ya que slo se esperan clulas NK son responsables de la lisis de AMLcells

primarios (Fig. 1B) tambin en hypoxia. consecuentemente con el aumento de

CD69 en 1% de O2, encontramos clulas that NK expuestos a 48 h de hipoxia
de 1% de lisis O2increased oftarget clulas K562 por 20% despus de 4 h (1,6
resultado combinado de plegado, E: Tratio que van 20: 1 [1.5 veces mayor] a
40: 1 [1.3 veces mayor], p <0,05, Fig 1C.). Como las clulas K562 representan
un sistema clsico para NKcell lisis mediada, pero no son de origen AML,
investigamos NKcell lisis mediada en 5 lneas de clulas de AML (HEL, HL-60,
KG-1a, NB-4y OCI-AML3). En consecuencia con los resultados obtenidos con
K562, weobserved un aumento medio de 1,39 veces la lisis de lneas de clulas
de AML inhypoxia (p <0,05), sin embargo con la variabilidad entre las lneas
differentcell (HEL: 1,19 plegado, HL-60: 1,36 veces, KG-1a : 1,32 veces, NB41.29 veces, OCI-AML3 1,48 veces) .
En el siguiente paso, se utiliz muestras primarias AML (n = 5, por Charcaracteriza- de pacientes con LMA ver Tabla 1) como clulas diana. Viabilityof
muestras primarias AML no fue alterado de manera significativa despus de 48
hof cultivo hipxico. Sin embargo, no hemos podido observar una
significantincrease en clulas NK lisis mediada por hipoxia-activado (40: 1: 32%
(al 21% de O2) frente al 25% (1% de O2) lisis, 80: 1: 53% (al 21 % O2) versus
48% (1% de O2) de lisis, no significativo). Curiosamente, mientras que las
clulas inK562 de clulas NK lisis mediada podra aumentarse por ofPBMCs de
exposicin a IL-2 (100 U / ml) despus de 48 h (37% de lisis frente a 62% de
lisis withIL-2), en muestras de AML primarias no hubo efecto de clulas IL-2
stimulatedNK en condiciones de hipoxia (Fig. 1D) .
3.3. Medicin de la lisis mediada por clulas en un sistema de co-cultivo ByFlow
cytometry
To investigar la lisis celular mediada con un methodthat no radiactivo permite
que un sistema de co-cultivo de tres celdas, un ensayo basado en FACS
wasdeveloped. En una primera etapa, las clulas efectoras (es decir, PBMCs) y
clulas diana (es decir, clulas blastos AML) se midieron individualmente por
FACS y specificgate que separa las dos poblaciones por su positividad para
calceinwas definidos (Fig. 2A izquierdo y central, puerta R3). La cantidad de
lysedcells se defini como clulas positivas PI en la puerta de destino R3 (Fig.
2C) andanalyzed travs de histogramas. Adems, este mtodo permite el
clculo pre-CISE del efector a la proporcin de clulas por calculationthe
nmero de clulas diana en la puerta R3 diana en comparacin con
cellnumbers.
By total de la adicin de un marcador adicional, este sistema podra ser
expandedto analizar una cooperacin de clulas de triple sistema de cultivo.
Como mesenquimales stromalcells tincin negativa para CD45, se us este
marcador para definir gateR2 que incluye slo las clulas CD45 positivas (es

