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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

PROCEDIMIENTO BSICOS
TABLA 3: PROCEDIMIENTOS BSICOS EN MICOLOGA
Toma de muestras
Examen directo (ED)
Cultivo
Identificacin

TOMA DE MUESTRA
Reviste una importancia primordial. El diagnstico va a depender en buena medida de la calidad de la muestra que va a procesarse. No debemos olvidar, pues, algunos condicionantes
bsicos a la hora de la recogida de muestras en las dermatomicosis.
a) Asegurarse de que no haya habido tratamiento antifngico previo, sobre todo sistmico.
En tal caso, demorar la toma de muestras hasta pasadas al menos dos semanas.
b) Recoger una cantidad suficiente de material patolgico.
c) Utilizar el instrumental adecuado al tipo de muestra de que se trate.
El instrumental para la toma de muestras comprende pequeos utensilios adecuados para
practicar el raspado de las lesiones y obtener las escamas y fragmentos de pelo que van a
estudiarse. A tal fin, pueden emplearse hojas de bistur, curettes, plumillas metlicas o incluso los bordes de los portaobjetos. Nosotros adoptamos hace tiempo el uso de los vacinostilos, que ofrecen mltiples ventajas: son estriles, desechables, fciles de obtener, de coste
muy bajo, y su forma permite emplearlos tanto para raspar en superficie mediante su extremo plano, como para obtener material del lecho ungueal en las onicomicosis por medio de
su extremo punzante. En las micosis ungueales, sin embargo, preferimos tomar la muestra
con la pequea cucharilla del cuchillo de Le Cron, un instrumento de uso habitual en odontologa y fcil de encontrar en las tiendas o proveedores de instrumental mdico (Fig. 1).

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Comenzamos por limpiar bien la zona sospechosa con alcohol o lavado jabonoso, eliminando restos de pomadas, suciedad y restos epidrmicos. Nos aseguramos de que no ha existido tratamiento antifngico en los ltimos das, en caso afirmativo lo suspendemos y retrasamos la toma una o dos semanas.
Diferenciamos una serie de detalles para la toma micolgica segn la realicemos, en una pitiriasis versicolor, una tia, una candidosis o en micosis ungueales (Tabla 4).

TABLA 4: TOMA DE MUESTRAS


1. PITIRIASIS VERSICOLOR
2. TIAS
Tias del pelo
Tias de la piel lampia
3. CANDIDOSIS
Candidosis cutneas
Candidosis mucosas
4. MICOSIS UNGUEALES

PITIRIASIS VERSICOLOR
Lo ms sencillo, es el raspado de las escamas furfurceas y finas de las lesiones con el
borde de un portaobjeto, depositando el producto del raspado en otro portaobjeto que colocamos en posicin horizontal bajo la lesin.
Existen otros procedimientos entre los que destacamos la utilizacin de la cinta adhesiva
(cello, cinta adhesiva), con la que presionamos fuertemente sobre la lesin y a continuacin
pegamos en un portaobjeto. La maniobra tambin puede llevarse a cabo con un portaobjeto en
el que hemos depositado previamente unas gotas de cola de contacto de cianocrilato.
Esperando unos segundos, la aplicamos sobre una plaquita de la enfermedad, al endurecerse
la cola y retirar el portaobjeto arrancamos la superficie escamosa, lista para teir (Figs. 2, 3).

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Fig. 2. Pitiriasis toma con fixo

Fig. 3. Pitiriasis toma con portaobjeto

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TIAS
Sin olvidar las premisas indicadas al principio, describiremos la toma segn sea la tia de piel
lampia o glabra (sin cabellos), de zonas pilosas o bien de uas.
Toma de muestra de piel lampia
(Tinea corporis, tinea faciei, tinea cruris, tinea manuum y tinea pedis).
Raspamos en la periferia de la lesin, ya que la zona central de la misma, redondeada casi
siempre, est escasamente parasitada. Lo realizamos con un bistur, vacinoestilo, escalpelo
o con el borde de un portaobjeto. Recogemos en otro portaobjeto las escamas, las guardamos entre dos portaobjetos e identificamos con sumo cuidado la toma. Si la lesin presenta
vesculas (tinea pedis, tias inflamatorias) rompemos las mismas (Figs. 4-6).

Fig. 4. Tia toma con portaobjeto

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Fig. 5. Tia toma con portaobjeto

Fig. 6. Tia toma vacionestilo

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Toma de muestra de zonas pilosas
(Tinea capitis, tinea barbae).
Lo ms sencillo es raspar enrgicamente el borde de la lesin con lo que obtenemos no slo
escamas sino tambin pelos parasitados. Es til el uso de pinzas de depilacin para obtener
pelos parasitados, que no ofrecen resistencia a la traccin, y que nos permiten el examen
directo del parasitismo piloso en el cultivo. En las tias inflamatorias de estas localizaciones
o bien, obtenemos los pelos como hemos indicado, o simplemente tomamos el material purulento con un hisopo bacteriolgico estril. En ocasiones, se lleva a cabo con cepillos de plstico
estriles o bien, con un fragmento cuadrado de moqueta estril, con los que frotamos la zona
sospechosa, y a continuacin se inoculan directamente las placas de Petri con el medio. No
hay que olvidar que los cabellos o pelos de la barba sanos (ofrecen resistencia a la traccin)
obtenidos con pinzas no estn parasitados y por tanto, no son tiles para el estudio. La luz
de Wood puede ser til en algunas tias causadas por Microsporum, al permitir encontrar
ms fcilmente los pelos parasitados por su fluorescencia verdosa (Figs. 7.1,7.2, 8).

