser
transformado de esta manera, debido a que el grupo metilo no es
grupo saliente en absoluto. Se observ que la cycloisomerase
transformado cido 2-methylmuconic a
2-methylmuconolactone (2-ML), que era ms mineralizado.
No haba indicios de la existencia de un
exocclico 5-methylmuconolactone, un posible producto de
cicloisomerizacin alternativa de cido 2-methylmuconic.
En contraste con la cepa Pseudomonas sp. D7-4 (FranckMokross
y Schmidt, 1998; Taeger et al., 1988;) y
otras cepas obtenidas por el enriquecimiento, el 2-ML y
3-metilbenzoato de metilo (Taeger et al., 1988), que tambin eran
capaces de mineralizar 2-ML, cepa FLU100 fue capaz de crecer
en tolueno como nica fuente de carbono y energa.
Sin embargo, la transformacin de 3-metilcatecol por las clulas de
FLU100 tensin pre-cultiva en benceno o monohalogen
bencenos, casi el 55-65% de la prevista
3-metilcatecol acumula temporalmente como 2-ML.
Adems transformacin se observ despus de una fase de latencia de
2-3 horas (Fig. 2). Por el contrario, no hay o slo pequeas concentraciones
de 2-ML acumulado en caso de tolueno-inducida /
clulas en crecimiento (Fig. 3). Esto significa que las enzimas clave para
degradacin de 2-ML solamente fueron inducidos despus de la adaptacin
en tolueno, pero no en benceno o mono-halgeno
bencenos.
GRAFICA
aparecido, incluso despus de una incubacin prolongada (Fig. 2). En
Por el contrario, no se detect acumulacin de 2-ML cuando
clulas utilizadas fueron inducidos previamente con tolueno (Fig. 3).
En un segundo experimento, una solucin acuosa de
2-ML fue producido por la transformacin completa de
3-methycatechol por las clulas de FLU100 crecido en benceno,
seguido de la posterior separacin de las clulas. El final
concentracin de 2-ML se ajust a aproximadamente 1,7 mmol l-1
.
Esta solucin se dividi y se aade a dos cultivos lquidos de
FLU100 tensin pre-cultiva en tolueno. Una de estas culturas
se ha complementado con la PAC. Ambos cultivos
transformado 2-ML sin mostrar fase de latencia en la transformacin
tasas de 0,35 mmol l-1 h-1 OD-1 (cultivo sin PAC) y
0,17 mmol l-1 h-1 OD-1 (con CAP), respectivamente. La transformacin
tarifa sin CAP fue dos veces mayor, porque
la formacin de nuevas enzimas era posible (Fig. 3). Los
GRAFICA
Para identificar otros intermedios de 2-ML degradacin
va, los anlisis se realizaron mediante el uso de HPLCs con
un detector de dispersin de luz por evaporacin (HPLC-ELSD) o
un espectrmetro de masas (HPLC-MS). Sin embargo, ni
metabolitos de degradacin de 2-ML eran reproducible