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medicamentos
utilizados
na
terapia,
como
antimnio
pentavalente
Para obter molculas originais que exibem atividades anti-Leishmania, nosso grupo de
pesquisa
relatou
anteriormente
resultados
promissores
com
derivados
da
aminoquinolina (12-16). Agora, como uma continuao de nossos esforos para obter
novas drogas contra as leishmanioses, decidimos continuar a explorar as propriedades
biolgicas dos derivados de 4-aminoquinolina (AMQ) conjugando-a aos resduos de
sulfonamida, hidrazida e hidrazina. Alguns sulfonamidas e hbridos isoniazida
mostraram interessantes propriedades biolgicas, incluindo a atividade leishmanicida
(17). Assim, esta nova classe de compostos pode representar uma associao
subunidade atraente. Uma srie de AMQ (Figura 1), com base na estrutura de
amodiaquina, uma 4-aminoquinolina ativa contra Leishmania sp. a uma concentrao de
M (16), foi previamente sintetizada mostrando uma importante atividade antioxidante
(18). Neste trabalho, estes AMQ foram ensaiadas contra promastigotas e amastigotas de
L. amazonensis. Como composto AMQ-j foi encontrado muito ativo contra ambas as
formas de L. amazonensis, temos vindo a desenvolver uma srie de ensaios biolgicos,
a fim de esclarecer o mecanismo de ao levando morte celular deste protozorio.
Materiais e mtodos
Produtos quimicos
Miltefosina foi fornecido por Cayman Chemical Company (Michigan, EUA).
Amodiaquina foi comprada pela Ellipse Pharmaceuticals (Pessac, Frana).
Geneticina (G418), iodeto de propdio (PI), rodamina 123 (123 Rh), LPS
(lipopolissacardeo
a partir de Escherichia coli O26: B6), soluo de sal equilibrada de Hanks (HBSS),
hemina, cido flico, MTT, e JC-1 foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, EUA). 20,70-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA) foi obtido a
partir de Invitrogen Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). Soro fetal bovino e meio
RPMI 1640 foram adquiridos a CULTILAB (Campinas, So Paulo, Brasil); infuso
crebro-corao (BHI) foi comprado de-Lo? EDIA (Mumbai, ndia).
Parasitas
Promastigotas
de
L.
amazonensis
(IFLA/BR/67/PH8)
L.
amazonensis
utilizados
como
um
branco.
intensidade
de
fluorescncia
de
regresso
de
Probit.
Miltefosina
(0,5-30,0
g/ml)
com
algumas
modificaes.
fluorescncia
foi
monitorizada
de
crescimento
usando
uma
proporo
de
1:10
em
em
triplicado.
Miltefosina
foi
utilizado
como
positiva
Resultados
A atividade dos derivados 4-aminoquinolinicos (AMQ) contra promastigotas e
amastigotas de L. amazonensis
Neste trabalho, foi avaliada a citotoxicidade em clulas de mamferos e atividade in
vitro contra ambas as formas promastigotas de insetos e as intramacrofgicas de
amastigotas de L. amazonensis de dez 4-aminoquinolina (AMQ) derivados e seus
precursores (Tabela 1). Para a atividade antipromastigota, entre dez compostos AMQ
avaliada, trs compostos (AMQ-b, f, e j) apresentou uma forte atividade
antipromastigota (IC50 de 10,9, 0,5, e 5,9 g /ml, respectivamente), sendo mais eficaz
do que a amodiaquina e miltefosina nesta fase extracelular do parasita. Dos cinco
compostos contendo o ncleo de quinolina e seus derivados de sulfonamida, composto
AMQ-b exibida uma atividade significativa (valores de IC50 de 10,9 g / mL). A
presena destes dois grupos heterocclicos dentro da mesma estrutura (quinolina e
piridina) pode ser responsvel pela atividade do presente composto, quando comparado
com os outros da srie (AMQ-A-E). A associao entre o composto aminoquinolina e os
anlogos hidrazida tambm provou ser vantajosa. Este destacada no caso AMQ-f,
que cerca de 28 vezes mais ativo contra promastigotas de L. amazonensis, quando
comparado com miltefosina utilizado como contrelo positivo. Mais uma vez, a presena
de ambos os heterociclos encontrado pode ser interessante, porque mesmo nesta srie,
eles tambm exibem atividade (tal como o composto AMQ-F). vlido salientar que,
aparentemente, deslocando o anel de piridina na posio 4, como composto AMQ-i
tambm heterociclos contm, no provou ser ativa por causa do padro de substituio
no anel de piridina de 1,3 (ou 3-posio ). Na srie de hidrazina, a frao quinolina
combinada com um anel de benzeno tambm foi favorvel. O caso do composto AMQ-j
o qual apresenta um IC50 de 5,9 g / mL contra promastigotas de L. amazonensis
notvel.
