Prctica No.

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ESPECTROFOTOMETRIA

GENERALIDADES
La espectrometra se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una
muestra, en funcin de la longitud de onda o dicho de otra forma, la espectrofotometra
se refiere a los mtodos, cuantitativos, de anlisis qumico que utilizan la luz para medir
la concentracin de las sustancias qumicas.
Cada componente de la solucin tiene su patrn de absorcin de luz caracterstico.
Comparando la longitud de onda y la intensidad del mximo de absorcin de luz de una
muestra con soluciones estndar, es posible determinar la identidad y la concentracin
de componentes disueltos en la muestra (solucin incgnita).
Las ventajas de la espectrofotometria sobre otros mtodos analticos de laboratorio son
varias: es rpida, precisa, verstil, fcil de usar y eficiente en costo. Los
espectrofotmetros se han mejorado en precisin y versatilidad en los ltimos aos con
los avances de tecnologa, y hoy se consideran indispensables en un laboratorio de
qumica analtica.
La espectrofotometra se usa para diversas aplicaciones, tales como:
Anlisis cuantitativo y cualitativo de soluciones desconocidas en un laboratorio de
investigacin, estandarizacin de colores de diversos materiales, como plsticos y
pinturas, deteccin de niveles de contaminacin en aire y agua, y determinacin de
trazas de impurezas en alimentos y en reactivos.
Un espectrmetro tpico posee cuatro componentes bsicos:
1.- Una fuente de radiacin. Tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda
que cubre (usualmente es lmpara de tungsteno para luz visible, y deuterio para
ultravioleta).
2.- Un compartimiento para la muestra.
3.- Un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del
espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra.
4.- Un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacin que pasa por la muestra.
Toda forma de energa radiante se caracteriza por su longitud de onda. Para la
fotometra de absorcin interesa toda banda de frecuencia comprendida entre 200 y
2000 nm. La banda comprendida entre 400 y 700 nm puede ser percibida por el ojo
humano en forma de color. La radiacin comprendida entre 200 y 400 nm, conocida
como radiacin ultravioleta (RU) y aquella ubicada entre 700 y 2000 nm, denominada

radiacin infrarroja (IR), son invisibles para el ojo humano, pero pueden ser detectadas
mediante el uso de fotodetectores apropiados.
La luz emitida por la mayor parte de las fuentes luminosas est compuesta por
diferentes longitudes de onda, por lo cual se denomina policromtica. Utilizando
diferentes medios fsicos, como prismas o rejillas de difraccin, esa luz blanca puede ser
descompuesta, separndose las diferentes longitudes de onda que la componen. Al
proyectar sobre una pantalla observamos que la luz descompuesta permite apreciar el
conocido espectro de color, que va desde el violeta
en el extremo de onda de longitud ms corta, hasta
el rojo del extremo de onda longitud ms larga.

BANDA DE FRECUENCIA nm

COLOR PERCIBIDO

400-450

Violeta

450 500

Azul

500 570

Verde

570 590

Amarillo

590 620

Naranja

620 700

Rojo

El ojo humano responde a la radiacin electromagntica entre 380 y 750 nm

aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra
limitacin y permiten la medida de radiaciones de longitud de onda mayores (IR) y
menores (UV)
La luz solar o la luz emitida por un filamento de tungsteno es una mezcla de radiaciones
de distinta longitud de onda que el ojo humano se reconoce como blanca. En la regin
visible la luz se descompone en colores bsicos y complementarios. Si hacemos incidir
un haz de luz blanca sobre una solucin que absorbe luz a una longitud de onda
determinada, esta transmitir todas las dems longitudes de onda, apareciendo a la vista
del color complementario al que corresponde la longitud de onda absorbida.
En consecuencia una longitud que se observa de un color determinado al ojo humano,
deber ser iluminada para las radiaciones fotomtricas con un haz de luz de longitud de
onda del color que absorbe, es decir el color complementario. Las determinaciones
espectrofotomtricas han tenido un gran auge en los ltimos aos. Sus principales
ventajas son la sensibilidad relativamente elevada, la facilidad con la que permiten
realizar determinaciones rpidas y un grado de especificidad relativamente alto, todo
esto unido a su adaptacin en los autoanalizadores, la hacen una tcnica imprescindible
en el laboratorio clnico.

