Evaluacin de cepas industriales de

Saccharomyces cerevisiae para

la obtencin de etanol a partir de fuentes que
no afectan la produccin de alimentos
Teresa Fernndez,1,2 Carlos Martn1

Resumen

Se evaluaron una cepa de laboratorio

(No.1) y dos cepas industriales (No.2
y No.3) de Saccharomyces cerevisiae
para la produccin de etanol a partir
de hidrolizados cidos de bagazo. Las
cepas No.2 y No.3, aisladas de plantas
procesadoras de sustratos lignocelulsicos, presentaron una alta velocidad de
consumo de furfural y de HMF. Aunque
las tres cepas pudieron fermentar un
hidrolizado detoxificado, para dos de
ellas se observ una fuerte inhibicin en
la fermentacin. La cepa No.3, aislada
de una planta de produccin de etanol
a partir de licores al sulfito, present
una mayor tolerancia a inhibidores que
las otras dos. La inhibicin del rendimiento de etanol en la fermentacin del
hidrolizado no detoxificado fue de slo
2,3% con esa cepa, mientras que en las
cepas No.1 y No.2 fue de 73,9 y 86,4%,
respectivamente. La alta productividad
volumtrica y especfica de etanol, mayor
velocidad de consumo de glucosa y ms
rpida conversin del furfural, evidencian la superioridad de la cepa No.3,
as como su factibilidad para fermentar
hidrolizados sin necesidad de que medie
una etapa de detoxificacin.

Mohammad Taherzadeh2

Introduccin

Durante los ltimos aos aument el inters

por el etanol combustible debido al aumento de
los precios del petrleo crudo, la inminencia del
agotamiento de ese hidrocarburo y la necesidad
de mitigar el efecto invernadero. El etanol se ha
convertido en un importante producto en el mercado mundial de combustibles. Su comercializacin creci de menos de un millardo de litros en
1975 a ms de 39 millardos en 2006 y se espera
que alcance los 100 millardos en 2015 (Licht,
2006). Los altos costos de las materias primas azucaradas y amilceas, as como el debate alimentos
versus combustibles, han motivado el inters por
los materiales lignocelulsicos (MLC) como posibles materias primas para la produccin de etanol
(Hahn-Hgerdal et al., 2006). Se ha afirmado que
la produccin de etanol combustible podr permanecer como una industria importante y como
un sistema agrcola auto-sostenible en el siglo xxi
solamente si la utilizacin de los MLC se convierte
en una realidad comercial.
El bagazo de caa de azcar (Saccharum officinarum) es un MLC de gran inters para la produccin de etanol en Cuba sin afectar la produccin
de alimentos. Aunque el bagazo se utiliza como
combustible en los ingenios azucareros (Valds
y col., 2000), puede ser considerado una materia
prima potencial para la produccin de etanol,
especialmente si se tiene en cuenta su contenido

Palabras Clave: etanol celulsico, hidrolizado de bagazo, detoxificacin, S. cerevisiae.

1
2

Departamento de Qumica e Ingeniera Qumica, Universidad de Matanzas, Matanzas 44740, Cuba.

School of Engineering, Bors University Collage, 50190 Bors, Sweden.