Fig. 7.1. Tia toma zona pilosa

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Fig. 7.2. Tia toma zona pilosa

Fig. 8. Tia barba, toma pelo

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El material as obtenido en las diversas formas se puede depositar directamente en el portaobjetos para el examen directo, en una placa de Petri estril o en un sobre estril.
Llamamos de nuevo la atencin en el cuidado de la identificacin correcta de la muestra.
Para terminar, recordar que en las lesiones inflamatorias, las costras, secreciones y pelos,
especialmente los centrales, no suelen contener hongos, por ello es necesario eliminarlos
previamente. Y siempre es positivo realizar la toma en los bordes de la lesin.
CANDIDOSIS
Diferenciamos segn la localizacin mucosa, cutnea o ungueal. En las mucosas (boca,
genitales, ano) la recogida se puede realizar con hisopo bacteriolgico de algodn estril, o
con esponjas de poliester humedecidas previamente en medios de cultivo lquido. En orofaringe, asimismo, podemos realizar enjuagues con suero fisiolgico, que se siembra sobre
una placa de Petri con medio slido y permite hacer recuento del nmero de colonias.
En las lesiones de piel la recogida la realizamos con el mtodo descrito en las tias, pero
sealando que es ms aconsejable el fondo del pliegue para la toma. Si la lesin es hmeda utilizamos un hisopo estril (Figs. 9,10).

Fig. 9. Candidosis, toma bucal

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Fig. 10. Candidosis, toma en pliegues

En la toma de las candidosis es preciso, no olvidar las condiciones previas pero, especialmente, tener en cuenta las condiciones de traslado al laboratorio, para evitar la desecacin
del material, ya que las candidas no sobreviven ms de 24 horas en una toma seca. Por ello,
es aconsejable utilizar hisopos con dispositivo de humedad, y siempre intentar que la muestra llegue inmediatamente al laboratorio.
MICOSIS UNGUEALES
Los resultados del estudio micolgico van a depender en gran medida de la tcnica utilizada
para la obtencin de muestras. En las uas hay que extremar el cuidado, dado el alto porcentaje de falsos negativos.
La tcnica consiste en recortar con tijeras (alicates de podlogo para uas de pies), procurando llegar hasta la frontera entre la invasin fngica y la zona de ua sana, lugar donde los
hongos son viables y por tanto cultivables. A continuacin raspar con el extremo romo
(cucharilla) del cuchillo de Le Cron. Tambin se puede realizar con escarpelos, curetas o con
el mismo ngulo del portaobjeto. Asimismo, puede utilizarse una fresa rotatoria (pequeo
taladro) o incluso una biopsia punch ungueal.
El material as obtenido se deposita entre dos portaobjetos, en una placa de Petri estril o en
un sobre estril. Repartimos el material obtenido, para examen directo y para los diversos
cultivos. Es aconsejable realizar, antes de la toma, un lavado enrgico y asegurarnos que no
ha existido tratamiento antifngico previo. Con estos cuidados hemos mejorado muy positivamente los porcentajes de falsos negativos (Figs. 11,12).

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Fig. 11. Toma ungueal. Primero recortar

Fig. 12. Toma ungueal. Segundo raspar

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EXAMEN DIRECTO (KOH)


Se denomina Examen Directo (ED) a la tcnica diagnstica cuya finalidad estriba en detectar u observar el agente infeccioso directamente en la muestra patolgica, con ayuda de unos
reactivos o colorantes simples. A diferencia de la histopatologa, la muestra destinada al examen directo no necesita fijacin ni preparacin previa, y la observacin puede llevarse a cabo
de forma inmediata.
No participamos en la afirmacin de facilidad o sencillez con que se refieren la mayora de
los autores al ED, porque necesita un aprendizaje detallado; pero si compartimos la idea de
que es una tcnica muy prctica para identificar con rapidez la presencia de dermatofitos,
levaduras y mohos.
La tcnica es bien simple. Sobre el material que habamos destinado a ello en un portaobjetos se deposita una gota del reactivo elegido, habitualmente una solucin de potasa, y se
cubre con un cubreobjetos. Es indispensable calentar ligeramente la preparacin a la llama
de un mechero, y presionar suave y repetidamente con el mango del asa sobre el cubre,
hasta que la muestra aparezca completamente disociada, es decir, hasta que el material queratinoso se haya disuelto bajo la accin de la potasa.
Acto seguido, se procede a la observacin al microscopio, utilizando primero los aumentos
bajos (10X) y acto seguido, los altos (20X y 40X). El objetivo de inmersin no suele ser
necesario.
El Examen Directo es una tcnica sumamente rentable. La dificultad radica fundamentalmente
en la aparicin de una serie de artefactos, que luego citaremos, que se asemejan en gran
medida las verdaderas hifas del micelio. La solucin a esta dificultad radica en hacer una
adecuada preparacin, la utilizacin del disgregante-colorante ms idneo y la prctica diaria de la observacin microscpica, o sea de la experiencia personal. Describimos la tcnica
detalladamente (Figs. 13.1-13.4,14).

