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Cromatografia

Princpios bsicos

Ldia Manfrin Dias


Thales Augusto Garcia Pelizaro

Ldia Manfrin Dias


Bacharel em Biotecnologia

Thales Augusto Garcia Pelizaro


Estudante de Bacharelado em Biotecnologia

Cromatografia
Princpios bsicos

Sumrio
CAPTULO 1 - Princpios bsicos de cromatografia
Ldia Manfrin Dias
CAPTULO 2 - Cromatografia planar
Ldia Manfrin Dias
CAPTULO 3 - Cromatografia em papel
Ldia Manfrin Dias
CAPTULO 4 - Cromatografia em camada delgada
Ldia Manfrin Dias
CAPTULO 5 - Cromatografia em coluna
Ldia Manfrin Dias
CAPTULO 6 - Cromatografia lquida em coluna aberta
Thales Augusto Garcia Pelizaro
CAPTULO 7 - Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)
Thales Augusto Garcia Pelizaro
CAPTULO 8 - Cromatografia gasosa
Thales Augusto Garcia Pelizaro
CAPTULO 9 - Cromatografia em fluido supercrtico (CFSC)
Thales Augusto Garcia Pelizaro
CAPTULO 10 - Algumas aplicaes da cromatografia
Thales Augusto Garcia Pelizaro

CAPTULO 1 - Princpios bsicos de cromatografia


Ldia Manfrin Dias
1.1.

Introduo

A cromatografia uma tcnica fsico-qumica de separao,


identificao e determinao de componentes de uma mistura. A
palavra cromatografia derivada das palavras gregas chrom (cor) e
graphe (escrever) e foi empregada por um botnico russo que
utilizou-se da tcnica para separar componentes de extrato de folhas,
que levou distino em faixas coloridas, porm o processo
independente da cor.
A cromatografia realizada em duas fases, uma fase estacionria, e
uma fase mvel. Esta move-se atravs da fase estacionria e os
componentes da amostra segregam-se entre a fase mvel e a fase
estacionria dependendo do tipo de afinidade resultando em uma
migrao diferencial destes componentes. A fase estacionria
imobilizada em uma superfcie plana ou uma coluna enquanto a fase
mvel transporta a mistura de analitos.
A migrao das molculas da amostra pelo sistema cromatogrfico
depender da afinidade do componente pela fase estacionria. Se um
componente mais firmemente ligado fase estacionria, maior
quantidade de molculas estar presente nessa fase e mais demorada
ser a migrao pela fase mvel. Por outro lado, quanto menos firme
for essa ligao, mais molculas do componente estaro na fase
mvel, migrando mais rapidamente. A migrao das molculas na fase
mvel pela passagem na fase estacionria recebe o nome de eluio.
A identificao e a quantificao dos compostos separados se d
mediante a comparao com padres de concentraes conhecidas.
A cromatografia pode ser utilizada para determinao da pureza de
um composto e identificao de componentes em uma mistura alm de
oferecer muitas possibilidades para isolamento de componentes puros
de uma mistura.

Esta tcnica pode ser utilizada para separar desde molculas


menores at molculas mais complexas como as protenas e
aminocidos e por isso muito utilizada na bioqumica para obteno
de preparaes proteicas com alto grau de purificao e
homogeneidade. Existem diversos tipos de resinas que interagem de
diversas formas com as protenas possibilitando a separao utilizando
para isso, as caractersticas fsico-qumicas das protenas.
As diversas combinaes entre os tipos de sistemas
cromatogrficos, seu tipo de fase mvel e fase estacionria
possibilitaram cromatografia um grande potencial para aplicao em
diversas reas. Assim, as vrias formas de cromatografia podem ter
vrias classificaes possveis.

1.2.

Classificao

As tcnicas cromatogrficas podem ser classificadas de diversas


formas. Dentre elas, temos a classificao pela forma fsica do sistema
cromatogrfico; a classificao pela fase mvel empregada; a
classificao pela fase estacionria utilizada e classificao pelo
mecanismo de separao.
Considerando a forma fsica do sistema cromatogrfico, ou suporte
da fase estacionria, podemos ter a diviso em cromatografia planar e
cromatografia em coluna. Na classificao pela fase mvel, tem-se
trs classificaes: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a
supercrtica. Considerando a classificao pela fase estacionria,
temos a fase slida, a fase lquida e a fase quimicamente ligada. Na
classificao pelo modo de separao, temos os processos fsicos,
qumicos e mecnicos. Existe tambm a distino entre a polaridade
das fases. O sistema no qual a fase estacionria polar e a fase mvel
apolar, denominado fase normal. Ao passo que o sistema que
apresenta uma fase estacionria apolar e uma fase mvel polar
chamado fase reversa.
Neste livro, utilizaremos a classificao pela forma fsica do

sistema cromatogrfico, em que as respectivas caractersticas


referentes a cada tipo de cromatografia sero melhores detalhadas nos
captulos a seguir.

Tcnica
Fase mvel
Cromatogrfica

Planar

Em coluna

Em coluna

Em coluna

Fase
estacionria

Tipo de cromatografia

Lquido

Lquido

Cromatografia em papel
(CP)

Lquido

Slido

Cromatografia em camada
delgada (CCD)

Lquido

Fase ligada

Cromatografia em camada
delgada (CDD)

Gs

Lquido

Cromatografia gasosa
lquida (CGL)

Gs

Slido

Cromatografia gasosa
slida (CGS)

Gs

Fase ligada

Cromatografia gasosa de
fase ligada (CGFL)

Fluido
supercrtico

Slido

Cromatografia supercrtica
slida (CSS)

Fluido
supercrtico

Fase ligada

Cromatografia supercrtica
de fase ligada (CSFL)

Lquido

Lquido

Cromatografia lquida
lquida (CLL)

Slido

Cromatografia lquida
slida (CLS)
Cromatografia de
excluso (CE)

Fase ligada

Cromatografia lquida de
fase ligada (CLFL)
Cromatografia de troca
inica (CTI)
Cromatografia de
bioafinidade (CB)

Lquido

Lquido

Tabela 1.1 - Classificao de cromatografia pelas formas fsicas.

Existe outro tipo de classificao que forma como a amostra


desenvolve atravs do sistema cromatogrfico. No mtodo da eluio,
a amostra introduzida em uma nica alquota e depois introduz-se o
eluente, que ser a fase mvel pura que vai arrastar a amostra atravs
da coluna cromatogrfica. Outro mtodo de desenvolvimento o
deslocamento, em que se utiliza uma fase mvel para arrastar as
molculas da amostra, que mais atrada pela fase estacionria que os
componentes da amostra. E a anlise frontal, em que os componentes
da amostra descem a coluna por gravidade, sem a presena de um
eluente e o componente menos retido sai na forma pura.
1.3.

Termos gerais utilizados em cromatografia

A cromatografia uma medida quantitativa e qualitativa no qual os


dados podem ser obtidos e analisados atravs do cromatograma. O
cromatograma o resultado do seu desenvolvimento obtido
diretamente na superfcie planar ou aps a passagem do eluato por um
detector resultando em um grfico da concentrao do soluto em
funo do tempo ou volume de eluio.
As separaes cromatogrficas esto baseadas na quantidade de
amostra que est distribuda na fase mvel e na fase estacionria. Para
isso, definiu-se a constante de distribuio, ou coeficiente de
partio, que a razo entre a concentrao de um soluto na fase
estacionria e a sua concentrao na fase mvel.
A constante de equilbrio Kc para essa reao, que denominada
constante de distribuio, pode ser expressa como a razo entre a
concentrao analtica molar do soluto na fase estacionria cE por sua
concentrao analtica molar na fase mvel, cM:
K c=

cE
cM

( )

1.1

Um alto Kc indica que o soluto tem mais afinidade pela fase


estacionria, pois uma maior concentrao analtica molar do soluto

est nessa fase, e consequentemente fica mais tempo retido nela.


