Avaliao da

qualidade de produtos
base de Trichoderma

18 a 20 de setembro de 2012
Embrapa Meio Ambiente - Jaguarina, SP

IV CURSO TERICO E PRTICO

Avaliao da qualidade de produtos base de
Trichoderma

Trichoderma o principal agente de biocontrole de doenas de

plantas comercializado no Brasil. A maioria dos produtos comerciais base
de Trichoderma est em processo de registro no MAPA. Com isso, surgiu a
necessidade de padronizar as metodologias para a avaliao da qualidade
desses produtos, tanto para o setor de qualidade das biofbricas quanto
para os rgos de fiscalizao. Assim, no mbito do projeto Qualibio foram
desenvolvidas

metodologias

para

realizar

essas

avaliaes,

com

participao da Embrapa Meio Ambiente, Embrapa Arroz e Feijo, Empresa

de Pesquisa Agropecuria de Minas Gerais - Epamig/Viosa, Instituto
Biolgico - IB, Ceplac/Cepec e Universidade Federal de Pelotas UFPel.
Essas metodologias esto sendo transferidas sociedade por meio
do Curso Terico e Prtico Avaliao da qualidade de produtos base de
Trichoderma. At o momento foram realizados dois cursos na Embrapa
Meio Ambiente, Jaguarina-SP e um na Universidade Federal de Lavras,
Lavras-MG, com retorno positivo dos participantes, que j esto utilizando
as metodologias como rotina nos laboratrios.
O uso das metodologias padronizadas est auxiliando na promoo e
legalizao dos produtos, bem como em garantir a sua qualidade e
1

efetividade, repercutindo na melhoria dos produtos biolgicos nacionais e

consequentemente aumentando seu mercado consumidor.
PROGRAMAO
18/09/2012
8:30h Abertura Wagner Bettiol
9:00h - Importncia da padronizao de metodologias para avaliao da
conformidade de produtos contendo agentes de biocontrole Marcelo A. B.
Morandi
9:30h Aspectos gerais sobre Trichoderma como agente biolgico para o
controle de doenas de plantas Cleusa M. M. Lucon
10:30h coffee break
11:00h Metodologias para quantificao de Trichoderma para formulados
em p-molhvel, esporos concentrados e grnulos Zayame Vegette Pinto
12:00h - Almoo
14:00h Preparo e execuo das metodologias para a anlise qualiquantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma spp. Zayame
V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely
Nascimento,Patrcia E. Haddad.
15:30h- coffee break
16:00h - Continuao do preparo e execuo das metodologias para a
anlise quali-quantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma
spp. Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos
Agostini, Rosely Nascimento, Patrcia E. Haddad.
19/09/2012
8:00h Leitura do nmero de esporos ativos e germinados ao microscpio
ptico Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos
Agostini, Rosely Nascimento, Patrcia E. Haddad.
10:30h coffe break

11:00h- Contagem do nmero de esporos ao microscpio ptico - Cleusa

M. M. Lucon, Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos
Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrcia E. Haddad.
12:00h - Almoo
14:00h - Identificao molecular e morfolgica de Trichoderma Ricardo
HaraKava.
15:30h- coffe-break
16:00h - Preservao de isolados de Trichoderma Cleusa M. M. Lucon e
Zayame V. Pinto
16:00h Avaliao de contaminantes presentes em produtos a base de
Trichoderma - Cleusa M. M. Lucon e Zayame V. Pinto
20/09/2012
09:00h Avaliao do teste de microgotas - Zayame V. Pinto, Cleusa M.
M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrcia E.
Haddad.
10:00h Determinao do nmero de UFC de Trichoderma. Zayame V.
Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely
Nascimento, Patrcia E. Haddad.
10:30h - coffe-break
11:00h Anlise dos resultados e discuuso Wagner Bettiol, Marcelo A.
B. Morandi, Zayame Vegette e Cleusa M. M. Lucon.
13:00h Almoo e visita a casa de vegetao onde Trichoderma utilizado
em larga escala.
17:00h - Encerramento