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1. Preparacin: Depositamos una porcin del material obtenido (escamas, pelos, uas) en
un portaobjetos, aadimos unas gotas del disgregante-colorante, se mezcla, se fragmenta
mecnicamente (con la ayuda de un punzn), se coloca un cubreobjetos y se flamea suavemente evitando la ebullicin. Si la muestra se obtuvo mediante torunda o escobilln puede
practicarse el examen directo frotando un poco del mismo en un portaobjeto. A continuacin
aplicamos:
Disgregante-colorante: Sustancias que facilitan la observacin de filamentos, produciendo
una separacin de las escamas y fragmentos de uas. La ms usada es el hidrxido de potasio (KOH) en agua destilada al 20-40%. La capacidad disgregante de la potasa, para cabellos y uas, aumenta si le aadimos dimetilsulfsido. Si le agregamos glicerina, aumenta la
duracin de la preparacin hasta 48 horas, ya que evita la formacin de cristales de potasa.
La observacin se facilita aadiendo un colorante a la potasa. El ms usado era la tinta azul
negra Parker Superchrome. En la actualidad, se est utilizando la solucin de SwartzLamkins, que da resultados similares a la antigua frmula. Existen numerosos colorantes
como el clorazol, lactofenol, tcnicas de fluorescencia, pero no se utilizan de rutina en el
laboratorio.
2. Observacin: Se realiza mediante microscopio ptico, mejor con condensador de contraste de fase, ya que los elementos fngicos son refringentes. Comenzamos con un pequeo aumento (x 10), para tener una visin panormica de las escamas y buscar mejor la posible presencia de filamentos. Para confirmarlo, pasamos a un mayor aumento (x 40).
3. Interpretacin: Comentaremos los dermatofitos, las levaduras, los mohos y terminaremos
describiendo algunos artefactos.
Los dermatofitos aparecen de forma diferente segn estudiemos las escamas o el pelo. En
el ED de las escamas se presentan como filamentos hialinos, de bordes ntidos y regulares,
de paredes paralelas, septados (este hecho es muy importante) y con la presencia de ramificaciones, que toman color azul. No tienen relacin con los bordes celulares, a los que atraviesan sin orden determinado. A menudo, estas hifas se muestran fragmentadas en artroconidias cuboidales. Este patrn diagnostca genricamente a los dermatofitos, pero no podemos precisar la especie (Figs. 15.1,15.2,16.1,16.2).

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Fig. 15.1. ED KOH x 100

Fig. 15.2. ED KOH x 400

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Fig. 16.1. ED KOH

Fig. 16.2. Examen directo. KOH tinta Parker. X1000

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Si estudiamos el pelo tenemos que precisar que la "utilizacin" de la queratina de los pelos
por los dermatofitos curiosamente vara segn sea "in vivo" o "in vitro".
"In vivo" presenta dos patrones fundamentales, bien sea el parasitismo interior al pelo
(endotrix) o exterior al mismo (ectotrix). Este proceder s nos permite identificar la especie.
El patrn endotrix tiene a su vez dos tipos: Uno, artrosporado, que es el genuino endotrix,
que presenta todo el interior del pelo repleto de cadenas de conidios, artrosporados, de 3-4 nm
de dimetro (T. tonsurans, T. violaceum). Otro tipo de endotrix es el fvico, dentro del pelo
encontramos filamentos dispuestos a lo largo del mismo, ondulados unos, ramificados otros.
Son tpicas las burbujas de aire (T. schoenleinii) (Fig. 17).

Fig. 17. Examen directo de Tinea capitos. Parasitismo endotrix. KOH-tinta. X400

El patrn ectotrix presenta as mismo tres modelos: Uno, tipo en mosaico, en el que las
esporas son pequeas (2-3 nm dimetro), redondas, formando una densa y compacta vaina
alrededor del pelo, que no se dispersa con la potasa. En el interior del pelo hay filamentos
(M. canis, M. audouinii). Otro, tipo microide, presenta tambin pequeas esporas (2-4 nm
de dimetro), pero dispuestas de forma irregular en el exterior del pelo, ya que son fcilmente dispersables con la KOH, filamentos en el interior (T. mentagrophytes, T. rubrum,
M. gypseum). Y un tercero, tipo megasporado, con esporas de mayor tamao (4-6 nm), en
el exterior del pelo, dispuestas en grumos o racimos y otras sueltas. Filamentos intrapilares
(T. verrucosum) (Fig. 18).

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Fig. 18. Examen directo de Tinea capitis. Parasitismo ectotrix en mosaico. KOH-tinta.X400

TABLA 5: EL PARASITISMO PILOSO DE LOS DERMATOFITOS


Artrosporado

T. violaceum
T. tonsurans

Fvica

T. schoenleinii

En mosaico

M. canis
M. audouinii

Microide

T. mentagrophytes
M. gypseum

Megasporado

T. verrucosum

ENDOTRIX

ECTOTRIX

"In vitro" algunos dermatofitos atacan el pelo de una determinada forma, lo que constituye
una prueba de diagnstico diferencial, como es la produccin de rganos perforantes, que
se utiliza para diferenciar el T. mentagrophytes del T. rubrum, el primero produce rganos
perforantes y el segundo no (Fig. 19).