Outra definio importante o tempo de reteno da fase mvel,
ou tempo morto, que o tempo necessrio para que um soluto no
retido na fase estacionria passe por toda a coluna cromatogrfica, na
fase mvel. O tempo de reteno o tempo transcorrido desde a
injeo da amostra at o aparecimento do primeiro pico, indicativo de
que a amostra passou por toda a coluna cromatogrfica. Ou seja, o
tempo de reteno (tR) igual ao tempo que o analito permanece na
fase estacionria (tE) somado ao tempo morto (tM), que o tempo que
o analito permanece na fase mvel:
t R=t E +t M

1.2

Podemos agora definir a velocidade de migrao linear do soluto


(v) ao longo da coluna cromatogrfica de comprimento L, em cm s-1:
L
tR

( )

v=

1.3

A velocidade mdia linear das molculas na fase mvel (u) pode


ser expressa como:
u=

L
tM

( )

1.4

Na cromatografia, o fluxo da fase mvel caracterizado pela sua


vazo volumtrica na sada do sistema cromatogrfico. A vazo
volumtrica F para uma coluna de tubo aberto est relacionada com a
velocidade linear na sada do tubo uo:
F=u0 A=u 0 X r 2 1.5

Onde A a rea transversal da coluna cromatogrfica. Para uma


coluna recheada, a expresso fica:
F= r u0 1.6
Onde a frao disponvel para o lquido, ou seja, equivalente
porosidade da coluna.
O fator de seletividade, , definido como a razo entre a
constante de distribuio do soluto mais retido (B) e a constante de
distribuio do soluto menos retido (A), onde:
KB
KA

( )

1.7

Essa medida fornece uma informao de quo bem a coluna


capaz de separar os analitos A e B.
Referncias
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.;VIEIRA, P. C. Cromatografia - um
breve ensaio. Qumica nova na escola. v. 7, 1998.
NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia Princpios
bsicos e tcnicas afins. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.
SKOOG, D. A; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R.
Fundamentos de qumica analtica. Trad. Marco Tadeu Grassi. So
Paulo: Pioneira Thomsom Learning, 2006.

CAPTULO 2 Cromatografia planar


Ldia Manfrin Dias
A cromatografia planar uma tcnica de separao de compostos
em que a fase estacionria sustentada por uma base plana ou pelos
poros de um papel. A fase mvel por sua vez desloca-se por
capilaridade ou sob efeito da gravidade. Esta uma tcnica eficaz para
anlise de baixo custo de compostos que requerem o mnimo
tratamento de amostra.
A cromatografia planar tambm escolhida por diversas outras
vantagens como para a anlise biomolecular porque pode ser realizada
uma separao paralela de numerosas amostras, o que aumenta o
rendimento; vrios protocolos para diferentes analitos podem ser
realizados simultaneamente; a informao armazenada no
cromatograma pode ser reavaliado se necessrio; a deteco e
quantificao podem ser facilmente repetidas sob diferentes
condies, alm de todo o processo de desenvolvimento
cromatogrfico poder ser acompanhado visualmente.
O procedimento de introduo da amostra no sistema de
cromatografia planar e o registro e anlise do cromatograma
atualmente no podem ser realizados por um dispositivo automtico
pois a tcnica no pode ser automatizada por completo. Assim, vale
ressaltar algumas definies gerais que facilitam a interpretao de um
cromatograma, como as medidas de distncia comuns s
cromatografias planares.
Na Figura 2.1, esto indicadas algumas nomenclaturas importantes
para a anlise de um cromatograma planar.

Figura 2.1 - Cromatograma caracterstico de uma cromatografia planar.

Na cromatografia planar, a fase mvel presente em um reservatrio,


entra em contato com o sistema cromatogrfico e arrasta os
componentes por uma distncia dm, enquanto os componentes da
amostra percorrem uma distncia dr, medidas a partir do ponto de
aplicao da amostra.
Para fins qualitativos, define-se o fator de reteno, que a
medida da distncia percorrida pelos componentes na placa em
resposta ao movimento do solvente. Essa medida obtida pela razo
entre a distncia dr percorrida pelas substncias e a distncia dm
percorrida pela fase mvel no sistema cromatogrfico. Esse fator de
reteno tem importncia para a identificao dos compostos contidos
nas amostras, pois cada composto possui um fator de reteno
caracterstico.
dr
dm

( )

Rf =

2.1

Existem alguns fatores que afetam o valor do fator de reteno,


como a temperatura do solvente e da placa, sendo necessrio
padronizar as medidas nas determinadas condies cromatogrficas.
A cromatografia planar pode ser subdividida em cromatografia em
papel e cromatografia em camada delgada, que sero melhor descritas
nos captulos subsequentes.
Referncias
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.
GIBBONS, S. An Introduction to Planar Chromatography. In:
SARKER, S. D.; LATIF, Z; GREY, A. I. (ed). Methods in
Biotechnology, Vol. 20, Natural Products Isolation. 2 ed. New
Jersey: Humana Press Inc, 2006.
SRIVASTAVA, MM. (ed.). High-Performance Thin-Layer
Chromatography (HPTLC). 1 ed. New York: Springer, 2011.

CAPTULO 3 Cromatografia em Papel (CP)


Ldia Manfrin Dias
3.1.

Introduo

uma tcnica cromatogrfica em que a fase mvel lquida arrasta


os solutos por uma fase estacionria lquida, classificando-a como
cromatografia lquida-lquida. A separao ocorre por partio, ou
seja, pela diferena de solubilidade dos componentes nas fases mvel
e estacionria.
A cromatografia em papel apresenta como vantagens a
simplicidade da tcnica, a necessidade de pequena quantidade de
amostra, boa capacidade de resoluo e aplica-se principalmente
separao e identificao de compostos polares, hidrossolveis ou que
tenham capacidade de formar pontes de hidrognio.
Na CP, os componentes menos solveis so arrastados na fase
mvel, que geralmente so solventes orgnicos apolares enquanto os
componentes mais polares ficam retidos na fase estacionria. O papel
utilizado nesta cromatografia composto basicamente por celulose,
porm esta no funciona como fase estacionria. A celulose
composta por vrias unidades de glicose unidas por oxignios. As
molculas de gua presentes na atmosfera tem grande afinidade pelas
hidroxilas da glicose, ficando retidas nela e funcionando como fase
estacionria. O papel nesse caso funciona apenas como um suporte
para a fase estacionria.
3.2.

Tipos de papel e fase mvel

O suporte da cromatografia em papel uma tira de papel fina de


celulose, retangular ou circular. Essa tira de papel pode ser modificada
a fim de facilitar a interao com determinados tipos de substncias a
que se deseja separar. Alguns so: papel acetilado, que facilita a
interao com substncias hidroflicas; papel impregnado, usado para

substncias moderadamente hidroflicas ou hidrofbicas; papel


carregado, que permite a separao de molculas orgnicas e
inorgnicas; papel de fibra de vidro, quando as condies de
temperatura e acidez so extremas e papel tratado, utilizado para
substncias anfteras ou que contm muitas hidroxilas.
A fase mvel por sua vez deve ser escolhida de acordo com a
natureza qumica da substncia que ser separada. Normalmente
utiliza-se como fase mvel um solvente menos polar e como fase
estacionria, um composto mais polar. Como exemplos de solventes
que podem ser utilizados como fase mvel temos o ter de petrleo,
hexano, benzeno, ter dietlico, clorofrmio, acetato de etila, acetona,
etc.
3.3.

Cromatografia em papel em fase normal e fase reversa

Na cromatografia em papel em fase normal, a fase estacionria


um composto polar enquanto a fase mvel um composto apolar ou
relativamente apolar. A fase estacionria pode ser aquosa ou no.
Na cromatografia em fase reversa, a fase estacionria um
composto apolar e a fase mvel um composto polar. O papel
(suporte) pode ser tratado com substncias polares ou apolares a fim
de adquirir as propriedades desejadas.
3.4.

Aplicao da amostra

A amostra deve ser dissolvida em um solvente voltil apropriado e


aplicado como manchas, de 0,5 centmetro no mximo, ao longo de
um lado do papel (se a tira for retangular) a cerca de 2 centmetros das
bordas.
A quantidade de amostra a ser aplicada depende da tcnica
utilizada, mas quanto menor a quantidade, melhor a resoluo da
mancha no papel. Esta deve ser aplicada por uma micropipeta ou
tubos capilares em quantidades da ordem de L.

3.5.

