Enzimologa - Regulacin

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

La interconversin de biomolculas dentro de la clula se da a partir de vas

o rutas metablicas, secuencias de reacciones qumicas catalizadas por enzimas
que llevan a la produccin de los diferentes componentes celulares. Estas vas
pueden ser denominadas anablicas cuando estn destinadas a la sntesis de un
compuesto a partir de precursores ms pequeos, o catablicas, cuando proceden
en el sentido de degradar compuestos. Algunas vas pueden ser consideradas
como anfiblicas, cuando pueden proceder en uno u otro sentido, y generalmente
comparten algunas enzimas.
Consideremos el camino anfiblico:
catablico
E1

E2

E3

ABCD
anablico
donde E1, E2 y E3 son las enzimas que catalizan cada una de las reacciones.
Como vemos es imposible controlar el flujo en una sola direccin sin afectar la
otra. Por eso, lo que se observa en general es que las etapas regulatorias de una
va metablica anfiblica estn organizadas de la siguiente manera:
E2
E4

E1

AB

CD
E3

Es decir que siempre habr por lo menos una enzima nicamente perteneciente a
una de las direcciones metablicas. Adems, por lo general estas reacciones son
irreversibles (G<<0).
Las necesidades fisiolgicas de cada clula hacen que las vas metablicas
sean capaces de cambiar rpidamente de velocidad o sentido. En realidad, no
todas las vas metablicas funcionan a su mxima capacidad al mismo tiempo y
ms an, existen rutas que en ciertas fases del ciclo celular son anuladas por

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completo. La situacin contraria implicara un despilfarro de metabolitos y energa

para las clulas (ver ciclos ftiles).
El control del funcionamiento de las diferentes rutas metablicas se realiza
modulando la actividad de una o ms enzimas claves de la va (enzimas
regulatorias). Esta regulacin no se da en todas las enzimas de la va, sino casi
siempre en aquellas que son nicas para la va (ver ejemplo anterior).
Los seres vivos han desarrollado diferentes estrategias para lograr la
regulacin mencionada:
- Compartamentalizacin
- Regulacin de la cantidad absoluta de enzima
- Regulacin de la actividad enzimtica:

mediada por metabolitos

modificacin covalente

modificacin de la estructura cuaternaria

unin a otras protenas

activacin proteoltica irreversible

- Isoenzimas

Compartamentalizacin
Con el objeto de maximizar la economa celular, muy a menudo las rutas
catablicas y anablicas se hallan separadas en diferentes organelas. La
presencia en un mismo compartimiento de la sntesis de cidos grasos y su
degradacin conducira a la existencia de un ciclo ftil. La ocurrencia de la sntesis
de los cidos grasos en el citoplasma mientras la oxidacin de los mismos tiene
lugar en la mitocondria brinda la posibilidad de controlar ambos metabolismos
regulando el transporte de los metabolitos comunes a nivel de membrana.
En plantas existen vas glucolticas paralelas en el cloroplasto y en el
citosol, con funciones y regulacin adecuadas a su entorno, y el proceso de
fotorrespiracin tiene lugar en tres compartimientos celulares diferentes.

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Otro ejemplo de compartamentalizacin muy claro es el que existe en el

ncleo de las clulas eucariotas donde la sntesis de ADN y ARN se realiza en
zonas localizadas.

Control de la concentracin de enzima

Las necesidades metablicas pueden requerir cambios en la actividad de
alguna enzima en particular. Una de las formas ms obvias en que esto puede
conseguirse es cambiando la concentracin de enzima. As, la necesidad de una
mayor actividad enzimtica encontrara respuesta a travs de una mayor velocidad
de sntesis de esa enzima. Esto puede ocurrir por procesos hormonales o estar
vinculados a la concentracin del sustrato o un metabolito relacionado con la
actividad de esta enzima. Del mismo modo, puede ocurrir que la necesidad sea
una disminucin de la actividad, en cuyo caso puede darse una baja en la
velocidad de sntesis. Otro mecanismo plausible es un incremento en la velocidad
de degradacin de la enzima (por protelisis).
A este tipo de regulacin se lo denomina grueso o grosero, para
diferenciarlo de la regulacin fina que se ver ms adelante.
Cualquiera sea el mecanismo, las principales caractersticas de lla regulacin a
travs de la variacin de la concentracin de enzima son:
a. Es un proceso costoso energticamente (hay que sintetizar de novo cidos
nucleicos y protenas, o bien destruir protenas que cost mucho sintetizar)
b. Es un proceso lento, puede tomar de horas a das
c. Es muy importante durante la adaptacin a nuevas condiciones ambientales
o durante cambios en el desarrollo (embriognesis, diferenciacin tisular)