NDICE
I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS
BIOLGICOS BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM P-MOLHVEL,
GRNULOS DISPERSVEIS E SUSPENSO CONCENTRADA.
I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NMERO DE CONDIOS
I.II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS
PORCENTAGEM DE CONDIOS VIVEIS
I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS UNIDADE
FORMADORA DE COLNIA
II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS
BIOLGICOS BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM P-DE-ESPORO.
II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NMERO DE CONDIOS
II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS
PORCENTAGEM DE CONDIOS VIVEIS
II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS UNIDADE
FORMADORA DE COLNIA

I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS

BIOLGICOS BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM P-MOLHVEL,
GRNULOS DISPERSVEIS E SUSPENSO CONCENTRADA.

I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NMERO DE CONDIOS

1. PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo em que o resultado expresso em nmero de condios
por massa ou volume de produto biolgico formulado. Tem como base a preparao de
suspenso de condios de Trichoderma e contagem do nmero de condios com auxilio
de uma Cmara de Neubauer (hemacitmetro) ao microscpio ptico.
2. APLICAO
Aplicvel aos produtos nas formulaes p-molhvel, grnulos dispersveis e suspenso
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
5

- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Micropipeta de 10 mL e 1000 L;
- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 L;
- Cmara de Neubauer (ou hemacitmetro);
- Microscpio ptico;
- Contador manual;
- Agitador magntico;
- Barra magntica.
5. SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1000 mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20
minutos.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do incio da anlise.
6.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde diluio 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma srie de diluio para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser
realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratao.

6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90

rpm.
6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
6.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em
cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magntico por 5 minutos.
6.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-1), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
6.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
6.8 Para obter a diluio 10-3 repetir os itens 6.6 e 6.7 (diluio seriada), utilizando o
tubo da diluio anterior (10-2). Proceder assim repetidamente at alcanar a diluio
apropriada para contagem de condios (Tabela 1). Para cada diluio deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
Tabela 1. Diluio apropriada a ser utilizada para o contagem do nmero de condios,
de acordo com a concentrao mencionada no rtulo do produto.
Concentrao de condios*
Diluio para contagem
109
10-4
108
10-3
*Quando a concentrao do produto no conhecida deve-se utilizar as duas
diluies e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 condios por
subcompartimento da cmera de Neubauer, conforme observao ao
microscpio ptico.
6.9 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador de
tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento;
6.10 Retirar imediatamente uma alquota representativa da suspenso com auxlio de
uma micropipeta;

6.11 Colocar a suspenso na canaleta da cmara de Neubauer, j coberta com a

lamnula, at o preenchimento de todo o espao existente entre a lamnula e a cmara de
Neubauer;
6.12 Antes de iniciar a contagem, deixar a cmara de Neubauer com a suspenso de
condios em repouso por 5 minutos, para que os condios precipitem, facilitando a
contagem e reduzindo erros;
6.13 Realizar a contagem de condios ao microscpio ptico, no aumento de 250X ou
400X, nos campos 1 e 2 da cmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados
(subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por
campo da cmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).
Observao: Muitos condios ficam exatamente sobre as linhas de demarcao internas
dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os condios que estiverem nas
linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observao para evitar que eles sejam
contados duas vezes.

Campo 1
Campo 2

Figura 1. Localizao dos campo 1 e 2 na cmara de Neubauer.

E1

E2

E3

E4

E5

Figura 2. rea dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de

condios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5.
7. CLCULO DO NMERO DE CONDIOS
Para determinar o nmero de condios utilizar a frmula a seguir para cada repetio:
Condios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}
Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5
Quando utilizada a diluio 10-3, multiplica-se o resultado por 103 e, quando utilizada a
diluio 10-4, por 104.
Observao: O software CALIBRA, desenvolvido no mbito do projeto Qualibio, est
disponvel para cpia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os clculos
e armazena as informaes para a emisso de laudos. A sugesto que o software seja
sempre utilizado, para uma maior facilidade e preciso nas anlises.

8. REPETIO

Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma srie de diluio seriada. A diluio selecionada, deve-se colocar na
cmara de Neubauer para contagem.

