Addis Counting

I Mestrado Anlises Clnicas
INTRODUO
A actividade profissional decorreu no Laboratrio de Anlises Clnicas (LAC)

Maria Celeste Formosinho Fernandes, com sede na Rua Egas Moniz, Lisboa.
Este LAC possui um corpo tcnico qualificado para executar as valncias de

Imunologia, Endocrinologia, Bioqumica, Hematologia e Microbiologia, constitudo
pelo Director Tcnico, especialista em Anlises Clnicas pela Ordem dos
Farmacuticos, trs especialistas em Anlises Clnicas, tcnicos de anlises clnicas,
auxiliares de laboratrio, assistentes de consultrio e de limpeza.
Os servios encontram-se completamente informatizados, possuindo uma rede

de computadores com terminais ligados directamente aos aparelhos, o que permite a
informatizao dos servios desde a abertura de fichas at emisso de boletins,
passando pelo envio directo dos pedidos e retorno dos respectivos resultados para a
ficha do utente. Softlab foi o programa informtico escolhido pelo laboratrio.
O laboratrio encontra-se apetrechado com moderno equipamento automatizado.

As metodologias a aplicar so escolhidas em funo do desempenho pretendido, de
forma apropriada s condies do laboratrio, e de acordo com o equipamento e
reagentes.
O funcionamento passa pelo atendimento dos utentes com a organizao do

dossier do utente, por via informtica. Procede-se recolha dos produtos biolgicos,
segundo as regras exigidas para o efeito, e de acordo com o tipo de anlises solicitadas.
Os equipamentos so preparados diariamente, no que respeita a reagentes,
calibradores e controle, segundo as recomendaes do fabricante para cada tipo de
aparelho. As anlises, na sua grande maioria, so realizadas em equipamentos
automatizados, os resultados so validados pelos especialistas e/ou tcnico superior.
O LAC adoptou um Sistema de Gesto da Qualidade, so aplicados e cumpridos

os requisitos da Norma NP EN ISO 9001:2000, das Normas para o Laboratrio Clnico
da Ordem dos Farmacuticos e do Manual de Boas Prticas Laboratoriais.
Joana Selada Domingues
-1-

TCNICAS / EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
BIOQUIMICA
Equipamento
Tcnica Manual
Parmetro
Clculo Urinrio/Renal
Contagem de Addis
Espermograma
Grau de Digesto das Fezes
Pesquisa de Drogas de Abuso - Canabinides,
Herona, Morfina, Opiceos
Pesquisa de Protenas de Bence Jones
Pesquisa de Protenas na Urina
Pesquisa de Sangue Oculto nas Fezes
Sedimento Urinrio
Microtech 672
Electroforese de Protenas
Modular Analytics SWA
cido Flico
cido rico
Albumina
-Amilase
Alanina-aminotransferase - ALT/GPT
Aspartato-aminotransferse - GOT/AST
Bilirrubina Directa
Bilirrubina Total
Clcio
Colesterol
Creatinafosfoquinase - CPK e CPK-MB
Creatinina
Desidrogenase lctica - LDH
Fosfatase cida
Fosfatase Alcalina - ALP
Fosfatase cida No Prosttica
Ferritina
Ferro
Fsforo
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Gama-Glutamiltransferase - GGT
Glucose
Hemoglobina glicosilada
Imunoglobulinas
Insulina
Ionograma - Potssio, Sdio, Cloro
Lipoprotenas de alta densidade - HDL
Lipoprotenas de baixa densidade LDL
Lipoprotenas de muito baixa densidade VLDL, Lpidos totais
Magnsio
Paratormona PTH
Protenas totais
Transferrina
Triglicridos
Ureia
Vitamina B12
Urisys 2400
Urina tipo II
1. CLCULO URINRIO
Colorimtrico
1.1. Fundamento do mtodo
Determinao semi-quantitativa dos componentes mais importantes do clculo

urinrio: clcio, oxalato, fosfato, magnsio, amnia, cido rico e cistina.
O mtodo tritimtrico usado para o clcio e o mtodo colorimtrico para os
restantes componentes.
Clcio: a determinao titrimtrica com soluo titriplex (sal dissdico do cido

etilenodinitrotetractico) sendo usado o cido calconcarboxilico como indicador.
Oxalato: o complexo corado formado pelo ferro (III) e cido sulfosalicilico
descolorado pelo oxalato.
-3-

Amnio: com a adio do reagente de Nessler (tetraiodomercurato de potssio),
o amnio d origem a uma soluo amarela acastanhada.
Fosfato: o cido fosfomolibdico formado pela adio de molibdato de amnio
reduzido a molibdnio azul pela aco de agentes redutores. (disulfito de sdio, sulfato
4-metilaminofenol)
Magnsio: em meio tamponado o magnsio reage com um reagente corado (1azo-2-hidroxi-3-(2,4-dimetil-carboxanilido)-naftaleno-1-(2-hidroxibenzeno-5-sodio
sulfonato) para formar um complexo vermelho.
cido rico: em meio tamponado o cido molibdatofosfrico reduzido pelo
cido rico formando azul de molibdnio
Cistina: a cistina reduzida a cistena pelo sulfito de sdio. Em meio alcalino a
cistena origina uma colorao vermelha na presena de nitroprussiato de sdio.
Os componentes determinados encontram-se na forma dos seguintes elementos,

nos quais os clculos so baseados: Oxalato de clcio (CaC2O4.H2O), fosfato de
magnsio e amnio (MgNH4PO4.6H2O), hidrogeno fosfato de clcio (CaHPO4.2H2O),
fosfato triclcico (Ca10(PO4)8(OH)2), urato de amnio, cido rico e cistina. (bula
Merckognostics)
2. CONTAGEM DE ADDIS
Contagem em Cmara
A contagem de Addis uma medida quantitativa da excreo de eritrcitos,

leuccitos e cilindros na urina colhida perodo de 12 horas. A excreo de protenas e a
densidade da amostra tambm so determinadas. Permite a monitorizao doena renal.
Medir o volume da amostra de urina de 12 horas. Homogeneizar e medir 10ml.

