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Actividad Enzimtica.

Amilasa Salival

ndice

Introduccin

Pginas 3-4

Objetivos del prctico

Pgina 5

Materiales

Pgina 6

Mtodo experimental

Pginas 7-8

Clculos y Resultados

Pginas 9-10

Discusin

Pginas 12-13

Conclusin

Pgina 14

Cuestionario

Pgina 15

Bibliografa

Pgina 16

Introduccin
Las enzimas son catalizadores especficos importantsimos en la regulacin de la
qumica de las clulas y los organismos. La catlisis es esencial para hacer que
muchas reacciones bioqumicas de importancia crucial se produzcan en
condiciones fisiolgicas a velocidades tiles. Una reaccin que requiere de
muchas horas para completarse no puede ser til, desde el punto de vista
metablico.

En la clula, hay innumerables reacciones posibles entre las molculas. La clula


aprovecha la catlisis para canalizar las sustancias hacia rutas que sean tiles en
vez de hacia reacciones despilfarradoras. Las enzimas que la clula utiliza son
catalizadores poco habituales, ya que en la mayor parte de los casos, la eficacia
de su accin puede controlarse, de manera que se module la produccin de
distintas sustancias en respuesta a las necesidades de la clula y del organismo.

La actividad enzimtica tambin puede ser afectada por diversos factores, como
la temperatura, debido a que la enzima presenta una estructura proteica el
aumento de temperatura puede en algunos casos aumentar su velocidad, pero
tambin puede ser desnaturalizada si aumenta mucho, volviendo a su estructura
primaria y perdiendo su funcin biolgica. Existe la temperatura ptima en la
enzima que se presenta cuando est en su mxima actividad. Otro factor
importante es el pH, que es caracterstico en cada enzima donde pueda realizar su
funcin y cualquier cambio puede afectar la velocidad de la reaccin. Existen
tambin sustancias qumicas que pueden aumentar la actividad enzimtica o
disminuirla, constituyendo otro factor principal.

En este prctico se trabaj con la -amilasa, que es una enzima que degrada
almidn y es la principal amilasa encontrada en humanos y otros mamferos.
Aunque se encuentra en muchos tejidos, la amilasa es ms abundante en el jugo
pancretico y saliva.
La amilasa salival tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los
enlaces 1-4 del componente -amilasa al digerir el glucgeno y el almidn para
formar azcares simples.
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Tiene actividad enzimtica a un pH de 7 y puede demostrarse detectando la


aparicin del producto o la desaparicin del sustrato.
El mtodo experimental en el laboratorio se bas en medir la actividad enzimtica
de la -amilasa, utilizando un test colorimtrico que detecta el almidn. Para ello
se contar con una solucin de lugol, ya que el almidn en presencia de esta
solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica.
El Iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilasa, formando un
complejo de color azul. Cuando la -amilasa acta, degrada la amilasa, se
desintegra la hlice y por tanto en presencia de la solucin de lugol ya no dar una
coloracin azul.
El objetivo de este laboratorio fue determinar la actividad enzimtica de la amilasa
salival por medio de la desaparicin del sustrato y el anlisis de como distintas
condiciones tales como la temperatura o el pH, pueden afectar en el actuar de la
enzima.

Objetivos del prctico

Medir la actividad enzimtica de la -amilasa.

Analizar cmo afectan las distintas condiciones, tales como temperatura,


pH, concentracin de NaCl, en que acta la enzima.

Realizar lectura de absorbancia de las diluciones para obtener la


concentracin de almidn de cada tubo y gracias a eso poder evaluar la
influencia del cambio de temperatura en el ensayo.

Construir curva de calibracin.

Materiales

1 Gradilla
10 tubos de ensayo
2 micropipetas (200 y 1000 l)
3 vasos de precipitado (50 o 100 ml)
Bao de hielo (0C)
Bao termorregulador (90)
Estufa a 37C
Cubetas para espectrofotometra
Espectrofotmetro

Soluciones y Reactivos

Solucin de almidn al 2%
Lugol
Solucin salina fisiolgica
Agua destilada
Saliva humana

Mtodo experimental
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Un voluntario junt aproximadamente 5 ml de saliva en un vaso precipitado


pequeo y se diluy con agua.