Figura 3. Esquema das repeties utilizadas na metodologia para anlise da qualidade

de produtos base de Trichoderma.
9. PRESERVAO DAS AMOSTRAS APS A ANLISE E DESCARTE
Logo aps as anlises, as amostras devero ser lacradas e armazenadas conforme
recomendao do fabricante at a data de validade, caso haja necessidade de repetio
dos procedimentos. Aps este perodo ou, se no houver mais interesse nas amostras, as
mesmas devero ser autoclavadas a 120 C por 20 minutos, e em seguida descartadas.
10. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

10

I. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS

PORCENTAGEM DE CONDIOS VIVEIS
1. PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo onde o resultado expresso em porcentagem de condios
viveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alquota da suspenso de
condios de Trichoderma em reas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubao em temperatura adequada para a germinao dos
condios e contagem do nmero de condios viveis ao microscpio ptico.
2 APLICAO
Aplicvel aos produtos nas formulaes p-molhvel, grnulos dispersveis e suspenso
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3 AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 2 C (BOD);
- Micropipeta de 10 mL, 15 L e 1000 L;
- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 L e 1000 L;
11

- Placas de Petri descartvel esterilizadas;

- Agitador magntico;
- Barra magntica.
5 SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1.000 mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20 g;
- cido ltico: 20 g;
- gua destilada: 20 g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodo ou azul de Trypan): 0,1 g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magntico dentro de capela de exausto de gases.
6. MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a gua destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condio de
12

esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do incio da anlise.
7.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde diluio 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma srie de diluio para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve
ser realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratao.
7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspenso. Ou
colocar em agitador magntico por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-1), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
7.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
7.8 Para obter a diluio 10-3 repetir os itens 7.6 e 7.7 (diluio seriada), utilizando o
tubo da diluio anterior (10-2). Proceder assim repetidamente at alcanar a diluio
apropriada para contagem de condios (Tabela 1). Para cada diluio deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.

13

Tabela 1. Diluio apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de condios, de

acordo com a concentrao mencionada no rtulo do produto.
Concentrao de condios
Diluio
109
10-4
108
10-3
*Quando a concentrao do produto no conhecida deve-se utilizar as duas diluies e
escolher para contagem a que obtiver melhor visualizao dos condios, conforme
observao ao microscpio ptico.
7.9 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador de
tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento.
7.10 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 L da diluio apropriada em placas de
Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma
placa.

Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcaes e os 15 L da suspenso

para anlise da viabilidade porcentagem de condios viveis.
7.11 Transferir as placas em BOD a 25 2 C, no escuro.
7.12 Aps iniciar a germinao (apresenta variao de 9 a 20 h aps o plaqueamento em
funo do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 L)
em cada ponto (local onde foi colocada a diluio apropriada) com a suspenso (cinco
pontos por placa) (Figura 1).
14

7.13 Avaliar a viabilidade usando microscpio ptico no aumento de pelo menos 400x.
7.14 O condio considerado vivel, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 Glossrio).
7.15 Contar os condios viveis e no viveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100
condios por ponto.
7.16 Se necessrio, fazer nova avaliao na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.
7.17 Calcular a taxa mdia de viabilidade utilizando a frmula:
Viabilidade (%)=(mdia do nmero de condios viveis das pesagens/total de condios) X 100

Deve ser realizado o clculo para cada gota de cada pesagem de cada diluio,
separadamente. Posteriormente, obter a mdia aritmtica de cada pesagem.

Condio germinado

Condio ativo no
germinado

Condio inativo

Figura 2. Vista dos condios de Trichoderma viveis (germinados e ativos no

germinados) ou inativos em microscpio ptico, aps 14 horas de incubao.
8. REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma diluio seriada (itens 7.6 e 7.8). Da diluio selecionada, deve-se colocar
cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.10 e Figura 1).