Para avaliar os efeitos citotxicos do AMQ, macrfagos hospedeiros foram tratados com
estes compostos e avaliados pelo mtodo de MTT. Entre os compostos avaliados AMQ
(a-j), nenhum deles mostrou citotoxicidade para macrfagos peritoneais nas
concentraes mais elevadas ensaiadas (30,0 g / mL). Em contraste, amodiaquina foi
mais citotxica para os macrfagos (IC50 de 20,9 g / mL). Este resultado favorvel
controle (Figura 2). Miltefosina (9,0 g / ml), utilizado como frmaco de controle,
induziu um aumento de 40% nos nveis de ROS.
Quando macrfagos infectados com L. amazonensis foram tratados com AMQ-j, a
produo de ROS foi aumentada de uma forma dose dependente quando comparado
com macrfagos infectados com L. amazonensis no-tratados (Figura 3). Aps 24 h de
tratamento com 7,0, 13,5, e 27,0 g / ml do composto, pode-se observar um aumento na
produo de ROS (25,3%, 33,0%, e 46,3%, respectivamente) em comparao com o
controlo (Macrfagos infectados com L. amazonensis). Macrfagos infectados com L.
amazonensis tratados com AMQ-j nas mesmas concentraes utilizadas para os ensaios
de ROS, isto , a 7,0, 13,5, e 27,0 g / mL tambm inibiram a multiplicao de parasitas
intracelulares em todas as concentraes testadas (51,7%, 55,3%, e 91,2%,
respectivamente). Alm disso, uma correlao linear (R2 = 0,9666) entre a percentagem
de inibio da carga global dos parasitas intracelulares e a produo de ROS, aps
tratamento foi tambm observada.
Discusso
Neste trabalho, ns informamos a atividade leishmanicida de derivados da 4aminoquinolina (AMQ) contra promastigotas e amastigotas de L. amazonensis. Os
resultados demonstraram que alguns compostos exibiram um forte efeito leishmanicida
contra L. amazonensis, sendo mais seletivo contra o parasita do que para o macrfago
hospedeiro. Leishmania amazonensis tem sido associado com vrias caractersticas
clnicas da leishmaniose humana, incluindo cutnea e leishmaniose cutnea difusa no
Brasil e tambm pode induzir a resultados clnicos fatais, incluindo a forma visceral da
doena (28,29).
Muitos compostos antimalricos so baseados no uso de ncleo de quinolina tal como
4-aminoquinolinas, lcoois arilo-aminoquinolina e 8-aminoquinolinas (30). Isto tambm
foi o caso de medicamentos leishmanicidas, tais como sitamaquina e tafenoquine
(31,32). Alm disso, outros alvos de mecanismo de ao destas drogas em Leishmania,
est relacionada com desordens mitocondriais e suas consequncias (31-34). Nos
estudos descritos aqui, ns tambm confirmamos que o efeito leishmanicida da AMQ
est relacionado disfuno mitocondrial. O composto AMQ-j induz a despolarizao
do potencial de membrana mitocondrial em promastigotas e de macrfagos com L.
amazonensis. Como os amastigotas esto dentro da clula hospedeira, seria de interesse
determinar se a despolarizao mitocondrial observadas em clulas infectadas a partir
de macrfagos ou de parasitas intracelulares. Curiosamente, os macrfagos no
infectados tratados com AMQ-j no induziu a despolarizao do potencial de
membrana mitocondrial, sugerindo que este composto foi seletivamente txico
unicamente para as mitocndrias em macrfagos infectados com L. amazonensis. Alm
disso, em macrfagos infectados, a despolarizao do potencial de membrana
mitocondrial era dependente da dose. A correlao foi tambm observada entre a
reduo da carga global de parasitas intracelulares e a diminuio do potencial
mitocondrial. Por conseguinte, podemos concluir que a AMQ-j pode atuar diretamente
dentro da mitocndria do parasita, causando disfuno mitocondrial do protozorio e,
posteriormente, a morte do parasita intracelular.