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Las levaduras suelen presentarse bajo el aspecto de blastoconidias en gemacin y pseudomicelio. Su observacin puede plantear mayores dificultades que la de los dermatofitos. En
el caso de la pitiriasis versicolor, la imagen es patognomnica, estando constituida por una
mezcla de blastosporos singulares provistos de un ntido collarete de gemacin y pseudomicelio corto y grueso. Todos estos elementos se tien con gran rapidez mediante la tinta
Parker azul permanente o el colorante de Swartz-Lamkins (Fig. 20).

Fig. 20. Examen directo de queilitis candidiasica. Blastoconidias y pseudomicelio. KOH-tinta X1000

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Las gotas de grasa pueden tomarse por clulas de levadura, aunque su esfericidad, su distinta tonalidad y su variado tamao ayudan a distinguirlas.
La imagen conocida como hongo en mosaico (mosaic fungi) puede resultar muy engaosa, ya que estas estructuras, constituidas por cristales de colesterol y de otras substancias,
se parecen mucho a las artroconidias de los dermatofitos, de las que pueden diferenciarse
por su disposicin a lo largo del borde de las clulas epidrmicas y por su forma irregular.
Finalmente, de modo ocasional, pueden observarse en los exmenes directos macroconidias, que en ningn caso corresponden a dermatofitos, siendo la mayora de las veces, testimonio de la presencia de un moho contaminante u oportunista.
Para terminar, haremos unos breves comentarios: el examen directo es interesante, rpido,
aproximativo, pero repetimos, no permite distinguir las diversas especies de dermatofitos. Es
fcil cuando es positivo, es difcil cuando es negativo. El examen directo no excluye el cultivo,
que es imprescindible para el diagnstico de las diferentes especies de dermatofitos.
SIEMBRA/CULTIVO
El Examen Directo puede permitirnos detectar la presencia del agente causal en la muestra
patolgica, pero nada o casi nada nos dice de la identidad de ese agente, salvo muy limitadas excepciones (Malassezia globosa en la pitiriasis versicolor y Scopulariopsis brevicaulis
en ciertas onicomicosis). El diagnstico definitivo de una micosis requiere un segundo paso:
el aislamiento e identificacin del hongo responsable de la misma, mediante cultivo.
El cultivo se lleva a cabo depositando una cantidad de la muestra patolgica en la superficie
de uno o varios medios de cultivo, dispuestos en recipientes que pueden ser de dos tipos:
tubos y placas. Nosotros preferimos las placas de Petri, de 9-10 cm de dimetro, porque permiten una mejor disposicin del inculo y facilitan la observacin y el estudio de las colonias.
Tienen la desventaja de ofrecer ms riesgo a la contaminacin, pero este problema puede
limitarse con la adicin de ciertos antibiticos y practicando las siembras cuidadosamente
(trabajando siempre junto a la llama del mechero) (Figs. 22.1-22.3, 23.1, 23.2, 24.1, 24.2).

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Las placas o tubos, una vez inoculados, se incuban a temperatura ambiente o, mejor, en estufa a 25C. Esta es la temperatura ideal para el desarrollo de la mayora de los agentes causantes de dermatomicosis, aunque algunos de ellos, como T. verrucosum o las levaduras del
gnero Candida crecen con mayor rapidez a 37C. El cultivo de las levaduras lipoflicas del
gnero Malassezia, que requieren temperaturas de 30C a 32C, no se lleva a cabo de forma
rutinaria, por no ser indispensables para el diagnstico de la pitiriasis versicolor, pero constituye un prometedor campo de investigacin en otras dermatosis y es posible que se generalice en el futuro.
Cuando la incubacin se realiza en estufa, a temperaturas por encima de los 30C, o cuando se prolonga ms all de las dos semanas, es aconsejable disponer las placas en bolsas
de plstico cerradas, para evitar la desecacin del medio.
IDENTIFICACIN
Los cultivos deben examinarse peridicamente a lo largo del tiempo de incubacin, y no
deben desecharse como negativos hasta transcurridas tres semanas a partir de su siembra.
Debe vigilarse la aparicin de cualquier tipo de colonia, levaduriforme o filamentosa, teniendo en cuenta que los hongos contaminantes que pudieran estar presentes en el material
patolgico, o introducirse en el medio al practicar las siembras o durante la incubacin, crecen con ms rapidez que los patgenos, pudiendo fcilmente cubrirlos o ahogarlos en pocos
das, impidindonos su aislamiento (Fig. 25).
Las colonias sospechosas, una vez detectadas, deben replicarse en medios frescos si se
observa contaminacin. Una vez se estima alcanzada la madurez de la colonia, se procede
a anotar sus caractersticas macromorfolgicas, esto es su color, textura (granulosa, pulverulenta, anteada, vellosa, algodonosa o glabra), superficie (plana, elevada, plegada, crateriforme) y color del reverso. Con la prctica, el aspecto macroscpico de las colonias a menudo
basta para orientar la identificacin de la especie, al menos en los hongos filamentosos, de
modo similar a lo que ocurre con las plantas.
Esta observacin debe completarse siempre con el estudio de los caracteres micromorfolgicos, lo que llevaremos a cabo tomando una muestra de la superficie de la colonia por medio
de un papel adhesivo transparente. ste, se coloca acto seguido sobre un portaobjeto en el
que previamente habremos depositado una gota de la solucin colorante, habitualmente azul
de lactofenol. La observacin se realiza al microscopio, generalmente, con aumentos bajos
(de x 100 a x 400) y debe centrarse en la morfologa de las estructuras reproductoras, en
especial, los distintos tipos de conidias.
En aquellos casos en que la micromorfologa no permita alcanzar una identificacin definitiva
de la especie aislada, se recurre a ciertas tcnicas auxiliares (tests fisiolgicos o bioqumicos) que se detallan en los captulos correspondientes. Esto reza sobre todo para las levaduras, cuya morfologa es mucho ms pobre que la de los hongos filamentosos.