Como ya se ha discutido la velocidad de una reaccin depende de la

cantidad de enzima presente. Muchas enzimas que catalizan puntos de regulacin
de una va metablica se hallan en concentraciones muy pequeas.
La velocidad de sntesis de estas enzimas puede ser aumentada o
reprimida mediante la accin de hormonas sobre los mecanismos que controlan la
expresin gnica. Por ejemplo, la insulina es una hormona anablica que induce la

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sntesis de glucoquinasa, fosfofructoquinasa, piruvato quinasa y glucgeno

sintetasa mientras que reprime la sntesis de varias enzimas gluconeognicas.
Tambin en muchos casos un sustrato determinado es capaz de regular la
sntesis de una enzima. Por ejemplo la glucosa es capaz de inhibir la sntesis de
piruvato carboxilasa, que es la enzima que cataliza la etapa limitante en la sntesis
de glucosa a partir de piruvato. Este es un ejemplo ms de la lgica del
metabolismo: no tendra sentido habiendo gran cantidad de glucosa sintetizar ms
a expensas de los aminocidos que son una posible fuente de piruvato.
En procariotes, los genes relacionados con el uso de un metabolito
particular se encuentran adyacentes entre s en el cromosoma, e incluyen
regiones del ADN que regulan la velocidad con que se transcriben estos genes en
respuesta a la disponibilidad de ese metabolito. A estos arreglos genmicos se los
denomina operones. Definimos entonces como concepto de opern a un conjunto
de genes, cuya funcin est relacionada, controlados por un nico promotor, y
cuya transcripcin da lugar a un nico mensajero que es policistrnico.
Un ejemplo clsico de control de la sntesis de enzima es el de la galactosidasa de Escherichia coli. Esta enzima cataliza la hidrlisis de lactosa para
convertirla en glucosa y fructosa, hexosas que pueden ser metabolizadas por
gluclisis. El gen de la -galactosidasa (Z) en E. coli. forma parte de un opern,
llamado lac, junto con otros dos genes: el de la -galactsido permeasa (Y) y el de
la -tiogalactsido transacetilasa (A). El opern lac posee adems de los genes
mencionados otros elementos: el promotor (zona reconocida por la ARN
polimerasa) y el que
codifica

para

la

sntesis

de

protena

represora

Esquema general de un opern

Operon

Figura 1a

una

Seales de terminacin

que se une al opern

e

impide

su

transcripcin.

En

presencia de lactosa

Gen 1
Gen
regulador

Gen
promotor

Gen
operador

Gen 2
Genes
estructurales

Gen 3

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en la clula, se produce alolactosa que se une al represor, lo inactiva y se

transcribe el ARNm (Figura 1).
(ver animacin en http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/zlacoperonanim.html,
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/majorsbiology/lacoperon.html)

Esquema general de un
opern tipo lac

Figura 1b
Represor
Polimerasa

Represor presente:
no hay transcripcin

Gen 1
Gen
regulador

Gen
promotor

Gen 3

Genes
estructurales

Gen
operador

Represor

Gen 2

Inductor

Polimerasa

Gen 1

ARN sintetizado
Polimerasa

Gen 2

Gen 3

El inductor se une
al represor y lo libera,
permitiendo la transcripcin

Gen 1

Gen 2

Gen 3

Regulacin fina de la actividad enzimtica

La regulacin de la actividad enzimtica a nivel de su sntesis es un proceso
a largo plazo. A lo largo del ciclo celular muchos metabolitos son sintetizados y
dejan de serlo en repetidas ocasiones dependiendo de las necesidades de ese
metabolito en cada ocasin. La adaptacin a necesidades inmediatas de cambios
en la velocidad metablica se da por medio de la regulacin fina de la actividad de
enzimas persistentes, sin modificacin de su concentracin. Este tipo de
regulacin se da mediante diversos mecanismos.