Con los siguientes datos, se realiz la dilucin del sustrato y la lectura de


absorbancia.

Tubo
I
II
III
IV
V

Agua destilada
4,500
4,250
3,250
2,000
750

Almidn 2% (l)
0
250
1,250
2,500
3,75o

Concentracin
0,00
0,10
0,50
1,00
1,50

A cada tubo se le agreg tambin 500 l de lugol.


Experimento 1: Determinacin de la Actividad Enzimtica
1. Tomamos 2 tubos de ensayo con 3 ml de solucin neutra de almidn
2% (p/v). Luego, colocamos los tubos en un bao trmico a 37 por 2
minutos.
2. Al retirar los tubos de ensayo del bao trmico, le agregamos 1 ml de
la saliva diluida (enzima) al tubo nmero uno y 1 ml de suero
fisiolgico al tubo nmero dos. Luego mezclamos suavemente.
3. Incubamos por 10 minutos a 37C.
4. Aadimos 500 l de Lugol.
5. Realizamos la lectura de la absorbancia en el espectrofotmetro a
590 nm.

Experimento 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica.


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1. Tomamos 4 tubos de ensayo. Se aadi a cada tubo 1 ml de saliva


diluida.
2. Incubamos por 5 minutos cada tubo a la siguiente temperatura :
Tubo 1: 0 grados.
Tubo 2: Temperatura ambiente.
Tubo 3: 37 grados.
Tubo 4: 90 grados.

3. Agregamos a cada tubo 3 ml de solucin de almidn 2%. Luego


mezclamos.
4. Incubamos a la temperatura correspondiente por 10 minutos.
5. Aadimos 500 l de Lugol.
6. Realizamos la lectura de la absorbancia en el espectrofotmetro a
590 nm.

Clculos y Resultados

Construccin de la curva de calibracin.

Tubo

Agua destilada

I ( Blanco )
II
III
IV
V

4500
4250
3250
2000
750

Almidn 2%
(l)
0
250
1,250
2,500
3,750

Concentracin %

Absorbancia 590 nm

0,00
0,10
0,50
1,00
1,50

0
0,017
0,1
0,247
0,457

Experimento 1:

Determinar la concentracin de almidn en cada tubo.


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Tubo 1: 3 ml de almidn , 1ml de saliva diluida y 500 l lugol


*Absorbancia: 0,564.
Tubo 2: 3 ml de almidn , 1ml de suero fisiolgico y 500 l de lugol.
*Absorbancia: 0,597.

Clculo de concentracin en base a la absorbancia y la ecuacin de la recta


obtenida en la curva de calibracin.

Concentracin de almidn tubo 1


0,564 0,0382 / 3,142 = 0,16

Concentracin de almidn tubo 2


0,597 0,0382 / 3, 142 = 0,17

Experimento 2:

Determinar la concentracin de almidn en cada tubo.


Tubo 1: Absorbancia 0,765
Tubo 2: Absorbancia 2
Tubo 3: Absorbancia 0,850
Tubo 4: Absorbancia 2

Concentracin de almidn tubo 1


0,765 0,0382 / 3,142 = 0,23

Concentracin de almidn tubo 2


10

2 0,0382 / 3,142 = 0, 62

Concentracin de almidn tubo 3


0,850 0,0382 / 3,142 = 0,25

Concentracin de almidn tubo 4


2 0,0382 / 3,142 = 0,62

Discusin
La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin catalizada
por enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando la temperatura
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se eleva debido al incremento de la energa cintica de la energa de las


molculas reactantes.
Sin embargo, al final, la energa cintica de la enzima excede a la barrera
energtica para romper los enlaces dbiles de hidrogeno que conservan su
estructura secundaria y terciaria.
A esta temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la
actividad cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima de
accin. Los lmites de actividad para la mayor parte de las enzimas tiene lugar
entre los 10C y 50C; la temperatura ptima para las enzimas en el cuerpo se
halla alrededor de 37C.
La amilasa salival en acta en condiciones ptimas a un pH 7 y con una
temperatura de 37C.
En la primera parte de este prctico se obtuvo una proporcionalidad de la
absorbancia con respecto a la concentracin, obteniendo en la curva de
calibracin una lnea recta ascendente. Esto quiere decir que hubo cumplimiento
de la Ley de Beer, que como ya sabemos, postula que la absorbancia es
directamente proporcional a la concentracin de una sustancia.