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Examen macroscpico
En primer lugar observaremos si la colonia tiene aspecto levaduriforme (como gota de
queso fundido) (Fig. 25 A) o filamentoso (vulgarmente moho). En el segundo supuesto anotar si el crecimiento es muy rpido (mohos) (Fig. 25 C) o lento (dermatofitos) (Fig. 25 B). En
general, para los dermatofitos, es solo orientativo, pero con experiencia podremos sospechar las especies mas frecuentes en nuestro medio: E. floccosum, M. canis, M. gypseum,
T. mentagrophytes, T. rubrum, T. violaceum, T. verrucosum...
Realizamos la observacin con el siguiente orden:
1. Color: Tanto del anverso (micelio areo): blanco, crema, amarillo, anaranjado, rojo, violeta...; como del reverso (micelio vegetativo): amarillento casi siempre, puede ser rojo,
marrn, violeta o sin color.
2. Superficie: Pulverulenta, vellosa, aterciopelada, algodonosa...
3. Relieve: Plano, crateriforme, elevado cupuliforme, radiado...
4. Borde: Neto, con vellosidades...
5. Velocidad de crecimiento: Similar para casi todos (+/- 10 mm/semana), lento (1 mm/semana):
T. verrucosum, T. violaceum.

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Debemos tener en cuenta que los caracteres morfolgicos de los dermatofitos varan segn
las condiciones del cultivo, tipo de medios, temperatura y en especial para el color, la luz que
reciba la colonia. Por esto, la experiencia personal para las cepas del propio laboratorio es
tan valiosa. Algunos medios naturales (harina de maz, patata, etc.) estimulan la produccin
de pigmentos y otros medios artificiales como el DTM, especfico para los dermatofitos, colorean el medio.
Examen microscpico
Se lleva a cabo de una manera sencilla obteniendo un fragmento del cultivo, con esptula o
con un trozo de cinta adhesiva, de la zona central de la colonia y montndolo entre porta y
cubre, con unas gotas de azul de lactofenol, permite observar al microscopio ptico (x 100,
x 400) los caracteres microscpicos del micelio fngico.
1. Micelio tabicado, hifas septadas, ramificadas, formando una maraa. Observamos la periferia de la misma para encontrar conidias (macro y microconidias) o bien algunas estructuras morfolgicamante interesantes para el diagnstico micolgico.
2. Conidias: Microconidias, son unicelulares, pequeas, redondas, ovales o piriformes.
Presentan dos tipos de disposicin: a lo largo de la hifa (tipo acladium) en forma de racimos (cruz de Lorena). Unas veces son sesiles, otras nacen sobre cortos esterigmas. Las
macroconidias, son multicelulares, grandes, con tabiques transversales. Existen diversos
tipos: fusiformes, en raquetas y en lpiz o maza. A su vez pueden tener las paredes gruesas o finas, ser lisas o rugosas, aisladas o en racimos.
3. Estructuras morfolgicas especiales: Casi todas variantes de tamao y forma de las hifas
septadas:
Espirales: hifa fina enrollada en espiral.
Hifa en raqueta: ensanchamiento oval de una porcin media o terminal de una hifa.
Cuerpos nodulares: filamentos engrosados formando nudos sobre si mismo.
Candelabro fvico: divisin terminal de una hifa en dos o tres puntas engrosadas.
Hifa peptinada: pequeas prolongaciones en un solo lado de la hifa, que adopta as forma
de peine.
Hifa retrgrada: hifa que nace en sentido contrario, en ngulo agudo, al resto de las
ramificaciones.

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ESTRATEGIA DE LABORATORIO
Recordemos que la estrategia consiste en dividir el desarrollo del aprendizaje en tres niveles.
El primer nivel va destinado a todos los dermatlogos, aunque no tengan conocimientos de
laboratorio ni de micologa. El segundo nivel, est dirigido a aquellos dermatlogos que
poseen algunos medios, conocimientos y el inters cientfico de investigar los hongos. El
tercer nivel, va destinado a aquellos investigadores que trabajan con los hongos como
protagonistas.

