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Laboratorio de Bioqumica

I. INTRODUCCION
Las protenas son macromolculas que contienen nitrgeno, El nombre protena
proviene de la palabra griega ("prota"), que significa "lo primero" o del dios
Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar.. Son el componente clave de
cualquier organismo vivo y forman parte de cada una de sus clulas y son para
nuestro organismo lo que la madera es para el barco. Cada especie, e incluso entre
individuos de la misma especie, se hallan diferentes protenas, lo que les confiere un
carcter especfico tanto gentico como inmunolgico. La mayor similitud con los
humanos, la encontramos entre los animales mamferos como los bovinos o porcinos
y la menor con las protenas de los moluscos y las de las plantas. Las protenas estn
formadas por: carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno fundamentalmente, aunque
tambin podemos encontrar, en alguna de ellas, azufre, fsforo, hierro y cobre. Las
protenas se distinguen de los carbohidratos y de las grasas por contener adems
nitrgeno en su composicin, aproximadamente un 16%.
La parte ms pequea en que pueden dividirse las protenas son los aminocidos.
Estos aminocidos son como las letras del abecedario, que con un nmero
determinado se pueden formar infinidad de palabras. Existen 20 aminocidos y con
ellos se forman todas las protenas. De estos aminocidos 8 son esenciales
(imprescindibles como fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina,
triptfano, valina y solo los nios: arginina y la histidina), es decir los tenemos que
ingerir con la dieta ya que nuestro organismo no los puede obtener de ninguna otra
forma. El consumo de protenas es necesario, adems de para aportar todos los
aminocidos esenciales, para cubrir las siguientes funciones:

Plstica: Reparar el desgaste diario, producido en el recambio y la renovacin celular


y sntesis de nuevos tejidos en situaciones de crecimiento y desarrollo, ante heridas,
fracturas o quemaduras por ejemplo.

Reguladora: Forman parte de numerosas enzimas, hormonas, anticuerpos o


inmunoglobulinas, que llevan a cabo todas las reacciones qumicas que se desarrollan
en el organismo.

Energtica: En ausencia o insuficiencia en la ingesta de carbohidratos, o cuando se


realiza un consumo de protenas que supera las necesidades, proporcionan 4 Kcal/g,
siendo este el fenmeno ms costoso para el organismo, adems de implicar una
sobrecarga de trabajo para algunos rganos y sistemas.

Transporte: Contribuyen al mantenimiento del equilibrio de los lquidos corporales y


transportan algunas sustancias, por ejemplo el hierro o el oxgeno.

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II. OBJETIVOS
Reconocer la presencia de algunos aminocidos en las protenas.
Adquirir informacin sobre algunas propiedades fsicas y qumicas de
aminocidos

Conocer algunas propiedades de las protenas.

Poder reconocer cualitativamente la presencia de protenas por medio de


reacciones cualitativas, como la reaccin de Biuret
Por medio de la coloracin poder reconocer grupos funcionales.
Reconocer la presencia de algunos aminocidos en las protenas.

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III. FUNDAMENTOS TEORICOS


Las Protenas
Las protenas son macromolculas; son biopolmeros, es decir, estn constituidas
por gran nmero de unidades estructurales simples repetitivas (monmeros).
Debido a su gran tamao, cuando estas molculas se dispersan en un disolvente
adecuado, forman siempre dispersiones coloidales, con caractersticas que las
diferencian de las disoluciones de molculas ms pequeas.
Por hidrlisis, las molculas de protena se escinden en numerosos compuestos
relativamente simples, de masa pequea, que son las unidades fundamentales
constituyentes de la macromolcula. Estas unidades son los aminocidos, de los
cuales existen veinte especies diferentes y que se unen entre s mediante enlaces
peptdicos. Cientos y miles de estos aminocidos pueden participar en la formacin
de la gran molcula polimrica de una protena.
Funcin de las Protenas
Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas
constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los procesos
biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas.
Bastan algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las
funciones que desempean. Son protenas:
casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones qumicas en organismos

vivientes;
muchas hormonas, reguladores de actividades celulares;
la hemoglobina y otras molculas con funciones de transporte en la sangre;
los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra infecciones o

agentes extraos;
los receptores de las clulas, a los cuales se fijan molculas capaces de

desencadenar una respuesta determinada;


la actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del msculo

durante la contraccin;

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el colgeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de sostn.

