Modificao da informao gentica (II)

Principais mecanismos que geram variabilidade gentica nas bactrias e

contribuem para o processo de evoluo:
. Mutao
. Transposio
. Transferncia de genes ( veiculada por plasmdeos ou bacterifagos)
. Recombinaes entre regies das molculas do DNA

Mutao- qualquer alterao permanente de uma sequncia de

bases do DNA, mesmo que no tenha efeito detectvel no fentipo.
Pode levar ao estabelecimento de uma subpopulao.

Como surgem as mutaes ?

Espontneas
na ausncia de qualquer agente mutagnico
aleatrias; podem resultar de erros durante a replicao do
DNA
Baixa frequncia: ~ 10-8 por par de nucletidos e por
gerao
Induzidas
Desenvolvem-se aps exposio a um agente mutagnico,
que aumenta a frequncia de mutao.

Teste de Ames usado para despistar a potencial aco mutagnica de compostos

qumicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosmticos, pesticidas, etc.);
recorre a mutantes auxotficos de bactrias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.).
Neste teste, analisada a frequncia de reverso das clulas de mutante auxotrfico a
prototrficas por aco do composto a testar.

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Teste de Ames- deteco de compostos mutagnicos

Placa onde foi introduzido o

possvel agente mutagnico
maior n de colnias prototrficas
em relao histidina
do que na placa controlo

Placa controlo
(colnias de revertentes espontneos)

Estirpe ou clone- uma populao de clulas geneticamente idnticas

Gene- um fragmento de DNA em que a sequncia de bases, aps
transcrio e traduo, origina uma protena com uma sequncia de
aminocidos bem definida

Genoma- conjunto de todos os genes de um organismo.

Gentipo- conjunto de genes especfico que um organismo possui.

(Ex. his, his-)
- gene hisC (codifica para protena HisC); hisCFentipo- propriedade observvel. A expresso fenotpica profundamente
influenciada por factores ambientais.
Ex. Estirpe His+ versus estirpe His-

Mutao espontnea
Tautomerismo de basesresulta de erros na replicao
do DNA devido incorporao
de nucletidos contendo formas tautomricas raras das
bases.

Os nveis de mutao espontnea

so controlados pela actividade
de polimerases 5-3 e
exonucleases 3-5
(reconhecimento e reparao
de erros durante a replicao
do DNA)

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Mutao espontnea por transio

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Neste tipo de mutao uma purina substituda por outra purina

diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina diferente)
ex: G
A
C

Outras causas de mutaes espontneas:

- radicais de oxignio (p.ex. Guanina 8-Hidroxiguanina)

Mutao
pontual

Adio e eliminao de bases

Seta azul
indica a direco da
replicao
Hipotticamente, pode ocorrer
um escorregamento numa das
cadeias (cadeia em formao
ou parental) que leva
formao de um lao
estabilizado por ligaes de HA continuao da replicao
de DNA leva adio ou remoo
de nucleotdeo(s), respectivamente.
Adio de 1 T
Eliminao de 2 Ts

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Transposio

(~750 1600 bp)

Tn-5
Canamicina (resistncia)
Tetraciclina (resistncia)
Tn-10
Tn-1681 Heat-stable enterotoxin formation (virulncia)
- requer a enzima transposase e extremidades contendo sequncias de repetio
invertida (IR); recombinao no-homloga
- em clulas do tipo procaritico e do tipo procaritico
- sequncias de insero so transposes simples
Transposes complexos podem transportar genes diversos (p.ex. Genes que conferem resistncia a
antibiticos ou a metais pesados, genes que codificam para toxinas, etc)

A mutao pode ocorrer por insero de uma sequncia de insero ou de um

transposo complexo dentro da sequncia codificante de um gene ou na sua
regio reguladora.
Consequncias possveis:
- paragem prematura da traduo por introduo de um codo stop;
- interrupo da sequncia codificadora de um gene;
- activao da transcrio de um gene (o transposo pode transportar uma regio reguladora);
- transferncia de genes para plasmdeos, ou de plasmdeos para o cromossoma;
(P.ex. Os transposes complexos que transportam genes de resistncia a antibiticos
podem contribui para a criao de plasmdeos R e para a disseminao
deste fenmeno entre bactrias)