ATAC No. 1/2009

de carbohidratos y su disponibilidad en forma

concentrada en los ingenios azucareros.
Los MLC contienen carbohidratos en forma de
celulosa y hemicelulosas, los que mediante procesos de hidrlisis generan monosacridos como,
glucosa, xilosa y otros. A continuacin, estos azcares pueden ser convertidos en etanol por fermentacin utilizando diferentes microorganismos.
La hidrlisis de la celulosa puede ser catalizada
por cidos o por enzimas. Tanto en la hidrlisis
cida como en el pretratamiento para la hidrlisis
enzimtica ocurre la degradacin de los azcares
con formacin de subproductos inhibitorios de la
fermentacin alcohlica, tales como cidos alifticos, aldehdos furnicos y compuestos fenlicos
(Taherzadeh y Karimi, 2007).
Los microorganismos para ser empleados en
la fermentacin de hidrolizados lignocelulsicos
deben producir etanol con un alto rendimiento y
productividad y hacer resistencia a los inhibidores presentes en los hidrolizados (Martn y col.,
2002).
La bsqueda de organismos resistentes a los
inhibidores se ha convertido en una tarea de
mxima prioridad. En este trabajo se investig la
fermentacin de hidrolizados cidos de bagazo
con la utilizacin de dos cepas industriales y una
de laboratorio de S. cerevisiae. Las cepas industriales fueron aisladas de una planta de fermentacin de licores al sulfito y de una planta demostrativa de produccin de etanol a partir de residuos
lignocelulsicos.
Materiales y Mtodos

Obtencin de los hidrolizados

El bagazo de caa de azcar, donado por el
ingenio azucarero Mario Muoz, de Matanzas,
Cuba, fue secado al aire, molido y conservado
en bolsas plsticas a temperatura ambiente. Los
hidrolizados fueron obtenidos por hidrlisis cida
en dos etapas. En la primera etapa, muestras de
bagazo fueron impregnadas con cido sulfrico a
una concentracin final de 0,5 % y una relacin de
10 g de slidos por 100 g de mezcla. El material
fue colocado en un reactor presurizado, donde se
calent a 180oC durante 7 minutos para hidrolizar
las hemicelulosas. A continuacin, el hidrolizado
hemicelulsico fue separado del material fibroso
por filtracin a vaco. En la segunda etapa, la celulosa contenida en el material fibroso fue hidrolizada por calentamiento con cido sulfrico a
230 oC durante 7 minutos. La concentracin de
6

H2SO4 fue 0,5 % y la carga de slidos fue 12 g

por 100 g de mezcla. Finalmente, el hidrolizado
celulsico fue separado por filtracin al vaco y se
conserv congelado hasta usos posteriores.
Detoxificacin de los hidrolizados
Los hidrolizados fueron detoxificados por tratamiento con Ca(OH)2 al 20 % (w/w) hasta pH 10 y
se mantuvieron bajo esas condiciones durante una
hora. Luego resultaron filtrados, neutralizados a
pH 5,5 y filtrados nuevamente.
Cepas
Se utilizaron tres cepas de S. cerevisiae. La cepa
No. 1 (CBS 8066) es una cepa de laboratorio que
se utiliz como referencia porque ha sido utilizada previamente en estudios similares (Talebnia
y Taherzadeh, 2006). Las cepas No. 2 y No. 3 son
cepas industriales. La No. 2 fue aislada de hidrolizados fermentados de astillas de pino en una planta
demostrativa de produccin de etanol (Domsj
fabriker AB, rnskldsvik, Suecia), mientras que
la No. 3 fue aislada de una planta productora de
etanol a partir de licores de pulpeo de madera por
el proceso al sulfito (Mo Do, Suecia).
Preparacin del inculo
Las tres cepas fueron conservadas en cuas de
YPD-agar (10 g L-1 de extracto de levadura, 20 g
L-1 de peptona, 20 g L-1 de glucosa y 20 g L-1 de
agar). Una asada de la cepa a estudiar fue transferida a 100 mL de medio sinttico (20 gL-1 de
glucosa, 7,5 gL-1 de (NH4)2SO4, 3,5 gL-1 de K2HPO4,
0,75 gL-1 de MgSO4.7H2O, 1 mL de solucin de
vitaminas, y 1 mL de solucin de trazas de metales. Esta ltima solucin contiene en gL-1: EDTA,
3; CaCl2.2H2O, 0,9; ZnSO4.7H2O, 0,9; FeSO4.7H2O,
0,6; H3BO3, 0,2; MnCl2.H2O, 0,16; Na2Mo4.2H2O,
0,08; CoCl2.2H2O, 0,06; CuSO4.5H2O, 0,06; KI,
0,02. La solucin de vitaminas se prepar en
gL-1 con: cido p-aminobenzoico, 0,2; cido
nicotnico, 1; pantotenato de calcio, 1; piridoxina, 1; tiamina, 1; biotina, 0,05; m-inositol, 25
(Karimi et al., 2005). El volumen resultante fue
incubado en un Erlenmeyer de 300 mL a 300C,
120 rpm hasta alcanzar valores de densidad ptica
(DO620) entre 8 y 11.
Fermentacin de los hidrolizados
La fermentacin anaerbica se realiz en
Erlenmeyers de 300 mL equipados con tapas de
goma, dos tubos capilares de cristal y una trampa
de CO2. Los capilares fueron usados para la toma
de muestras despus de 0, 2, 4, 8, 12 y 24 horas
y para la inyeccin de N2 (con menos de 5 ppm
ATAC No. 1/2009