Estructura de las Protenas


Es la manera como se organiza una protena para adquirir cierta forma. Presentan
una disposicin caracterstica en condiciones fisiolgicas, pero si se cambian estas
condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformacin y su funcin,
proceso denominado desnaturalizacin. La funcin depende de la conformacin y
sta viene determinada por la secuencia de aminocidos.
Conformaciones o niveles estructurales de la disposicin tridimensional

Estructura primaria.

Estructura secundaria.

Nivel de dominio.

Estructura terciaria.

Estructura cuaternaria.
A partir del nivel de dominio slo las hay globulares.

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Propiedades de las Protenas


Solubilidad: Se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y dbiles estn

presentes. Si se aumenta la temperatura y el pH, se pierde la solubilidad.


Capacidad electroltica: Se determina a travs de la electroforesis, tcnica

analtica en la cual si las protenas se trasladan al polo positivo es porque su


molcula tiene carga negativa y viceversa.
Especificidad: Cada protena tiene una funcin especfica que est determinada

por su estructura primaria.


Amortiguador

de

pH

(conocido

como

efecto

tampn):

Actan

como

amortiguadores de pH debido a su carcter anftero, es decir, pueden


comportarse como cidos (aceptando electrones) o como bases (donando
electrones).
Aminocidos
Un aminocido, como su nombre indica, es una molcula orgnica con un grupo
amino (-NH2) y un grupo carboxlico (-COOH; cido). Los aminocidos ms
frecuentes y de mayor inters son aquellos que forman parte de las protenas. Dos

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aminocidos se combinan en una reaccin de condensacin que libera agua
formando un enlace peptdico. Estos dos "residuos" aminoacdicos forman un
dipptido. Si se une un tercer aminocido se forma un tripptido y as,
sucesivamente, para formar un polipptido. Esta reaccin ocurre de manera natural
en los ribosomas, tanto los que estn libres en el citosol como los asociados al
retculo endoplasmtico.
Todos los aminocidos componentes de las protenas son alfa-aminocidos. Por lo
tanto, estn formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo
amino, a un hidrgeno y a una cadena (habitualmente denominada R) de estructura
variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes
aminocidos; existen cientos de cadenas R por lo que se conocen cientos de
aminocidos diferentes, pero slo 20 forman parte de las protenas y tienen
codones especficos en el cdigo gentico.
La unin de varios aminocidos da lugar a cadenas llamadas polipptidos o
simplemente pptidos, que se denominan protenas cuando la cadena polipeptdica
supera los 50 aminocidos o la masa molecular total supera las 5.000 uma

Propiedades de los Aminocidos


cido-bsicas.

Comportamiento de cualquier aminocido cuando se ioniza. Cualquier


aminocido puede comportarse como cido y como base, se denominan
sustancias anfteras.

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Cuando una molcula presenta carga neta cero est en su punto isoelctrico. Si
un aminocido tiene un punto isoelctrico de 6,1 su carga neta ser cero cuando
el pH sea 6,1.
Los aminocidos y las protenas se comportan como sustancias tampn.
pticas.

Todos los aminocidos excepto la glicina tienen el carbono alfa asimtrico, lo


que les confiere actividad ptica; esto es, sus disoluciones desvan el plano de
polarizacin cuando un rayo de luz polarizada las atraviesa. Si el desvo del
plano de polarizacin es hacia la derecha (en sentido horario), el compuesto se
denomina dextrgiro, mientras que si se desva a la izquierda (sentido
antihorario) se denomina levgiro. Un aminocido puede en principio existir en
sus dos formas enantiomricas (una dextrgira y otra levgira), pero en la
naturaleza lo habitual es encontrar slo una de ellas.
Estructuralmente, las dos posibles formas enantiomricas de cada aminocido
se denominan configuracin D o L dependiendo de la orientacin relativa en el
espacio de los 4 grupos distintos unidos al carbono alfa. El hecho de que sea
dextrgiro no quiere decir que tenga configuracin D.