TABLA 6: ESTRATEGIA EN PITIRIASIS VERSICOLOR


PRIMER NIVEL
Examen con luz de Wood
SEGUNDO NIVEL
Examen directo con cinta adhesiva
TERCER NIVEL
Identificacin especies Malassezia

ESTRATEGIA DE LABORATORIO DE LA PITIRIASIS VERSICOLOR


PRIMER NIVEL
Objetivo: Confirmar el diagnstico clnico de pitiriasis versicolor.
Mtodo: Aplicacin de luz de Wood. Observamos una fluorescencia amarilla, verde amarillenta. Aconsejamos oscuridad absoluta en la habitacin de exploracin, cerciorndose de
que no existe tratamiento previo de la lesin con cremas o ungentos porque imposibilitan la
fluorescencia. Podemos observar lesiones no perceptibles a simple vista. Lo nico que necesitamos es una lmpara de Wood, de fcil adquisicin en la actualidad. Este proceder,
aunque no sea propiamente de laboratorio, lo incluimos por su simplicidad y para complementar el signo clnico de la uada de Besnier. Es til tanto para confirmar el diagnstico
como para valorar la eficacia del tratamiento (Figs. 26.1, 26.2).

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Fig. 26.1. Pitiriasis 1 nivel luz de Wood

Fig. 26.2. Pitiriasis 1 nivel luz de Wood 2

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SEGUNDO NIVEL
Objetivo: Demostrar la presencia de Malassezia en unas lesiones clnicas sospechosas de
pitiriasis versicolor.
Mtodo: Examen directo de las escamas cutneas obtenidas con cinta adhesiva.
Presionamos con un fragmento de cinta adhesiva sobre una lesin tpica, lo separamos de
la piel y lo pegamos sobre un portaobjeto. Depositamos una gota de KOH al 20-30% (con
tinta azul Parker o bien la solucin de Swartz-Lamkins) en un cubreobjeto y observamos al
microscopio. Encontraremos racimos de clulas levaduriformes, redondeadas, de 4-8 micras,
con gemaciones y junto a estos racimos, podemos hallar filamentos cortos, tabicados e incluso ramificados. Esta imagen es patognomnica. Slo necesitamos cinta adhesiva, un portaobjeto y cubreobjetos, una gota de potasa y un sencillo microscopio (Figs. 27,28).

Fig. 27. Pitiriasis 2 nivel ED X400

Fig. 28. Pitiriasis 2 nivel ED X1000

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ESTRATEGIA DE LABORATORIO DE LAS TIAS O DERMATOFICIAS


TABLA 7: ESTRATEGIA EN LAS TIAS
PRIMER NIVEL
Cultivo en medio DTM/DTA
SEGUNDO NIVEL
Identificacin genrica de dermatofitos
TERCER NIVEL
Identificacin de las especies de dermatofitos frecuentes

PRIMER NIVEL
Objetivo: Demostrar si en una lesin dermatolgica sospechosa, existen o no dermatofitos,
con una finalidad epidemiolgica y fundamentalmente, teraputica.
Mtodo: Siembra en medio DTM/DTA.
Ya se ha comentado la toma de muestras para las tias, repasemos ahora la siembra: el
material que hemos obtenido, (escamas, pelos, fragmentos de uas) lo depositamos, con la
ayuda de un asa de platino estril, en la superficie del medio (tanto en tubo, como en placas
de Petri) en varios puntos.
La siembra en este primer nivel la realizamos en medio DTM o DTA y, a la semana, el medio
(que es de color amarillo miel) cambia el color a rojizo, slo y exclusivamente si el hongo que
crece es un dermatofito. Sin embargo, el medio no cambia de color si el hongo que crece no
es un dermatofito. No necesitamos microscopio, slo como indicamos en la siembra: un
mechero de alcohol, un asa de platino y un tubo/placa con el medio DTM o DTA (Fig. 31).

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Fig. 31.Tias 1 nivel cultivo en DTM

SEGUNDO NIVEL
Objetivo: Identificacin genrica y rpida de dermatofitos.
Mtodo: La realizamos mediante el examen directo y el parasitismo piloso.
Incluimos en este nivel el Examen Directo, y no lo hicimos en el primer nivel porque necesita
microscopio y, adems, porque, despus de muchos aos realizndolo, seguimos pensando
que representa cierta dificultad y precisa cierto aprendizaje y "oficio" de laboratorio. Con el examen directo incluimos el estudio del parasitismo piloso. Ambos representan algo muy interesante y rpido en el diagnstico de los dermatofitos como origen fngico de una dermatosis.
Examen directo (ED)
Recordamos y resumimos que los dermatofitos aparecen de forma diferente segn estudiemos
las escamas o el pelo. En el ED de las escamas se presentan como filamentos hialinos, de bordes ntidos y regulares, de paredes paralelas, tabicados (este hecho es muy importante) y con
la presencia de ramificaciones, que toman color azul. No tienen relacin con los bordes celulares, a los que atraviesan sin orden determinado. Este patrn diagnostca genricamente a
los dermatofitos, pero no podemos precisar la especie (Fig. 15.1, 15.2, 16.1).

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 32. E. floccosum colonia

Fig. 33. E. floccosum micro

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA


Punta fina: M. canis (Figs. 34, 35).
Presentan macroconidias grandes, de gruesas paredes, fusiformes, espinulosas, con sus
extremos puntiagudos, en ocasiones el distal en forma curva. Normalmente, son muy
numerosas. Tienen escasas microconidias, a veces abundantes. Las colonias son de
color amarillo anaranjado, ms acentuado en la periferia, de aspecto plumoso. Es un
hongo zooflico.