Tipos de desenvolvimentos

Existem quatro formas para o desenvolvimento da cromatografia: a


eluio ascendente, descendente, radial e bidimensional.
A forma mais simples a cromatografia ascendente, em que uma
tira de papel colocada verticalmente, marcada com o ponto de
partida da amostra e o ponto de chegada da fase mvel e colocada
em uma cuba cromatogrfica vedada, para que o vapor da fase mvel
no se perca. O nvel da fase mvel no papel deve ficar abaixo do
ponto de partida da amostra, a cerca de 2 centmetros. A fase mvel se
movimenta em fluxo ascendente por capilaridade diminuindo a
velocidade at atingir o ponto de chegada marcado. Quando isto
acontecer, o papel retirado da cuba cromatogrfica e seco com um
secador, com ar quente ou frio, at que a fase mvel evapore. As
distncias sugeridas entre a as amostras a serem aplicadas e a distncia
entre o ponto de aplicao da amostra e a chegada da fase mvel esto
indicadas na Figura 3.1.
Na cromatografia descendente, o papel ficar em uma posio
vertical com uma pequena poro da extremidade superior em contato
com um recipiente contendo o solvente. Os pontos de partida da
amostra e de chegada da fase mvel seguem a marcao equivalente
da cromatografia ascendente e o solvente desce por capilaridade e
gravidade.
Na cromatografia radial, o papel possui formato circular e o
solvente colocado no centro do papel enquanto as amostras so
dispostas ao redor.
A cromatografia bidimensional por sua vez caracterizada por duas
etapas. A primeira feita segundo a metodologia da cromatografia
ascendente, e num segundo momento, gira-se o papel 90 e faz-se
novamente o deslocamento ascendente.

Figura 3.1 - Diferentes tcnicas de desenvolvimento em uma cromatografia em


papel. Em A, cromatografia ascendente; em B, descendente; em C, radial e em D,
bidimensional. As setas indicam a direo do desenvolvimento.

3.6.

Deteco das substncias separadas

As substncias separadas normalmente no apresentam colorao,


sendo necessrio a utilizao de mtodos para a deteco dos
componentes. Existem quatro mtodos que podem ser utilizados para
essa deteco: os mtodos qumicos, fsicos, biolgicos ou
enzimticos.
Nos mtodos qumicos utilizam-se substncias qumicas
reveladoras que reagem com a substncia desejada e formam
compostos coloridos, sendo que somente onde houve a reao com a
substncia que se quer determinar ficar colorido.
Nos mtodos fsicos, a deteco ocorre por fluorescncia e somente

substncias que absorvem radiaes de luz ultravioleta e ficam


fluorescentes sero detectadas.
Os mtodos biolgicos so utilizados para detectar substncias
como antibiticos por meio de microrganismos, onde no local onde a
substncia est presente, no h crescimento de microrganismos.
Os mtodos enzimticos so utilizados para detectar enzimas ou
seus substratos.
3.7.

Anlise qualitativa e quantitativa

A anlise qualitativa de uma substncia feita atravs de seu fator


de reteno, como descrito no captulo 2. Neste caso ideal realizar-se
a eluio da amostra paralelamente a um padro, para a comparao e
garantia de igualdade das condies.
A anlise quantitativa pode ser realizada diretamente no papel ou
aps a substncia ser extrada dele.
A extrao da substncia ocorre com a eluio desta do papel e
posterior submisso a anlise em espectrofotometria. Caso a
substncia seja desconhecida, deve-se recorrer a tcnicas como
espectrometria de massa, infravermelho, absoro atmica,
fluorescncia por raios-X e outros, para sua identificao.
A anlise diretamente no papel envolve a comparao entre as
intensidades das cores e tamanhos das manchas; a rea das manchas,
em que corta-se a rea correspondente a mancha e pesa-se
comparando a padres e a densitometria, em que mede-se a
intensidade da cor apresentada pela substncia.
3.8.

Fatores que interferem na Cromatografia em Papel

O tipo de papel, a fase mvel e a temperatura so variveis que


influenciam na anlise da cromatografia em papel e na sua resoluo e
reprodutibilidade do fator de reteno (Rf). A temperatura tem
influncia na anlise no sentido de que quando esta est acima da
temperatura ambiente, o tempo de anlise diminui porm a prejudica a

resoluo. A temperatura acima da temperatura ambiente, pode afetar


o tempo de anlise porm pode melhorar a resoluo.
Alm da temperatura, a separao dos componentes pode ocorrer
de forma incompleta devido a migrao diferenciada de soluto de
regies de concentraes diferentes. Para se ter um resultado confivel
e reprodutvel, a melhor maneira realizando a cromatografia
juntamente a um padro sob mesmas condies de temperatura, fase
mvel e tipo de papel.
Referncias
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.
GIBBONS, S. An Introduction to Planar Chromatography. In:
SARKER, S. D.; LATIF, Z; GREY, A. I. (ed). Methods in
Biotechnology, Vol. 20, Natural Products Isolation. 2 ed. New
Jersey: Humana Press Inc, 2006.
NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia Princpios
bsicos e tcnicas afins. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.

CAPTULO 4 - Cromatografia em Camada Delgada (CCD)


Ldia Manfrin Dias
4.1.

Introduo

uma tcnica em que a fase estacionria consiste de uma camada


delgada de adsorvente slido que reveste um material suporte rgido e
plano, podendo ser uma placa de vidro ou uma folha de alumnio ou
plstico, de modo que o processo de separao ocorre de forma
bidimensional. Este suporte revestido com a camada delgada
chamado placa de Cromatografia em Camada Delgada. Essa placa de
CCD colocada em contato com a fase mvel, lquida, para o
desenvolvimento da cromatografia. Sobre essa camada delgada ocorre
a separao por adsoro, caracterizada por um aumento da
concentrao de uma substncia (adeso de molculas) na superfcie
de um slido.
A cromatografia em camada delgada um dos mtodos mais
versteis e amplamente utilizados na cromatografia, permite a
realizao de anlises qualitativas rpidas, de fcil execuo, e
tambm possui vantagens como necessidade de mnimo prtratamento da amostra, reprodutibilidade e baixo custo.
De modo geral, a cromatografia ocorre colocando-se uma gota de
soluo contendo a amostra na base da placa de CCD, seguindo o
mesmo procedimento e respeitando-se as mesmas distncias entre as
amostras e bordas que as recomendadas para a Cromatografia em
Papel (ver seo 3.4). Posteriormente aguarda-se a evaporao do
solvente. A placa ento colocada em uma cuba cromatogrfica onde
est contida a fase mvel, que migra na fase estacionria por
capilaridade. Da mesma forma que na Cromatografia em Papel, a
medida que a fase mvel move-se, esta arrasta os componentes da
amostra a diferentes velocidades, ficando em diferentes distncias na
placa dependendo da interao com a fase estacionria.
Na CCD, os componentes mais polares ficaro retidos no
adsorvente por interaes como formao de sal, coordenao, pontes

de hidrognio e dipolo-dipolo.
4.2.

Tipos de adsorvente e fase mvel

A escolha do adsorvente e do solvente so etapas muito importantes


para a otimizao da separao, pois alguns adsorventes e solventes
so especficos para certas aplicaes.
Existe uma ampla variedade de materiais adsorventes disponveis,
como a slica, alumina, carvo ativado, celulose, poliamida, sais
metlicos, entre outros.
A slica gel um dos adsorventes mais utilizados para a
cromatografia por adsoro, seguida pela celulose e alumina. A slica
gel um material amorfo e poroso formado por precipitao de
solues de silicato por adio de cido. Durante o processo de
formao da slica gel, grupos hidroxila so formados na sua
superfcie, o que confere a mesma propriedades nicas de separao,
alm da possibilidade de substituio desses grupos para interao
com diferentes molculas. Se a substituio for feita por
hidrocarbonetos de cadeia longa, a superfcie torna-se mais apolar,
podendo ser utilizada para cromatografia em fase reversa.
A celulose, tambm utilizada como suporte da fase estacionria na
cromatografia em papel, possui uma estrutura polimrica de ligaes
entre glicoses em que grupos hidroxila ficam disponveis, fazendo
com que a gua ou lcoois fiquem retidos interagindo com substncias
hidroflicas como aminocidos, ons inorgnicos e derivados de cidos
nucleicos.
A alumina fabricada em trs faixas de pH, cido, bsico e neutro
para diferentes tipos de amostras. Sob condies aquosas, compostos
cidos como fenis, cido carboxlico e aminocidos so bem
separados em alumina cida; enquanto compostos bsicos, como
aminas e compostos bsicos, so separados em alumina bsica.
Compostos neutros como aldedos, cetonas e lactonas so separados
por alumina neutra. A alumina bsica a mais utilizada dos trs tipos.
Os solventes utilizados para a fase mvel devero ser escolhidos

