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Профессиональный Документы
Культура Документы
_______________________
Assinatura do Orientador
CAMPINAS, 2011
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
ii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
iv
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
Agradecimentos
Agradeo a Profa. Dra Adriana Vitorino Rossi pela orientao desse
trabalho.
Aos amigos do GPQUAE: Accia, Eva, Lilia, Patrcia Castro e Patrcia
Tonon, Willian, Nathssia, Juliana, Adriano, Sabir, Suryyia, Martha, pela amizade,
companheirismo, brincadeiras, ajuda nas disciplinas, nas discusses e por tudo ao
longo desse trabalho, tudo ficou mais fcil graas presena e amizade de cada
um de vocs.
Agradeo a todos os funcionrios do IQ-UNICAMP que contriburam para a
realizao deste trabalho. Em especial a Isabel (Bel) e ao Miguel, da CPG, Rita,
ao Ricardo e Fabi, das salas de aparelhos por toda ajuda.
Agradeo tambm aos queridos amigos do GEM, que contriburam com
muita pacincia, incentivo e amizade, para que os momentos mais difceis fossem
superados com alegria: Aline, Richard, Heloisa, Juclio, Renata, Alexandre,
Grazielle, Jaqueline, Dbora, Walter, Dosil, Fracassi e Volpe obrigada por todo
apoio!
Agradeo aos amigos: Lvia, Dani, Juliana, Laiane, Benedito, Francine,
Manu, Marcelo, Brbara, Samuel, Magale, Euzbio, Pedro, Vinicius e Guilherme,
pela amizade, carinho e apoio sempre.
Dra Tnia e Marly por todo profissionalismo e seriedade que foram
essenciais para vencer os desafios pelo caminho.
Agradeo a minha famlia querida: Minha V Marlene, meus pais meus
irmos, meus tios, tias, primos e amigos de Minas, que entenderam que minha
ausncia era necessria para que esse sonho fosse realizado.
Cada pgina dessa dissertao meu agradecimento a Deus e a todas as
pessoas que de alguma forma me ajudaram a alcanar esse objetivo.
Muito obrigada!
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
vi
Curriculum vitae
Graduao-Licenciatura em Qumica
Universidade vale do Rio Doce- UNIVALE- Governador Valadares-MG Concluso:
12/2007
ATUAO PROFISSIONAL
Tcnica em Qumica, no Instituto de Qumica, IQ-UNICAMP, Campinas
Desde: outubro de 2010
TRABALHO DESENVOLVIDO EM INICIAO CIENTIFICA
Bolsa de Iniciao Cientfica - BIC FAPEMIG, vinculada ao projeto de pesquisa
Implantao e validao de um sistema de injeo em fluxo aplicado
determinao de nitrato em solos." Perodo: Maro de 2006 a fevereiro de 2007
Orientado pela Profa. Dr. Raquel Andrade Donagemma.
PARTICIPAO EM EVENTOS CIENTFICOS
Quantificao de antocianinas em extratos de frutas com medidas colorimtricas
em dispositivo porttil. No 16o Encontro Nacional de Qumica Analtica, Campos do
Jordo, 2011.
Ferramentas analticas no estudo da degradao trmica de antocianinas. Na 34
Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Florianpolis, 2011.
Formao continuada e atividades de extenso em foco: Comida, vida e
Qumica. Para integrar professores, estudantes e pesquisadores. Na 34 Reunio
Anual da Sociedade Brasileira de Qumica, Florianpolis, 2011.
II Escola de inverno de Separaes Mini curso 2: Eletroforese capilar.
IQ-UNICAMP, 2011.
Comisso organizadora do IV Frum de Ps Graduao em Qumica.
IQ-UNICAMP, 2010.
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
vii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
viii
Resumo
Estudo da degradao trmica de antocianinas de extratos de uva (Vitis vinifera
L. Brasil) e jabuticaba (Myrciaria cauliflora).
Autora: Aline Guadalupe Coelho
Orientadora: Adriana Vitorino Rossi
Antocianinas (ACYS) so corantes naturais que conferem cor a folhas,
flores e frutas, so derivados glicosilados do ction flavlio, da classe dos
flavonides e apresentam potencial para uso como corante, alm de atividade
antioxidante e teraputica. Essas caractersticas estimulam buscar formas de
viabilizar a utilizao desses corantes na indstria de diversos segmentos, alm
de fomentar pesquisas acerca de sua estabilidade. Nesse trabalho, realizou-se o
estudo da degradao trmica de extratos de ACYS, obtidos de uva (Vitis vinifera
L. Brasil) e jabuticaba (Myrciaria Cauliflora). Os padres das ACYS majoritrias
para cada fruta malvidina-3-glicosdeo e cianidina-3-glicosdeo foram utilizados
como referncia. Foram realizados ensaios de estabilidade, para extratos obtidos
a 25, 55 e 85 C, com pH ajustado para 3,0 e mantido natural, armazenados sobrefrigerao ou a temperatura ambiente. Alm disso, foram realizados ensaios de
degradao acelerada a 55 e 85 C com monitoramento espectrofotomtrico e
anlises dos extratos e padres iniciais e degradados por UHPLC-MS. Os ensaios
de estabilidade dos extratos foram monitorados por at 170 dias. Foi verificado o
efeito da baixa temperatura de armazenamento, para a estabilidade dos extratos
de uva, enquanto para os extratos de jabuticaba foram verificados tambm o efeito
da diminuio do pH, e do aumento da concentrao. Os estudos da degradao
trmica indicaram o aumento da velocidade da degradao das ACYS, com o
aumento da temperatura. As anlises de UHPLC-MS dos extratos degradados
indicaram que a temperatura de degradao no altera a rota de degradao das
ACYS nas amostras. As reaes de degradao dos padres seguem ajustes de
segunda ordem com energias de ativao de 95,20,1 e 89,340,05 kJ mol-1, e
tempos de meia vida de 78 2 e 4,2 0,1 e 58,7 e 3,80,4 horas para degradao
a 55 e 85 C da cianidina-3-glicosdeo e malvidina-3-glicosdeo, respectivamente.