15

Figura 3. Esquema das repeties utilizadas na metodologia para anlise da qualidade

de produtos base de Trichoderma.
9. PRESERVAO DAS AMOSTRAS APS A ANLISE E DESCARTE
Logo aps as anlises, as amostras devero ser lacradas e armazenadas conforme
recomendao do fabricante at a data de validade, caso haja necessidade de repetio
dos procedimentos. Aps este perodo ou, se no houver mais interesse nas amostras, as
mesmas devero ser autoclavadas a 120 C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

11. GLOSSRIO
Condio: estrutura no sexual de reproduo de fungos.
Condio ativo ou em processo de germinao: o condio que aumentou de tamanho
em relao ao no germinado, mas que ainda no emitiu tubo germinativo.

16

Condio germinado: o condio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do condio.
Condios inativos: condios no viveis.
Condios no germinados: condios que podem ou no estar viveis, porm no
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
condio.
Condios viveis: so os condios ativos e os germinados.
Conidiforo: estrutura do fungo produtora de condios.
Grnulos: tipo de formulao de produto biolgico em forma de grnulos que se
desfazem na presena de gua.
P-molhvel: tipo de formulao de produto biolgico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com gua, formando suspenses dotadas de grande
estabilidade.

I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS UNIDADE

FORMADORA DE COLNIA
1 PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo, onde o resultado expresso em unidades formadoras de
colnia (UFC/mL). Tem como base a homogeneizao do produto biolgico com o
diluente esterilizado (soluo salina com adio de Tween 80). A partir dela realizado
diluies decimais, as quais so distribudas em placas sobre meio BDA com Triton e
incubadas a 25 2 C no escuro para posterior contagem do nmero de colnias
formadas pelo Trichoderma.
2 APLICAO
Aplicvel aos produtos nas formulaes p-molhvel, grnulos dispersveis e suspenso
concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.
3 AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem
17

ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos

estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 2 C (BOD);
- Micropipeta para 10 mL, 20 L, 100 L e 1000 L;
- Ponteiras estreis para micropipeta de 10 mL, 20 L, 100 L e 1000 L;
- Placas de Petri descartvel esterilizada;
- Ala de Drigalski esterilizada;
- Agitador magntico;
- Barra magntica;
- Microscpio ptico;
- Lmina de microscopia e fita adesiva transparente.
5 SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm
por 20 minutos.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
18

-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;

-gua destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a gua destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condio de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adio de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendao do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a gua destilada e Triton X-100 (redutor de colnia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e
para avaliar a condio de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7 PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:
7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do incio da anlise.
7.1.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90
g do diluente (corresponde diluio 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para
cada amostra e duas sries de diluies para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem
deve ser realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira amostra para evitar
maior tempo de hidratao.
19

7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90

rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
7.1.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspenso. Ou
colocar em agitador magntico por 5 minutos.
7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-1), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
7.1.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
7.1.8 Para obter a diluio 10-3 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluio seriada), utilizando
o tubo da diluio anterior (10-2). Proceder assim repetidamente at alcanar a diluio
apropriada para contagem de condios (Tabela 1). Para cada diluio deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
Tabela 1. Mximo de diluio seriada que deve ser realizado para obteno da diluio
apropriada.
Informao do fabricante
105
106
107
108
109
1010
1011
1012

Diluir at
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
10-11
10-12
10-13

7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.
7.1.10 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador
de tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.
20

7.1.11 Pipetar imediatamente trs alquotas de 20 L de cada diluio preparada para a

superfcie do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na
Figura 1.

Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com trs alquotas de 20L da diluio seriada referente a marcao da placa.
7.1.12 Os tubos com as diluies devem ser guardados sobre refrigerao (2-8 C) por
no mximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colnia;
7.1.13 Esperar para que os 20L de cada diluio sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 2 C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluies houve o crescimento de colnias de Trichoderma e
selecionar as trs ltimas diluies que apresentaram o crescimento do fungo nas trs
gotas das duas pesagens realizadas para a realizao do teste de unidade formadora de
colnia.
7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLNIA (UFC):
7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluies seriadas da refrigerao por 30 a 40
minutos antes do incio da anlise.
7.2.2 Misturar o contedo dos tubos de cultura com as diluies escolhidas em agitador
para tubos de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento;
7.2.3 Transferir de cada diluio apropriada, com uma micropipeta estril, 100L para a
superfcie de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton;
7.2.4 A diluio distribuda uniformemente sobre a superfcie do meio com uma ala
de Drigalski esterilizada, imediatamente aps a transferncia. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma ala de Drigalski.
21