Centrifugar, rejeitando o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1ml de soro
fisiolgico. Homogeneizar e encher a cmara de contagem. Contar isoladamente as
hemcias, leuccitos e cilindros nos 9 quadrados de 1mm.
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N= S/V n V/10
= n de cada elemento no volume total
= vol. cm3 da suspenso soro fisiolgico (1 cm3)
= vol. cm3 onde foi feita a contagem (0.0009 cm3)
= volume total de urina
= n cilindros (pequena ampliao), n hemcias (grande ampliao),

n leuccitos (grande ampliao)
3. ESPERMOGRAMA
Amostra:esperma colhido at 30 min antes. Abstinncia de 3-4 dias.

Avaliao dos seguintes parmetros fsicos e exame microscpico:
- pH: avaliao do pH com papel indicador;
- Tempo de liquefaco: tempo de passagem de gel a lquido aps colheita;
- Viscosidade: 30 minutos aps a colheita avaliar a viscosidade; homogeneizar a
amostra, com uma pipeta Pasteur tomar uma alquota e deixar cair
espontaneamente; se a queda ocorrer gota a gota a viscosidade normal;
- Exame microscpico directo: assinalar a presena de espermatozides,
aglutinao,
clulas
epiteliais,
leuccitos,
eritrcitos,
clulas
de
espermatognese, cristais de fosfato de espermina, muco e Trichomonas.

Quando no se observam espermatozides, centrifuga-se todo o volume
ejaculado, despreza-se o sobrenadante e observa-se o sedimento ao microscpio;
- Mobilidade: realizar um exame a fresco entre lmina e lamela aquecidas a
37C, observar vrios campos com a objectiva de 40 contando pelo menos 200
espermatozides; avaliar o movimento classificando em rectilneo rpido, lento,
in situ ou imveis;
- Vitalidade: os espermatozides mortos so permeveis eosina enquanto os
vivos permanecem incolores; misturar uma gota de esperma com uma gota de
Giemsa a 10%, deixar em contacto 20 segundos, fazer o esfregao e observar ao
microscpio.
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- Morfologia: observar no exame microscpico os espermatozides normais ou
anormais (alteraes da cabea, do colo, da cauda ou alteraes mistas);
- Contagem em cmara: clculo do nmero de espermatozdes/mL = n
espermatozides contados 100.000.
4. GRAU DE DIGESTO DAS FEZES
Exame macroscpico, microscpico, caracteres fsicos
Para este exame o utente deve submeter-se a um regime alimentar em que

entrem hidratos de carbono, gorduras e protenas.
O estudo do grau de digesto das fezes permite apreciar o estado da funo

digestiva e rapidez do trnsito intestinal.
As fezes devero ser avaliadas em relao aos caracteres fsicos: consistncia,
forma, cheiro, cor e reaco (pH).
No exame macroscpico dever ser realizada a pesquisa de elementos anormais:
muco, sangue, ps, parasitas, fibras musculares, gordura, detritos vegetais
Para o exame microscpico, depois das fezes bem homogeneizadas, preparar
uma soluo com soro fisiolgico. Fazer trs preparaes, uma s com soro fisiolgico
e fezes, outra com lugol e fezes e a terceira com sudam III e fezes. Proceder ao
reconhecimento dos seguintes elementos:
-
Resduos alimentares de origem animal (fibras musculares, gorduras)
Resduos alimentares de origem vegetal (amido, cristais, celulose digestvel e

no digestvel)
Substncias de origem intestinal (muco, leuccitos, hemcias e clulas epiteliais)
5. PESQUISA DE DROGAS DE ABUSO
Imunocromatografia

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Amostra: Urina colhida no laboratrio.
Imunoensaio cromatogrfico baseado no princpio de vnculos competitivos. As
drogas que podem estar presentes na urina competem com a droga conjugada para
formar pontes com o anticorpo.
Durante o teste, a amostra de urina migra por aco capilar, se a droga no
estiver presente na amostra, no ocorrer a saturao das pontes do anticorpo. As
partculas revestidas de anticorpo sero capturadas por conjugado da droga imobilizado
e uma linha colorida visvel aparecer na regio da linha teste. Se a droga estiver
presente na amostra, no se formar uma linha visvel, pois ocorrer uma saturao de
todas as pontes de anticorpo anti-droga.
6. PESQUISA DE PROTENAS DE BENCE JONES
Turbidimetria
As protenas de Bence Jones so protenas anormais que apresentam

precipitao a 40-60C, redissolvendo-se a temperaturas de 100C.
Aparecem com grande frequncia em pacientes com mieloma mltiplo, podendo
surgir tambm em processos neoplsicos do osso, leucemias e nefrite crnica.
Centrifugar a amostra de urina de 24 horas. Em tubo de ensaio colocar cerca de

4ml de urina e 1ml do tampo de acetato e misturar. O pH final dever ser de 5.
Colocar em banho-maria a 56C durante 15 minutos. Um precipitado indica a
presena de protenas Bence Jones.
Caso haja turvao ou precipitao, aquecer o tubo em banho de gua fervente
por 3 minutos e observar a diminuio da turvao. A protena Bence Jones redissolverse- a 100C.
Um aumento da turvao ou precipitao ao ferver indicar a presena de
albumina e globulina, que ir mascarar o resultado. Neste caso, filtrar o contedo do
tubo imediatamente aps retir-lo do banho fervente e observar o filtrado. Se for claro e
se tornar turvo medida que arrefece e voltar a ficar claro quando retorna temperatura
ambiente a prova positiva para a protena de Bence Jones.
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7. PESQUISA DE PROTENAS NA URINA
Turbidimetria
Proteinria definida como o aumento da quantidade de protenas na urina.