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
ix
Abstract
Study of thermal degradation of anthocyanins of grape (Vitis vinifera L. BRASIL)
and jabuticaba (Myrciaria cauliflora).
Author: Aline Guadalupe Coelho
Advisor: Adriana Vitorino Rossi
Anthocyanins (ACYS) are natural dyes that give color to leaves, flowers and
fruits, they are glycosylated derivatives of flavylium cation, the class of flavonoids
and have potential for use as a dye, as well as antioxidant activity and therapy.
These features facilitate finding ways to encourage the use of these dyes in
various industry segments, and foster research about its stability. In this work, we
carried out the study of thermal degradation of ACYS extracts obtained from grape
(Vitis vinifera L. 'Brazil') and jabuticaba (Myrciaria cauliflora). Standards of the
ACYS (malvidin-3-glucoside and cyanidin-3-glucoside) present in major quantity in
each fruit were used as a reference. Stability tests over time, for extracts obtained
at 25, 55 and 85 C, with pH adjusted to 3.0 and maintained course, and stored
under refrigeration, were performed at room temperature. Further tests were
carried out in order to determine accelerated degradation at 55 and 85 C and
were analyzed through spectrophotometry. Initial and degraded standards were
analyzed by UHPLC-MS. Monitoring of the extracts was performed for up to 170
days, and the effect of storage temperature for stabilization of grape extracts was
verified. In case of jabuticaba extracts, the effect of lower pH, the concentration of
the extracts was also verified in addition to storage temperature. The thermal
degradation studies indicated that the increased speed of degradation of ACYS
with increasing temperature. The UHPLC-MS analysis of degraded extracts to
indicate, that the degradation temperature does not change the route of
degradation of samples. The standards degradation reaction followed fit second
order adjustment with activation energies of 95.20.1 and 89.340.05 kJ mol-1,
half-life of 782, 4.20.1 and 58.70.4 and 3.8 hours to decay to 55 and 85 C of
cyanidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside, respectively.
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................ XIII
LISTA DE TABELAS. ......................................................................................... XIV
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ XV
PREFCIO ......................................................................................................... XXII
CAPTULO 1: INTRODUO................................................................................. 1
1. INTRODUO .................................................................................................... 2
1.1. ANTOCIANINAS .............................................................................................. 2
1.2. APLICAO INDUSTRIAL ............................................................................. 4
1.3.1 DEGRADAO TRMICA DE ANTOCIANINAS .......................................... 7
1.4 COPIGMENTAO .......................................................................................... 9
1.5 TCNICAS ANALTICAS UTILIZADAS NO ESTUDO DE ANTOCIANINAS . 11
1.6 FRUTAS UTILIZADAS COMO FONTES DE ANTOCIANINAS ...................... 15
1.6.1 UVA BRASIL ............................................................................................... 15
1.6.2 JABUTICABA .............................................................................................. 16
1.7 SISTEMA DE AUTORIZAO E INFORMAO EM BIODIVERSIDADE
(SISBIO) ................................................................................................................ 17
CAPTULO 2: OBJETIVOS .................................................................................. 19
2.1 GERAIS: ......................................................................................................... 20
2.2 ESPECFICOS: ............................................................................................... 20
CAPTULO 3: PARTE EXPERIMENTAL .............................................................. 21
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xi
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ACYS - Antocianinas
ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
AOAC - Association of Analytical Communities
CE - Eletroforese capilar
Ea - Energia de ativao
ESI Ionizao por eletrospray
HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia
IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renovveis
k- Constante de reao
MS Espectrometria de massas
PPO - Polifenoloxidase
SISBIO Sistema de Autorizao e Informao em Biodiversidade
t1/2 Tempo de meia vida
UHPLC Cromatrografia Lquida de Ultra Alta Aficincia
UV-Vs Ultravioleta- Vsivel
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xiv
LISTA DE TABELAS.