cuidadosamente para garantir uma boa separao, pois estes


competem com o analito dissolvido pelos stios de ligao do
adsorvente e devem levar em conta o tipo de interao com a molcula
a que se deseja separar e sua natureza qumica. Um composto muito
polar requer uma fase mvel que interage fortemente com o
adsorvente para poder migrar na placa de CCD. Quando um solvente
puro no muito eficiente na separao dos componentes, pode-se
utilizar uma mistura.
Dessa forma, na seleo do solvente importante que as
polaridades dos mesmos sejam determinadas, pois esto diretamente
relacionadas com seu poder de eluio. O poder de eluio definido
pelo parmetro de resistncia do solvente 0 que determina a interao
de um determinado solvente com o absorvente. Esse valor de 0
tabelado e, um solvente que tem um parmetro de alta resistncia em
um adsorvente, como a slica gel, pode ter um parmetro de resistncia
do solvente diferente em um absorvente diferente.
A Tabela 4.1 mostra as resistncias relativas dos diferentes
solventes em vrios tipos de absorventes. Em muitos casos, a srie
eluotrpica dos solventes o intermedirio entre as resistncias em
um ou mais solventes em uma mistura de solventes.

Fase mvel

1,2 dicloetano

0,44

Nitrometano

0,64

2-nitropropano

0,53

Acetonitrila

0,65

Trietilamina

0,54

Piridina

0,71

Acetona

0,56

2-metoxietanol

0,74

1,4-dioxano

0,56

Dimetilsulfxido

0,75

Tetrahidrofurano

0,57

2-propanol

0,82

Acetato de metila

0,60

Etanol

0,88

1-pentanol

0,61

Metanol

0,95

Anilina

0,62

1,2 etanodiol

1,1

Fase mvel

Tabela 4.1 - Parmetro de resistncia do solvente 0.

4.3.

Preparao das placas

Existem duas formas de preparao das placas, a preparao


caseira e as placas pr-fabricadas.
A preparao das placas caseiras inicia com a limpeza das placas
de vidro de 20 cm de comprimento e largura varivel, tomando os
devidos cuidados contra a impregnao de gorduras em sua superfcie.
Aps isso, faz-se uma preparao de 30 g de adsorvente para 60 ml de
gua, agita-se e aplica-se uniformemente sobre a superfcie da placa
por espalhamento com auxlio de um basto de vidro. A placa
deixada em repouso para secar por 30 minutos e posteriormente faz-se
a ativao da placa a temperatura de 105 a 110C por 30 a 60 minutos
para melhorar a ligao entre o adsorvente e o suporte inerte.
As placas pr-fabricadas comercialmente so fabricados com
ligantes polimricos orgnicos a uma concentrao de 1 a 2%, so
mais resistentes e principalmente mais homogneas que as caseiras, o
que possibilita uma melhora na qualidade de separao e

consequentemente possibilita resultados mais reprodutveis.


4.4.

Aplicao da amostra

A aplicao da amostra uma etapa que requer ateno pois


refletir na qualidade da separao cromatogrfica. Manchas grandes e
irregulares podem ocorrer se o responsvel pela tcnica no souber
escolher o solvente e aplicar a amostra, resultando em uma qualidade
ruim da cromatografia.
A amostra pode ser aplicada na forma de gotas ou na forma de
bandas. Para a aplicao da amostra, a soluo contendo a mesma
aspirada para dentro de uma micropipeta de tubo capilar em um
volume entre 0,1 to 1,0 l e concentrao aproximada de 0,1 a 2 g
por gota ou de 2 a 10 g por 10 mm de banda, e gotejada
paralelamente a uma das bordas, deixando-se um recuo de 1,5 a 2 cm
da mesma. Cada gota deve ficar a uma distncia uma da outra de 1 cm
aproximadamente.
4.5.

Tipos de desenvolvimentos

A eluio do solvente pode ser realizada de diferentes formas. Uma


delas a cromatografia ascendente, onde a fase mvel migra por
capilaridade na placa de CCD que colocada verticalmente em uma
cuba cromatogrfica fechada semelhantemente ao desenvolvimento da
Cromatografia em Papel (ver seo 3.5).
Outra tcnica de desenvolvimento a bidimensional, em que em
um primeiro momento feito unidimensionalmente, semelhante ao
desenvolvimento ascendente e em um segundo momento a placa
retirada e rotacionada a 90 e submetida a novo desenvolvimento.
A cromatografia ascendente unidimensional com mltiplo
desenvolvimento pode ser feito tambm. Nessa tcnica, realiza-se o
cromatograma, retira-se a placa ao final, seca-se e submete-se a
mesma a nova cromatografia, utilizando a mesma fase mvel. O
processo repetido at que se consiga uma boa separao.

Outra tcnica que pode ser utilizada o desenvolvimento


horizontal, onde as placas ficam na posio horizontal, e as amostras
so dispostas em linha reta, com a fase mvel disposta em uma das
extremidades, para placas retangulares ou as amostras ficam ao redor
centro de um crculo, com a fase mvel no centro, para placa circular.
Nesse tipo de desenvolvimento pode-se contar com o auxlio de um
equipamento chamado Chromatotron, em que um movimento
centrfugo de velocidade controlada realizado na placa e o
desenvolvimento ocorre do centro para as bordas. Alguns exemplos
desses tipos de desenvolvimentos podem ser vistos na Figura 3.1.
4.6.

Anlise qualitativa e quantitativa

Ao trmino do desenvolvimento, a placa de CCD retirada da


cmara e seca para remoo da fase mvel e identificao dos
componentes. Substncias coloridas no necessitam de tratamento,
pois podem ser visualizadas. Porm, substncias que no apresentam
colorao devem ser submetidas a outras tcnicas que permitam a
visualizao. Dentre essas tcnicas, trs tcnicas: fsica, qumica e o
mtodo biolgico.
O uso da luz ultravioleta para se observar as regies fluorescentes
pode ser usada como um mtodo fsico. Quando as substncias no
so fluorescentes, pode-se modificar os adsorventes com reagentes
fluorescentes e observar-se manchas escuras referentes s substncias
que no so fluorescentes sob um fundo fluorescente (adsorvente).
Como tcnicas qumicas so utilizados reagentes cromognicos que
reagem com a substncia de interesse e formam um composto
colorido. O reagente deve ser borrifado uniformemente sob a
superfcie da placa.
Os mtodos biolgicos utilizam reaes enzimticas ou bacterianas.
A anlise quantitativa feita eluindo-se a amostra e quantificandoa. Nesse caso a densitometria pode ser utilizada assim como na
Cromatografia em Papel, que consiste em determinar a rea e
intensidade da mancha. Podem ser medidos tambm a intensidade de

fluorescncia e radioatividade para substncias que apresentam essa


caracterstica.
4.7. Fatores que interferem na Cromatografia em Camada
Delgada
Impurezas como a gua podem interferir na qualidade da
cromatografia no sentido de que as molculas podem ocupar os
centros de adsoro que as molculas da amostra ocupariam,
bloqueando esses centros e influenciando na reprodutibilidade.
A escolha inadequada do solvente e a concentrao da amostra nas
gotas que sero aplicadas frequentemente podem levar a perda de
qualidade na separao cromatogrfica. A gota contendo amostra,
quando muito concentrada, pode causar uma difuso anormal no
adsorvente na direo da migrao resultando em caudas que variam
em comprimento dependendo do quo concentrada est a amostra.
4.8. Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficincia
(CCDAE)
Hoje, grande parte das etapas da Cromatografia em Camada
Delgada so automatizadas e aperfeioadas, o que levaram a um
avano do desempenho, que caracterizado por Cromatografia em
Camada Delgada de Alta Eficincia. Esse avano permite a anlise de
um grande nmero de amostras, alta velocidade e reprodutibilidade,
possibilidade de deteco de amostras a baixas concentraes e maior
rapidez na separao.