de O2). El volumen de trabajo fue 100 mL de

hidrolizado, los cuales fueron enriquecidos con
los mismos componentes del medio sinttico
usado en la preparacin del inculo y en iguales
concentraciones. Se adicion adems 0,1 mL de
ergosterol. La fuente de carbono fue la misma que
posean los hidrolizados. Los frascos se inocularon con 4 mL de inculo de una concentracin
de clulas igual a 4 gL-1 y se incubaron a 30 0C y
120 rpm durante 24 horas. La referencia se prepar con glucosa aadida, en igual concentracin
que los hidrolizados, como fuente de carbono. Se
enriqueci tambin con las mismas sales y dems
componentes utilizados en las muestras de estudio. Se realizaron dos rplicas en todos los casos.
Como criterio de la fermentabilidad se tomaron:
el rendimiento (YE/G), la productividad volumtrica
(Q), y la productividad especfica (q) de etanol, la
velocidad de consumo de glucosa (VCG) y la inhibicin del rendimiento (IY) y de la productividad
volumtrica (IQ). Para calcular el rendimiento en
etanol se dividi la concentracin de etanol producido a las 24 h por la concentracin de glucosa
inicial. La productividad volumtrica (Q) se bas
en los gramos de etanol producidos por litro de
medio de cultivo por hora durante las primeras 8 h
de fermentacin y la productividad especfica es la
relacin entre Q y la concentracin inicial de clulas (masa seca). La biomasa seca se determin centrifugando (2 minutos a 4000 rpm) 5 mL de cultivo
en un tubo de ensayos previamente pesado. Las
clulas fueron lavadas con agua destilada y centrifugadas nuevamente. Luego de expulsar el sobrenadante se secaron a 105 0C durante 48 horas. La
velocidad de consumo de glucosa se calcul como
la diferencia entre las concentraciones, inicial y
luego de 8 h, dividida por 8 h. Por ltimo, la inhibicin del rendimiento de etanol (IY) se calcul
mediante la siguiente expresin:
IY =

Yref - Ypreh

x 100

Yref
Donde Yref y Ypreh son los rendimientos en etanol
de la referencia y el prehidrolizado, respectivamente. De modo similar fue calculada la inhibicin
de la productividad de etanol.
Anlisis
Los hidrolizados y medios de fermentacin
fueron analizados por HPLC. El efluente fue H2SO4
5 mM a una velocidad de flujo de 0,6 mL/min. Para
la separacin de glucosa, cido actico, etanol y
glicerol se utiliz una columna Aminex HPX-87H
ATAC No. 1/2009

(Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.) y un detector RI

(Jasco International Co., Tokyo, Japn). El furfural y el HMF fueron detectados con un detector
UV/VIS a 210 nm. La composicin de los hidrolizados se muestra en la tabla 1.
Resultados y discusin