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Regulacin por metabolitos

La regulacin por metabolitos es un proceso reversible que puede
involucrar activacin o inhibicin. No es del tipo s o no, que anula completamente
una va activa o restaura la actividad de otra que tiene actividad nula.
Esencialmente todas las regulaciones de este tipo se dan sobre enzimas que
catalizan etapas irreversibles. Las molculas efectoras (activadores o inhibidores)
operan segun dos tipos de estrategias:
-

efectores que actuan sobre el sitio activo: en el caso de que se trate de un

inhibidor el mecanismo es de inhibicin competitiva

efectores que se unen a un sitio distinto del sitio activo: la unin de la

molcula efectora (estimulador o inhibidor) a un sitio diferente al de la
catlisis implica una modificacin en la estructura de la protena que implica
un cambio en su actividad enzimtica. Este mecanismo es el alosterismo
(discutido en sesiones anteriores)

Este tipo de regulacin permite grandes cambios en la actividad a pesar de que la

[S] no vare demasiado dentro de la clula (Figura 2).

120

Velocidad relativa (%)

100

Figura 2
Rango de la [S]
in vivo
+ activador

actividad sin efectores

80

60

+ inhibidor

40

20

[S]

Si bien la naturaleza de los metabolitos implicados en regular enzimas es

muy variada, es muy frecuente encontrar como efectores alostricos

a los

adenilatos (ATP, ADP y AMP). El uso de estos compuestos como efectores

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permite coordinar la velocidad de formacin de ATP con la de su uso. As, fue muy
til la introduccin del concepto de carga energtica, definida como:

CE =

[ATP ] + 0,5[ADP]
[ATP ] + [ADP] + [AMP]

Este cociente vara entre 0 y 1, si es 0 todo el adenilato est como AMP, si es 1

como ATP. La CE vara in vivo, adoptando valores entre 0,7 y 0,9. La Figura 3
muestra de que manera estn influenciadas las velocidades de las enzimas que
utilizan o consumen ATP por la CE. Debido a la accin de la adenilato kinasa (ATP

Figura 3

Velocidad
de la reaccin

Reacciones que
producen ATP

Reacciones que
consumen ATP

0,5
Carga energtica

1
CE promedio
de la clula = 0,86

+ AMP 2 ADP) y a que [ATP] > [ADP] >> [AMP], cualquier pequeo cambio en
las concentraciones de ATP o ADP resultarn en cambios relativamente grandes
en [AMP]. As, las enzimas que tienen al AMP como efector alostrico son
sensibles a pequeos cambiuos en la [ATP] o [ADP].

Inhibicin feed-back o retroinhibicin. Este tipo de regulacin de una determinada

va metablica se da cuando el producto final de una va principal o secundaria
inhibe una de las primeras enzimas del proceso. La retroinhibicin se puede dar
en caminos lineales como la gluclisis (inhibicin por ATP o citrato de la

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fosfofructoquinasa)

en

caminos

desoxirribonucletidos.

No

tiene

ramificados

sentido

como

mantener

la

la

sntesis

de

produccin

de

desoxirribonucletidos durante todo el ciclo celular: cuando cesa la replicacin,

aumenta la concentracin de los mismos y estos inhiben la ribonuclesido fosfato
reductasa.
En vas metablicas ramificadas se pueden encontrar diferentes variantes de este
tipo de inhibicin (ver Figura 4):
-

Retroinhibicin secuencial. Cada uno de los productos finales inhibe a la

primera enzima que conduce a su propia sntesis, pero no a la primera de la
va general, que es inhibida por el precursor comn a las ramas
metablicas. En la Figura 4, P inhibe a E4, Q inhibe a E5 solamente. Esto
causa acumulacin de D, que generalmente acta como inhibidor de E1.
Cada uno inhibe su propia sntesis. Este tipo de inhibicin se da en la
sntesis de nucletidos, y permite balancear la cantidad que se produce de
una y otra base.