Referncias
GIBBONS, S. An Introduction to Planar Chromatography. In:
SARKER, S. D.; LATIF, Z; GREY, A. I. (ed). Methods in
Biotechnology, Vol. 20, Natural Products Isolation. 2 ed. New
Jersey: Humana Press Inc, 2006.
NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia Princpios
bsicos e tcnicas afins. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.
SRIVASTAVA, MM. (ed.). High-Performance Thin-Layer
Chromatography (HPTLC). 1 ed. New York: Springer, 2011.
STRIEGEL, M. F.; HILL, J. Thin-Layer Chromatography for
Binding Media Analysis. 1 ed. Los Angeles: The Getty Conservation
Institute, 1996.
WALL, P. E. Thin-layer Chromatography - A Modern Practical
Approach. 1 ed. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2005.

CAPTULO 5 - Cromatografia em coluna


Ldia Manfrin Dias
A cromatografia em coluna a tcnica cromatogrfica mais
utilizada pois permite a separao e purificao de quantidades
significativas de compostos em uma mistura.
Na cromatografia em coluna, a fase estacionria mantida em um
tubo e a fase mvel move-se em seu interior por efeito da gravidade
ou sob presso.
A escolha da coluna cromatogrfica uma etapa importante para a
garantia da eficincia do processo. Para cada tcnica cromatogrfica
em coluna, um tipo de tubo empregado, podendo ser de vidro, metal,
plstico, uma coluna fechada de ao inoxidvel ou colunas
empacotadas ou capilares, como no caso da cromatografia gasosa.
A cromatografia em coluna pode ser de vrias formas, mas
apresenta o cromatograma caracterstico representado na Figura 5.1,
obtido por um registrador no momento em que as amostras passam
por ele.
Nessa figura est representada a separao de uma mistura que
contm somente dois componentes. O pico esquerda representa o
composto que no ficou retido na fase estacionria, pois ficou menos
tempo nela, logo passou pelo detector primeiro. Assim, o tempo
morto, que o tempo em que o composto no retido gastou na fase
mvel pode ser facilmente identificado, pela nomenclatura tM. O
segundo componente por sua vez ficou retido na fase estacionria,
ento todo o tempo que ele demorou para passar pelo detector, menos
o tempo morto, o tempo de reteno na fase estacionria tE. E
finalmente podemos determinar o tempo de reteno, tR, que ser a
soma do tempo morto e o tempo de reteno na fase estacionria.

Figura 5.1 - Cromatograma tpico de uma cromatografia em coluna de uma mistura


de dois componentes. tM representa o tempo morto, ou seja, o tempo em que um
soluto no retido gasta para passar pela coluna cromatogrfica. O tE representa o
tempo em o soluto fica retido na fase estacionria e o tR o tempo de reteno que
ocorre desde o momento da injeo da amostra at o aparecimento do pico no
detector da coluna. Wb representa a largura do pico na linha de base.

Para que uma coluna cromatogrfica seja eficiente, necessrio


nela exista uma grande diferena entre as constantes de distribuio
das substncias de interesse ou que esta tenha um alto nmero de
pratos tericos, deixando-a mais seletiva. Numa coluna
cromatogrfica, existem uma srie de estgios independentes onde
ocorre o equilbrio entre o analito distribudo na fase mvel e na fase
estacionria. Assim, cada estgio independente de equilbrio
chamado de prato terico. O nmero de pratos tericos (N) pode ser
calculado segundo a equao abaixo:
tr 2
t
N=16 .
=5,545 . r
wb
wh

( )

( )

5.1

Onde wh a largura do pico na sua meia altura.


O nmero de pratos tericos pode ser influenciado por diversos
fatores, como a altura da coluna e para isso, recorre-se a uma
avaliao comparativa que corresponde ao clculo da razo entre o
comprimento da coluna, L, e o nmero de pratos, N:
H=

L
N

5.2

Quanto maior for o nmero de pratos tericos e menor for o valor


de H, mais eficiente ser a coluna cromatogrfica.
A cromatografia em coluna pode ser subdividida em trs grandes
grupos: a cromatografia lquida, quando a fase mvel for um lquido,
cromatografia gasosa, quando a fase mvel for um gs e cromatografia
em fluido supercrtico, quando a mesma for um fluido em estado
supercrtico. Todos esses grupos so melhor descritos nos captulos
subsequentes.
Referncias
CIOLA, R. Fundamentos da cromatografia a gs. 2 ed. So Paulo:
Editora Edgard Blcher LTDA, 1985.
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.
SKOOG, D. A; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R.
Fundamentos de qumica analtica. Trad. Marco Tadeu Grassi. So
Paulo: Pioneira Thomsom Learning, 2006.

CAPTULO 6 - Cromatografia lquida em coluna aberta


Thales Augusto Garcia Pelizaro
6.1.

Introduo

A cromatografia lquida era feita em coluna aberta (Cromatografia


Lquida Clssica - LC) no perodo que antecedeu a dcada de 1970,
com condies de presso ambiente ou em baixas presses. O
processo da cromatografia lquida envolve as seguintes etapas:
preparao do suporte, adio de amostra e solvente, deteco e
quantificao.
De uma forma geral eram feitas separaes das fraes em tubos de
ensaios e o solvente presente nas fraes, evaporados. A diferena dos
pesos entre o tubo antes e aps a evaporao fornece o valor de massa
eluida em determinado tubo. Dessa forma, era feito um grfico em
papel milimetrado no qual era mostrada a separao identificada.
6.2. Alguns mecanismos relacionados a separao presentes em
cromatografia lquida clssica
6.2.1. Adsoro
A fase estacionria slida a ser usada pode ser a slica (SiO 2) ou a
alumina (Al2O3)n. Como fase mvel utiliza-se a semipolar ou apolar,
tendo como possveis exemplos: hexano, acetado de etila. O composto
alvo de interesse atua interagindo com uma superfcie polar de fase
estacionria. A interao em funo das polaridades e geometria.
Aqueles componentes mais polares ficam retidos na fase estacionria e
permanecem por mais tempo no suporte.
Pelo fato de o processo de adsoro ser muito sensvel as variaes
de fatores estricos dos solutos, um mtodo adequado para separar
compostos de alta semelhana com diferenas mnimas na
estereoqumica.

Figura 6.1 - Pela maior polaridade e geometria mais prxima do stio ativo
(azul claro) presente na fase estacionria (amarelo) o soluto presente na
fase mvel (verde) desloca a molcula ligada anteriormente (azul escuro) e
permanece por mais tempo.

6.2.2. Excluso por tamanho


Este mecanismo no tem relao com foras qumicas de interao.
Para ter a separao usado materiais com poros de tamanhos
especficos que tem uma funo similar a peneira. Onde os compostos
de maior tamanho que os poros da fase estacionria, so retidos e no
entram. Consequentemente saem mais rapidamente da coluna. E as
partculas menores, por entrarem nos poros levam mais tempo para
serem eluidas.

Figura 6.2 - Representao simples em uma coluna mostrando uma fase


estacionrio com espaos que permite a passagem de apenas algumas
partes das molculas, cujo tamanho adequado.

6.2.3. Partio
Em cromatografia por partio, o processo decorrente de um
arranjo dos solutos pela fase mvel e fase estacionria. Algo diferente
do que acontece na adsoro em que necessria uma interao entre
a parte do adsorvente, composto analisado e o solvente.
A solubilidade do composto de interesse nas duas fases influncia o
funcionamento do processo de partio. Um processo muito sensvel
as diferentes quantidades de massa molecular dos solutos. Com isso,
componentes homlogos so separados com maior eficincia
utilizando-se o mecanismo de partio.
Dentre as dificuldades do processo, se destaca a fixao da fase
estacionria ao suporte slido. Ao longo da operao de separao
ocorre uma solubilizao do filme pela fase mvel, sendo removido da
coluna. Uma alternativa vivel para isso fazer uma dissoluo da
amostra num solvente saturado, ou seja, realizar uma pr-saturao da
fase mvel com a estacionria.

Figura 6.3 - A barra azul o suporte com a fase estacionria (verde) que
ir interagir com uma frao da molcula (preto) e uma outra parte da
molcula est em contato com a fase lquida.

6.2.4. Troca inica


utilizado para separar compostos de alta polaridade. Envolve o
uso de uma resina atuando como trocadora de ons e funciona como a
fase estacionria. Os materiais que compem a resina possuem grande
quantidade de cargas eltricas, podendo ser positiva ou negativa e tem
um valor igual ao da carga em ons livres possuindo uma carga oposta,
chamados contra-ons.
Quando uma soluo caminha pela resina e apresenta ons de carga
similar aos contra-ons, existe a possibilidade de deslocar os contraons presentes no material inicialmente e assim, ocupa o lugar deles.