Durante la hidrlisis se formaron inhibidores

de la fermentacin, tales como cido actico, furfural, hidroximetilfurfural y cido frmico. La alta
concentracin de aldehdos furnicos es comparable con la encontrada en hidrolizados de bagazo
obtenidos por explosin con vapor, asistida con
impregnacin con cido sulfrico (Martn y col.,
2002). Los hidrolizados fueron detoxificados con
el objetivo de disminuir su toxicidad hacia las
levaduras.
El proceso de detoxificacin permiti reducir la
concentracin de los principales inhibidores entre
11,1 y 15,0 % (Tabla 1). No obstante, el contenido
de aldehdos furnicos (2,5 g/L) an se mantuvo a
un nivel inhibitorio para las levaduras.
Tabla No. 1
Concentracin de los principales componentes
detectados en los hidrolizados, g/L.
Medio

Glucosa

cido
actico

Furfural

HMF

Hidrolizado
detoxificado

11,2

1,7

0,7

1,8

Hidrolizado
no detoxificado

12,1

2,0

0,8

2,0

Produccin de etanol y consumo de glucosa

durante la fermentacin.
La alta concentracin de aldehdos furnicos
exige una alta tolerancia a inhibidores por parte
de la cepa de levadura a utilizar en la fermentacin. El objetivo del trabajo fue evaluar dos cepas
industriales que, por haber sido aisladas de plantas procesadoras de sustratos lignocelulsicos,
han experimentado una adaptacin a los inhibidores presentes en los hidrolizados. Adems, la cepa
No. 2 es floculante, lo que facilita su separacin
por sedimentacin y permite ahorrar recursos, ya
que se evita el uso de centrfugas (Purwadi et al.,
2007).
Para evaluar la capacidad de las cepas de levadura se hicieron fermentaciones del hidrolizado
sin detoxificar, el hidrolizado detoxificado y una
solucin de referencia en paralelo para cada cepa.
La solucin de referencia contena glucosa en la
misma concentracin que los hidrolizados, pero
no contena inhibidores.
7

Como era lgico esperar, la fermentacin de los

hidrolizados estuvo inhibida en comparacin con
la de la referencia. La inhibicin del rendimiento de
etanol fue menor que la de la productividad volumtrica (Fig. 1), lo que se debi a que los inhibidores impidieron una produccin rpida de etanol
durante las primeras horas, pero luego ocurri un
Figura No. 1

Inhibicin del rendimiento (barras grises) y la

productividad volumtrica de etanol (barras blancas)
durante la fermentacin de los hidrolizados detoxificados y
sin detoxificar.

especfica de etanol tambin reportaron valores similares para ambos hidrolizados (Tabla 2). La mayor
productividad especfica en la fermentacin del
hidrolizado sin detoxificar fue obtenida con la cepa
No. 3. Este resultado evidencia la superioridad de
esa cepa con respecto a las dems, as como su
factibilidad para fermentar hidrolizados sin necesidad de que medie una etapa de detoxificacin.
Figura No. 2

Consumo de glucosa (rombos) y formacin de etanol

(cuadrados) durante la fermentacin del hidrolizado
detoxificado (smbolos vacos) y del hidrolizado sin
detoxificar (smbolos rellenos) con la cepa No. 1.

100

60

20.0

40
20
0

Cepa 3-No
Cepa 2 Cepa 2-No
Cepa 3Cepa -1
Cepa 1-No
Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado Detoxificado