Inhibicin concertada. Es una alternativa a la retroinhibicin secuencial. En

este caso P y Q inhiben a E1, pero deben estar juntos para ejercer su
efecto, por separado no son inhibidores. Se elimina la necesidad de regular
E1 indirectamente a travs de D.

Inhibicin cooperativa o sinrgica. En este caso P y Q inhiben a nivel de E1,

pueden hacerlo de forma independiente de la presencia del otro, pero
tienen un efecto mayor si estn juntos. Supongamos que 1 mM P produce
un 50% de inhibicin, y Q otro tanto. Si los dos estn juntos en una
concentracin de 1 mM cada uno, la actividad residual no va a ser del 25%
como cabra de esperar sino menor an. Podemos considerar que la
presencia de uno de los inhibidores potencia el efecto del otro, y viceversa.

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Inhibicin acumulativa (parcial). P y Q inhiben fuertemente su propia va (E4 y

E5), pero inhiben a E1 parcialmente, es decir que aunque estn en
concentraciones saturantes, no llevan la actividad a 0. As se previene que una
acumulacin excesiva de P o Q frene por completo la sntesis del otro
compuesto.
Figura 4
Retroinhibicin por producto
final en un camino lineal
E1

E2

E3

E4

Secuencial
E1

E2

E4

Concertada
E2

E4

E4
E2
C

Enzimas
E5
isofuncionales

Acumulativa
E2
B

E3

E1

D
E5

E3

D
E5

E1

E6
F

E3

E5
E

E4

E3
C

D
E5

Enzimologa - Regulacin

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Otra forma de regular este tipo de caminos metablicos es cuando existen

enzimas isofuncionales (isoenzimas) en el primer paso, es decir que la
obtencin de B puede darse a partir de dos enzimas diferentes. All uno de los
productos finales, digamos P, regula una de las enzimas, mientras que Q
regula la otra.

Regulacin por modificacin covalente

Muchas veces la actividad de una determinada enzima es regulada
mediante modificacin covalente reversible de la misma. Algunas de estas
enzimas pasan de una forma menos activa a otra ms activa unindose
covalentemente a un grupo qumico de pequeo tamao como el Pi o el AMP.
Tambin se da el caso inverso, en el que una enzima muy activa se desactiva al
liberar algn grupo qumico.

Fosforilacin
El caso ms tpico de modificacin covalente es el de fosforilacindefosforilacin.. Este tipo de reacciones son catalizadas por protena quinasas,
siendo ATP el dador de fosfato. Los residuos de aminocidos que pueden ser
fosforilados son: Ser, Thr, Tyr Lys y His. Por ejemplo la glucgeno fosforilasa ( la
enzima que libera unidades de glucosa del glucgeno ) es activada en un residuo
especfico de serina.
La fosforilacin puede tener distintos efectos sobre la actividad de una
enzima:

activacin

inhibicin

cambio en la sensibilidad a efectores

cambio en la estructura cuaternaria

La remocin de los grupos fosfato

especficas.

es catalizada por protena fosfatasas

Enzimologa - Regulacin

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Un ejemplo de modulacin de la activad enzimtica mediante fosforilacindefosforilacin es el de la fosforilasa:

fosforilasa b + 2 Pi

fosforilasa a + 2 H 2O

fosforilasa b + 2ATP

fosforilasa a + 2A DP

En general, en las enzimas de las vas degradativas del metabolismo, la forma

fosforilada es ms activa que la no fosforilada, mientras que en las vas
biosintticas ocurre lo contrario.

Adenilacin. Otro ejemplo de regulacin de la actividad enzimtica por

modificacin covalente es la adenilacin-desadenilacin. Este es el caso de la
glutamina sintetasa que se describe ms abajo.
Enzima + ATP Enzima-ADP + PPi

Interconversin disulfuro-ditiol. La interconversin de grupos ditioles (SH) de

cadenas laterales de cisterna en disulfuros (-S-S-) por oxidacin es un proceso de
enorme importancia en la regulacin enzimtica en plantas. Es necesaria la
existencia de al menos tres protenas: la ferredoxina, la tiorredoxina y la
tiorredoxina reductasa. En el caso de las enzimas del ciclo de Calvin y Benson, el
estado reducido de las enzimas blanco de este sistema tiene una Vmax unas 50
veces superior al estado oxidado.