Figura 6.4 - Amostra presente na fase lquida com carga negativa desloca o
contra-on de carga negativa que inicialmente estava ligado a carga fixa
presente na fase estacionria.

Referncias
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.
LANAS, F. M. Cromatografia lquida moderna: HPLC/CLAE.
Campinas, SP: Editora tomos, 2009.
NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia Princpios
bsicos e tcnicas afins. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.

CAPTULO 7 - Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)


Thales Augusto Garcia Pelizaro
7.1.

Introduo

A cromatografia lquida de alta eficincia conhecida como uma


cromatografia lquida moderna. A denominao moderna no tem
relao com o tempo. O termo utilizado para classificar uma
alterao indispensvel para a LC.
O fundamento da cromatografia lquida moderna se deve a criao
de diversas melhorias nos setores da cromatografia, entre elas tm-se a
parte de equipamentos, empacotamentos especiais, a teoria do
funcionamento do sistema, o uso de colunas e tambm tem a parte de
informtica com desenvolvimento de programas e computadores com
finalidade de captao e interpretao dos resultados com eficincia.
Todos os mecanismos de separao descritos para a cromatografia
lquida clssica (adsoro, excluso por tamanho, partio, troca
inica) esto presentes na cromatografia lquida de alta eficincia. O
que muda de fato so os aperfeioamentos dos processos.
Vale destacar que atualmente, vrios pesquisadores tm optado pelo
uso da sigla LC apenas, em vez de HPLC (High Perfomance Liquid
Chomatography) ou em portugus o termo CLAE (Cromatografia
Lquida de Alta Eficincia). Isto, uma forma de evitar confuses a
respeitos da cromatografia lquida clssica e moderna.
7.2.

Princpios da Cromatografia Lquida Moderna

Martin e Synge publicaram em 1941 um trabalho no qual fizeram


uma comparao da cromatografia, destilao e extrao usando
solventes. De uma forma geral, diziam que a coluna de cromatografia
apresenta diversas etapas da extrao lquido-lquido, ou de pratos
tericos. Devido ao uso deste ltimo termo, o trabalho lembrado
como a teoria dos pratos. O termo de pratos foi usado como
referncia ao que era usado na poca para explicao da teoria de

destilao.

Figura 7.1 - Retngulos representam os pratos em coluna de destilao (a) e


os pontos tracejados mostram os que seriam os pratos tericos, pois em
cromatografia no existem pratos de fato (b).

7.2.1. Parmetros relacionados com a eficincia de uma coluna de


cromatografia lquida de alta eficincia
A denominao prato terico teve seu conceito definido para
expressar a eficincia num processo que consiste em um contato
lquido-vapor dentro da coluna utilizada na destilao. E assim,
quanto maior for a quantidade de pratos (N) melhor o processamento
na coluna.
Uma alternativa para predizer a eficincia utilizar para tal a altura
equivalente a um prato terico (HETP, Heigh Equivalent to a
Theoretical Plate), definido pela letra H. Em uma coluna com
comprimento L, a equao 5.2 mostra como calculado o valor da
altura equivalente a um prato terico (H).
Assim, presume-se que quanto menor for o valor de H, mais
eficiente a coluna. Comparativamente mais vantajoso utilizar como
parmetro a altura equivalente a um prato terico em vez do nmero
de pratos tericos, pois o valor de H no depende do tamanho em

comprimento da coluna.
Porm, a teoria dos pratos no ideal para aplicar-se a
cromatografia, justamente por no ter de fato pratos na coluna.
Entretanto, foi um passo importante criar-se a teoria de cromatografia
em meados de 1940, e persiste ainda hoje.
7.2.2. Definindo a velocidade em cromatografia lquida
O pesquisador van Deemter em associao com outros
pesquisadores, desenvolveram um trabalho e definiram uma equao
de velocidade para a cromatografia gasosa (GC) mais simples, que
assim descrita:
H=

A+B
+C 7.1

Nos quais:
= velocidade linear mdia da fase mvel;
A = termo para difuso turbulenta;
B = termo para difuso molecular;
C = termo de transferncia de massa.
Entretanto, para a cromatografia lquida no se aplicaria a equao
7.1 com apenas 3 termos. Devido as diferenas entre a LC e a GC,
destacando o fato de que os termos relacionados a difuso em fase
mvel e transferncia de massa influenciarem mais em cromatografia
lquida do que em cromatografia gasosa. Assim, Knox e demais
pesquisadores desenvolveram uma ampliao da equao de Deemter
et. al, ampliando para 4 termos ao fracionar o valor de C para dois:
H=

A+B
=(C fe + Cfm ) 7.2

Sendo:
= velocidade linear mdia da fase mvel;
A = termo para difuso turbulenta;
B = termo para difuso molecular;
Cfe = termo de transferncia de massa na fase estacionria;
Cfm = termo de transferncia de massa na fase mvel.
Referncias
HORNE, D. S.; KNOX, J. H.; MCLAREN, L. In: KELLER, R. A.
(Ed). Separation Techniques in Chemistry and Biochemistry. New
York: Dekker, 1967.
LANAS, F. M. Cromatografia lquida moderna: HPLC/CLAE.
Campinas, SP: Editora tomos, 2009.

CAPTULO 8 - Cromatografia gasosa


Thales Augusto Garcia Pelizaro
8.1.

Introduo

Este mtodo fsico um dos mais usados em laboratrios,


motivado pela excelente sensibilidade do mtodo que pode atuar na
separao e identificao de muitos compostos ao mesmo tempo.
Envolve uma fase mvel constituda de gs.
Quanto as divises tm-se a cromatografia gs-lquido (CGL) e
cromatografia gs slido (CGS). Em CGL a fase estacionria um
lquido de carter no voltil envolvendo um suporte, j em CGS a
fase estacionria um slido.
Atualmente a CGL mais amplamente usada, o que faz com que
no se use essas divises. Ento, tem-se definido apenas como
cromatografia gasosa (CG). Existem dois modelos de cromatografia
gasosa, as conhecidas como cromatografia convencional (CG) e a
cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR), detalhas no item 8.2.
O uso da cromatografia gasosa s indicado quando houver
necessidade de separao de compostos com capacidade de se
reduzirem a gs ou vapor. Deve-se destacar que a medida que o
composto for de carter mais inico sua capacidade de reduzir a gs
ou vapor menor, assim so mais difceis de serem sujeitos a via
cromatogrfica gasosa para serem separados, sendo melhor indicado a
cromatografia lquida.
A cromatografia gasosa possui vantagens, como a sua alta
capacidade de separao; a velocidade do processo alta; alta
sensibilidade e possibilidade de se trabalhar com pequenas
quantidades de amostras. Sobre suas desvantagens, pode ser citado por
exemplo o fato de serem aplicados para compostos de carter voltil e
baixa eficincia em relao aos resultados qualitativos (no apresenta
uma concluso definitiva).

8.2. Diferenciando a cromatografia gasosa convencional (CG)


da cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR)
A diferena da cromatografia gasosa (CG) dita como convencional
em relao a cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR) em
funo de que a CGAR apresentar picos mais finos, um fator que faz
com que a resoluo seja superior ao observado na convencional.
Outro ponto fundamental a ser observado quanto as colunas
capilares. Em cromatografia de alta resoluo as colunas capilares
usadas so apenas de alta resoluo. J as colunas capilares
convencionais e de slica fundida so de baixa resoluo, no
configurando um sistema de CGAR.
Nos casos de anlises de resduos prefervel o uso da CGAR, pois
possvel utilizar uma quantidade maior de soluo comparado ao
mtodo convencional.
8.3.

Montagem do sistema de cromatografia gasosa

De forma geral a aparelhagem necessria para ter o sistema de CG


envolve um compartimento de gs de arraste acoplado a um regulador
de presso com dois estgios, um injetor associado a coluna,
termostato, sistema de deteco e um registrador (Figura 8.1).

Figura 8.1 - Em 1 tem-se o compartimento de arraste do gs, 2 representa o


regulador de presso, 3 o injetor de amostra (neste caso uma seringa), o 4 a
coluna na qual a amostra injetada e est dentro de um forno, 5 indica o
termostato acoplado ao forno e permitindo o controle da temperatura, 6 o
detector que est ligado a coluna, e por fim o 7 representa o registrador de sinal
que sai do detector.