Apenas uma pequena parte das protenas est presente na urina (20 a 150mg/dia), sendo
a maioria albumina. O restante consiste, na quase totalidade, na proteina TammHorsfall, provavelmente secretada pelos tubulos distais. O aumento da permeabilidade
da membrana glomerular tem como primeiro sinal o aumento da albuminria. A perda
de selectividade demonstrada pelo aparecimento na urina de protenas de elevado peso
molecular. A diminuio da reabsoro tubular sugerida pelo aumento da
concentrao de protenas de baixo peso molecular na urina. (1)
A pesquisa protenas realizada pela adio de cido sulfossalicilico amostra

de urina. Em caso positivo haver turvao proporcional quantidade de protenas Esta
tcnica baseia-se no princpio da desnaturao proteica com formao de metaprotenas.
Se o resultado da pesquisa anterior for positivo dever proceder-se ao

doseamento da protena. O reagente de Esbach, formado por cido picrico e cido
citrico, utilizado para este doseamento. Atravs de um albuminmetro, onde se junta a
urina acidificada e o reagente de Esbach, mede-se a altura do densimetro na escala em
g%0.
8. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES

Imunocromatografia
As causas mais comuns de sangue oculto nas fezes so a lcera pptica, a

gastrite erosiva, o carcinoma gstrico, o carcinoma e plipos adenomatosos do clon.
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A membrana encontra-se coberta com anticorpo anti-hemoglobina na regio da
linha teste. Durante o teste a amostra reage com a partcula coberta com anticorpo antihemoglobina. A mistura migra por cima da membrana por aco capilar para reagir com
o anticorpo anti-hemoglobina, originando uma linha colorida. A presena da linha
colorida indica um resulta positivo, enquanto a sua ausncia indica um resultado
negativo.
9. MICROTECH 672 PC (DENSITOMETRIA)

O Microtech 672 PC (figura 1) um sistema completamente automatizado,
concebido para a anlise electrofortica de rotina. Realiza todos os passos necessrios
para a separao electrofortica de seroprotenas, lipoprotenas e hemoglobina, em
pequenas tiras suportadas de acetato de celulose, recorrendo leitura densitomtrica das
amostras e padres.
Amostra: Soro
A anlise do padro electrofortico das protenas pode elucidar acerca de vrias
situaes patolgicas, como sejam, o pico gama monoclonal e policlonal, a ponte do
cirrtico, perfil de inflamao, entre outras. A razo albumina/globulina tambm poder
alertar para a possibilidade de determinadas alteraes devidas a inflamao, cirrose
heptica, glomerulonefrite e sndrome nefrtico.
O termo electroforese refere-se migrao de partculas com carga num meio

lquido sobre a influncia de um campo elctrico.
A tcnica de electroforese separa as protenas sricas com base na premissa de
que as espcies proteicas tm diferentes mobilidades quando sujeitas a um campo
elctrico. Cada molcula possui uma carga elctrica devido presena de grupos
carregados positiva e negativamente. A carga total dita as caractersticas de migrao
das espcies a um dado pH. (1)
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Figura 1
A electroforese de zona em acetato de celulose ocorre em vrias etapas:

aplicao das amostras (soro), migrao, colorao, descolorao, diafanizao,
secagem e leitura pela luz de digitalizao. As protenas so separadas a um pH alcalino
(8,9) utilizando o princpio de electroforese de zona em suporte adequado, acetato de
celulose. O tampo confere carga negativa s protenas e determina a passagem de
corrente. Esta primeira fase, separativa, consiste na migrao das protenas no sentido
ctodo nodo a diferentes velocidades, quando sujeitas a um campo elctrico. A
mobilidade da albumina superior da globulina alfa 1, seguindo-se a alfa 2, beta e
finalmente a fraco gama, permitindo assim separar as vrias fraces. Quando a
migrao est completa, as protenas so ento sujeitas a um processo de colorao com
Vermelho S de Ponceau. O corante, Ponceau S, cora as fraces proteicas de vermelho,
tendo igual afinidade para todas as fraces. A colorao s possvel em meio
fortemente cido. Os banhos com descolorante permitem a descolorao de tudo o que
no seja protenas. A tira ento sujeita a uma leitura por densitometria e os resultados
apresentados graficamente. Os resultados so obtidos em percentagem, percentagem
essa que em funo da rea corada e da intensidade da cor.
10. MODULAR ANALYTICS SWA (FOTOMETRIA/EQL/ISE)

O Modular Analytics SWA (figura 2) um sistema completamente
automatizado, controlado por software e destinado a anlises de bioqumica e
imunoensaios. Foi concebido para determinaes quantitativas e qualitativas in vitro
usando uma ampla variedade de testes para anlise.
- 10 -
Figura 2
O sistema descrito constitudo por 5 unidades hardware: uma unidade de

controlo, uma unidade central (core), um mdulo ISE, um mdulo P e um mdulo E.
Efectua anlises fotomtricas no mdulo P, anlises de electroquimioluminiscncia no
mdulo E e testes selectivos para ies no mdulo ISE.
A unidade core transporta as amostras atravs de cada mdulo analtico,
possuindo um leitor de cdigos de barra da amostra e permitindo a utilizao de
diversos tipos de tubos de amostra, primrios ou secundrios, com diferentes alturas e
volumes. Apresenta uma rea de entrada para amostras de urgncia., com prioridade na
pipetagem.
O mdulo ISE (figura 3) confere ao sistema um mtodo electrnico, por

potenciometria indirecta, para analisar amostras de sdio, potssio e cloro. Os principais
componentes consistem em trs cartuchos de medio, um elctrodo de referncia, trs
pipetadores, um poo de diluio e uma unidade de desgaseificao. Pode processar at
900 testes por hora.
- 11 -
Figura 3
O mdulo P (figura 4) proporciona ao sistema um mtodo fotomtrico, capaz de

analisar at 800 testes in vitro por hora. Os principais componentes so o sistema de
pipetagem, o sistema de reagentes, o sistema do disco de reaco e a rea das teclas de
funo. O sistema de medio fotomtrica possui uma lmpada de halognio tungstnio,
como fonte de luz, e um espectrofotmetro de comprimento de onda mltiplo. Quanto
s caractersticas deste sistema, tem capacidade para reagentes com cdigos de barra,
armazenamento refrigerado para 90 frascos de reagente, 160 cuvetes de reaco semidescartveis, funes de manuteno automatizadas, notificao de calibrao
automtica, qumicas de parmetro de ponto final, cintica e isoenzima, branco de
amostra automtico, qumicas no lineares (logit-log de trs, quatro e cinco parmetros).
Figura 4
- 12 -