7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100L da
soluo salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton com ala de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 2 C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
nmero de colnias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 2 C, no escuro, novamente as culturas at 7 dias para
verificar se as colnias formadas so realmente de Trichoderma, por meio da
visualizao da colnia na placa e das estruturas do fungo em microscpio ptico.
7.2.8 Para observar em microscpio ptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colnia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidiforos e
condios) em microscpio ptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificao de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8 - REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada uma diluio seriada (item 7.1.6). Das trs diluies selecionadas,
deve-se plaquear no mnimo cinco repeties por diluio (7.2.3).

22

Figura 2. Esquema das repeties utilizadas na metodologia para anlise da qualidade

de produtos base de Trichoderma.
9 CONTAGEM DE COLNIAS
Fazer a contagem do nmero de unidades formadoras de colnias, por placa, no tempo
de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a frmula:
UFC/mL= nmero mdio de colnias nas placas X diluio escolhida da amostra X 10*
* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100L de suspenso.
Observao: Ideal que cada placa tenha de 30 a 300 colnias.
10 - PRESERVAO DAS AMOSTRAS APS A ANLISE E DESCARTE
Logo aps as anlises, as amostras devero ser lacradas e armazenadas conforme
recomendao do fabricante at a data de validade, caso haja necessidade de repetio
dos procedimentos. Aps este perodo ou, se no houver mais interesse nas amostras, as
mesmas devero ser autoclavadas a 120 C por 20 minutos, e em seguida descartadas.
11. LIMPEZA
23

Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o

local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

24

II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS

BIOLGICOS BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM P-DE-ESPORO.

II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NMERO DE CONDIOS

1. PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo em que o resultado expresso em nmero de condios
por massa ou volume de produto biolgico formulado. Tem como base a preparao de
suspenso de condios de Trichoderma e contagem do nmero de condios com auxilio
de uma Cmara de Neubauer (hemacitmetro) ao microscpio ptico.
2. APLICAO
Aplicvel aos produtos na formulao p-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3. AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
25

- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;

- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Micropipeta de 10 mL e 1000 L;
- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 L;
- Cmara de Neubauer (ou hemacitmetro);
- Microscpio ptico;
- Contador manual;
- Agitador magntico;
- Barra magntica.
5. SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1000 mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20
minutos.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do incio da anlise.
6.2 Pesar 0,1g do produto em erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com
soluo salina com Tween a 0,1 % (corresponde s diluio 10-3). Devem ser realizadas
duas pesagens para cada amostra e uma srie de diluio para cada pesagem. A segunda
pesagem deve ser realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira amostra
para evitar maior tempo de hidratao.
6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
26

6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O

nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
6.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em
cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magntico por 5 minutos.
6.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-3), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (obter a suspenso 10-4). Descartar a ponteira em seguida. Utilizar para a
contagem a diluio apropriada segundo a Tabela 1.
6.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
Tabela 1. Diluio apropriada a ser utilizada para o contagem do nmero de condios,
de acordo com a concentrao mencionada no rtulo do produto.
Concentrao de condios*
Diluio para contagem
9
10
10-4
< 108
10-3
*Quando a concentrao do produto no conhecida deve-se utilizar as duas
diluies e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 condios por
subcompartimento da cmera de Neubauer, conforme observao ao
microscpio ptico.
6.8 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador de
tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento;
6.9 Retirar imediatamente uma alquota representativa da suspenso com auxlio de uma
micropipeta;
6.10 Colocar a suspenso na canaleta da cmara de Neubauer, j coberta com a
lamnula, at o preenchimento de todo o espao existente entre a lamnula e a cmara de
Neubauer;
6.11 Antes de iniciar a contagem, deixar a cmara de Neubauer com a suspenso de
condios em repouso por 5 minutos, para que os condios precipitem, facilitando a
contagem e reduzindo erros;
27

6.12 Realizar a contagem de condios ao microscpio ptico, no aumento de 250X ou

400X, nos campos 1 e 2 da cmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados
(subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por
campo da cmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).
Observao: Muitos condios ficam exatamente sobre as linhas de demarcao internas
dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os condios que estiverem nas
linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observao para evitar que eles sejam
contados duas vezes.