Tabela 1: Concentrao mdia de ACYS extrada com gua em diferentes
temperaturas. ........................................................................................................ 31
Tabela 2: ACYS identificadas nos extratos de uva e jabuticaba por UHPLC-MS e
pelo mtodo de Goiffon et al. ................................................................................ 34
Tabela 3: Dados padro de malvidina-3-glicosdeo. ............................................. 40
Tabela 4: Dados padro de cianidina-3-glicosdeo. .............................................. 42
Tabela 5: Dados de espcies presentes em extrato bruto de uva. ....................... 46
Tabela 6: Dados de espcies presentes em extrato bruto de jabuticaba. ............ 46
Tabela 7: Constantes de reao, tempo de meia- vida e parmetros de Arrhenius
para a degradao da Malvidina-3-glicosdeo. ...................................................... 62
Tabela 8: Constantes de reao, tempo de meia- vida e parmetros de Arrhenius
para a degradao de cianidina-3-glicosdeo ........................................................ 63
Tabela 9: Constantes de reao, tempo de meia- vida e parmetros de Arrhenius
para a degradao de extrato bruto de uva .......................................................... 64
Tabela 10: Constantes de reao, tempo de meia-vida para a degradao de
extrato purificado de jabuticaba............................................................................. 64
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura ction flavilio, sendo que antocianinas tm R = unidade
glicosdica. Se R= H, tm-se antocianidinas. ......................................................... 3
Figura 2: Mudanas estruturais das ACYS em funo do pH (TERCI e ROSSI,
2002). ...................................................................................................................... 5
Figura 3: Variao da cor de solues aquosas de ACYS obtidas de uva em
funo do pH. ACYS de uva com solues de pH conhecido variando de 1 a 14 da
esquerda para direita. ............................................................................................. 6
Figura 4: Possvel mecanismo de degradao trmica de ACYS (Original em
Patras et al, 2010). .................................................................................................. 7
Figura 5: Modelo hipottico da copigmentao intramolecular de antocianinas
adaptado de Falco et al, 2003) ............................................................................ 10
Figura 6: Modelos de interaes intermoleculares entre delfinidina-3-glicosdeo e
rutina (adaptado de Rein, 2005). ........................................................................... 11
Figura 7: Espectro eletrnico de ACYS em solues de pH 1,0 e 4,5 e estrutura
do ction flavlio (A) e hemiacetal(B). R= H ou substituinte glicosilado (adaptado de
Wrolstad et al, 2005) ............................................................................................. 12
Figura 8: Frutos de Vitis vinifera L. A) cv. Itlia, B) cv. Rubi, C) cv.Benitaka, D)
Brasil (Oliveira-Collet et al 2005) ........................................................................... 15
Figura 9: Origem das variedades Rubi e Benitaka a partir da Itlia (1972 em Santa
Mariana e 1988 em Flora, respectivamente) e da variedade Brasil a partir da
Benitaka (1991 na regio de Flora). Original em Oliveira-Collet et al 2005. ......... 16
Figura 10: Uva Brasil utilizada no trabalho. .......................................................... 16
Figura 11: Frutos de jabuticaba ............................................................................ 17
Figura 12: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de jabuticaba e uva,
respectivamente, extrado a 55 C, tendo gua destilada como branco................ 30
Figura 13: Estrutura genrica das ACYS (Harbone,1994). .................................. 32
Figura 14: Cromatograma do extrato de jabuticaba. Condies cromatogrficas:
eluio isocrtica em fase reversa, fase mvel: gua deionizada: acetonitrila: cido
frmico 89:9:10 (v/v/v), volume de injeo 20 L, deteco em 525 nm. .............. 33
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xvi
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xvii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xviii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xix
de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 %
de A e 5 % de B. Volume de injeo 10 L. .......................................................... 51
Figura 37: Cromatrogramas UHPLC-MS do extrato bruto de uva e picos das
ACYS identificadas. Condies: eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%)
e B (acetonitrila:cido frmico 0,1 %), eluio: 12 min, vazo da fase
mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 min: 80 % de A
e 20 % de B, 8 a 10 min: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 min: 95 % de A e 5% de
B. Volume de injeo 10 L . ................................................................................ 51
Figura 38: Espectro de massas da protogucinaldeido, obtida da injeo do extrato
bruto de jabuticaba no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V,
Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura de
dessolvatao = 400 C. ....................................................................................... 52
Figura 39: Espectro de massas da cianidina-3-glicosdeo, obtida da injeo do
extrato bruto de jabuticaba no UHPLC-MS, Condies MS: Capilar 0,80 kV, Cone
30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V, temperatura da fonte = 120 C e temperatura
de dessolvatao = 400 C. .................................................................................. 52
Figura 40: Monitoramento de extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva amostras
degradadas a 55 C, monitorados por 70 horas com medidas em 525 nm., tendo
gua destilada como branco. ................................................................................ 53
Figura 41: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva
amostras degradadas a 55 C utilizando gua destilada como branco, monitorados
por 70 horas com medidas em 525 nm. ................................................................ 53
Figura 42: Monitoramento de extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva amostras
degradadas a 85 C utilizando gua destilada como branco, monitorados por 12
horas com medidas em 525 nm. ........................................................................... 54
Figura 43: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva
amostras degradadas a 85 C utilizando gua destilada como branco, monitorados
por 9 horas com medidas em 525 nm. .................................................................. 54
Figura 44:Espectro de massas de produtos de degradao dos extratos de
jabuticaba , obtida da injeo do extrato bruto de jabuticaba no UHPLC-MS,
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xx
eluio
por
gradiente
(gua:cido
frmico
0,1%)
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xxi
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
Prefcio
xxii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xxiii
Coelho, A. G.
Dissertao de Mestrado
xxiv
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
Captulo 1: Introduo
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
1. Introduo
A utilizao de corantes naturais que possam substituir corantes artificiais
relevante tendo em vista que corantes artificiais so potencialmente txicos e
podem causar reaes adversas nos consumidores (Ring et al, 2001). Desde
meados da dcada de 1970, alguns corantes vermelhos, por exemplo, tm sido
banidos devido a seus efeitos toxicolgicos (Mazza & Brouillard, 1987).