Uridilacin-desuridilacin
La uridilacin-desuridilacin es otro mecanismo de regulacin presente en la
cascada de regulacin de la glutamina sintetasa. Las dos acividades: la de
uridilacin y la de hidrlisis son catalizadas por la misma cadena polipeptdica.
Enzima + UTP Enzima-UDP + PPi

Enzimologa - Regulacin

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Glutamina sintetasa
La regulacin de la glutamina sintetasa bacteriana (enzima que sintetiza glutamina
a partir de glutamato) es un ejemplo en el que varios mecanismos de control se
conjugan para lograr una regulacin extremadamente fina y coordinada de su
actividad.
Esta enzima es regulada acumulativamente por los metabolitos finales del
metabolismo de glutamina (la glutamina es la fuente de grupos amino de una serie

de compuestos) y por alanina y glicina. Cuando todos estos metabolitos estn

presentes la inhibicin es total.
Tambin la actividad de esta enzima se controla mediante modificacin qumica
reversible por adenilacin. Cuando est adenilada es menos activa, mientras que
es ms activa mientras est desadenilada. Tanto la adenilacin como la
desadenilacin estn catalizadas por la misma enzima: la adeniltransferasa
(ATasa). Esta enzima es capaz de catalizar un proceso o el inverso dependiendo
de su regulacin a travs de una protena P que puede existir en dos formas PA
(enlaza AMP) y PD (lo libera). La conversin de PA e PD es regulada a su vez por
uridilacin

Enzimologa - Regulacin

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La glutamina sintetasa tambin es regulada a nivel de la expresin gnica (es

decir a nivel de la cantidad absoluta de enzima).

Regulacin por protenas: Existen enzimas que son reguladas por protenas
estimuladoras o protenas inhibidoras. Un ejemplo tpico es el de la calmodulina
que es capaz de registrar los niveles intracelulares de calcio y activar un gran
nmero de enzimas cuando el nivel del catin aumenta dentro de la clula. Otro
caso conocido es el de la glucokinasa, que se asocia a una protena regulatoria
(GKRP) capaz de transmitir seales regulatorias por parte de metabolitos que se
unen a esta protena y no a la glucokinasa. La GKRP compite con la glucosa por la
unin a glucoquinasa, de modo que acta como un inhibidor competitivo con
respecto a la glucosa. La unin es promovida por fructosa-6-P. Como esta se
produce a partir de la Glc-6-P que la misma glucoquinasa genera, es similar a una
retroinhibicin, slo que es efectuada indirectamente a travs de la GKRP. Por
otra parte, la fructosa-1-P se une a la GKRP y hace que esta se despegue de la
glucoquinasa, por lo que incrementa la actividad de fosforilacin de glucosa. Estas
propiedades le permiten al hgado balancear la fosforilacin de glucosa con la de
fructosa luego de una ingesta de sacarosa.

Activacin proteoltica:
El mecanismo ms arriba mencionado implica la interconversin reversible
entre una forma activa y una inactiva de la enzima. La activacin proteoltica es en
cambio un mecanismo de activacin irreversible de formas enzimticas inactivas a
formas activas. Muchas enzimas se activan por hidrlisis de uno o ms pptidos
de un precursor inactivo llamado zimgeno o proenzima. Este mecanismo
regulatorio se da en enzimas digestivas como tripsina, quimotripsina y pepsina y
en enzimas que participan en el proceso de coagulacin de la sangre. Estas
protenas son inactivadas mediante la unin de inactivadores proteicos
especficos.

Enzimologa - Regulacin

14

Por ejemplo, el quimotripsingeno (24kD) da origen a la quimotripsina por

separacin de 2 dipptidos. Este precursor es una cadena de 245 aminocidos
que posee en su estructura dos puentes disulfuro intracatenarios. Su conversin a
alfa-quimotripsina se debe a la hidrlisis enzimtica de 4 enlaces peptdicos por
accin de la tripsina y quimotripsina consecutivamente:

122

201

136

245

S-S

S-S

QUIMOTRIPSINGENO
(inactivo)

Tripsina
Arg
1

245
S-S

S-S

Quimotripsina
2 pptidos

Leu

Ile

Tyr

Ala

146

149

S-S

245

S-S

La quimotripsina hidroliza enlaces peptdicos que contiene grupos carbonilo

de aminocidos aromticos. La pancreatitis, condicin dolorosa y a menudo fatal,
se caracteriza por la activacin prematura de proteasas secretadas por el
pncreas.
El tripsingeno (24kD), da origen a la tripsina por separacin de un
hexapptido del amino-terminal por accin de la enterocinasa. La tripsina hidroliza
enlaces en los que intervienen Arg y Lys.