ECUACIN DE LAMBERT-BEER. COEFICIENTE DE EXTINCIN

Cuando un haz de luz atraviesa una lmina de un material, se puede producir la
absorcin de esa radiacin por parte de las molculas all presentes. Si eso sucede se
dice que ese material contiene cromforos. Estas son aquellas estructuras capaces de
absorber esa radiacin electromagntica, porque su configuracin electrnica es tal que
la diferencia de energa entre alguno de sus niveles electrnicos coincide precisamente
con la energa de esos fotones. En tal caso la intensidad de la luz emergente ser:

I=I0 -Ia

donde Ia es la intensidad de luz absorbida durante el trayecto. I e I0 son las

intensidades de luz emergente e incidente, respectivamente, medidas segn la misma
trayectoria de la segunda de ellas.

La relacin I / I0 se conoce como transmitancia (T) y es la medida primaria que se

realiza en los instrumentos para medir la absorcin de luz por parte de una muestra. Si
la relacin se expresa en forma porcentual, entonces se llama porcentaje de
transmitancia:
% T = 100.I / I0
La luz absorbida Ia sera I0 I es decir, la diferencia entre la intensidad de la luz incidente
y la intensidad transmitida despus de pasar a travs de la muestra. A veces se expresa
en forma porcentual en funcin de la transmitancia medida como :
Porcentaje de absorcin = (Tblanco - Tmuestra. ) x 100 o absorbancia.
La ley que gobierna este comportamiento es conocida como Ley de Lambert-Beer:. Esta
ley establece la relacin entre el grado de absorbancia de una solucin y otras dos
variables: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz
recorre a travs de la solucin. Segn esta ley, la absorbancia de una solucin es
directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del paso de luz.
A= a.b.c
Donde: A= Absorbancia, a= Coeficiente de absorcin, b= Longitud del paso de luz en
centmetros (paso ptico) c= Concentracin del absorbente

Esta ecuacin constituye la base del anlisis cuantitativo de las determinaciones

espectrofotomtricas.

A= Cl
A: Absorbancia : Coeficiente de extincin C: Concentracin l: paso ptico
A: No tiene unidades
: Coeficiente de absortividad o coeficiente de extincin. Tiene unidades inversas.
Ejemplo: M-1 cm-1
C: Unidades de concentracin. Ejemplo: Moles/litros
l: longitud de la trayectoria del paso de luz a travs de la muestra( paso ptico). Se
expresa en cm.

Coeficiente de extincin molar: Absorbancia de una disolucin 1 M de un soluto , para

un paso ptico de 1 cm.
E0.1 % representa la absorbancia de una disolucin de soluto al 0.1 % (peso/volumen, es
decir a una concentracin de 1 mg/mL.
Es necesario medir antes el disolvente (referencia) y luego la muestra ya que

A disolucin = A disolvente + A soluto.

Cuando se trata de estudiar la absorcin de las molculas biolgicas, es frecuente
trabajar con disoluciones acuosas. Si se trata de cuantificar y/o caracterizar las
molculas de un soluto, habr que emplear un disolvente cuyas molculas no absorban
a las mismas longitudes de onda que las molculas estudiadas. Si se elige un disolvente
adecuado, se puede suponer que la absorcin de la disolucin ser funcin directa de la
concentracin del soluto.
Hoy en da, la incorporacin de un ordenador a los espectrofotmetros permite hacer las
determinaciones con gran rapidez El ordenador almacena los valores y, al medir la
muestra, proporciona directamente los valores de absorbancia o transmitancia.
Tambin se utiliza con frecuencia, en vez de Absorbancia, el trmino densidad ptica,
DO, que se refiera a la absorbancia de una muestra cuando el paso ptico es de 1 cm.
Cubetas: Las cubetas pueden ser rectangulares y circulares. Las ms utilizadas en la
espectroscopia UV-visible son las cubetas rectangulares de 1cm de paso ptico.
Pueden ser de diferentes volmenes: 3,0 mL, 1,5 mL, y 0.8mL, con pasos pticos de
0,01, 0,05, 05 y 1 cm.