Corantes so substancias que conferem, intensificam ou restauram a cor de
um alimento e so classificados como aditivos alimentares. No Brasil so 13 os
corantes orgnicos sintticos artificiais permitidos em alimentos (ANVISA), sendo
alguns, azo compostos, que podem ser metabolizados a aminas aromticas e
causar danos aos tecidos heptico e renal (Amin et al,2010).
Por sua vez, corantes naturais, com cores atrativas e possveis aes
benficas sade, despertam o interesse para estudos sobre sua obteno e
conservao. Alm disso, o manejo consciente para favorecer a preservao de
espcies nativas e exticas que so fontes desses corantes tambm torna esses
estudos interessantes.
1.1. Antocianinas
Antocianinas
(ACYS)
so
compostos
com
diversas
caractersticas
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
R'
OR"
HO
Antocianidina
Grupo R
Grupo R
Cianidina
Delfinidina
Malvidina
Pelargonidina
Peonidina
Petunidina
OH
OH
OCH3
H
OCH3
OCH3
H
OH
OCH3
H
H
OH
reduo
de
riscos
de
acidente
vascular
cerebral,
atividade
2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato
1,1-difenil-2- picrilhidrazina
Coelho, A.G.
tambm
Captulo 1
demonstraram
atividade
Dissertao de Mestrado
antioxidante
desses
compostos.
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
aldedos.
Protoglucinaldedo
cido
p-hidroxibenzico
so
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
OH
O
HO
OH
HO
HO
O Gli
OH
HO
OH
Deglicosilao
OH
cido Protocateco O
Clivagem
Pelargonidina
Pelargonidina-3-glicosdeo
HO
Clivagem
OH
OH
O Gli
Deglicosilao
Cianidina-3-glicosdeo
HO
OH
Protoglucinaldedo
OH
OH
OH
H
HO
HO
OH
OH
OH
Clivagem
HO
Cianidina
HO
cido 4-hidroxibenzoco
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
avaliar a influncia de fatores como: pH, luz, oxignio, enzimas, acares, cido
ascrbico, dixido de enxofre, sulfitos, metais e copigmentos que so fatores que
reconhecidamente afetam a estabilidade de ACYS e podem limitar suas
aplicaes industriais (Wang & Xu, 2007; Ersus & Yurdagel, 2007; Giusti &
Wrolstad, 1999;). Aquecimento normalmente empregado para extrao de
ACYS, alm disso, tratamentos trmicos so utilizados para esterilizar os extratos
e manter suas cores caractersticas, inativando enzimas em processos de
pasteurizao (Harboune et al, 2008 apud Lund, 1982) e branqueamento
(Sampaio, 2008), por exemplo. Como esses tratamentos chegam a ser
indispensveis, a composio e a concentrao dos extratos de ACYS devem ser
monitoradas para assegurar sua qualidade e dos produtos finais contendo ACYS.
Estudos envolvendo a degradao de ACYS indicam a estabilidade de
sucos de mirtilo (blueberry) a temperaturas de at 60 C e destacam a acelerao
da degradao com o aumento da temperatura. Amostras incubadas a 80, 90,
100, 110, e 115 C apresentaram perda de 50% das ACYS em intervalos de tempo
de 180, 115, 40, 15 e 10 minutos (Buckow et al, 2010). Essa fruta contm
predominantemente malvidina-3-glicosdeo e delfinidina-3-glicosdeo e pequenas
quantidades de peonidina-3-glicosdeo e petunidina-3-glicosdeo. Segundo os
autores a estabilidade trmica de diferentes sucos varia com as diferentes ACYS
encontradas em cada fruta. A estabilidade trmica tende a diminuir com o nmero
de hidroxilas ligadas a antocianina e com a posio dos glicosdeos, indicando a
correlao entre a estrutura qumica e a estabilidade das ACYS.
Yang et al (2008) estudaram a cintica de degradao trmica de ACYS de
milho roxo, variedade originalmente cultivada na Amrica Latina e, atualmente, na
China. Esse milho contm cianidina-3-glicosdeo, pelargonidina-3-glicosdeo e
peonidina-3-glicosdeo. Ajustes indicam que os processos de degradao de
extratos aquosos dessas amostras a 70, 80 e 90 C seguem perfil de primeira
ordem. Os autores destacam a maior estabilidade das amostras de ACYS obtidas
do milho quando comparadas a ACYS obtidas de amoras silvestres (blackberry),
indicando que a susceptibilidade trmica das amostras de ACYS depende da
composio que apresentam.
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
1.4 Copigmentao
Um
fator
relevante
para
estabilizar
ACYS
conhecido
como
Coelho, A.G.
intramolecular
Captulo 1
copigmentao
Dissertao de Mestrado
intermolecular,
associao
com
10
metais
sugeridos
como
intermolecular (Brouillard,1983).
as
foras
que
dirigem
copigmentao
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
11
oficial
da
AOAC
(Association
of
Analytical
Communities)
para
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
ACYS totaismg/L A M FD 10
12
Equao 1
Absorbncia
para
cromatografia
separao
lquida
de
desses
alta
corantes
eficincia
(Terci,
(HPLC)
2004).
uma
Atualmente,
das
tcnicas
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
13
relacionados
elucidao
estrutural,
transformaes
durante
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
14
com
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
15
Figura 8: Frutos de Vitis vinifera L. A) cv. Itlia, B) cv. Rubi, C) cv.Benitaka, D) Brasil
(Oliveira-Collet et al 2005)
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
16
Figura 9: Origem das variedades Rubi e Benitaka a partir da Itlia (1972 em Santa
Mariana e 1988 em Flora, respectivamente) e da variedade Brasil a partir da Benitaka
(1991 na regio de Flora). Original em Oliveira-Collet et al 2005.