O mdulo E (figura 5) um sistema de imunoensaio multi-teste com acesso
aleatrio e com capacidade para 170 testes por hora. Os principais componentes
consistem nas reas de reagente, medio, consumveis e preclean. Apresenta
capacidade para reagentes com cdigos de barra, armazenamento regulado por
temperatura para 25 embalagens de reagente, 1008 cuvetes e pontas de ensaio
descartveis, funes de manuteno automatizadas, assim como notificao de
calibrao automtica.
Figura 5
Os principais benefcios que este equipamento apresenta devem-se juno da
qumica clnica e imunologia num s aparelho; optimizao do fluxo de amostras,
com transporte prioritrio de emergncia; ao fluxo flexvel de informao; solues
flexveis com actualizao possvel, sistema back up, mascara de mdulos.
Com a reduo de manipulao por parte do operador h uma reduo efectiva
da probabilidade de erros no laboratrio e um aumento de segurana.
O facto de poder ter todos os reagentes a bordo refrigerados evita a manipulao
e aumenta a estabilidade dos mesmos, o que melhora a reprodutibilidade dos resultados.
10.1 ELECTROQUIMIOLUMINISCNCIA (EQL) / MODULO E
10.1.1 Fundamento do mtodo
EQL um processo no qual espcies altamente reactivas so geradas a partir de

precursores estveis na superfcie de um elctrodo, reagindo depois umas com as outras
- 13 -

levando produo de luz. A EQL baseia-se no uso de um complexo de rutnio e
tripropilamina, sendo o produto final quimioluminiscente.
As reaces de quimioluminiscncia que levam emisso de luz a partir do
complexo de rutnio so iniciadas electricamente, aplicando voltagem aos complexos de
rutnio que so ligados a micropartculas revestidas com estreptavidina.
10.1.1 a) cido Flico/Vitamina B12

O cido flico intervm em muitas reaces metablicas como transportador de
grupos carbono. A deficincia em cido flico pode ocorrer por m absoro intestinal,
ingesto insuficiente, aumento das necessidades (gravidez, doena maligna) ou por
interferncia de outros frmacos (metotrexato, por exemplo). A vitamina B12 est
envolvida na maturao dos eritrcitos e no metabolismo geral das clulas somticas. A
deficincia em vitamina B12 pode estar associada falta de factor intrnseco, pode ser
secundria a patologias gastro-intestinais (gastrectomia, inflamao, etc.). (1)
O mtodo para a determinao do cido flico e vitamina B12 baseia-se no

princpio da competio.
A amostra (soro para o cido flico; soro ou plasma para a vitamina B12)
incubada com os reagentes de pr-tratamento. Uma nova incubao da amostra com a
protena de fixao do folato/factor intrnseco marcada com rutnio, forma um
complexo de folato/vitamina B12, cuja quantidade depende da concentrao do analito
na amostra. Aps a incorporao das microparticulas revestidas de estreptavidina e de
folato/vitamina B12 marcado com biotina, os locais no ocupados da protena de fixao
do folato/ factor intrnseco marcado com rutnio so ocupados, formando-se um
complexo entre a protena de fixao do folato/ factor intrnseco marcada com rutnio e
o folato /vitB12-biotinilado. O complexo formado liga-se fase slida pela interaco da
biotina e da estreptavidina. A mistura da reaco aspirada para a clula de leitura,
onde as micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do electrodo. Os
elementos no ligados so removidos. A aplicao de uma corrente elctrica ao
elctrodo
induz
uma
emisso
quimioluminiscente
que
medida
por
um
fotomultiplicador.
10.1.1 b) Ferritina/Paratormona (PTH) /Insulina
- 14 -

A ferritina consiste no complexo ferro-apoferritina, o qual uma das formas
principais de armazenamento de ferro no organismo. A paratormona uma hormona
peptdica que estimula os osteoclastos a aumentar os nveis de clcio no sangue. A
determinao da paratormona til no diagnstico diferencial de hipo e hipercalcmia,
em doentes com insuficincia renal e na avaliao da funo da paratiroide em
desordens do metabolismo sseo e mineral. A insulina uma hormona proteica que
diminui as concentraes sricas de glucose. A principal aplicao clnica do
doseamento da insulina a avaliao de indivduos com diabetes mellitus que requerem
tratamento com insulina. (1)
O doseamento da ferritina, PTH e insulina recorre tcnica de sandwich.

A amostra (soro ou plasma), um anticorpo monoclonado biotinilado especfico
anti-ferritina/PTH/insulina
um
anticorpo
monoclonal
especfico
anti-
ferritina/PTH/insulina marcado com o complexo de rutnio reagem entre si e formam

um complexo sandwich. Aps a incorporao das micropartculas revestidas de
estreptavidina, o complexo formado liga-se fase slida pela interaco da biotina e da
estreptavidina. A mistura da reaco aspirada para a clula de leitura, onde as
micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do elctrodo. Os elementos
no ligados so removidos. A aplicao de uma corrente elctrica ao elctrodo induz
uma emisso quimioluminiscente que medida por um fotomultiplicador.
10.2 IMUNOENSAIO DE INIBIO TURBIDIMTRICA/MODULO

10.2.1. Fundamento do mtodo
A hemoglobina glicosilada consiste numa molcula de hemoglobina ligada a um resduo

de acar, permitindo realizar um controlo da glicmia a longo termo. (1)
Este mtodo utiliza brometo de tetradeciltrimetilamnio (TTAB) como detergente no
reagente hemolisante para eliminar a interferncia dos leuccitos, uma vez que o TTAB
no faz a lise dos leuccitos. Todas as variantes de hemoglobina que so glicadas no
terminal N da cadeia e que apresentam regies reconhecveis por anticorpos idnticas
s da HbA1c so determinadas com este ensaio. Assim, ao contrrio do que acontece
com os mtodos cromatogrficos, o estado metablico dos doentes diabticos que
apresentem hemoglobinopatias ou uremia pode ser determinado com o presente ensaio.
- 15 -