En el experimento 1, se peda determinar la actividad enzimtica de dos


diluciones, una con amilasa salival y la otra con suero fisiolgico. De los resultados
obtenidos podemos concluir que en la amilasa salival la actividad enzimtica acta
con menor velocidad que en el suero fisiolgico, ambos a la misma temperatura.

En el experimento 2, se midi el efecto de la temperatura sobre la actividad


enzimtica, incubando la misma reaccin a diferentes temperaturas.
A 0 C se apreci el valor ms bajo, debido a que en la baja temperatura, los
choques entre las molculas disminuyen tambin, por lo que la actividad
enzimtica baja.
A temperatura ambiente el valor obtenido es ms alto que a 37, en lo que
creemos que pudo haber existido un error al momento de aadir alguna solucin ,
porque segn lo estudiado, la temperatura ptima de la amilasa salival que es a la
que se encuentra al interior del cuerpo es de 37, por lo tanto el resultado deba
arrojar en la temperatura ambiente un valor menor que el obtenido a los 37, ya
que como la temperatura ambiente es ms baja se supone que no va a perder su
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actividad, pero s disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser


menores.
A los 70 C, el valor aument de manera considerable, debido a que los choques
entre las molculas aumentan de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar.

Conclusin

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En esta experiencia de laboratorio conocimos la importancia que tienen los


catalizadores biolgicos enzimas en el organismo, que tienen propiedades y que
tambin hay factores que influyen en su actividad.
En este prctico se dio nfasis en como la temperatura afecta la actividad
enzimtica en una enzima especfica, que en este caso fue la -amilasa.
La realizacin de este experimento nos permiti comprobar que en la actividad
enzimtica la temperatura influye en la velocidad de la reaccin, pudiendo
observar que a una temperatura baja la actividad disminuye considerablemente si
la comparamos con la temperatura alta, en la que la actividad enzimtica aumenta
tanto que pierde su funcionalidad , vuelve a su estructura primaria, y se produce
su desnaturalizacin.
Podemos recalcar la eficacia en los resultados obtenidos del experimento 1, en el
cual pudimos comprobar la teora , sobre el experimento 2 , en el que tuvimos
algunas complicaciones en relacin de los resultados con lo que la literatura dice
sobre el efecto de temperatura en la actividad enzimtica.

Cuestionario
1.

Es la amilasa una enzima del tipo Hidrolasa?


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Las enzimas se dividen en grupos, que definen sus funciones con mayor
precisin. Entre las principales clases estn las Hidrolasas que catalizan
rupturas hidrolticas. La amilasa pertenece a la clase de hidrolasas , ya
que tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 14
del componente amilasa al digerir el glucgeno y el almidn para formar
azcares simples.
2. Es la amilasa una enzima proteica simple o compleja?
Las enzimas se clasifican segn su composicin. Una enzima que posee
solo una protena recibe el nombre de enzima simple. Tambin existen las
enzimas complejas, que estn compuestas de una parte proteica y otra no
proteica , a la que se le llama cofactor , que puede ser un grupo prosttico
o una coenzima. Muchas enzimas utilizan molculas pequeas unidas, que
se denominan coenzimas, para facilitar la catlisis. La amilasa es compleja
pero la actividad enzimtica la transforma en simple.
3. Se afirma en internet que La enzima humana de las amilasas alfas
es una metaloenzima de calcio, totalmente incapaz de funcionar en
ausencia de calcio Es correcta esta afirmacin? Cmo podra
verificarlo?
Las - amilasas son metaloenzimas que tienen al menos un ion
calcio por cada molcula de protena. Este calcio es esencial para su
estabilidad y para el mantenimiento de su actividad enzimtica. El
nmero de calcios ligados a su molcula vara de uno a diez. Todas
ellas son estables en un rango de pH que va de 5,5 a 8,0.
Se podra verificar a travs de un examen de sangre u orina ya que
el incremento de la actividad srica de la -amilasa observada en las
afecciones ms comunes del pncreas, se debe a un escape de la
enzima en el tejido intersticial y tejido peritoneal con mayor absorcin
a travs del sistema linftico y venas.

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