1.6.2 Jabuticaba
Jabuticaba (Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg) uma espcie nativa
brasileira pertencente famlia das Myrtaceae, encontrada do Par ao Rio Grande
do Sul. Os frutos negros (Figura 11) so bagas globosas cujo epicarpo varia de
roxo-escuro a preto. A polpa macia, branca, suculenta e de sabor cido (Citadin
et al, 2005) os frutos crescem fixados ao tronco da rvore. Os frutos podem ser
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
17
Coelho, A.G.
Captulo 1
Dissertao de Mestrado
18
Coelho, A.G.
Captulo 2
Captulo 2: Objetivos
Dissertao de Mestrado
19
Coelho, A.G.
Captulo 2
Dissertao de Mestrado
20
2. Objetivos
2.1 Gerais:
2.2 Especficos:
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
21
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
22
3. Parte experimental
3.1 Consideraes gerais
Os procedimentos experimentais foram divididos em duas fases alm de
um conjunto de procedimentos preliminares comum a todos os estudos: a
obteno dos extratos, a quantificao e identificao das ACYS e a anlise
termogravimtrica dos extratos. A primeira fase envolveu o estudo da estabilidade
de extratos de ACYS ao longo do tempo em diferentes condies de pH,
temperatura de extrao e temperatura de armazenamento. A segunda fase
relacionou-se com a simulao de degradao acelerada dos extratos e padres
de ACYS, alm de estudos dos produtos de degradao gerados.
Refrigerador GE TMNF-E;
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
23
3.2.2 Materiais
3.2.4 Reagentes
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
24
As frutas utilizadas neste trabalho foram Vitis vinifera L. cv. Brasil (Uva
Brasil) e Myrciaria cauliflora (Jabuticaba). As uvas foram adquiridas no comrcio
varejista local em um nico lote e armazenadas em congelador domstico. As
jabuticabas foram colhidas na cidade de Casa Branca-SP e fornecidas congeladas
pela empresa Anidro do Brasil Extraes Ltda tambm em um nico lote. Para
realizao dos experimentos, as pores necessrias de frutas eram removidas do
congelador e mantidas a temperatura ambiente at degelo.
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
25
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
26
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
27
demais manteve-se o pH natural (4,5 0,1 para os extratos de uva e 3,5 0,1
para os de jabuticaba).
Para armazenamento e monitoramento da degradao, metade dos extratos
foi mantida temperatura ambiente e os demais foram armazenados sob
refrigerao a 8 C, por at 170 dias, todos em frascos de vidro mbar.
Quinzenalmente, foram obtidos espectros de 400 a 800 nm dos extratos em celas
de acrlico com caminho ptico de 1 cm.
Coelho, A.G.
Captulo 3
Dissertao de Mestrado
28
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
29
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
30
4. Resultados e discusso
4.1 Estudos preliminares
ACYS so compostos fenlicos pertencentes classe dos flavonides.
Esses compostos apresentam absoro caractersticas na regio do visvel, com
mximo de absoro entre 510 e 540 nm, valores relacionados com o padro de
hidroxilao das antocianidinas e a posio de fixao do acar nas molculas
(Goiffon et al,1999). Esse padro pode ser observado na Figura 12 que apresenta
espectros eletrnicos obtidos a partir dos extratos brutos de jabuticaba e uva,
respectivamente. Os espectros eletrnicos so teis como indicativo da presena
de ACYS em uma amostra, entretanto como pode ser observado nos espectros
eletrnicos, no possvel distinguir diferentes ACYS apenas com esses dados.
1,5
2,0
1,5
Absorbncia
Absorbncia
1,0
0,5
1,0
0,5
0,0
400
0,0
500
600
700
(nm)
400
500
600
700
(nm)
uva,
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
31
Temperatura (C)
Jabuticaba
Uva
25
55
85
25
55
85
Concentrao*
(mg/L)
1,7 0,2
16,5 0,9
51 5
49 2
90 2
96 3
Concentrao*
(mg/100 g de casca)
8,50,7
1608
51052
52614
9349
98250
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
32
t 'r
t ' r cianidia3gli cosdeo
Equao 2
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
33
Cianidina-3-glicosdeo
Malvidina-3-glicosdeo
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
34
(Estudo apresentado na Fase 2 item 4.3.2 pgina 46). Essa identificao leva em
considerao o potencial intrnseco da espectrometria de massas como tcnica de
identificao. importante considerar que UHPLC-MS uma tcnica sofisticada
que, certamente, apresenta melhores resultados de identificao em comparao
com o mtodo de Goiffon e colaboradores. Entretanto quando um UHPLC-MS no
estiver disponvel, o mtodo de Goiffon pode ser utilizado como um screening com
resultados satisfatrios, como aponta o comparativo das ACYS identificadas pelos
dois mtodos, apresentado na tabela 2. Algumas ACYS identificados pelo mtodo
de Goiffon no foram identificados por UHPLC-MS devido a idade dos extratos
quando a anlise foi realizada. Os dados obtidos por UHPLC-MS so relevantes
tambm devido ausncia de biblioteca de espectros de massa para ACYS o que
torna a identificao mais trabalhosa.