A glicohemoglobina (HbA1c) da amostra (sangue total) reage com o anticorpo
anti-HbA1c e forma complexos antignio-anticorpo solveis. Os polihaptenos reagem
com o excesso de anticorpos anti-HbA1c, formando um complexo anticorpopolihapteno insolvel que pode ser determinado turbidimetricamente.
A concentrao de hemoglobina determinada num segundo canal. A

hemoglobina libertada na amostra hemolisada convertida num derivado que tem um
espectro de absoro caracterstico que medido bicromaticamente.
10.3 IMUNOTURBIDIMETRIA/MODULO P
O uso de anticorpos especficos para quantificao das protenas sricas tornouse uma valiosa ferramenta de diagnstico. As propriedades de disperso da luz dos
agregados de antignio-anticorpo foram observadas pela primeira vez por Pope e
Healey, em 1938. Ritchie utilizou leituras turbidimtricas para quantificar protenas
especficas. Lizana e Hellsing descreveram a intensificao da polimerizao com
polietilenoglicol (PEG) para melhorar a sensibilidade e aumentar a taxa de formao do
complexo Ag-Ac, permitindo a rpida progresso da reaco at ao fim e reduzindo o
risco de falsos negativos em amostras que contenham antignio em excesso. (bula
Roche)
Concentraes elevadas de antignio podem originar o efeito de hook, do qual
resultam falsas concentraes baixas. (1)
10.3.1 a) Albumina
A albumina tem como funo principal manter a presso osmtica nos espaos
intra e extravascular. Nveis elevados ocorrem em desidratao aguda, enquanto a
diminuio dos seus nveis ocorre em situaes variadas como inflamao, doena
heptica, perda urinria, perda gastrointestinal, ascite e edema. (1)
O aumento de excreo urinria de albumina (microalbuminria) precede e
altamente preditivo de nefropatia diabtica. (1)
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Os anticorpos anti-albumina reagem com o antignio na amostra (soro, plasma
ou urina) e formam complexos antignio-anticorpo. Estes, aps a aglutinao, so
determinados por turbidimetria.
10.3.1. b) Imunoglobulinas
Alteraes nos valores das imunoglobulinas podem ocorrer por infeces
crnicas, infeces por parasitas, doenas autoimunes ou doenas hepticas. O aumento
monoclonal pode dever-se a proliferao maligna ou benigna de um nico clone. A
deficincia em imunoglobulinas est associada a linfomas, mielomas, sndrome
nefrtico, enteropatia, queimaduras, entre outras causas. (1)
Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao

quantitativa de imunoglobulinas. Os anticorpos anti-Ig A, G ou M reagem com o
antignio na amostra (soro ou plasma) e formam um complexo Ag-Ac. Aps a
aglutinao, a determinao feita por turbidimetria.
Podem ocorrer resultados falsamente baixos devido a um excesso de antignio
(efeito zona). Estes antignios bloqueiam o anticorpo impedindo a formao do
complexo Ag-Ac. Esta situao pode ser detectada aps diluio apropriada da amostra.
As
chamadas
paraprotenas
secretadas
nas
gamopatias
monoclonais
(imunoglobulinmia monoclonal) podem diferir das respectivas imunoglobulinas de

origem policlonal, na composio e tamanho dos seus aminocidos. Tambm neste
caso, a ligao ao anticorpo pode ser prejudicada. Assim, as amostras de soro de
pacientes com um diagnstico clnico incerto devem ser sujeitas a uma electroforese de
protenas para identificar um eventual excesso de antignio ou gamopatia monoclonal.
10.3.1 c) Transferrina
A avaliao dos nveis plasmticos de transferrina til no diagnstico
diferencial da anemia e monitorizao do tratamento da anemia ferropnica. (1)
O doseamento da transferrina baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica.
Os anticorpos anti-transferrina reagem com o antignio na amostra (soro ou plasma) e
formam um complexo antignio-anticorpo. Aps a aglutinao, a determinao feita
por turbidimetria. A adio de PEG permite a progresso rpida da reaco at ao fim e
aumenta a sensibilidade.
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Antignio transferrina + anticorpo anti-transferrina complexo antignio-anticorpo
10.4 POTENCIOMETRIA/MODULO ISE
A potenciometria a medio da diferena de potencial entre dois elctrodos

numa clula electroqumica. Um elctrodo consiste num condutor metlico em contacto
com uma soluo electroltica. (1)
Os elctrodos selectivos so sensores com capacidade para medir directamente
fluidos biolgicos. Os elctrodos selectivos de ies medem sdio, potssio e cloro
(amostra de soro).
O potencial de cada elctrodo medido relativamente a um elctrodo de
voltagem estvel fixa por cloreto de prata, o elctrodo de referncia. Um elctrodo
selectivo de io desenvolve uma voltagem que varia com a concentrao do io ao qual
responde. A relao entre a voltagem desenvolvida e a concentrao do io detectado
logaritmica, sendo expressa pela equao de Nernst.
10.5 TESTE COLORIMTRICO
Nas anlises colorimtricas, pela comparao da cor de uma amostra com a de

um padro, em circunstncias adequadas, podemos saber a concentrao de uma dada
substncia na amostra. (2)
A espectrofotometria consiste na medio da intensidade luminosa da luz a um

comprimento de onda seleccionado, designando-se de espectrofotometros os
equipamentos que seleccionam o comprimento de onda desejado. Os testes
colorimtricos baseiam-se na medio das variaes de absoro na zona visvel (entre
400 e 700 nm). (1)
10.5.1 a) Bilirrubina Directa
- 18 -