En la zona del visible se utilizan cubetas de vidrio o incluso de plstico y desechables,

mientras que en la del UV se recurre al cristal de cuarzo, pues el vidrio absorbe la
radiacin UV.
CURVA DE CALIBRACIN
Es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la absorbancia (ordenadas)
frente a la concentracin (abscisas). Este mtodo de trabajo consiste en ensayar varias
soluciones de concentraciones conocidas, y determinar sus absorbancias. Posteriormente
se traza la curva de calibracin (que debe ser una recta) representando grficamente las
concentraciones (x) frente a sus absorbancias (y). Una vez ensayadas las soluciones del
problema, su concentracin se averigua por interpolacin de las absorbancias de las
soluciones problema en la recta de calibracin.
Este procedimiento slo es vlido si el cromgeno obedece la ley de Lambert Beer, y si
las soluciones estndar y las soluciones problema son ledas en idnticas condiciones.
En las determinaciones fotomtricas se da a conocer la linealidad, que es el intervalo de
concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre
concentracin del cromgeno y la absorbancia. En la solucin que sobrepasa los lmites
de linealidad, la ley de Lambert Beer deja de cumplirse, convirtindose la recta de la
grfica en una curva a partir de ese punto de concentracin. La lectura de una
absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una determinacin falsa.
Ante esta situacin hay que diluir la muestra, para que su concentracin est dentro de
los lmites de linealidad.
CURVA ESPECTRAL
Curva espectral de una sustancia qumica indica las caractersticas de absorcin de dicha
sustancia con relacin a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva espectral se
presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se denomina espectro de
absorcin, o en funcin de la transmitancia, denominndose espectro de transmisin.
Los espectrofotmetros deben permitir efectuar la comparacin entre la seal obtenida
por una mezcla que no contiene el analito y otra que si lo tiene para poder tener la seal
de esa diferencia. As, el registro de la variacin del coeficiente de absortividad molar,
de la absorbancia A, o de la transmitancia T, en funcin de la longitud de onda origina el
"espectro" o curva espectral de una sustancia qumica que indica las caractersticas de
absorcin de dicha sustancia con relacin a la longitud de onda.
En general, los espectrmetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). El
tanto por ciento de transmitancia se refiere a la cantidad de radiacin que pasa a travs
de la muestra y alcanza el detector. Una solucin no absorbente, mostrara una lectura
de 100% de transmitancia en un espectrofotmetro calibrado. Las unidades de
absorbancia van de 0 a 2. La absorbancia se relaciona con la transmitancia como
A =- log 1/T, (logaritmo decimal).

COLORIMETRA Y FOTOCOLORIMETRA
Muchos mtodos para anlisis cuantitativos de sangre, suero, plasma, orina y otros
materiales biolgicos se basan en la produccin de soluciones coloreadas de tal forma
que intensidad de color obtenido puede usarse como medida de concentracin de la
sustancia problema. La medida de la intensidad de color como ndice de la
concentracin es lo que se llama colorimetra y los aparatos en los que se hace la
comparacin de colores se llaman colormetros, es decir que colorimetra es la
comparacin que se realiza entre el color producido por la solucin de ensayo con el de
una solucin de la misma sustancia de concentracin conocida.
Los procedimientos que se basan en la medida de intensidad de color en trminos de
absorcin a longitudes de onda especficas se conocen con el nombre de fotomtricos y
el instrumento que se usa se llama fotmetro. En este caso se determina la cantidad de
luz absorbida en un determinado intervalo espectral por una concentracin conocida de
la sustancia. En los mtodos fotomtricos a diferencia de los colorimtricos no se
comparan colores sino intensidad luminosa para un determinado intervalo de longitud
de onda.
CONCLUSIONES