Os resultados de identificao mostram que os mtodos utilizados so
satisfatrios e permitiram o isolamento e a identificao das diferentes ACYS
obtidas a partir das amostras de uva e jabuticaba.
Tabela 2: ACYS identificadas nos extratos de uva e jabuticaba por UHPLC-MS e pelo
mtodo de Goiffon et al.
Uva
UHPLC-MS
Cianidina-3-glicosdeo
Petunidina-3-glicosdeo
Peonidina-3-glicosdeo
Malvidina-3-glicosdeo
Derivado da petunidina
Derivado da malvidina
Derivado 6 acetil petunidina
Cianidina-3-glicosdeo
Jabuticaba
Goiffon et al.
Cianidina-3-glicosdeo
Petunidina-3-glicosdeo
Pelargonidina-3-arobinosdeo
Malvidina-3-glicosdeo
Cianidina
Cianidina-3-glicosdeo
Pelargonidina-3-glicosdeo
Cianidina
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
35
copigmentos.
Essa
interao
responsvel
por
fenmenos
de
Derivada da massa
Massa (%)
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
36
Derivada da massa
Massa (%)
Coelho, A.G.
D 1 final max
100
A
inicial
max
onde:
Afinal max
Ainicial max
Equao 3
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
37
Temperaturas de extraao
o
25 C
o
55 C
o
85 C
70
D(%)
60
50
40
30
20
10
0
JN8
J38
J3A
JNA
Figura 18: Representao dos valores de D (calculados pela equao 3), para extratos
de Jabuticaba com pH natural e armazenado a 8 C (JN8), com pH ajustado para 3,0 e
armazenado a 8 C (J38), com pH ajustado para 3,0 e armazenado a temperatura
ambiente (J3A) e com pH natural e armazenado a temperatura ambiente (JNA).
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
38
Coelho, A.G.
Captulo 4
80
Dissertao de Mestrado
39
Temperaturas de extraao
o
25 C
o
55 C
o
85 C
D (%)
60
40
20
UN8
U38
U3A
UNA
Figura 19: Grfico de barras correspondentes aos valores de D (calculados pela equao
3), para extratos de uva com pH natural, armazenado a 8 C (UN8), com pH ajustado
para 3,0, armazenado a 8 C (U38), com pH ajustado em 3,0 e armazenado a temperatura
ambiente (U3A) e com pH natural e armazenado a temperatura ambiente (UNA).
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
40
Identificao
Malvidina-3-glicosdeo
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
41
Figura 20: Cromatogramas do padro de A: malvidina-3-glicosdeo, B: malvidina-3glicosdeo degradado a 55 C e C: malvidina-3-glicosdeo degradado a 85 C, injetados no
UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio por gradiente A (gua:cido frmico
0,1%) e B (acetonitrila: cido frmico 0,1%), tempo de eluio de 12 minutos, vazo da
fase mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80% de A
e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70% de A e 30% de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de
B. Volume de injeo 10 L
As Figuras 22 A a C mostram os cromatogramas do padro cianidina-3glicosdeo, nas condies inicial, degradado a 55 C e 85 C respectivamente. Na
Figura 23 est espectro de massas do padro. A Tabela 4 indica o tempo de
reteno e a razo massa/ carga referente ao padro analisado.
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
42
Os cromatogramas indicaram as mudanas ocorridas com a cianidina-3glicosdeo ao longo da degradao, com a diminuio da altura do pico
caracterstico do padro.
Tabela 4: Dados padro de cianidina-3-glicosdeo.
tr (min)
2,6
Identificao
cianidina-3-glicosdeo
Figura 22: Cromatogramas do padro de A: cianidina-3-glicosdeo, B: cianidina-3glicosdeo degradado a 55 C e C: cianidina-3-glicosdeo degradado a 85 C injetados no
UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio por gradiente A (gua:cido frmico
0,1%) e B (acetonitrila:cido frmico 0,1%), tempo de eluio de 12 minutos, vazo da
fase mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80% de A
e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70% de A e 30% de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de
B. Volume de injeo 10 L .
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
43
com
razo
massa/carga
de
449
493,
correspondendo
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
44
temperatura.
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
10
20
30
40
50
10
60
Tempo (Horas)
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0
12
Tempo (Horas)
Figura 25: Monitoramento dos padres de malvidina-3-glicosideo (preto) e B:cianidina-3glicosideo (vermelho)ostras degradadas a A: 55 C e B: 85 C utilizando gua destilada
como branco, monitorado por 55 e 11 horas respectivamente, com medidas em 525 nm.
Coelho, A.G.
Captulo 4
0 horas
2 horas
17 horas
28 horas
45 horas
55 horas
Tempo
Tempo
0,0
400
500
600
B
0,5
0,0
400
700
45
0 horas
2 horas
17 horas
28 horas
45 horas
55 horas
1,0
Absorbncia
Absorbncia
0,5
Dissertao de Mestrado
500
(nm)
600
700
(nm)
Figura 26: Espectros eletrnicos do padro de A: malvidina-3-glicosdeo e B: cianidina-3glicosdeo, amostras degradadas a 55 C utilizando gua destilada como branco,
monitorados por 18,5 horas.