Qumicas.

Las que afectan al grupo carboxilo, como la descarboxilacin, etc


Las que afectan al grupo amino, como la desaminacin.
Las que afectan al grupo R.
Estructura Bsica de loa Aminocidos

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IV. PARTE EXPERIMENTAL


Reaccin de Biuret sobre el Grupo Peptdico:
Esta reaccin sirve para identificar protenas y pptidos, pero no aminocidos, al
mezclar una protena con un lcalis concentrado y algunas gotas de sulfato de
cobre CuSO4 se produce un color caracterstico debido al grupo CO.NH (enlace
peptdico). El cobre del sulfato cprico, forma un complejo en medio alcalino, con
los nitrgenos del enlace peptdico de los que el hidrogeno es desplazado.

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Este complejo toma una coloracin caracterstica violeta. La prueba se denomina
Biuret a que la urea calentada por encima de su punto de fusin se descompone en
amoniaco, acido cinico y CNOH, el cual junto con otra molcula de urea forma
Biuret: NH2.CO.NH.CO.NH2, sustancia que con el sulfato de cobre en medio bsico da
la coloracin caracterstica.
O
H2N

NH2

H2N

NH

NH

NH2

HN

NH2

OH

OH

O
H2N

NH3

NH

NH

R
O

O
N

2-

Cu

2Na+

R
CH3

CH3

Curso de la Determinacin

En cuatro tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de


protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina y
solucin de glicina (aminocido). Se le aadi dos gotas del reactivo de Biuret
obteniendo como resultado una coloracin morada o violeta (resultado positivo) para
todas las muestras proteicas y un resultado negativo (ausencia de coloracin) para la
muestra de glicina (ver figura 1).

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Protena de
huevo,
carne y
harina

Glicina
(Aminoci
do)
Figura 1.

Discusin de Resultado
Como sabemos la reaccin de Biuret se usa para reconocer el grupo peptdico, por
tanto, sustancias en cuya estructura se halle la presencia de este darn positivo a
esta reaccin (cambio de coloracin a violeta) , por este motivo era de esperarse que
las protenas de huevo, carne y harina den positivo a la reaccin, debido a que las
protenas son compuestos formados por series de aminocidos unidos mediante
enlaces peptdicos, en el caso de la glicina, la respuesta a la reaccin ser negativa
debido a la glicina es un aminocido, no forma un enlace peptdico en su estructura y
por tanto el reactivo de Biuret no forma del complejo (por consiguiente no habr
cambio en la coloracin de la solucin).

Reaccin de la Ninhidrina sobre el Grupo Amino


Reaccin para la deteccin de aminocidos, actualmente acoplada a sistemas de
valoracin automtica. La Ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante
energtico que por una desaminacin oxidativa de los aminocidos conduce a la
formacin del aldehdo correspondiente, con liberacin de amoniaco y gas carbnico
y formacin de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molcula de hidrindrantina,
en presencia de otra de ninhidrina, condensa a travs del amoniaco produciendo una
estructura denominada indanona o prpura de Ruhemann, manifestando un color
azul violeta, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la
histidina.

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Curso de la Determinacin
En cinco tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de
protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina,
solucin de alanina y - alanina (estos dos ltimos aminocido).
A estos tubos con muestra se les aadi dos gotas de ninhidrina al 0.5% obteniendo
como resultado una coloracin azul (resultado positivo) para las

muestras de:

solucin diluida de protena de huevo, solucin de protena de carne y alanina,


adems,

resultado negativo (ausencia de coloracin) para las muestras de

alanina y solucin de protena de harina (ver figura 2).

Figura 2.