Fig. 34. M. canis colonia

Fig. 35. M. canis micro

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS


Punta redondeada: M. gypseum (Figs. 36, 37).
Presenta conidias grandes, gruesas paredes, espinuladas, muy parecidas hasta aqu a las
del M. canis, pero las puntas son redondeadas, menos agudas; asimismo, son menos
numerosas. Puede haber microconidias en racimos. La colonia es muy tpica, granulosa, de
color canela, que la diferencia a simple vista de la de M. canis. M. gypseum es un dermatofito geoflico.

Fig. 36. M. gypseum colonia

Fig. 37. M. gypseum micro

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 39. T. mentagrophytes micro

La presencia de hifas espirales es casi exclusiva de esta especie. Si lo unimos a los caracteres de la colonia: blanco ocre, pulverulento para la variedad mentagrophytes (zooflico) y blanco algodonoso para la variedad interdigitale (antropoflico), y a la presencia de numerosas
microconidias, redondeadas dispuestas en racimos, no tendremos dudas en el diagnstico.
En caso de duda sembramos en medio Agar-Urea, en el que T. mentagrophytes cambia el
color del medio (vira a rosa intenso/rojizo), mientras que T. rubrum no. Otra prueba diferencial
sera la formacin de rganos perforantes, que es positivo para T. mentagrophytes y negativa
para T. rubrum.
Si no existen hifas espirales: Siembra en medio potato dextrosa agar (PDA):
- Positivo (Colonia roja): T. rubrum (Figs. 40, 41).

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 40. T. rubrum. Colonia: izquierda en MGS, derecha en PDA

Fig. 41. T. rubrum micro

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS


Las colonias de T. rubrum presentan en este medio una coloracin rojiza, vinosa, especialmente en el reverso. Sus tpicas microconidias en lgrimas, estn dispersas o dispuestas a
ambos lados de las hifas (segn el tipo "acladium"). Hay escasas macroconidias en forma de
lpiz, finas, lisas y multiseptadas, muy semejantes a las que produce T. mentagrophytes.
Repasamos los caracteres diferenciales de T. rubrum, que en cierto modo ya han aparecido:
No hay formas espirales. Ureasa negativo. Formacin de rganos perforantes negativa y
especialmente positiva en medio potato dextrosa agar (PDA), con colonias de intenso y notorio color rojo-vino, especialmente en el anverso. Es un dermatofito antropoflico, con preferencia por la invasin de las uas.
- Negativo (colonia blanca): T. tonsurans (Figs. 42, 43).

Fig. 42. T. tonsurans colonia

Fig. 43. T. tonsurans. Microconidias. X400

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA


Visto as, el diagnstico deT. tonsurans es por exclusin y con dificultades. Nos ayuda en su
diagnstico el hecho de conocer que la toma micolgica procede de una tia de la cabeza,
de tipo puntos negros. No presenta hifas espirales. Las colonias son blancas en medio PDA
y forman microconidias redondeadas, que nacen con una base aplanada, muchas veces en
forma de clavo. Tambin, es tpica la presencia de clamidosporos terminales e intercalares.
Es un hongo antropoflico y en la actualidad en Espaa, apenas se asla.
De todas formas, dadas estas dificultades, es necesario en ocasiones recurrir al crecimiento
en medios agar-trichophyton, especialmente los nmeros 1, 2, 3 y 4, donde crece abundantemente en los n 3 y 4, pero no en los dos primeros (no tienen tiamina), mientras que
T. mentagrophytes y T. rubrum crecen bien en los cuatro medios.
SI NO EXISTEN NI MACRO NI MICROCONIDIAS
Tres especies pertenecientes al gnero Trichophyton, todas de crecimiento lento, no producen conidias normalmente, slo observamos hifas y algunos elementos que describimos a
continuacin.
Colonia violcea: T. violaceum (Figs. 44, 45).
Presenta colonias de crecimiento muy lento, pequeas, de consistencia crea, con un
color violeta oscuro (vino tinto), aterciopeladas, en el reverso se ve muy bien su coloracin. El crecimiento mejora en medios con tiamina (Agar trichophyton n 3 y 4). No produce conidias. Slo se observa una maraa de hifas de color violeta, con algunos engrosamientos intercalados, a veces en cadenas. Es un dermatofito antropoflico.
Hifas toruloides: T. verrucosum (Figs. 46, 47).
Lo que primero llama la atencin es el lento crecimiento de la colonia (30 das), crecimiento
que mejora si se incuba a 37C y en medios con tiamina (Agar trichophyton 3 y 4). Tambin
ciertos caracteres microscpico de la colonia: como ser crateriforme, de color ocre-amarillento a grisceo, superficie lisa y plegada, y suele penetrar en el agar.
Microscpicamente slo aparecen hifas, no conidias. En las hifas se intercalan cadenas
de clamidosporos, de diferentes tamaos, dando lugar a las tpicas hifas toruloides. Es
un hongo zooflico.