Campo 1
Campo 2

Figura 1. Localizao dos campo 1 e 2 na cmara de Neubauer.

E1

E2

E3

E4

E5

Figura 2. rea dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de

condios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5.
28

7. CLCULO DO NMERO DE CONDIOS

Para determinar o nmero de condios utilizar a frmula a seguir para cada repetio:
Condios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}
Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5
Para obter a concentrao do produto original, o resultado obtido deve ser multiplicado
pela diluio utilizada. Quando utilizada a diluio 10-3, multiplica-se o resultado por
103e, quando utilizada a diluio 10-4, por 104.
O resultado final ser a mdia das 4 repeties.
Observao: O software CALIBRA, desenvolvido no mbito do projeto Qualibio, est
disponvel para cpia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os clculos
e armazena as informaes para a emisso de laudos. A sugesto que o software seja
sempre utilizado, para uma maior facilidade e preciso nas anlises.

8. REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma srie de diluio seriada. A diluio selecionada, deve-se colocar na
cmara de Neubauer para contagem.

29

Figura 3. Esquema das repeties utilizadas na metodologia para anlise da qualidade

de produtos base de Trichoderma.
9. PRESERVAO DAS AMOSTRAS APS A ANLISE E DESCARTE
Logo aps as anlises, as amostras devero ser lacradas e armazenadas conforme
recomendao do fabricante at a data de validade, caso haja necessidade de repetio
dos procedimentos. Aps este perodo ou, se no houver mais interesse nas amostras, as
mesmas devero ser autoclavadas a 120 C por 20 minutos, e em seguida descartadas.
10. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS
PORCENTAGEM DE CONDIOS VIVEIS
30

1. PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo onde o resultado expresso em porcentagem de condios
viveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alquota da suspenso de
condios de Trichoderma em reas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubao em temperatura adequada para a germinao dos
condios e contagem do nmero de condios viveis ao microscpio ptico.
2 APLICAO
Aplicvel aos produtos na formulao p-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3 AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 2 C (BOD);
- Micropipeta de 10 mL, 15 L e 1000 L;
- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 L e 1000 L;
- Placas de Petri descartvel esterilizadas;
- Agitador magntico;
31

- Barra magntica.
5 SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1.000 mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20 g;
- cido ltico: 20 g;
- gua destilada: 20 g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodo ou azul de Trypan): 0,1 g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magntico dentro de capela de exausto de gases.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a gua destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condio de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
32

Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes

de serem utilizadas.
7 PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do incio da anlise.
7.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9
g com soluo salina com 0,1% (corresponde s diluies 10 -3). Devem ser realizadas
duas pesagens para cada amostra e duas sries de diluies para cada pesagem (item 8).
A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira
amostra para evitar maior tempo de hidratao.
7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspenso. Ou
colocar em agitador magntico por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-3), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida. Escolher a diluio apropriada segundo
a Tabela 1.
7.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
Tabela 1. Diluio apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de condios, de
acordo com a concentrao mencionada no rtulo do produto.
Concentrao de condios
Diluio
109
10-4
< 108
10-3
*Quando a concentrao do produto no conhecida deve-se utilizar as duas diluies e
escolher para contagem a que obtiver melhor visualizao dos condios, conforme
observao ao microscpio ptico.
33

7.8 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador de

tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o
turbilhonamento.
7.9 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 L da diluio apropriada em placas de
Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma
placa.

Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcaes e os 15 L da suspenso

para anlise da viabilidade porcentagem de condios viveis.
7.10 Transferir as placas em BOD a 25 2 C, no escuro.
7.11 Aps iniciar a germinao (apresenta variao de 9 a 20 h aps o plaqueamento em
funo do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 L)
em cada ponto (local onde foi colocada a diluio apropriada) com a suspenso (cinco
pontos por placa) (Figura 1).
7.12 Avaliar a viabilidade usando microscpio ptico no aumento de pelo menos 400x.
7.13 O condio considerado vivel, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 Glossrio).
7.14 Contar os condios viveis e no viveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100
condios por ponto.
7.15 Se necessrio, fazer nova avaliao na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.
7.16 Calcular a taxa mdia de viabilidade utilizando a frmula:
34

Viabilidade (%)=(mdia do nmero de condios viveis das pesagens/total de condios) X 100

Deve ser realizado o clculo para cada gota de cada pesagem de cada diluio,
separadamente. Posteriormente, obter a mdia aritmtica de cada pesagem.

Condio germinado

Condio ativo no
germinado

Condio inativo

Figura 2. Vista dos condios de Trichoderma viveis (germinados e ativos no

germinados) ou inativos em microscpio ptico, aps 14 horas de incubao.
8 - REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma diluio seriada (itens 7.6). Da diluio selecionada, deve-se colocar
cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.9 e Figura 1).

35

Figura 3. Esquema das repeties utilizadas na metodologia para anlise da qualidade

de produtos base de Trichoderma.
9 - PRESERVAO DAS AMOSTRAS APS A ANLISE E DESCARTE
Logo aps as anlises, as amostras devero ser lacradas e armazenadas conforme
recomendao do fabricante at a data de validade, caso haja necessidade de repetio
dos procedimentos. Aps este perodo ou, se no houver mais interesse nas amostras, as
mesmas devero ser autoclavadas a 120 C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

11. GLOSSRIO
Condio: estrutura no sexual de reproduo de fungos.
Condio ativo ou em processo de germinao: o condio que aumentou de tamanho
em relao ao no germinado, mas que ainda no emitiu tubo germinativo.
36

Condio germinado: o condio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do condio.
Condios inativos: condios no viveis.
Condios no germinados: condios que podem ou no estar viveis, porm no
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
condio.
Condios viveis: so os condios ativos e os germinados.
Conidiforo: estrutura do fungo produtora de condios.
Grnulos: tipo de formulao de produto biolgico em forma de grnulos que se
desfazem na presena de gua.
P-molhvel: tipo de formulao de produto biolgico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com gua, formando suspenses dotadas de grande
estabilidade.

II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS UNIDADE

FORMADORA DE COLNIA
1 PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo, onde o resultado expresso em unidades formadoras de
colnia (UFC/mL). Tem como base a homogeneizao do produto biolgico com o
diluente esterilizado (soluo salina com adio de Tween 80). A partir dela realizado
diluies decimais, as quais so distribudas em placas sobre meio BDA com Triton e
incubadas a 25 2 C no escuro para posterior contagem do nmero de colnias
formadas pelo Trichoderma.
2 APLICAO
Aplicvel aos produtos na formulao p-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3 AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
37

ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem

ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 2 C (BOD);
- Micropipeta para 10 mL, 20 L, 100 L e 1000 L;
- Ponteiras estreis para micropipeta de 10 mL, 20 L, 100 L e 1000 L;
- Placas de Petri descartvel esterilizada;
- Ala de Drigalski esterilizada;
- Agitador magntico;
- Barra magntica;
- Microscpio ptico;
- Lmina de microscopia e fita adesiva transparente.
5 SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1000mL;
-Tween 80: 1mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm
por 20 minutos.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
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Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a gua destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condio de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adio de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendao do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a gua destilada e Triton X-100 (redutor de colnia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e
para avaliar a condio de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7 PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:
7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do incio da anlise.
7.1.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para
99,9 g com soluo salina com 0,1% (corresponde s diluies 10 -3). Devem ser
realizadas duas pesagens para cada amostra e duas sries de diluies para cada

39

pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos aps a colocao
de gua na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratao.
7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
7.1.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspenso. Ou
colocar em agitador magntico por 5 minutos.
7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-3), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida.
7.1.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
7.1.8 Para obter a diluio 10-5 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluio seriada), utilizando
o tubo da diluio anterior (10-4). Proceder assim repetidamente at alcanar a diluio
apropriada para contagem de condios (Tabela 1). Para cada diluio deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
Tabela 1. Mximo de diluio seriada que deve ser realizado para obteno da diluio
apropriada.
Informao do fabricante
105
106
107
108
109
1010
1011
1012

Diluir at
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
10-11
10-12
10-13

7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.