8.4.

Alternativas de injetores para as amostras na coluna

O uso de seringa um mtodo amplamente usado. Estas seringas


so montadas com o objetivo de evitar vazamentos. Trata-se de uma
tcnica simples. O problema deste injetor decorrente do fato de que
o solvente os e compostos mais volteis podem sair primeiros em
relao aos compostos menos volteis. Isso provoca uma mudana na
composio da amostra inicialmente.
No caso de amostras concentradas, utilizado um injetor slipt
(traduo para o portugus: diviso). Este injetor uma aparelhagem
que funciona vaporizando a amostra no momento em que ela est
sendo misturada ao gs de arraste.
Com isso, ocorre uma separao entre duas fraes. Uma frao
menor da amostra volatizada vai para dentro da coluna e outra maior
eliminada. Porm, se as amostras usadas forem diludas, o injetor
utilizado o splitless (em portugus significa: sem diviso).

Diferentemente do injetor split, este possui uma vlvula de


fechamento peridico. Neste fechamento, a amostra injetada, sofre
vaporizao e manda para a coluna.
O uso do injetor splitess vivel para casos de anlises envolvendo
solues bem diludas, compostos saindo da causa do solvente e
compostos de carter termolbeis. Interessante destacar que os
injetores comerciais em sua boa parte so projetados para atuarem de
duas formas: split e splitless.
Por fim, existe o injetor cold-on column que envolve uma aplicao
da amostra diretamente na coluna no sendo requerido um
preaquecimento e nem a mistura do gs de arraste. Em relao aos
outros trs injetores citados, este possui vantagens significativas como
reduo de diviso da amostra devido a temperatura, aumento da
preciso em casos com compostos altamente volteis e melhoria na
quantificao dos compostos separadamente presentes na amostra.
8.5.

Tipos de colunas utilizadas

Um cromatgrafo a gs pode ser montado utilizando as colunas


empacotadas e as colunas capilares. Em colunas empacotadas, sua
construo feita depositando-se um filme da fase estacionria lquida
sobre um suporte slido feito de material inerte que ir ret-la. O
material obtido empacotado sob tcnicas especficas no tubo
cromatogrfico, utilizado para a anlise. No caso das colunas
capilares, a fase estacionria lquida inserida nas paredes dos tubos
capilares sob a forma de um filme fino da ordem de alguns mcrons,
ou seja, no encontra-se um suporte slido. As colunas capilares so
mais eficientes que as colunas empacotas.
8.6.

Definies dos diferentes modelos de detectores

Detector de condutividade trmica (DCT) um tipo de detector


sensvel a temperatura do gs. Sua vantagem que no provoca

destruio da amostra e universal. Enquanto, as desvantagens se


restringem ao fato de ter uma capacidade de resposta inferior aos
outros tipos de detectores e s podem ser usados com temperatura e
velocidade de arraste do gs constante.
Outro modelo de detector o detector de ionizao de chama
(DIC), que capaz de identificar qualquer componente sob ao
trmica e ao ser queimado gera compostos de carga eltrica. um tipo
de detector ideal em sistema com variao de temperatura e
velocidade do arraste de gs, tambm boa aplicao para anlise
quantitativa por apresentar um grande faixa linear e possui boa
resposta para quase todos os compostos orgnicos. Porm, afeta a
amostra ao destru-la e se tiver compostos de mesma concentrao
pode ocorrer de ter respostas diferentes.
Enfim, o detector de captura eletrnica (DCE), em que seu
princpio de funcionamento est associado a capacidade de captura de
eltrons por parte de alguns compostos. Como vantagem temos seu
alto teor de seletividade para compostos que capturam eltrons, no
detectando, por exemplo, lcoois e cetonas. Igualmente ao DIC
provoca destruio a amostra, e outra desvantagem est no fato de que
devem ser feitas limpezas regularmente, pois pode ser facilmente
contaminado pelas amostras usadas.
8.7.

Os registradores

So os compartimentos que realizam o desenho dos cromatograma,


ou seja, interpretam os resultados provenientes dos detectores.
Existem trs tipos de registradores: simples (s apresenta o
cromatograma); integrador (apresenta o cromatograma e quantifica os
picos) e o computador (apresenta o cromatograma, quantifica os picos
e ainda faz as correes necessrias de forma automtica).

Referncias
CECCHI. H. M. Fundamentos tericos e prticos em anlise de
alimentos. 2 ed. rev. Campinas: Editora da Unicamp, 2003.
CIOLA, R. Fundamentos da cromatografia a gs. 2 ed. So Paulo:
Editora Edgard Blcher LTDA, 1985.
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.
NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia Princpios
bsicos e tcnicas afins. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.

CAPTULO 9 - Cromatografia em fluido supercrtico (CFSC)


Thales Augusto Garcia Pelizaro
9.1.

Introduo

O fluido supercrtico o estado de uma substncia ou composto


que est sujeito a presso e temperatura acima daquela na qual
representa o ponto crtico apresentando caractersticas de um gs e
lquido, sem real diferenciao de fases (ver Figura 9.1).
A descoberta da capacidade de solubilizao por parte do fluido
supercrtico ocorreu na dcada de XIX, mais precisamente em 1879.
Um feito de Hannay e Hogarth. Entretanto, o uso do fludo
supercrtico como alternativa em mtodos analticos s ocorreu de fato
no final do sculo XX.
Um dos motivos que impulsionou a utilizao do fludo
supercrtico est no objetivo de obter uma fase mvel com
caractersticas fsico-qumicas que se aproximassem das fases lquidas
e gasosas. Isso devido as vantagens de um e de outro.
Sobre o uso do gases como fase mvel, este apresenta um aumento
do coeficiente de difuso decorrente da baixa densidade, o que leva a
um resultado mais rpido e eficiente. Entretanto, a desvantagem est
no poder de solubilizao limitado, restringindo o uso em casos de
cromatografia com componentes no volteis. Em fase mvel lquida
o contrrio, pois a densidade alta.

Figura 9.1 - Diagrama presso versus temperatura mostrando os trs


estados fsicos, slido, lquido, gasoso e o ponto crtico delimitando a regio
do fluido supercrtico.

9.2.

Anlise das propriedades fsico-qumicas

Um fludo supercrtico possui como caracterstica uma densidade


acima de quando o composto est no estado slido, e o valor dessa
densidade bem prximo do observado no estado lquido. Porm,
sobre a viscosidade do fludo supercrtico tem-se uma aproximao
maior com a dos gases.
Em relao ao coeficiente de difuso, o fludo supercrtico possui
um valor maior que o encontrado em lquido, porm menor do que o
visto em gases. Isso indica que em anlises com CFSC tem-se uma
maior eficincia de anlises comparada as cromatografias lquidas e
em tempo menor.

9.3.

Fundamentos da cromatografia por fludo supercrtico

Atravs de uma equao de estado possvel representar as


propriedades termodinmicas de um gs, fornecendo o volume com
base na temperatura e presso. Para isto a equao de Estado de Virial
representa bem o que observado, descrito abaixo pela equao 9.1:
PV = A+

B' C' D'


+ +
+... 9.1
V V V

Na equao, o A indica o primeiro coeficiente de Virial, o B o


segundo, o C o terceiro e o D o quarto e assim sucessivamente at
ter-se o nmero de virial adequado. Cada um dos viriais est em
funo da temperatura. Outra forma de representar a equao 9.1 est
representada pela equao 9.2:
PV = A+ BP+ CP+ DP + ... 9.2
O valor de A igual tanto na equao 9.1 como na 9.2 e sabendo
que este primeiro coeficiente de Virial e seu termo tem relao com a
lei dos gases perfeitos, isso permite a definio de uma nova equao:
PV =RT + BP+ CP+ DP +.. . 9.3
Berthelot no incio do sculo XX definiu uma equao de estado
que seria a primeira equao de estado sendo representada por:
PV =RT +

[( ) (

)]

9 RT c 16 T C

P 9.4
128 Pc
T

O termo TC representa a temperatura do gs no ponto crtico, e Pc


a presso do gs no ponto crtico. O termo entre colchete equivale ao
segundo coeficiente de Virial, o B nas equaes 9.1; 9.2 e 9.3.
9.4.