A bilirrubina resulta do catabolismo do heme. O aumento de bilirrubina d
origem a ictercia, a qual pode ter diferentes causas como hemlise, doena
hepatocelular, obstruo intra ou extraheptica, hereditrias e fisiolgicas (neonatal). (1)
O doseamento qumico o mais comum na determinao da bilirrubina, sendo

utilizado o cido sulfanlicodiazotado o qual consiste em cido sulfanlico e nitrato de
sdio, diazoreagente.
Depois da introduo do mtodo diazo para a determinao da bilirrubina por
Ehrlich, em 1883, foram propostas vrias modificaes com o objectivo de melhorar a
reaco. Em 1938, Jendrassik e Grof apresentaram um teste que produziu resultados
fiveis. As vantagens deste mtodo so a maior preciso e a interferncia reduzida por
pigmentos.
O cido sulfanlico diazotado, produzido a partir da reaco do nitrito de sdio
acidificado com cido sulfanlico, reage com a bilirrubina da amostra (soro ou plasma)
para formar azobilirrubina. No ensaio da bilirrubina directa, apenas a bilirrubina
conjugada reage com o cido sulfanlico diazotado. A intensidade da cor vermelha do
corante azo formado directamente proporcional concentrao de bilirrubina directa
(conjugada) e pode ser determinada fotometricamente.
Bilirrubina + io diaznio azobilirrubina.
Os problemas que podem surgir na determinao da bilirrubina esto associadas

sua fotosensibilidade, que aumenta com a temperatura, uma vez que a luz cinde pontes
de hidrognio tornando-a mais solvel. A hemoglobina um interferente negativo, deve
sempre rejeitar-se a amostra hemolisada.
10.5.1 b) Bilirrubina total

A determinao da bilirrubina total baseia-se no mtodo desenvolvido por
Wahlefeld et al., no qual utilizado um detergente para acelerar a reaco e prevenir a
precipitao da protena. O reagente diazo utilizado o 2,5-diclorofenil diaznio
tetrafluoroborato (DPD) que, em condies de acidez, se liga muito rapidamente
bilirrubina da amostra (soro ou plasma) e forma azobilirrubina. A intensidade da cor da
azobilirrubina produzida proporcional concentrao de bilirrubina total e pode ser
- 19 -

medida fotometricamente. O procedimento simples e correlaciona-se bem com o
mtodo de Jendrassik-Grof.
10.5.1 c) Clcio
Certas patologias podem estar associadas ao aumento ou diminuio nas
concentraes de clcio no sangue. Algumas causas comuns de hipocalcmia so a
insuficincia renal crnica, hipoparatiroidosmo, osteomalcia e hemorragia aguda. A
hipercalcmia pode estar associada a doenas malignas, alteraes da tiride e
hiperparatiroidismo. (1) (3)
A determinao do clcio baseia-se na reaco deste com a complexona de ocresolftalena em soluo alcalina. A intensidade da cor do complexo prpura formado
directamente proporcional concentrao de clcio da amostra (soro, plasma ou urina) e
medida fotometricamente.
10.5.1 d) Creatinina
A creatinina produzida a nvel endgeno e libertada a velocidade constante,
sendo os nveis plasmticos mantidos em limites estreitos. A sua clearence renal um
indicador de taxa de filtrao glomerular. (1)
O mtodo de Jaff Compensado baseia-se na reaco de Jaff descrita por

Popper et al, em 1886, e modificada por Bartels. Esta verso modificada tem uma
sensibilidade mais elevada e melhor preciso do que o mtodo Jaff original. a
reaco mais usada para dosear a creatinina.
Em soluo alcalina, a creatinina da amostra (soro, plasma ou urina) forma um
complexo amarelo-laranja com picrato, o complexo de Janovski. A intensidade da cor
directamente proporcional concentrao de creatinina e pode ser medida
fotometricamente. Nos ensaios em que utilizado o branco de amostra cintico, a
interferncia da bilirrubina minimizada. O complexo de cor vermelha medido entre
500 e 520nm. O io picrato absorve significativamente a inferior a 500 nm, logo a
leitura do complexo deve ser a superior a 500 nm.
A desvantagem do mtodo Jaff devem-se s numerosas interferncias que
podero ocorrer, desde a temperatura, uma vez que a altas temperaturas (> 30C) a
glucose, cido rico e cido ascrbico reagem com o picrato, originando uma
- 20 -

interferncia positiva. Exige uma amostra livre de protenas, j que os grupos cetometil
e cetometileno reagem com o picrato alcalino originando compostos altamente corados.
Tambm podero ocorrer interferncias negativas, por oxidao de certos compostos na
presena de bases fortes, formando-se produtos de degradao, bilirrubina e
hemoglobina, que causam a interferncia. (1)
Vrias tcnicas tm sido propostas no sentido de retirar interferentes, tendo

como objectivo o aumento da especificidade. Uma dessas tcnicas o mtodo de Jaff
cintico que se baseia no facto de certas substncias interferentes reduzirem lentamente
o picramato alcalino, como glucose, cido ascrbico e cido rico, enquanto outras
reagem mais prontamente, como cetoacidos (acetoacetato), piruvato, protenas e
cefalosporinas. Assim, executa-se um mtodo espectrofotomtrico a 2 tempos (ensaio
colorimtrico cintico): no primeiro tempo (20 seg.), temos interferentes que reagem
rapidamente; no segundo tempo (80 seg.), reage tudo excepto os interferentes que
reagem lentamente, depois dos 80 seg. (protenas e outros interferentes).
2 tempo - 1 tempo = janela de creatinina
10.5.1 e) Ferro
A alterao do metabolismo do ferro est relacionada com vrias outras
patologias, incluindo anemia, doena cardiovascular, hepatite crnica, doena renal
terminal e infeces. (1)
Foram descritos diversos mtodos fotomtricos para determinao do ferro.