40

7.1.10 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador

de tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.
7.1.11 Pipetar imediatamente trs alquotas de 20 L de cada diluio preparada para a
superfcie do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na
Figura 1.

Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com trs alquotas de 20L da diluio seriada referente a marcao da placa.
7.1.12 Os tubos com as diluies devem ser guardados sobre refrigerao (2-8 C) por
no mximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colnia;
7.1.13 Esperar para que os 20L de cada diluio sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 2 C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluies houve o crescimento de colnias de Trichoderma e
selecionar as trs ltimas diluies que apresentaram o crescimento do fungo nas trs
gotas das duas pesagens realizadas para a realizao do teste de unidade formadora de
colnia.
7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLNIA (UFC):
7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluies seriadas da refrigerao por 30 a 40
minutos antes do incio da anlise.
7.2.2 Misturar o contedo dos tubos de cultura com as diluies escolhidas em agitador
para tubos de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento;
7.2.3 Transferir de cada diluio apropriada, com uma micropipeta estril, 100L para a
superfcie de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton;
41

7.2.4 A diluio distribuda uniformemente sobre a superfcie do meio com uma ala
de Drigalski esterilizada, imediatamente aps a transferncia. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma ala de Drigalski.
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100L da
soluo salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton com ala de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 2 C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
nmero de colnias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 2 C, no escuro, novamente as culturas at 7 dias para
verificar se as colnias formadas so realmente de Trichoderma, por meio da
visualizao da colnia na placa e das estruturas do fungo em microscpio ptico.
7.2.8 Para observar em microscpio ptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colnia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidiforos e
condios) em microscpio ptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificao de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8 - REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada uma diluio seriada (item 7.1.6). Das trs diluies selecionadas,
deve-se plaquear no mnimo cinco repeties por diluio (7.2.3).

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Figura 2. Esquema das repeties utilizadas na metodologia para anlise da qualidade

de produtos base de Trichoderma.
9 CONTAGEM DE COLNIAS
Fazer a contagem do nmero de unidades formadoras de colnias, por placa, no tempo
de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a frmula:
UFC/mL= nmero mdio de colnias nas placas X diluio escolhida da amostra X 10*
* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100L de suspenso.
Observao: Ideal que cada placa tenha de 30 a 300 colnias.
10 - PRESERVAO DAS AMOSTRAS APS A ANLISE E DESCARTE
Logo aps as anlises, as amostras devero ser lacradas e armazenadas conforme
recomendao do fabricante at a data de validade, caso haja necessidade de repetio
dos procedimentos. Aps este perodo ou, se no houver mais interesse nas amostras, as
mesmas devero ser autoclavadas a 120 C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

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11. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

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Wagner Bettiol
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. bettiol@cnpma.embrapa.br
Marcelo Augusto Boechat Morandi
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. mmorandi@cnpma.embrapa.br
Zayame Vegette Pinto
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. zayame@cnpma.embrapa.br
Rosely Nascimento
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. rosely@cnpma.embrapa.br
Elen Ribeiro dos Santos Agostini
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. elen@cnpma.embrapa.br
Cleusa Maria Mantovanello Lucon
Instituto Biolgico de So Paulo,
Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
04014-002, So Paulo, SP. mantova@biologico.sp.gov.br
Ricardo Harakava
Instituto Biolgico de So Paulo,
Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
04014-002, So Paulo, SP. harakava@biologico.sp.gov.br
Patrcia E. Haddad
Instituto Biolgico de So Paulo,
Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
04014-002, So Paulo, SP. patriciaehaddad@yahoo.com.br

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