Tempo
Tempo
1,0
Absorbncia
Absorbncia
0,5
0 horas
1 horas
2 horas
4 horas
6 horas
9 horas
11 horas
0,0
400
500
600
(nm)
700
0 horas
1 horas
2 horas
4 horas
6 horas
9 horas
11 horas
0,5
0,0
400
500
600
700
(nm)
Figura 27: Espectros eletrnicos do padro de A: malvidina-3-glicosdeo e B: cianidina-3glicosdeo amostras degradadas a 85 C utilizando gua destilada como branco,
monitorados por 11 horas.
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
46
Figura 28: Cromatogramas do A: extrato bruto de uva, B: extrato bruto de uva degradado
a 55 C e C: extrato bruto de uva degradado a 85 C injetados no UHPLC-MS. Condies:
eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B (acetonitrila:cido frmico 0,1 %),
tempo de eluio 12 minutos, vazo da fase mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de
A e 1 % de B, 4 a 8 minutos: 80 % de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70 % de A e 30 %
de B, 10 a 12 minutos: 95 % de A e 5% de B. Volume de injeo 10 L
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
47
Petunidina-3-Glicosdeo
Malvidina-3-Glicosdeo
Peonidina-3-Glicosdeo
Cianidina-3-Glicosdeo
Delfinidina-3-Glicosdeo
.
Figura 29: Cromatrogramas do extrato bruto de uva e os picos das ACYS identificadas
injetados no UHPLC-MS. Condies cromatogrficas: eluio por gradiente A (gua:cido
frmico 0,1%) e B (acetonitrila:cido frmico 0,1 %), tempo de eluio de 12 minutos,
vazo da fase mvel:0,35 mL/min, gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 minutos:
80 % de A e 20 % de B, 8 a 10 minutos: 70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 minutos: 95 %
de A e 5% de B. Volume de injeo 10 L .
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
48
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
49
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
50
Degradado a 55 C
Degradado a 85 C
Degradado a 85 C
Degradado a 55 C
Degradado a 55 C
Degradado a 85 C
Figura 35:Espectro de massas de produtos de degradao dos extratos de uva bruto por
UHPLC-MS, Condies: Capilar 0,80 kV, Cone 30 V, Extrator 3 V, RF lentes 0,5 V,
temperaturas da fonte: 120 C e dessolvatao: 400 C
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
51
Figura 37: Cromatrogramas UHPLC-MS do extrato bruto de uva e picos das ACYS
identificadas. Condies: eluio por gradiente A (gua:cido frmico 0,1%) e B
(acetonitrila:cido frmico 0,1 %), eluio: 12 min, vazo da fase mvel:0,35 mL/min,
gradiente inicial: 99 % de A e 1 % de B, 4 a 8 min: 80 % de A e 20 % de B, 8 a 10 min:
70 % de A e 30 % de B, 10 a 12 min: 95 % de A e 5% de B. Volume de injeo 10 L .
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
52
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
1,0
0,9
A
0,8
0,7
0,6
0,5
-10
53
1,1
Coelho, A.G.
10
20
30
40
50
60
70
80
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
-10
10
20
Tempo (Horas)
30
40
50
60
70
80
Tempo (horas)
0 horas
2 horas
15 horas
21 horas
40 horas
47 horas
64 horas
70 horas
0,5
0,0
400
500
600
(nm)
700
Tempo
B
Absorbncia
Absorbncia
Tempo
1,0
0 horas
2 horas
15 horas
21 horas
40 horas
47 horas
64 horas
70 horas
1,5
1,0
0,5
0,0
400
500
600
700
(nm)
Figura 41: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva amostras
degradadas a 55 C utilizando gua destilada como branco, monitorados por 70 horas
com medidas em 525 nm.
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
54
0,9
1,1
1,0
0,8
0,7
0,6
0,5
0
10
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
12
Tempo (horas)
10
12
Tempo (Horas)
Tempo
1,0
0,5
0,0
400
500
600
(nm)
700
Tempo
B
Abosrbncia
Absorbncia
1,5
0 horas
2 horas
5 horas
9 horas
10 horas
0 horas
2 horas
5 horas
9 horas
10 horas
1,0
0,5
0,0
400
500
600
700
(nm)
Figura 43: Espectros eletrnicos dos extratos brutos de A: jabuticaba e B: uva amostras
degradadas a 85 C utilizando gua destilada como branco, monitorados por 9 horas com
medidas em 525 nm.
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
55
Degradado a 55 C
Degradado a 85 C
Degradado a 55 C
Degradado a 85 C
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
56
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
57
Coelho, A.G.