Alguns dos parmetros considerados na CFSC

9.4.1. Seletividade
Este o parmetro com maior maleabilidade no quesito de
alteraes com o objetivo de separao dos compostos em anlises. As
mudanas de seletividade podem ser realizadas alterando-se a fase
mvel, fase estacionria, temperatura, adicionando modificadores e
outras opes.
9.4.2. Temperatura
A influncia da temperatura pode ser visualizada em duas ticas
diferentes, considerando uma presso constante ou densidade
constante. Se for utilizada a densidade constante, a equao de Van't
Hoff deve ser utilizada:
H T
d ln k
=
9.5
1
R
d
T p

( )

Onde,
Ht0 = entalpia necessria para transio do soluto entre as duas
fases
R = uma constante dos gases
k = o fator de reteno
Em caso de presso constante, um pouco mais complexo sobre a
variao de temperatura. Depende muito das condies. Grande parte
dos solventes quando sujeitos ao aumento de temperatura, tendo a

temperatura inicial como a do ambiente, o valor de k diminuir.


Porm, em temperaturas maiores que a do ponto crtico, a constante k
se eleva.
Nas presses mais prximas daquela relacionada ao ponto crtico, a
elevao de k mais acentuada. A explicao devido ao maior
volume livre presente na fase mvel provocar queda de solubilidade e
gerar um desvio de partio para a fase estacionria.
9.4.3. Densidade e presso
Uma alterao na presso consequentemente ter efeitos na
densidade. Isso confere um destaque para a presso como parmetro a
ser considerado. Efeitos na eluio so importantes para o
funcionamento da anlise cromatogrfica. Se afeta a densidade,
afetar a eluio na fase mvel.
9.4.4. Fase mvel
Diversos tipos de fase mvel so conhecidos e utilizados. O que
determina a escolha da fase mvel so as caractersticas da amostra
avaliada. Como exemplo de fase mvel tem-se o dixido de carbono,
hexafluoreto de enxofre, xennio, metanol, entre outros.
9.5.

Equipamentos para a CSFC

A montagem de um equipamento ideal para o funcionamento de


anlises por cromatografia por fludo supercrtico envolve
basicamente uma bomba, o injetor, a coluna cromatogrfica, um
sistema de aquecimento, o restritor e o detector. De maneira geral,
notrio que o sistema possui semelhanas com o equipamento usado
para CLAE e para CGAR.
Sobre a bomba utilizada, igual aquela empregada para a
cromatografia lquida de alta eficincia, podendo ser de trs tipos:
bomba de pressurizao pneumtica; bomba de pisto reciprocante e a

bomba tipo seringa.


Para os injetores, possvel a utilizao de dois tipos distintos, um
injetor convencional de cromatografia gasosa ou um que usado em
cromatografia lquida de alta eficincia utilizando vlvulas de vrias
entradas.
Em relao a coluna, igualmente as outras cromatografias, deve ser
levado em considerao os solutos envolvidos nas anlises, pois
dependendo do tamanho da partcula, a resoluo melhor ou de
qualidade mais baixa, tendo a eficincia afetada. Partculas pequenas
proporcionam maior resoluo, porm tem uma alta perda da carga
gerando situaes adversas. Entretanto, ao se tratar de partculas
maiores tem-se uma perda em relao a resoluo, porm tem-se um
ganho quanto a perda de carga, pois menor do que a observada com
o uso de partculas pequenas. Isso oferece uma condio de se ter
fluxos maiores e diminuio do tempo para a obteno dos resultados.
A temperatura altera a partio e seletividade das partculas, e com
isso necessrio controlar a mesma durante o processo de
cromatografia, o que justifica utilizar o sistema de aquecimento.
O uso do restritor se deve a necessidade de ter a presso constante
dentro da coluna, lembrando que a presso afeta a densidade do soluto
e assim na anlise cromatogrfica.
O detector a parte do equipamento que identificar os resultados
da cromatografia, podendo ser utilizado dois tipos. Um que
empregado na CLAE (detector por UV) e um muito comum na
cromatografia gasosa (detector por ionizao em chama).
Referncias
CARRILHO, Emanuel; TAVARES, Maria Ceclia H.; LANCAS,
Fernando M. Fluidos supercrticos em qumica analtica. I.
Cromatografia com fluido supercrtico: conceitos termodinmicos.
Qumica Nova, v. 24 (4), 2001.
CARRILHO, Emanuel; TAVARES, Maria Ceclia H.; LANCAS,

Fernando M. Fluidos supercrticos em qumica analtica. II.


Cromatografia com fluido supercrtico: instrumentao. Qumica
Nova, v. 26 (5), 2003.
NETO, F. R. A.; NUNES, D. S. S. Cromatografia Princpios
bsicos e Tcnicas afins. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia, 2003.

CAPTULO 10 - Algumas aplicaes da cromatografia


Thales Augusto Garcia Pelizaro
Inmeras so as aplicaes da tcnica de cromatografia e algumas
sero citadas neste captulo.
10.1. Cromatografia em papel
A cromatografia em papel utilizada, de preferncia, para a
separao de substncias polares, hidroflicas. Alm disso, vantajoso
para o acompanhamento de reaes qumicas ou acompanhamento da
separao dos componentes de uma mistura.
10.2. Cromatografia em camada delgada
A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) permite a separao
tanto de substncias hidrofbicas quanto hidroflicas. A CCD
frequentemente usada em anlises farmacuticas, anlises clnicas,
qumica industrial, qumica de alimentos, anlise de pesticidas, anlise
de pureza de corantes, cosmticos, etc.
A Cromatografia em Camada Delgada de Alta Eficincia (CCDAE)
possui maior aplicao na rea de anlise clnica, como anlise de
drogas no sangue, e anlise ambiental.
10.3. Cromatografia lquida
Na cromatografia lquida por adsoro destaca-se como aplicao,
a anlise de vitaminas, carotenides, oligossacardeos em alimentos, e
atua como controle de qualidade na verificao de presena de
micotoxinas em alimentos.
A cromatografia lquida de partio tem aplicao na verificao
de alimentos, como a anlise de vitaminas, antioxidantes (butilhidroxi-tolueno e o butil-hidroxi-anisol) e tambm os cidos graxos
localizados (leos e gorduras).

Diferentemente, a cromatografia por troca inica permite analisar


presena de metais, aminocidos e protenas em alimentos, cidos
orgnicos nas frutas e tambm verificao do tratamento da dureza da
gua. No caso da cromatografia lquida de excluso molecular possui
efeito ne anlise em alimentos sobre a presena de protena,
polissacardeos, resduos de pesticidas e acerca de compostos naturais
que conferem algumas caractersticas importantes ao alimento como o
sabor e a cor.
10.4. Cromatografia gasosa
A cromatografia gasosa possui aplicao em anlises de pesticidas,
leos e gorduras (presena cidos graxos e seu nvel de oxidao) e
tambm tem ampla utilizao em anlises de diversos tipos de
compostos presentes em alimentos, como os cidos orgnicos,
conservantes, lcool, vitaminas e tambm possveis contaminaes na
embalagem.
10.5. Cromatografia por fludo supercrtico
Utilizao da cromatografia por fludo supercrtico pode ser
empregada em vrios aspectos. Entre as aplicaes, temos o uso para
anlises em alimentos, como a identificao de vitaminas
lipossolveis. Outra aplicao est na caracterizao de produtos
naturais, muito utilizada na indstria de cosmticos.
No caso de anlises de pesticidas, a cromatografia por fludo
supercrtico se torna uma boa sada para casos de compostos que so
termicamente instveis, o que no tem seu monitoramento favorvel
utilizando a cromatografia gasosa (mais empregada para anlise de
pesticidas). Tambm tem uma aplicao para separao de polmeros
como os poliglicis, importantes para a indstria qumica. E por fim,
outra grande importncia da CSFC quanto aos frmacos como uma
tcnica para obteno de compostos de carter farmacutico.

Referncias
CARRILHO, Emanuel; TAVARES, Maria Ceclia H.; LANCAS,
Fernando M. Fluidos supercrticos em qumica analtica. III.:
aplicaes. Qumica Nova, v. 29 (4), 2006.
CECCHI. H. M. Fundamentos tericos e prticos em anlise de
alimentos. 2 ed. rev. Campinas: Editora da Unicamp, 2003.
COLLINS, C. H. e BRAGA, G. L. Introduo a mtodos
cromatogrficos. 2 ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1987.