RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS

1.- OBJETIVOS:
-

Familiarizarse con el uso de la cmara de recuento de

microorganismos.
Determinar la carga microbiana en diferentes muestras de agua y
suelo.

2.- METODOS:
RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS
Una de las mayores del recuento microscpico es brindar informacin
adicional sobre el tamao y la morfologa de los contados.
La cmara ms utilizada es la de Petroff-Hausser.

Camara de recuento de Petroff-Hausser

Tipo de cuadro

Area
[cm2]

Volumen
[ml]

Factor
[1/Volumen]

Cuadrado total

1.00 x 10-2

2.00 x 10-5

5.00 x 104

Cuadrado grande

4.00 x 10-4

8.00 x 10-7

1.25 x 106

Cuadrado pequeo

2.50 x 10-5

5.00 x 10-8

2.00 x 107

TCNICA DE RECUENTO DIRECTO DE MICROORGANISMOS.

Un recuento directo es un recuento en las clulas individuales de una
poblacin microbiana. El recuento directo puede hacerse visualmente,
utilizando un microscopio y un porta objetos especial denominado cmara
de recuento.

La cmara de recuento de Petroff.Hausser se usa, junto a un microscopio,

para realizar un recuento directo de clulas. Consta de un porta que tiene
unos pocillos superficiales (de 0,02 mm de profundidad). En el fondo de
porta hay grabada una rejilla de 1mm2 dividida en 25 cuadrados grandes,
cada uno de los cuales est dividido en 16 cuadrados ms pequeos. De
esta manera, el volumen total de la rejilla es de 0.02 (un quinceavo) mm3, y
cada cuadrado grande es un veinticincoavo de esta cantidad.
Todas las cmaras de reciento poseen una profundidad conocida y tiene
marcados unos cuadros de dimensiones tambin conocidas. De esta
manera, cada cuadro que observemos al microscopio presenta un volumen
determinado de lquido, por ejemplo un microlitro (0,001 ,ul).
Se puede calcular cuantas clulas estn presentes en 1ml o en cualquier
otro volumen del cultivo, contando las clulas de varios cuadros y haciendo
la media. Puesto que las clulas vivas y las muestras tienen un aspecto

parecido observado al microscopio, el recuento directo es un recuento total

de clulas.
El recuento microscpico no requiere de un equipo caro, tan solo se necesita
una cmara de recuento, no muy cara adems del microscopio ptico que
existe en cualquier laboratorio de microbiologa.

3.- MATERIALES:
- cmara de recuento de Petroff.Hausser
- placa Petrifilm
- Porta Paul Marienfeld
- Mechero de alcohol.
-Alcohol.
-Microscopio
-Franela.
-Pipeta pasteur.
-Muestra de Agua Estacada.

4.- PROCEDIMIENTO:

Preparar la zona de trabajo (Mesa) en donde se realizara la

experimentacin desinfectando con alcohol y posteriormente limpiar
con la franela.

Prepara cmara Petroff.Hausser y luego cargar la muestra de agua

estancada a travs de la pipeta Pasteur y seguidamente colocar en la
lmina en el mismo borde del mismo.

Dejar reposar aprximamente de 3-5 minutos.

Despus de reposar llevamos la cmara de recuento Petroff.Hausser

en el microscopio ptico.

Observamos y realizamos el conteo respectivo.

Objetivo: 10x/0.25

5.- RESULTADOS:
Se obtuvo los siguientes resultados en el conteo.

2
1
4
3
-Conteo en el Cuadro numero 1.- = 15
-Conteo en el Cuadro numero 2.- = 21
-Conteo en el Cuadro numero 3.- = 17
-Conteo en el Cuadro numero 4.- = 20
Hacemos el clculo.
Suma de conteos = (15 + 21 + 17 + 20) / 4 = 18.25

18.25 x 25 x 50 x 1000 = 25 X 106 clulas/ml.

6.- CONCLUSIONES:
-Logramos familiarizarnos con el uso de la cmara Petroff-Hausser para el
recuento de microorganismos.
-Se pudo Determinar el nmero de microorganismo (Carga Microbiana) en la
muestra de agua estancada cuantitativamente.

CUESTIONARIO.
1.- DESCRIBE LOS OTROS MTODOS QUE EXISTEN PARA DETERMINAR
EL NMERO DE MICROORGANISMO POR ML DE MUESTRA.
Mtodos de recuento del nmero bacterias en una muestra
El nmero de bacterias puede determinarse directamente por recuento del
nmero total de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero ms
probable, por filtracin o por el recuento de clulas viables en placa (clulas

capaces de dividirse en un medio de cultivo slido, tambin se refieren

como unidades formadoras de colonias, UFCs).

Recuento en filtros de membrana

En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de
la muestra a travs de un filtro de membrana de tamao adecuado
para retener a las bacterias (0.22-0.45 m). Una vez filtrada la
muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo slido y se
incuba

Recuento directo con contadores electrnicos

Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas
suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la
corriente elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las
clulas pero tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

Mtodos de recuento de bacterias viables en placa

Estos mtodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables
presentes en una muestra. Implican la dilucin seriada de la muestra en
agua, caldo o solucin salina, la inoculacin de la dilucin en medio de
cultivo slido y la incubacin durante 24-48 HORAS .

Recuento en placa por siembra en pro-fundida

Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre
placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra
diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar.
Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se
desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo
generalmente utilizado para el recuento de microorganismos
anaerobios facultativos o microaerofilos.
Recuento en placa por siembra en superficie
Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la
muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En
este mtodo todas las colonias crecen sobre la superficie del medio.
Generalmente se utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias
aerobias.

2.- QUE VENTAJAS Y DESVENTAJAS PRESENTA ESTE MTODO.

Ventajas:
-Que el conteo es mucho ms rpido para poder contabilizar los
microorganismos.
-Requiere poco tiempo en el reposo de la placa.

-No requiere de costosos aparatos y para el conteo solo se necesita un

microscopio.
Desventajas:
-No es posible diferenciar los microorganismos vivos de los muertos.