Captulo 4
58
1,1
1,00
1,05
Dissertao de Mestrado
0,95
0,90
0,85
0,80
0,75
0,70
0,65
0,60
0
20
40
60
80
100
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0
20
40
Tempo (horas)
60
80
100
120
Tempo (Horas)
1,0
1,0
0,9
1,1
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0,3
0
10
15
20
Tempo (horas)
10
15
20
Tempo
Absorbncia
A
0,4
0 horas
1 horas
3 horas
8 horas
24 horas
30 horas
49 horas
77 horas
101 horas
120 horas
0,2
0,0
400
0 horas
1 horas
8 horas
24 horas
30 horas
49 horas
77 horas
101 horas
120 horas
1,0
Tempo
B
Absorbncia
0,6
0,5
0,0
500
600
(nm)
700
400
500
600
700
(nm)
Captulo 4
1,0
Tempo
Absorbncia
0 horas
1,5 horas
3,5 horas
8,5 horas
10,5 horas
12,5 horas
14,5 horas
18,5 horas
0,5
0,0
400
500
600
700
Dissertao de Mestrado
1,0
Absorbncia
Coelho, A.G.
Tempo
59
0 horas
1,5 horas
3,5 horas
8,5 horas
10,5 horas
12,5 horas
14,5 horas
18,5 horas
0,5
0,0
400
500
(nm)
600
700
(nm)
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
60
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
61
C 1 C01 kt
Equao 4
De acordo com a Equao 4, grficos (C-1 x t) com ajuste linear indicam que
a reao de segunda ordem, sendo que C refere-se a concentrao de ACYS,
[ACYS]. Esse ajuste foi satisfatrio com os dados do monitoramento cintico da
degradao das solues de padres de ACYS, como pode ser observado nas
Figuras de 52 a 53.
A Figura 52 traz os grficos tpicos que representam ajustes de cintica de
segunda ordem para a degradao dos padres de malvidina-3-glicosdeo e
cianidina-3-glicosdeo a 55 C. A Figura 53 anloga, com dados tpicos de
degradao a 85 C. A linearidade das curvas obtidas aponta adequao do
ajuste, ou seja, sugere que a degradao ocorre de acordo com processo de
segunda ordem com relao concentrao de ACYS.
8500
8000
7500
[ACYS]
-1
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
0
50000
100000
150000
200000
t(s)
Figura 52: Ajuste de segunda ordem para degradao a 55 C dos padres de malvidina3-glicosdeo (preto) e cianidina-3-glicosdeo (vermelho) monitorados por 55 horas
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
62
18000
16000
14000
[ACYS]
-1
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
10000
20000
30000
40000
t(s)
Figura 53: Ajuste de segunda ordem para degradao a 85 C dos padres de malvidina3-glicosdeo (preto) e cianidina-3-glicosdeo (vermelho), monitorados por 11horas.
t 1/ 2
1
k [ ACYS] 0
Equao 5
ln k ln A
Ea
R
Equao 6
k (dm3/mol s)
0,1490,004
0,2780,009
t 1/2 (horas)
782
4,20,1
Ea (kJ/mol)
95,20,1
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
63
5000
4500
4500
4000
4000
-1
3000
[ACYS]
[ACYS]
-1
3500
2500
2000
3500
3000
2500
2000
1500
1500
1000
0
50000
Tempo(s)
1000
0
10000
20000
30000
40000
50000
tempo(s)
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
64
24000
22000
20000
[ACYS]
-1
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
-10000
tempo (s)
k (dm3 / mol s)
0,23 0,02
t 1/2 (horas)
8,4 0,8
Coelho, A.G.
Captulo 4
Dissertao de Mestrado
65
pgina 62 e 63) e de alguns extratos (Tabelas 9 e 10, pgina 64), com valores da
mesma ordem de grandeza dos resultados da degradao acelerada.
Coelho, A.G.
Captulo 5
Captulo 5: Concluso
Dissertao de Mestrado
66
Coelho, A.G.
Captulo 5
Dissertao de Mestrado
67
5-Concluso
Extratos de jabuticaba com concentrao de ACYS 1,70,2; 16,50,9 e
515 mg/L foram obtidos, respectivamente, a 25, 55 e 85 C. A concentrao dos
extratos de uva obtidos em diferentes temperaturas foi 492 mg/L a 25C; 902 a
55 C; e 963 mg/L a 85 C. O aumento da concentrao de ACYS nos extratos
obtidos com temperatura mais elevada aponta o efeito favorvel da temperatura
na extrao.
Os dados de identificao por UHPLC-MS indicaram cianidina-3-glicosdeo,
petunidina-3-glicosdeo, peonidina-3-glicosdeo e malvidina-3-glicosdeo como
constituintes dos extratos de uva e cianidina-3-glicosdeo para jabuticaba.
O monitoramento da estabilidade dos extratos nas diferentes condies
estudadas neste trabalho demonstrou o efeito do pH, da temperatura de extrao,
da concentrao e de enzimas para a estabilidade dos extratos de jabuticaba. A
estabilidade dos extratos de uva est relacionada com a temperatura de
armazenamento dos extratos, associada com a diminuio de atividade enzimtica
e da velocidade das reaes a temperaturas mais baixas.
Os ensaios de degradao acelerada dos extratos e padres corroboram o
efeito significativo da temperatura na degradao de ACYS, a despeito de
vantagens como aumento na concentrao de ACYS extradas e inativao
enzimtica.
Temperaturas
elevadas
podem
comprometer
rapidamente
Coelho, A.G.
Captulo 5
Dissertao de Mestrado
68
cromatogrficas
espectrometria
de
massas
para
detalhar
Coelho, A.G.
Captulo 6
Captulo 6: Referncias
Dissertao de Mestrado
69
Coelho, A.G.
Captulo 6
Dissertao de Mestrado
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