decir, leucocitos), las clulas includingtarget (Fig. 2B, izquierda) y la

combinacin de las clulas diana y efec-tor (Fig. 2B, medio). MSC quedan fuera
de esta puerta y se hencenot analizado ms de lisis (Fig. 2B, derecha). A
continuacin, se analiz la puerta R2 (objetivo y efectoras clulas INCLUD-ing)
de positividad PI asmentioned antes.
3.4. MSC proteger blastos AML contra de clulas NK mediada lysis Next,
se aplic este sistema para investigar los efectos de las clulas del estroma
mes-enchymal (MSC) como otro componente pertinentes del microambiente
cuando se co-cultivaron con clulas diana. Clulas PrimaryAML fueron elegidos
como clulas diana (n = 5, para la caracterizacin ofAML pacientes por favor
consulte la Tabla 1). Viabilidad de las muestras de AML wasnot alterado de
manera significativa cuando se co-cultivadas con MSC (25 103perassay)
durante 48 h (viabilidad 90,0% frente a 90,6%, no significativo). InterCuriosamente, hemos observado que la co-cultura de la LMA primaria
explosiones withMSC durante 48 h protegidas significativamente blastos AML
de clulas NK-medi ado lisis (E: T ratio de 20: 1, la reduccin de la lisis 50,7%; p
<0,05, Fig. 3A, E: T relacin de 10: 1 la reduccin de la lisis 50,8%, p <0,05%).
3.5. Mecanismos de proteccin de explosiones ALD por MSC Next,
nos trataron de aclarar an ms los medios de proteccin de explosiones ofAML
por el MSC en el sistema de co-cultivo. Especialmente nos wantedto s si es el
contacto directo clula-clula de MSC blaststo leucmica que es de proteccin
(por ejemplo, cambiando la E: T o clulas relacin hidingtarget) o si MSC
factores protectores secretos. Por lo tanto, usedMurine lneas de clulas del
estroma EL08-1D2 y EL28-1B3 que son o "seguidores" (EL08-1D2) o "nopartidarios" (EL28-1B3) para clulas principales que contiene progenitoras
hematopoyticas [18]. Curiosamente, slo MSCcell lnea EL08-1D2 como una
lnea celular partidario significativamente explosiones protectedAML de lisis
mediada por clulas, mientras que no hubo clulas effectof "no partidario"
(68,1% de lisis sin MSC, 67,5% forEL28-1B3 lisis y 36,4% de lisis para EL081D2, p <0,01, Fig. 3B). Accord-vez ms, estos resultados tambin se pudo
confirmar en el modelo K562, aunque con menor lisis celular (34,5% de lisis sin
MSC, 31,5% lysisfor EL28-1B3 y 17.6% de lisis para EL08-1D2, p = 0,01, Fig.
3C) . Takentogether, estos datos sugieren un apoyo effectinstead especfico
MSC relacionado de un mero efecto inespecfico, fsica.
4. Discussion
The razones para los resultados decepcionantes para muchos enfoques
Immunother putico en la LMA son en gran parte desconocido, pero en general
reflect nuestro pobre entendimiento de la compleja mechanismsinvolved.
Mientras una gran incertidumbre radica en el imperfecto conocimiento cornisa
de antgenos diana pertinentes sobre los blastos leucmicos, hay podraser

otros factores involucrados, lo que podra no ser evidente cuando lookingat las
explosiones o clulas efectoras alone.The rea putativa de solicitud de inmune
dirigida tera- tartas de AML habr terapia de mantenimiento y / o el
tratamiento ofminimal enfermedad residual. Aqu, las clulas diana (es decir
leucmica StemCells) residen en la mdula sea, donde sobrevivieron el
initialtreatment y, finalmente, se iniciar de nuevo para causar la proliferacin
de recada theclinical. Por lo tanto, podra ser la pena investigar los efectos de
la mdula sea en la respuesta inmune de effectorcells contra AML explosin.
La mdula sea, o mejor el (clulas madre) espacio pequeo, ofrece un
santuario o microambiente que las con-siste de ciertos componentes
especficos. La mejor identificados y characterizedcomponent son las clulas
estromales mesenquimales y la presin parcial recientemente theoxygen ha
sido identificado como un jugador crtico enel clulas madre compartment.First,
se encontr que la hipoxia de 1% de clulas NK O2activates pero no las clulas
T, lo que sugiere un tipo altamente especfica de respuesta de estas clulas
inmunocompetente hacia la hipoxia. Consistente con este hallazgo, NKcells
fueron significativamente ms activo y la lisis de las clulas diana
wasincreased durante condiciones de hipoxia cuando se aplica un modelo
cellline. Curiosamente, para las clulas T un efecto diferente de la hipoxia ha
beendescribed, con hipoxia inhibicin de la respuesta inmune hacia
solidtumours [17]. Sin embargo, las clulas NK han demostrado ser las clulas
efec-tor en la LMA tanto in vitro como in vivo; por ejemplo se demostr que los
pacientes inAML con clulas activas NK supervivencia libre de recada fue
signif-vamente mayor que en los pacientes con clulas NK inactivos [19]. Por lo
tanto, nos centramos en las clulas NK y no investigar ms a fondo la hipoxia
effectsof de clulas-T. Estbamos sin embargo incapaz de observar cualquier
lisis-sig significa- de blastos primarios AML por las clulas NK en nuestro
sistema, butin nuestro modelo estimulacin de las clulas NK con IL-2, que se
conoce clulas NK toactivate de una manera significativa, hizo tampoco
mejorar celllysis . Una limitacin significativa sin embargo es que los datos no
eran obtenido en un entorno autlogo con clulas PBMC y AML fromthe mismo
paciente. De hecho, la hipoxia podra influir cellmediate NK innata pero deja de
clulas T mediada por MHC ms especfica immunityunaffected. Sin embargo,
la observacin de que las clulas NK lysisis mediada disminuido al utilizar
muestras primarias AML est en lnea con theprevious hallazgos de las
llamadas clulas "mieloide", que son clulas espectadoras presentas en
muestras primarias AML, inactivar las clulas NK [5], posiblemente a travs de
la generacin de especies de radicales de oxgeno [20] .SECOND, que fueron
capaces de identificar en este contexto otra poblacin-cin de clulas
mieloides "" (que se derivan de la mdula sea) que protegen las clulas de
AML cuando se co-cultivaron con clulas efectoras: MES-enchymal las clulas
del estroma (MSC), que tenan una fuerte effecton protectora blasts.MSC
leucmica han cosechado un gran inters en los ltimos aos, mainlydue a sus
efectos conocidos de quimioproteccin en blastocitos de la AML. Mecanismos-