Efeito das mutaes ao nvel das protenas

Molcula de DNA
normal
Protena normal

Mutao "missense"
Mutao pontual num
codo pode levar substituio
de um aminocido por outro,
resultando numa protena
diferente (p.ex. inactiva)

Mutao "nonsense
(sem sentido)
Origina o aparecimento
de um codo STOP, tendo
como consequncia a produo
de uma protena truncada,
sem actividade

Mutao "frameshift
(mutao desfasada)
A adio ou eliminao de
pares de bases no mltiplos
de 3, leva alterao da grelha de leitura aberta do
segmento de DNA que
codifica para uma protena

Expresso das mutaes

A deteco de mutantes numa populao microbiana s posvel se as alteraes
ocorridas no patrimnio gentico do microrganismo causar uma alterao de fentipo

"Forward mutation (mutao directa)

Gene
selvagem

gene mutado

protena modificada

Forward

Estirpe selvagem

Mutante

Contudo, a seguir a uma primeira mutao directa, podem seguir-se mutaes

(mutao inversa ou mutao supresso) que restabelecem o gentipo selvagem
ou um gentipo equivalente ao que existia antes da 1 mutao

restabelecimento do fentipo original

"Reverse mutation" (mutao inversa)

AAA (K, Lys)

Forward

selvagem

UCC (S, Ser)

selvagem

GAA (E, Glu)

Reverse

mutante
Forward

UGC (C, Cys)

mutante

AAA (K, Lys)

selvagem

Reverse

AGC (S, Ser)

selvagem


"Suppressor mutation" (mutao supresso)

As mutaes de supresso (alterao compensatria) podem restabelecer
o fentipo original. Podem ser intragnicas ou extragnicas
Ex. mutao supresso intragnica

K
S
P
S
L
R
A
AAG AGU CCA UCA CUU AAU GCC
(-A)
(+G)

Selvagem

AAG GUC CAU CAC UUA AUG GCC

K
V
H H
L
M
A

Mutante
duplo

Mutao silenciosa
Devido degenerescncia do cdigo gentico, nem todas as
mutaes so expressas fenotipicamente. Em muitos codes,
a modificao na 3a base uma mutao silenciosa.
GCU
A

GCC, GCA, GCG

A
A
A

Mutao neutra
Resulta na codificao de um aminocido diferente, mas
funcionalmente equivalente
AAA
K
Lisina

AGA
R
Arginina

(aminocidos com cadeias laterais inicas)

Mutaes induzidas
 Agentes mutagnicos

Qumicos

Fsicos
Exemplo:

Radiao UV

 Preparao e seleco de mutantes

Agentes mutagnicos
- so agentes que aumentam a taxa de mutao (~ 1000 x)
Taxa de mutao- a probabilidade de haver uma mutao
num gene quando a clula divide. A taxa de mutao espontnea
num determinado gene de 10- 8 (1 mutao em cada 108 genes
que replicam)

Os agentes mutagnicos so frequentemente usados em laboratrio para a

produo de mutantes para investigao ou melhoramento
de estirpes para fins biotecnolgicos
Seleco de mutantes
Para fins biotecnolgicos, os mutantes obtidos por manipulao
gentica so mais difceis de aceitar

Deteco e seleco de mutantes

Tipo de mutantes

Seleco

Bioqumicos- levam a alteraes

metablicas

- Auxotrficos
- Tm mutaes em vias metablicas
- Necessitam de um produto de uma
via metablica no meio de cultura,
porque no so capazes de o sintetizar

- Prototrficos
Crescem em meio mnimo
(sem suplementos adicionais)

Exemplos
Auxotrficos para a sntese de
aminocidos, vitaminas, etc.

