Extraccin y Purificacin de ADN

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la

mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de
recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener
cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar
anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los
elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos
nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso
aplicar mtodos de extraccin adecuados. Dada la gran variedad de mtodos de
extraccin y purificacin de cidos nucleicos existentes, la eleccin de la tcnica
ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes:

cido nucleico diana

organismo fuente
material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.)
resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la
purificacin)
uso posterior

A continuacin se recogen los principios de algunos de los mtodos de extraccin y

purificacin de cidos nucleicos que ms se emplean en la actualidad.
Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis
celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos
de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de
tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo
(un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido
nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:

rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.)

tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles,
etc.)
digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.)

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al

mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que
solubilicen las membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las
enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los
restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin.
Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares
suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:
extraccin/precipitacin, cromatografa, centrifugacin, separacin por afinidad.
Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los
contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinacin de fenol y cloroformo con el objetivo de eliminar las protenas. Para
concentrar los cidos nucleicos, suele realizarse una precipitacin con isopropanol o
etanol.

Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la mezcla un

portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la precipitacin. Tambin puede
realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas elevadas
(precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante cambios del pH.
Cromatografa
Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin como son: la
cromatografa en gel, la cromatografa de intercambio inico, la cromatografa de
adsorcin selectiva y la cromatografa de afinidad. La cromatografa en gel
aprovecha las propiedades de las partculas porosas del gel para tamizar molculas.
Se emplea una matriz con poros de tamao definido, que dejan pasar las molculas
ms pequeas por difusin, pero no las ms grandes, que eluyen en el volumen
vaco o volumen muerto As pues, las molculas eluyen por orden de tamao
decreciente. La cromatografa de intercambio inico es otra tcnica, que se basa en
la interaccin electrosttica de la molcula diana con un grupo funcional de la
matriz en columna. Los cidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga
negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio inico con simples
tampones salinos. En la cromatografa de adsorcin, los cidos nucleicos se fijan
selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por ejemplo,
sales caotrpicas), mientras que otras molculas biolgicas no se fijan.
A continuacin, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o con un tampn
hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las
aplicaciones posteriores.
Centrifugacin
La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin eficaz. As, por
ejemplo, la ultracentrifugacin en gradientes autogenerados de CsCl (cloruro de
cesio) con fuerzas gravitacionales elevadas se lleva empleando mucho tiempo para
purificar plsmidos. La centrifugacin suele asociarse a otros mtodos, como la
cromatografa de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la cromatografa
en gel y la centrifugacin para separar el ADN o ARN de contaminantes ms
pequeos (sales, nucletidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar segn el
tamao. Algunos procedimientos combinan la adsorcin selectiva en una matriz
cromatogrfica y la elucin por centrifugacin para purificar de forma selectiva un
tipo de cido nucleico.
Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB
El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado
por Murray y Thompson en 1980 y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner
y sus colaboradores El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de
vegetales y alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para
eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo,
alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha
aplicado con frecuencia en gentica molecular de los vegetales y ha sido probado
en ensayos de validacin para detectar organismos genticamente modificados
(OGM) (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes adicionales
para adaptar el mtodo a una amplia gama de matrices de alimentos transformados
o sin transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms
et al, 2001)
Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos
nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos
fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden

eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la

concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol. En esta seccin se
describirn los principios de las tres etapas principales: la lisis de la membrana
celular, la extraccin del ADN genmico y su precipitacin.
Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la
primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana
celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el
tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas
biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por molculas de
lpidos y de protenas, unidas por interacciones no covalentes.

Figura 1. Representacin simplificada de las membranas celulares.

Tal como muestra la figura 1, las molculas lipdicas estn ordenadas en una doble
capa continua, en la que las molculas protenicas estn disueltas. Las molculas
lipdicas estn formadas por extremos hidrfilos, denominados cabezas, y
extremos hidrfobos, denominados colas. En este mtodo, el detergente
(CTAB) contenido en el tampn de extraccin provoca la lisis de la membrana.
Dado que la composicin de los lpidos y del detergente es similar, el componente
de CTAB del tampn de extraccin captura los lpidos que integran la membrana
celular y nuclear.
La figura 2 ilustra el mecanismo de solubilizacin de los lpidos con un
detergente.

Figura 2. Solubilizacin de los lpidos.

La figura 3 ilustra cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente

captura los lpidos y las protenas al entrar en contacto la membrana
celular y el tampn de extraccin con CTAB. Con una concentracin salina
(NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los cidos
nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio,
entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirrionucleasa. Al
unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente
disminuye.
El Tris-HCl confiere a la solucin la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o
superior daa el ADN). Es importante sealar que, como los cidos nucleicos se
degradan fcilmente en esta fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el
tiempo transcurrido entre la homogeneizacin de la muestra y la adicin de la
solucin tampn con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la clula y
de los orgnulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los
cloroplastos), se purifica el ADN.

Figura 3. Rotura de la membrana celular y extraccin del ADN genmico.

Extraccin - En esta etapa, los complejos formados por los cidos nucleicos y el
CTAB se separan de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los
dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente
importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues
pueden inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones
hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos
no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El
cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases
acuosa y orgnica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si
dicha fase es densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase
inferior. Adems, si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente
(pH 7,8 8,0), los cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase orgnica. Si es
preciso, la extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de
eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la
extraccin de los cidos nucleicos, puede retroextraerse la fase orgnica con una
solucin acuosa, que se aade a continuacin al extracto anterior. Una vez
purificados los complejos de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin,
ltima etapa del procedimiento.
Precipitacin - En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del
detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de
precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada
(NaCl > 0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se
forme un precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato

de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el

detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por
lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con
etanol al 70% permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la
sal residual.
Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra
El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden
cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,
midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin
puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la
medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases
es sencilla y exacta. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa
concentracin inica resultan idneos. La concentracin de cidos nucleicos suele
determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de
contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las
protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la
pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros
son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm significa que la
muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos
aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de
2,2 aproximadamente.
Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede emplearse el
mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad
de cidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el
bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparndola con unos patrones de
concentracin.
Con un paso de luz de 1 cm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A
= 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN bicatenario, 37 g/ml de
ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30 g/ml de oligonucletidos. Si la muestra
tambin contiene protenas, el cociente A260/A280 ser considerablemente inferior
a dichos valores y no podr determinarse con exactitud la cantidad de cidos
nucleicos. Debe precisarse que la espectrofotometra no permite identificar de
forma fiable impurezas de ARN presentes en las soluciones de ADN. Puede
emplearse la absorbancia a 325 nm para poner de manifiesto la presencia de restos
en la solucin o la suciedad de la cubeta.

Aspectos sobre los que se realizar la evaluacin de la prctica.

1.- Por qu debe aadirse un detergente al tampn de extraccin?
2.- Por qu es importante en la etapa de extraccin
eliminar los
polisacridos y los compuestos fenlicos en el caso de los tejidos
vegetales? Qu ventajas tiene utilizar concentraciones hiposalinas (NaCl
< 0,5 M)?
3.- Qu sucede en la etapa de precipitacin? Por qu se utiliza una
concentracin salina alta (NaCl > 0,8 M)?
4.- Qu tcnica se utiliza para cuantificar los cidos nucleicos? Explique
brevemente cmo procedera?
5.- Qu informacin nos brinda la determinacin del cociente A260/A280
en la cuantificacin de los cidos nucleicos?