Un espectrofotmetro utiliza la luz para medir la concentracin de sustancias y

es el mtodo ms utilizado en el laboratorio por sus ventajas: rapidez, precisin,
versatilidad, fcil uso y de costos ms bajos.

Un espectrofotmetro nos ayudar para el anlisis cuantitativo y cualitativo de

soluciones desconocidas, en cortos periodos de tiempo y con un mximo de
precisin, la absorbancia y transmitancia son sus unidades bsicas de medida
sobre los cuales se fundamenta su determinacin.

Una curva de calibracin nos ayudar a estandarizar las absorbancias en base a

la medicin de la concentracin de una solucin, facilitando las lecturas,
ayudndonos a ahorrar tiempo y garantizar la emisin de resultados.

Cada elemento que compone un espectrofotmetro es de vital importancia en su

funcionamiento, si uno de ellos llegar a faltar o a fallar, la determinacin
fotomtrica de las sustancias tendra un elevado margen de error.

Nota:
En la siguiente pgina Ud. Puede conocer los ejercicios que se van a resolver
durante la prctica. Los estudiantes deben de traer papel milimetrado para poder
realizar esta actividad.

Ejercicios para resolver en la Prctica No. 2 (Espectrofotometra).

1.- Se prepar una solucin madre al 1% de una protena. Cmo procedera para
preparar 2 mL de las siguientes diluciones?
a) 1:1000; b) 1:250; c) 1:100; d) 1:75; e) 1:30.
b) Cal ser la concentracin de las soluciones diluidas?
2.- Se desea hallar la concentracin de una solucin pura de aldolasa. Para ello
se determina la DO a 280 nm de una dilucin 1:2 y se obtiene un valor de 0,8.
Posteriormente por el mtodo de microbiuret, tomando 0,5 mL de la solucin
original se obtiene un valor de DO a 330 nm igual a 0,62. Se conoce que el valor
de la tangente de la curva de calibracin es 0,6 (DO a 330 nm vs mg de BSA).
Datos: PM = 160 000; k280 nm, 1 mg/mL= 0,91
3.- A partir de una solucin original de una protena pura de concentracin
desconocida, se preparan varias diluciones: 1:20; 1:10; 1:5 y 1:2 y se miden sus
absorbancias a 280 nm. Los valores de DO obtenidos fueron:
1:20---- 0,09
1:10---- 0,2
1:5 ----- 0,4
1:2 ----- 0,95
Paralelamente se determinan sus concentraciones por el mtodo de microbiuret
utilizando BSA como patrn. La cotangente es igual a 2 (DO a 330 nm vs mg).
Las absorbancias de las muestras fueron:
1:20-----0,04, 0,06, 0.08
1:10-----0,08, 0,1, 0,06
1:5 -----0,16, 0.15, 0.17
1:2 -----0,4, 0,39, 0,41
Se tomaron 0,5 mL de cada muestra para determinar la concentracin.
a) Determine el coeficiente de extincin a 280 nm de la protena referido a: 1
mg/mL, 1 %. Calcule la concentracin de la solucin original por este mtodo y
exprsela en umol/L (PM 18 000).
4.- El coeficiente de extincin a 280 nm de la seroalbmina bovina es 0,68 para
una concentracin 0,1 %.
a) Halle la absorbancia que debe tener una solucin de concentracin: 1 mmol/L,
1 %, 10 mg/mL. (PM 69 000).
b) Podra leer directamente las absorbancias de esas soluciones en el
espectrofotmetro? En caso negativo, cmo procedera?