Discusin de Resultado
La reaccin con ninhidrina nos ayuda a diferenciar y (u otros) aminocidos en su
forma libre o como grupo amino y su presencia en molculas como las protenas,
fundamentndose en la posicin de este grupo amino. Por tanto podemos decir que
tanto en la solucin diluida de protena de huevo, solucin de protena de carne y
alanina encontramos grupos amino que dan coloracin azul con la ninhidrina,

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ahora si bien podemos decir que en las

muestras de alanina y solucin de

protena de harina no hay grupos amino, no se puede descartar totalmente la


ausencia de estos grupos debido a que pueden encontrarse en otra posicin como en
la alanina.

Reaccin Xantoproteica
Esta prueba sirve para caracterizar los aminocidos bencnicos. En esta prueba se
produce la nitracin del anillo bencnico presente en los aminocidos tirosina,
fenilalanina y triptfano, obtenindose nitrocompuestos de color amarillo, que se
vuelven anaranjados en medio fuertemente alcalino (formacin del cido pirmico o
trinitrofenol).
La adicin de cido ntrico concentrado

a soluciones que contienen protena

generalmente causa la formacin de un precipitado blanco que cambia a amarillo al


calentarlo.

El color se empieza a convertir en anaranjado cuando la solucin se

vuelve bsica.
superficie.

Las protenas insolubles cambian a amarillo y anaranjado en la

Las manchas amarillas en la piel se causan por el cido ntrico son el

resultado de una reaccin xantoprotica.

Esta reaccin se debe a la nitracin de

anillos fenlicos en la tirosina, fenilalanina y triptfano para dar sustitutos


nitrogenados que se colorean anaranjado con la adicin de base por la formacin de
sales.

Curso de la Determinacin
En cuatro tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de
protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina y
solucin tirosina (aminocido). A las muestras se le aadi tres gotas de cido ntrico
concentrado y se calent en bao de agua hasta ebullicin obteniendo como
resultado una coloracin amarilla (resultado positivo) para todas las muestras a
analizar. (Ver figura 3).

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Proten
a de
Huevo

Tirosina
(Se ven
los
vapores
nitrosos)

Figura 3.

Protena
de Harina
y Carne
(Se ve
menor
intensidad
de
coloracin)

Discusin de Resultado
El resultado positivo en todos los ensayos nos indica la presencia de restos fenlicos
en todas las muestras, se ve en la figura una intensa coloracin en la muestra de
protena de huevo, y desprendimiento de vapores nitrosos en la muestra de tirosina
(esto se da producto del calentamiento), adems de acuerdo a la intensidad en
coloracin de las soluciones podemos decir que en la protena de huevo hay mayor
concentracin de sustancias que contienen anillo bencnico que en la protena de
carne y en la de harina.

Reaccin de Millon:
La reaccin del Milln se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo en la molcula
proteica. Cualquier compuesto fenlico que no est sustituido en la posicin 3,5 como
la tirosina, el fenol y el timol producen resultados positivos en esta reaccin. De estos
compuestos, slo la tirosina est presente en las protenas, de manera que slo las
protenas que tienen este aminocido ofrecen resultados positivos. En esta prueba los
compuestos mercricos en medio fuertemente cido (cido ntrico) se condensan con
el grupo fenlico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no
es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgnicas en gran cantidad, ya
que el mercurio del reactivo del Milln es precipitado y se vuelve negativo, razn por
la cual este reactivo no se usa para medir albmina en orina. Debe tomarse en
cuenta que en el caso de que la solucin a examinar sea muy alcalina, debe ser
previamente neutralizada, ya que el lcali precipitara al in mercurio en forma de
xidos amarillos. Adems, protenas como la ovoalbmina producen un precipitado

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blanco que progresivamente por accin del calor se torna rojo; pero, las peptonas,
dan solamente una solucin de color rojo.

Curso de la Determinacin
En cuatro tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de
protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina y
solucin tirosina (aminocido). A las muestras se le agreg tres gotas del reactivo de
Millon y calentando los tubos de ensayo en bao de agua (el calentamiento debe ser
menor a 50) obteniendo como resultado en el caso de la protena de huevo un
precipitado en la superficie del tubo de color violeta (resultado positivo) y en el caso
de la o tirosina una coloracin naranja rojizo (resultado positivo).
(Ver figura 4).