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Fig. 44. T. violaceum colonia

Fig. 45. T. violaceum micro

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Fig. 46. T. verrucosum colonia

Fig. 47. T. verrucosum micro

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

ESTRATEGIA EN EL LABORATORIO DE LAS CANDIDOSIS


TABLA 10: ESTRATEGIA EN LAS CANDIDOSIS
PRIMER NIVEL
Diagnstico del gnero Candida
SEGUNDO NIVEL
Diagnsitico de la especie C. albicans
TERCER NIVEL
Diagnstico de todas las especies de gnero Candida

PRIMER NIVEL
Objetivo: Diagnstico del gnero Candida. Demostrar si en una afectacin cutnea,
mucosa o ungueal, si existen o no levaduras pertenecientes al gnero Candida, con finalidad teraputica.
Mtodo: Siembra en medio glucosado de Sabouraud (MGS).
Recordamos las precauciones que deben tenerse en cuenta al realizar la toma micolgica.
Se efecta con hisopo (torunda) bacteriolgico estril en lesiones mucosas y lesiones cutneas hmedas, y en piel y uas, como indicamos en el captulo de toma micolgica. Hay que
prestar atencin a la escasa supervivencia de las candidas en la muestra por lo que es aconsejable la siembra inmediata. La siembra la realizamos en medio glucosado de Sabouraud
(MGS) con cloramfenicol, mediante el hisopo que utilizamos en la toma o con un asa de
platino. Incubamos a temperatura ambiente y a las 48 horas obtenemos unas colonias blancas o blanco-marfil, cremosas, brillantes, como gotas de queso fundido. Son colonias tan
tpicas, que son diagnsticas por si mismas. Lo nico que necesitamos es un hisopo estril,
un mechero de alcohol y un tubo o placa con medio glucosado de Sabouraud. En 24-48 horas
podemos hacer el diagnstico con una simple visualizacin del tubo o placa (Fig. 48).
SEGUNDO NIVEL
Objetivo: Identificacin de la especie C. albicans, imputada como causa de la mayora de
las candidosis.
Mtodo: Partimos de la colonia que nos ha crecido en el primer nivel, sobre medio de
Sabouraud y realizamos una resiembra en un medio especfico.

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 48 Candida, primer nivel, colonia blanca en MGS

Para simplificar esta identificacin se han propuesto numerosos medios, que tienen en
comn una rpida identificacin de C. albicans, basndose en el aspecto macroscpico y
color que adquieren sus colonias. Usamos el medio ChromAgar Candida, en el que la colonia
de C. albicans se tie de color verdoso, facilitando el diagnstico rpido y fcil. Slo necesitamos un asa de platino, un mechero de alcohol y una placa de medio CROMAgar candida
(Fig. 49).

Fig. 49 Candida, segundo nivel, colonia verde a la izquierda (C. albicans) en medio ChromAgar

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

PATRONES DE DIAGNSTICO DE LOS HONGOS MS


FRECUENTES:
DERMATOFITOS (FIGS. 54-73)

Fig. 54. E. floccosum. SGA. 2 semanas

Fig. 55. E. floccosum. Macroconidias. ALFX 1000

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Fig. 56. M. canis. SGA. Colonias de 2 semanas

Fig. 57. M. canis. Macroconidias (detalle). ALF X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 58. M. gypseum. SGA. Colonias de 10 das

Fig. 59. M. gypseum. Macroconidias. ALF X1000

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 60. T. mentagrophytes var. mentagrophytes. SGA. Colonias de 3 semanas

Fig. 61. T. mentagrophytes var. interdigitale. SGA. Colonias de 3 semanas

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 62. T. mentagrophytes var. mentagrophytes. Macro y microconidias. ALF X400

Fig. 63 T. mentagrophytes var. mentagrophytes. Microconidias y espirales. ALF X400

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 64. T. rubrum. SGA. Colonias de 3 semanas

Fig. 65. T. rubrum. PDA. Colonias de 3 semanas

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 66. T. rubrum. Microconidias. ALF X400

Fig. 67. T. rubrum var raubistchekii. Macro y microconidias. ALF X1000

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 68. T. tonsurans var sulphureum. SGA. 3 semanas

Fig. 69.T. tonsurans. Microconidias. ALF X40

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 70 T. violaceum. SGA. 3 semanas

Fig. 71. T. violaceum. ALF X1000

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 72. T. verrucosum. SGA. 3 semanas

Fig. 73. T. verrucosum. Hifas toruloides. ALF X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS


LEVADURAS (FIGS. 74-79)

Fig. 74. Candida albicans. SGA

Fig. 75. Candida albicans. Clamidosporos. CMA X200

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 76. Candida parapsilosis. SGA

Fig. 77. Candida parapsilosis. CMA X100

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 78. Malassezia globosa. mDixon

Fig. 79. Malassezia globosa en cultivo. ALF X1000

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA


MOHOS (FIGS. 80-91)

Fig. 80. Scopulariopsis brevicaulis. SGA

Fig. 81. S. brevicaulis. ALF X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 82. Alternaria alternata. SGA

Fig. 83. Alternaria alternata. Dyctiosporos. ALF X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 86. A. flavus. SGA

Fig. 87. A. flavus-oryzae. ALF X1000

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Atlas de MICOLOGA CUTNEA

Fig. 88 A. terreus. SGA

Fig. 89. A. terreus. ALF X1000

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EL LABORATORIO en las MICOSIS CUTNEAS

Fig. 90. Fusarium sp. SGA

Fig. 91. Fusarium sp. Macro y microconidias. ALF X1000

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