Concentracin, g/L

Inhibicin, %

80

15.0

10.0

proceso de adaptacin de las cepas, lo que, relativa5.0

mente, llev a altos rendimientos de etanol al final
de la fermentacin. Para ilustrar este fenmeno en
0.0
la figura 2 se muestra la dinmica de formacin
0
4
8
12
16
20
24
de etanol y consumo de glucosa en la fermentaTiempo, h
cin de los hidrolizados con la cepa No. 1, la cual
fue la ms sensible a la inhibicin. A pesar
Tabla No. 2
de que la remocin de inhibidores durante
Parmetros de la fermentacin
la detoxificacin fue relativamente baja
YE/G2
VCG2
Q2
q2
(Tabla 1), el efecto en la fermentabilidad
Cepa
Medio
g g-1
g L-1 h-1 g L-1 h-1 g g-1 h-1
de los hidrolizados detoxificados fue muy
marcado. La inhibicin de la fermentacin
Hidrolizado
0,45
0,94
0,50
1,66
detoxificado
fue mucho menor en el hidrolizado detoxificado que en el hidrolizado sin detoxificar
No.1
Hidrolizado
0,12
0,06
0,19
0,63
no
detoxificado
(Fig. 2). El rendimiento de etanol en la fermentacin del hidrolizado detoxificado fue
Referencia
0,46
1,78
1,02
2,92
comparable al rendimiento en la referencia
Hidrolizado
0,43
0,86
0,43
1,43
(Tabla 2), por lo que la inhibicin de ese
detoxificado
parmetro fue inferior a 2 % para las tres
No.2
Hidrolizado
0,06
0,07
0,06
0,30
cepas, e incluso fue nula para la cepa No. 3
no detoxificado
(Fig. 1). La velocidad de consumo de glucosa,
Referencia
0,44
1,61
0,73
2,43
as como las productividades volumtrica y
Hidrolizado
0,44
0,93
0,46
1,53
especfica de etanol se incrementaron con la
detoxificado
detoxificacin, aunque sin llegar a los valores
No.3
Hidrolizado
0,43
0,94
0,46
1,53
de la referencia.
no detoxificado
En lo referente al comportamiento de las
Referencia
0,44
1,78
0,74
2,47
distintas cepas, se debe resaltar la alta tole, rendimiento de etanol por g de glucosa; VCG, velocidad de consumo de glucosa,
rancia a inhibidores de la cepa No. 3. Con YQ, productividad
volumtrica de etanol; q, productividad especfica de etanol.
esa cepa no se observ inhibicin del rendimiento de etanol en la fermentacin del hidrolizado detoxificado, mientras que la inhibicin en Consumo de aldehdos furnicos
el hidrolizado sin detoxificar fue mnima y la inhiLos parmetros del consumo de furfural y de
bicin de la productividad volumtrica fue com- HMF se muestran en la Tabla 3, mientras que la
parable para ambos hidrolizados (Fig. 1). La velo- dinmica de la conversin de esos compuestos
cidad de consumo de glucosa y la productividad durante la fermentacin con la cepa No. 3, la ms
E/G

ATAC No. 1/2009

dems, mientras que la No. 1

fue inferior. Evidentemente, la
alta conversin de los aldehidos furnicos por la cepa No. 3
Furfural-4 Furfural-24 HMF-4h, HMF-4h,
Cepa Detoxificacin
es la causa de la alta capacidad
h, %
h, %
%
%
de esa cepa para fermentar los
No. 1
S
18,2
52,3
5,9
29,0
hidrolizados sin detoxificar.
No
10,4
16,7
2,7
6,7
El consumo del furfural se
No. 2
S
23,7
85,5
0,0
58,3
debe a su reduccin a alcoNo
0,0
22,7
0,0
7,3
hol furfurlico, lo que ha sido
No. 3
S
73,5
85,3
8,5
56,5
demostrado previamente. La
capacidad de S. cerevisiae de
No
46,8
85,0
5,5
39,0
reducir el furfural fue obserresistente, se ilustran en la Figura 3. En la fermen- vada por primera vez por cientficos del ICIDCA
tacin con las cepas No. 2 y No. 3 se logr una alta (Daz de Villegas y col., 1992). Igualmente, se
conversin de los inhibidores furnicos, la cual conoce que el HMF es reducido a alcohol hidroxifue mayor en los hidrolizados detoxificados que metilfurfurlico. La reduccin del furfural y del
en los no detoxificados.
HMF en fermentaciones de hidrolizados de bagazo
Con ambas cepas, en la fermentacin de los ha sido reportada previamente por este colectivo
hidrolizados detoxificados 85 % del furfural fue de investigadores (Martn et al., 2002).
La dinmica de la conversin del furfural explica
consumido en 24 h, mientras que con la cepa
No. 1 slo se consumi 52,3 % (Tabla 2). El con- el comportamiento fermentativo de las cepas.
sumo de furfural fue ms rpido con la cepa No. 3, Durante las primeras horas, cuando las concenla cual logr altas conversiones de furfural incluso traciones de furfural eran altas, las fermentaciones
fueron lentas y la productividad de etanol fue
Figura No. 3
Dinmica del consumo de furfural (rombos) e HMF
baja, pero cuando el furfural fue convertido en el
(crculos) durante la fermentacin del hidrolizado
poco txico alcohol furfurlico las fermentaciones
detoxificado (smbolos vacos) y del hidrolizado sin
se activaron, conduciendo a altos rendimientos
detoxificar (smbolos rellenos) con la cepa No. 3.
de etanol (Tabla 2). Por otra parte, las menores
1.8
inhibiciones se observaron en las fermentaciones
1.5
en las que se alcanzaron las mayores conversiones
1.2
del furfural.
Concentracin, g/L