Var ious se han descrito, pero ninguno de estos pueden bereally aplicada a la
proteccin contra la lisis mediada por clulas, como theywere principalmente
relacionados con una disminucin de la capacidad para la apoptosis en
AMLblasts por ejemplo, misbalancing de protenas o metabolicchanges [12,13]
anti-apoptticos. Ya sea que la lisis celular mediada corto plazo es la induccin
de la apoptosis relacionadascon puede ser cuestionada, en cambio, los
mecanismos cito-txicos directos estn involucrados. Por lo tanto, la proteccin
de la LMA explosiones bydecreasing su capacidad para someterse a la
apoptosis parece poco probable en ourcontext.Instead, MSC podra proteger
blastos AML por la inhibicin de Ort-clulas NK. Este mecanismo podra ser ms
relevante en la proteccin ofmicroenvironment mediada contexto, como la
clula a clula de con-tacto directo no era necesaria para la proteccin. Por lo
tanto, los factores solubles secretedby MSC podran ser pertinentes que an sin
embargo tiene que ser defined.Interestingly, MSC se sabe que tienen
inmunomoduladores capaci-dades tanto in vitro como in vivo. Ellos han
demostrado positivelyinfluence injerto agudo y crnico frente al anfitrin de
enfermedad (GvH-D), anautoimmune como el trastorno despus Transplantacin alognico de clulas madre, donde alorreactivas clulas T del donante
ataque del anfitrin, dando lugar a daos orgnicos graves, como en el hgado,
el intestino o theskin. En esta configuracin, el MSC clnicamente podra
mejorar GvH-D [21], los mecanismos de andproposed incluyen la supresin de
la proliferacin de clulas T, la alteracin de los perfiles de citoquinas de
clulas o la induccin T y NK ofregulatory clulas T [22-25] .La explicacin
podra ser ms fcil simplemente el hecho de que el MSC pro-cionar una
especie de santuario anatmica de blastocitos de la AML, por ejemplo, Cmo
cambiar el por relacin E: T (como alo-reactiva PBMC que hacer frente a ms
clulas enel co-cultivo) o cubriendo o "esconder" blastos AML, por lo tanto preventilacin contacto directo clula a clula con el efector lymphocytesand
posterior lisis de las explosiones. Esta explicacin, sin embargo seemshighly
poco probable, ya que slo la lnea celular MSC apoyo EL08-1D2 pro-protegidas
explosiones ALD y no morfolgica similar, pero functionaldistinct, "no
partidario" lnea celular MSC EL28-1B3. Si la "proteccin anatomi-cal" por el
MSC sera correcto, que el "no-partidario" MSC debe ser protector como
well.Thus, es razonable especular que el MSC mediada proteccinde blastos
leucmicos parece ser iniciado por sustratos secretadas byThe MSC , por
ejemplo, como se describe en el contexto de la inmunosupresin ofGvH-D por
MSC.While nuestro estudio no es ciertamente capaz de identificar los
mecanismos relevantmolecular, proporciona datos razonables para sealar
outthe importancia del microambiente en el contexto de la respuesta inmune
contra AML. Adems, con el ejemplo de la hipoxia, es claro ver que la influencia
es complejo y no onlyand siempre resulta en la inhibicin o efectos
disminuidos. En lugar de ello, theinfluence del microambiente es altamente
complejo, dependingon el tipo de clula diana, el tipo de clula efectora, el tipo
de stromaand el nivel de la hipoxia, para nombrar unos pocos. Sera

interestingto combinar los diferentes componentes del microambiente, por

ejemplo hipoxia y MSC, para imitar lo natural nicho in vivo para (I) investigar
los efectos sobre la respuesta inmune, (II) para estudiar themechanisms
involucrados y (III) para encontrar medios para superar la INHI-bicin
proporcionado por MSC.
Conflicts de interest
None de los autores no tienen ningn conflicto de trabajo pertinentes inters
todeclare.AcknowledgmentsThis fue financiado por una subvencin de la
ResearchFoundation alemana (DFG FI 1487/2) y una beca de la Fundacin
Wilhelm Sander-(2013.005.1) a MF.