Isoenzimas:
Algunas enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su funcin biolgica
es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se
traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se
adapta perfectamente a la funcin que debe realizar. As, podemos observar la
existencia de isoenzimas en funcin de:

Enzimologa - Regulacin

15

el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isozimas

distintas en msculo y corazn.
el compartimento celular donde acta: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa
del citoplasma es distinta de la de la mitocondria.
el momento concreto del desarrollo del individuo: Por ejemplo, algunas
enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.

Un ejemplo muy claro de la diferencia en regulacin que aportan diferentes

isoenzimas en distintos tejidos es el de la fosfofructoquinasa 2 (PFK2),
responsable de la formacin de Fructosa-2,6-P2 (Fru-2,6-P2), un potente activador
de la fosfofructoquinasa 1 (PFK1), enzima clave para la regulacin de la gluclisis.
La enzima de hgado es inactivada por fosforilacin luego de una seal hormonal,
reduciendo la cantidad de Fru-2,6-P2 y frenando as la gluclisis. La enzima de
msculo, bajo las mismas condiciones, es fosforilada en un sitio diferente
resultando activada, con lo que aumenta la cantidad de Fru-2,6-P2 y se activa la
PFK1 y por consiguiente la gluclisis. Ms an, la enzima de hgado es apenas
inhibida por glicerol-3-P, mientras que la contraparte muscular es fuertemente
inhibida por este metabolito. Esto permite que bajo el mismo escenario metablico
y

aprovechando

mismas

las
Figura 5

seales

hormonales,

tejidos

Hexoquinasa

100

diferentes empleen las

enzimas

tareas

para

opuestas

(gluconeognesis

en

hgado,

en

gluclisis

msculo).

Glucoquinasa

80

Velocidad relativa

mismas

v = 25 (50%)

60

Glicemia aumentada
por ingesta de H de C
v=75

40

Glicemia normal
v=50

20

Tambin en hgado
y

pncreas,

fosforilacin

de

la
la

glucosa se puede dar

0
0

10

[Glc] (mM)

15

20

Enzimologa - Regulacin

16

por dos isoenzimas, la hexoquinasa, de especificidad amplia (fosforila otras

hexosas adems de glucosa) y muy baja Km (~0,1 mM) o la glucoquinasa,
estrictamente especfica para glucosa y de Km ms alta (~5 mM). Adems, la
glucoquinasa tiene una Vmax aproximadamente 1,5 veces mayor que la
hexoquinasa. La lgica de la existencia de dos isoenzimas en hgado es que este
rgano debe hacer frente a cambios en la concentracin srica de glucosa
(glucemia) para mantenerla constante en alrededor de 5 mM. Como a esa
concentracin la hexoquinasa est completamente saturada, ante un incremento
importante en la glucemia como el que se da luego de una ingesta abundante de
hidratos de carbono su actividad no cambia. En cambio, la glucoquinasa s
responde incrementando su actividad en respuesta al aumento de su sustrato al
no estar saturada (un 50% ms de actividad, ver Figura 5). Esto permite al hgado
retirar rpidamente el excedente de glucosa de la circulacin. Como se observa en
la Figura, la actividad de la hexoquinasa no vara. A modo de ejercicio y a efectos
de comparar las diferencias cinticas, sugerimos calcular la variacin en velocidad
de la hexoquinasa entre 5 y 10 mM Glc, y de ambas entre 5 y 15 mM Glc,
considerando valores de Km de 0.1 y 5 mM y de Vmax de 100 y 150 U para la
hexoquinasa y la glucoquinasa, respectivamente, con cinticas hiperblicas en
ambos casos.