Todos eles tm em comum a libertao de ies de Fe3+ do complexo de transferrina,
atravs do uso de cidos ou detergentes, seguida de reduo dos ies Fe3+ a Fe2+, com
reaco dos ies Fe2+ para produo de um complexo corado.
Assim, em condies acdicas (pH<2), o ferro libertado da transferrina. O
ascorbato reduz os ies de Fe3+ a Fe2+ que, de seguida, reagem com o Ferrozine e
formam um complexo corado. A intensidade da cor directamente proporcional
concentrao de ferro da amostra (soro ou plasma), podendo ser determinada
fotometricamente.
10.5.1. f) Magnsio
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A
deficincia
de
magnsio
est
associada
ao
desenvolvimento
de
hiperirritabilidade neuromuscular com tetania, induo da secreo de PTH e arritmia

cardiaca. Por outro lado, a hipermagnesmia manifesta-se por depresso do sistema
neuromuscular. (1)(4)
Este mtodo baseia-se na reaco do magnsio da amostra (soro, plasma ou

urina) com o azul de xilidilo numa soluo alcalina com EGTA para mascarar o clcio
na amostra. Em soluo alcalina, o magnsio forma um complexo prpura com o azul
de xilidilo, um sal de diaznio. A concentrao de magnsio medida
fotometricamente, atravs da diminuio da absorvncia de azul de xilidilo (ponto de
viragem).
10.5.1. g) Protenas Totais

As alteraes mais comuns na concentrao de protenas, com relevncia para o
laboratrio clnico, resultam da reaco de fase aguda, uma resposta inespecfica
inflamao ou dano tecidular. (1)
O biureto resulta da condensao de duas molculas de ureia, a quente.

Observou-se inicialmente que quatro molculas biureto formavam um complexo de cor
violeta com o cobre (Cu2+). Posteriormente, verificou-se que o mesmo ocorria com as
protenas e pptidos, passando a utilizar-se este mtodo para o doseamento proteico. Na
determinao de protenas pelo mtodo do biureto parte-se do pressuposto que todas as
protenas reagem da mesma forma com o io cprico. (1)
Em soluo alcalina, o cobre bivalente reage com as ligaes do pptido proteico

e forma o complexo de biureto com o caracterstico tom prpura. O trtaro sdicopotssico impede a precipitao do hidrxido de sdio e o iodeto de sdio impede a
auto-reduo do cobre. A intensidade cromtica, ou seja, o nmero de complexos
formados, directamente proporcional concentrao de protenas da amostra (soro ou
plasma) que pode ser determinada fotometricamente.
Protena + Cu2+ Complexo Cu-protena
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O mtodo do biureto simples, estvel, preciso, especfico (poucos
interferentes), com baixa sensibilidade (1,5 a 12 g/dl), no sendo por isso adequado
deteco de protenas na urina, mas o mtodo ideal para as protenas sricas. A
linearidade bastante alargada e amostras com concentraes elevadas podem ser
diludas a fim de se situarem na zona de linearidade. Os nicos interferentes so os
dextranos de baixo peso molecular usados no tratamento da hipotenso como
expansores de plasma.
No caso de soros muito ictricos, lipmicos ou hemolisados (libertao de
hemoglobina que actua como interferente positivo) necessrio preparar um branco de
amostra para compensar a turvao ou cor.
10.6 TESTE ENZIMTICO COLORIMTRICO/MODULO P
As enzimas podem ser usadas como reagentes na determinao de um analto, ou

serem elas prprias o analto a determinar. Tem sido crescente o uso de enzimas como
reagentes analticos, uma vez que oferecem a vantagem de maior especificidade para o
substracto a ser determinado. (1)
Os mtodos enzimticos so mais rpidos, mais sensveis e menos trabalhosos
do que os mtodos qumicos. Os reagentes enzimticos conservam-se bem quando
liofilizados, no entanto, uma vez hidratados tm um perodo de utilizao muito
reduzido pois difcil a sua conservao.
10.6.1 a) Alfa-Amilase
A amilase usada principalmente no despiste de doena pancretica. Alm da
pancreatite aguda, esta enzima pode encontrar-se elevada nas situaes de ascite,
peritonite, apendicite, doena neoplsica, colecistite e insuficincia renal. (1)
O mtodo cintico descrito baseia-se num procedimento de clivagem pela alfaamilase e hidrlise subsequente de todos os produtos de degradao a p-nitrofenol
(cromforo) pela aco da alfa-glucosidase. A intensidade da cor do p-nitrofenol
- 23 -

formado directamente proporcional concentrao da actividade da alfa-amilase da
amostra (soro, plasma ou urina), podendo ser determinada fotometricamente.
-amilase
5-etilideno-G7PNP + 5 H2O 2-etilideno-G5 + 2 G2PNP + 2-etilideno-G4 + 2 G3PNP +
etilideno-G3 +
-glucosidase
2 G2PNP + 2 G3PNP + G4PNP + 14H2O 5 PNP + 14G
10.6.1 b) cido rico

O cido rico o principal produto do catabolismo das purinas. A hiperuricmia
pode estar associada a consumo excessivo de purinas na dieta, doena maligna,
psoriase, insuficincia renal crnica e deficinca primria em enzimas do metabolismo
das purinas. Este aumento pode ser responsvel pelo sndrome de gota, o qual pode
estar na origem de artrite e nefropatia. (1)
No mtodo desenvolvido por Town et al, a amostra incubada com uma mistura
de reagentes que contm ascarbato oxidase e um sistema de aclaramento. importante a
eliminao do cido ascrbico, na reaco preliminar, de forma a impedir a interferncia
deste na reaco subsequente com a peroxidase.
A oxidao do cido rico pela uricase seguida pela reaco do perxido na
presena de peroxidase com formao de um corante imino-quinona, cuja intensidade
da cor vermelha proporcional concentrao de cido rico da amostra (soro, plasma
ou urina), sendo determinada fotometricamente:
uricase
cido rico + 2 H2O alantona + CO2 + H2O2
peroxidase
+
2 H2O2 + H + 4-aminofenazona + TOOS corante diimino-quinona + 4 H2O
TOOS: N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina
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A uricase uma enzima oxidoredutase. A reaco tem de ocorrer em meio
tamponado alcalino para que o CO2 passe a bicarbonato e as bolhas no interfiram na
reaco.
Esta reaco poder ter como interferentes certas substncias que actuam como
dadores de H+, reagindo com o oxignio libertado, impedindo a oxidao do
cromogneo. Tambm a hemoglobina pode actuar sobre o cromogneo prematuramente,
resultando numa interferncia positiva.
10.6.1 c) Colesterol
Na bioqumica clnica, o termo lpidos refere-se ao metabolismo lipoproteico e
ateroesclerose, uma das causas de doena cardiaca coronria. A reduo das
concentraes plasmticas de colesterol reduz a incidncia de doena cardaca
coronria. A hipercolesterolmia definida em termos de risco de doena cardiada
coronria. (1)(3)
O mtodo CHOD-PAP baseia-se na determinao da 4colestenona aps
clivagem enzimtica do ster de colesterol pela colesterol-oxidase e medio
subsequente, pela reaco de Trinder, do perxido de hidrognio formado. O colesterol
determinado de modo enzimtico utilizando colesterol esterase e colesterol oxidase.
colesterol esterase
steres do colesterol + H2O colesterol + RCOOH
Os steres de colesterol so clivados atravs da aco do colesterol esterase e