Protena de
Huevo
(ntese que
se formo en la
parte
superficial del
precipitado)

Tirosin
a

Figura 4.

Discusin de Resultado
Podemos apreciar que tanto la protena de huevo como la o tirosina dan positivo
con el reactivo de Millon, esto nos indica la presencia de grupos fenlicos tanto en la

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protena como en el aminocido que forman sales de mercurio insolubles en medio
fuertemente cido, tambin nos permite reconocer la ausencia de estos en la
protena de carne y en la protena de harina.

Reaccin de Hopkins Cole (Adamkiewicz)


Es especfica del grupo indol caracterstico del Triptfano. El anillo del indol se hace
reaccionar con cido Glioxlico en presencia de cido Sulfrico concentrado para
formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la solucin de
protena y el cido sulfrico. La estructura exacta del compuesto violeta no se
conoce, pero parece estar relacionado con el producto de condensacin del aldehdo
del cido Glioxlico con los nitrgenos de dos anillos indlicos, como se muestra en la
reaccin, ya que tambin se pueden formar complejos con otros aldehdos.

Curso de la Determinacin y Discusin de Resultado


En tres tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de
protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina. A
las muestras se le agreg diez gotas de cido actico glacial formando en todos los
casos un ligero precipitado, posteriormente se calentaron los tubos de ensayo en
bao

de

agua,

para

disolver

el

precipitado

formado,

luego

se

adicion

aproximadamente 1mL de cido sulfrico concentrado obteniendo como resultado en


el caso de la muestra de protena de huevo y protena de harina la formacin de un
anillo marrn, el cual no se form en el caso de la protena de carne. Esta
determinacin es exclusiva del aminocido triptfano y la formacin del anillo en la
solucin indica la formacin de

compuesto obtenido por la reaccin del cido

Glioxlico (impureza del acido actico glacial) con el triptfano en medio de acido
sulfrico, este compuesto es el bis-2-triptofanilmetano. (ver figura 5).

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La
ausencia
triptfano.
No
produce el
complejo
ni el anillo
coloreado.

Figura 5.

Formacin
del anillo
marrn
por
presencia
de

Reaccin de Foly (Folin)


Aminocidos Azufrados. Esta reaccin detecta la Cistena y protenas que la
contengan. En medio fuertemente alcalino, el radical mercapto de la Cistena se
desprende cido sulfhdrico que se pone en evidencia aadiendo sales de plomo para
que se forme de un precipitado negro de sulfuro de plomo.

Curso de la Determinacin y Discusin de Resultado


En tres tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de
protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina. A
las muestras se le agreg diez gotas solucin de acetato de plomo y adems a cada
tubo se le aadi gota a gota una solucin de hidrxido de Sodio esperando la
formacin de un precipitado negro lo que nos indica indirectamente la presencia de
azufre dbilmente ligado a la protena, esto puede darse debido a la presencia de
aminocidos como la cistena y la cistina en la protena, obteniendo como resultado
que solo la protena de huevo da positivo a esta reaccin. (Ver figura 6).

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Figura 6.
Reaccin de Aminocidos que contienen Azufre con Nitroprusiato de
Sodio
Este mtodo se fundamenta en la capacidad del sulfuro de sodio, obtenido por
hidrlisis alcalina de aminocidos que contienen azufre (como la cistena y la
metionina) de formar con Nitroprusiato de sodio un complejo de coloracin pardo
rojizo mediante la siguiente reaccin.
OH