- Placas rplica com meio de cultura

completo e meio mnimo

Mutantes nutricionais (auxotrficos Lys-)

obtidos por rplica plating

"Master plate "

Meio de crescimento
completo (contendo lisina)

(os mutantes Lys- esto assinalados

com um x)

" Replica plate "

Meio mnimo
(sem lisina)

Seleco indirecta (negativa)- replica plating

1) Tratamento com
agente mutagnico

2) Seleco de mutantes
auxotrficos para a
Lisina (Lys-)

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Por exemplo, a tcnica de

replica plating
usada para identificar
mutantes que perderam a
capacidade de
sintetizar um nutriente
essencial (so auxotrficos
em relao a esse nutriente)

A seleco indirecta
permite detectar

Mutantes bioqumicos e
mutantes condicionais
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Mutantes nutricionais (auxotrficos Lys-)

obtidos por rplica plating

"Master plate "

Meio de crescimento
completo (contendo lisina)

(os mutantes Lys- esto assinalados

com um x)

" Replica plate "

Meio mnimo
(sem lisina)

Deteco e seleco de mutantes

Tipo de mutantes

Seleco

Bioqumicos- levam a alteraes

metablicas

- Auxotrficos
- Tm mutaes em vias metablicas
- Necessitam de um produto de uma
via metablica no meio de cultura,
porque no so capazes de o sintetizar

- Prototrficos
Crescem em meio mnimo
(sem suplementos adicionais)

Exemplos
Auxotrficos para a sntese de
aminocidos, vitaminas, etc.

- Placas rplica com meio de cultura completo

e meio mnimo

Deficientes na capacidade de
fermentar acares

- Meio contendo um indicador de pH

Tipo de mutantes

Seleco

Morfolgicos

Anlise da morfologia colonial

(cor, mucosidade)
Ex: mutantes pigmentados e
despigmentados de Aspergillus nidulans

de Resistncia (resistentes)
Crescimento em meio de cultura que contm
concentraes seleccionadas do agente de
resistncia (ex. toxina, antibitico, etc.)
Ex: Desenvolvimento de colnias resistentes
a um antibitico

Seleco directa

A seleco directa permite

detectar mutantes morfolgicos,

mutantes de resistncia
e mutantes prototrficos
(a partir de populao de
mutante auxotrfico)

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Teste de Ames usado para despistar a potencial aco mutagnica de compostos

qumicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosmticos, pesticidas, etc.);
recorre a mutantes auxotficos de bactrias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.).
Neste teste, analisada a frequncia de reverso das clulas do mutante auxotrfico a
prototrficas por aco do composto a testar.

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

 Exemplos de agentes mutagnicos

Qumicos

Fsicos
Exemplo:

Radiao UV

Incorporao de anlogos de bases

Ex: 5-bromouracilo

Nos anlogos de bases

existe maior frequncia
da forma enol rara

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

A molcula de 5-bromouracilo incorporada no DNA em lugar de

timina, mas muitas vezes emparelha com guanina. O crescimento
de uma populao de clulas na presena deste anlogo origina
uma descendncia de clulas onde ocorreu substituio de bases
(par A-T par G-C).

Agentes alquilantes
Emparelhamento errado de bases
Agentes:
Hidroxilamina
Metanossulfonato de etilo (EMS)
Metanossulfonato de metilo (MMS)
N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
Posies de alquilao:
N7 e O6 da guanina
N3 da adenina
O4 da timina

A alquilao de purinas (A, G)

tambm torna mais lbil a sua
ligao desoxirribose
depurinao do DNA
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

Desaminao oxidativa das bases por aco de HNO2

A adenina desaminada a
hipoxantina a qual forma
ligao com citosina em
vez de timina

A citosina desaminada a
uracilo, o qual liga a adenina
em vez de guanina

A guanina desaminada a
xantina, a qual continua a
emparelhar com citosina,
mas s por duas ligaes de
hidrognio

Ligao mais lbil

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

cido nitroso como agente mutagnico

(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

A adenina desaminada emparelha com a citosina

O cido nitroso pode ser gerado na gua a partir de NO2- (nitrito; poluente da gua)

Agentes que se intercalam entre

as bases da cadeia dupla de DNA
Estes agentes qumicos intercalam-se entre as bases do DNA
formando um "lao" numa das cadeias. Quando ocorre replicao,
uma ou mais bases podem ser inseridas ou eliminadas.
Estes agentes causam mutaes do tipo "frameshift".
Exemplos:
-Brometo de etdeo
-Acridina laranja
-Proflavina

Agentes mutagnicos fsicos Radiao UV

Mutantes de interesse so seleccionados
entre as clulas sobreviventes.
Vantagem: eficiente e evita o recurso a
compostos qumicos (que so txicos)

Realizar seleco de mutantes na

ausncia de luz visvel
(mutao pode ser eficientemente
reparada por aco fotoqumica)