Tabla No. 3
Consumo de aldehdos furnicos durante la fermentacin,
% del contenido inicial

0.9
0.6
0.3

0.0
0

12

Tiempo, h

16

20

24

Formacin de glicerol
El glicerol fue el principal subproducto formado
durante la fermentacin. La produccin de glicerol
fue mayor en los hidrolizados detoxificados que
en los hidrolizados sin detoxificar (Fig. 4), y fue
inferior en los hidrolizados que en las referencias
(datos no mostrados). Se observ una estrecha

ATAC No. 1/2009

Concentracin, g/L

Concentracin, g/L

en el hidrolizado sin detoxificar. A las 4 h de fermentacin, esa cepa ya haba consumido tres cuartas partes del furfural contenido en el hidrolizado
detoxificado y casi la mitad
Figura No. 4
del contenido en el hidro- Produccin de glicerol durante la fermentacin del hidrolizado detoxificado (smbolos
vacos) y del hidrolizado sin detoxificar (smbolos rellenos) con las cepas No. 1 (A) y
lizado no detoxificado,
No. 3 (B).
mientras que el porcentaje
de furfural consumido al
1.6
1.6
final de la fermentacin
A
B
fue semejante para ambos
1.2
1.2
hidrolizados.
Aunque
el
consumo
0.8
0.8
de HMF fue inferior, con
todas las cepas se observ
0.4
0.4
la misma tendencia que
con el consumo de furfural
0.0
0.0
(Tabla2). La cepa No. 3 fue
0
4
8
12 16 20 24
0
4
8
12 16 20 24
claramente superior a las
Tiempo, h
Tiempo, h

correlacin entre el consumo de furfural y la formacin de glicerol. Un rpido consumo de furfural, como en la cepa No. 3, conllev a una mayor
formacin de glicerol, mientras que un retraso en
el consumo de furfural, como en la fermentacin
del hidrolizado sin detoxificar con la cepa No. 1,
condujo a una baja formacin de glicerol. Este
fenmeno ha sido observado previamente en fermentacin de hidrolizados de bagazo obtenidos
por explosin con vapor seguida de hidrlisis
enzimtica.
Conclusiones

El empleo de una cepa de Saccharomyces cerevisiae aislada de una planta de fermentacin de licores
de pulpeo al sulfito permiti fermentar hidrolizados
cidos de bagazo con una inhibicin mnima, debido
a la alta capacidad de la cepa para convertir los inhibidores furnicos en formas menos txicas. La cepa
aislada puede fermentar hidrolizados sin necesidad
de detoxificacin, lo que permite disminuir los costos
del proceso. La fermentacin de hidrolizados de
bagazo de caa de azcar permitira obtener etanol
combustible sin afectar la produccin de alimentos.
Agradecimientos

Este trabajo fue posible gracias al apoyo de proyectos del Ministerio de Educacin Superior de Cuba
(contrato No. 6.115) y de la International Foundation for Science (contrato No. F/3563-1).

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