SH
NH2

NH2

Na OH

Na2S

H2O

HO

HO

Na 2 S Na 2 Fe CN 3 NO Na 4 Fe CN 3 NOS

Curso de la Determinacin y Discusin de Resultado


En tres tubos de ensayo se coloc las siguientes muestras: solucin diluida de
protena de huevo, solucin de protena de carne, solucin de protena de harina. A
las muestras se le agreg diez gotas de solucin de hidrxido de Sodio y se lleva a
hervir los tubos en bao de agua durante aproximadamente 3 minutos luego se deja
enfriar y se aade 2 gotas de nitroprusiato de sodio observndose un cambio de
coloracin en los tres tubos siendo el cambio mas notorio en el caso de la protena de
huevo el complejo coloreado puede formarse por la presencia de aminocidos o
restos de cistena, cistina o metionina los cuales presentan enlaces R SH que se
rompen fcilmente por medio de una hidrlisis o por calentamiento. (Ver figura 7).

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Figura 7.
Reaccin de Sakaguchi
Este mtodo se basa en la reaccin de coloracin en medio fuertemente alcalino de
las guanidinas con naftol en presencia de un agente oxidante fuerte, la reaccin
consiste en la unin del naftol con el grupo guanidnico en presencia de iones
hipobromito (hipoyodito o hipoclorito) que oxidan el compuesto formado a una
quinonimina, en los cuales el hidrogeno del grupo imino esta sustituido por un radical
alquilo o arilo dando la coloracin rojo naranja respectiva.
OH

OH

NaBrO

NH2
HN

NH

NH

OH
NH2

HN

+ NaBr + H2O

O
OH

NH
NH2

Curso de la Determinacin y Discusin de Resultados


Para esta reaccin se uso como muestra el aminocido arginina el cual al reaccionar
con el naftol en presencia de un agente oxidante forman un compuesto imnico (la
naftilarginina) como se ve en la reaccin anterior que posteriormente formara una
naftoquinonimina donde los radicales alquilo o arilo son los que proporcionan la
coloracin rojiza del compuesto. La formacin del la naftoquinonimina toma base en
la siguiente reaccin: - (Ver figura 8)

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V. CONCLUSION

Las protenas estn constituidas por aminocidos, por los cuales los
mtodos se basan en el reconocimiento de los aminocidos.

Al realizar las diferentes pruebas con la solucin diluida de protena de


huevo, se pudo comprobar que est en una protena completa, pues dio
positivo a todos los ensayos de presencia de aminocidos.

Las protenas son sensibles a sales

de metales pesados como el

mercurio, cobre, plomo, etc.

En las reacciones donde se obtuvo precipitacin se debi a un cambio


en el estado fsico de la protena, este cambio es irreversible.

Cuando se hierve la solucin de una protena con otra sea nitrato y


nitrito mercurio, se forma un coagulo o una coloracin rojo pardo. Se
debe al grupo fenlico.

Si a la solucin de la protena se agrega unas gotas de solucin de


sulfato de cobre, aparece una coloracin violeta, le dan las protenas y
polipptidos pero no los aminocidos y o los dipptido y se debe a la
presencia de enlaces peptdicos.

Debido a su carcter anftero, las protenas reaccionan con los cidos y


con las bases los cidos proteicos y lcalis proteicos son insolubles en
agua y en solucin de sales neutras y se disocian en los cidos y en las
bases

diluidas,

pero

precipitan

en

medio

neutro.

Las

protenas

recuperadas resultan desnaturalizadas.

A diferencia de las aminas y cidos carboxlicos, los aminocidos son


slidos cristalinos no voltiles que se funden con descomposicin a
temperatura relativamente elevadas.

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VI. BIBLIOGRAFIA
Bioquimica, Mary K.Campbell,Shawn O.Farrell. 4ta edicion,2004,editorial
Thompson ,pag 91,92.
Bioquimica. Pea, Arroyo, Gomez.2da edicin,2004,editorial Limusa Mexico.pag
65-67,87.
Fundamentos de bioqumica estructural, Jos Mara Teijon Rivero, Armando Garrido
Pertierra. Editorial Alfa Omega, pag 27-37
www.wikipedia.com
Bioqumica de Harper,Robert K.Murray.Editorial El Manual Moderno S.A. de
C.V.Mexico D.F Santa Fe de Bogota.13 edicin, 1994.pag 51-69.

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