produzem colesterol livre e cidos gordos.
Colesterol oxidase
Colesterol + O2 4colestenona + H2O2
Com a ajuda da colesterol-oxidase, o colesterol transformado em

4colestenona e perxido de hidrognio pela aco do oxignio.
peroxidase
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2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona+ 4 H2O
O perxido de hidrognio produzido origina uma colorao vermelha atravs da

reaco coma 4-aminofenazona e o fenol, sob a aco cataltica da peroxidase. A
intensidade da cor directamente proporcional concentrao de colesterol da amostra
(soro ou plasma com heparina ou EDTA), podendo ser determinada fotometricamente.
Nesta ltima reaco, a reaco indicadora, recorre-se ao mtodo de Trinder.
Este mtodo apresenta interferentes, como a bilirrubina que interfere

negativamente. Sendo o colesterol usado para avaliar a colestase, situao em que a
bilirrubina elevada (> 5mg), a interferncia anteriormente referida ser ainda mais
importante.
10.6.1 d) Colesterol HDL

Na presena de sulfato de magnsio, o sulfato de dextrano forma selectivamente
complexos hidrossolveis com LDL, VLDL e quilomicrons que so resistentes s
enzimas modificadas por PEG.
A concentrao de HDL determinada enzimaticamente, pela colesterol esterase
e colesterol oxidase acopladas com PEG aos grupos amino.
Sob influncia da colesterol esterase, os steres do
colesterol so
quantitativamente decompostos em colesterol livre e cidos gordos. Na presena de

oxignio, o colesterol oxidado pela colesterol oxidase a colestenona e perxido de
hidrognio. O perxido de hidrognio formado reage com a 4-amino-antipirina e com a
N-(2-hidroxi-3- sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina de sdio (HSDA) para formar um
corante prpura-azul. A intensidade da colorao directamente proporcional
concentrao de colesterol da amostra (soro ou plasma tratado com heparina) e
medida fotometricamente.
PEG-colesterol esterase
ster do colesterol HDL + H2O colesterol + RCOOH
Colesterol HDL + O2 4colestenona + H2O2
2 H2O2 + 4-amino-antipirina + HSDA+ H+ + H2O pigmento prpura-azul + 5 H2O
10.6.1 e) Colesterol LDL
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Este mtodo usa um complexo de sulfato de ciclodextrina, sulfato de dextrano
(MOPS, POD, HSDA) e magnsio para estabilizar as molculas de VLDL e
quilomicrans. Um segundo reagente contm um detergente que forma micelas estveis
com o HDL e as VLDL e quilomicrans previamente estabilizadas, inibindo a sua
reaco com a colesterol esterase e oxidase. Aps a reaco do LDL da amostra (soro
ou plasma tratado com heparina) com a colesterol esterase e oxidase, o perxido de
hidrognio formado reage com 4-aminoantipireno formando um produto corado que
medido fotometricamente.
colesterol esterase
steres colesterol LDL + H2O colesterol + RCOOH
Colesterol LDL + O2 4colestenona + H2O2
2 H2O2 + 4-amino-antipirina + HSDA+ H+ + H2O pigmento prpura-azul + 5 H2O
10.6.1 f) Fosfatase cida e Fosfatase cida No Prosttica

A fosfatase cida srica constituida por cinco isoenzimas produzidos,
sobretudo, pelos eritrcitos, plaquetas, clulas reticuloendoteliais do bao e fgado e
clulas epiteliais dos rins, osso e prstata. (1)
A fosfatase cida no prosttica encontra-se aumentada nas situaes de
hipermetabolismo sseo, nomeadamente, hiperparatiroidismo, doena de Paget e
invaso maligna de tecido sseo. A fraco prosttica pode estar aumentada na
existncia de doena maligna da prstata. (1)
O ensaio utilizado consiste numa modificao do mtodo descrito por Hillmann.

O 1-naftol libertado durante a hidrlise enzimtica do 1-naftilfosfato convertido num
corante azico atravs de acoplao com o 2-amino-5-clorotolueno diazotado, sendo
determinado por fotometria. A adio de 1,5-pentanediol aumenta a actividade da
fosfatase cida prosttica (amostra de soro).
Na determinao da fosfatase no prosttica, o tartarato utilizado como
inibidor especfico da fosfatase cida prosttica.
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Fosfatase cida
1-naftilfosfato + H2O 1-naftol + fosfato
1-naftol + 2-amino-5-clorotolueno corante azico
10.6.1. g) Fosfatase Alcalina

A determinao dos nveis sricos de fosfatase alcalina de particular interesse
na avaliao da doena hepatobiliar e doena ssea associada ao aumento da actividade
osteoblstica. (1)(3)
Este mtodo baseia-se no ensaio desenvolvido por King e Armstrong. Na

presena de ies magnsio e zinco, o fosfato de p-nitrofenilo (substracto) hidrolisado
por fosfatases e forma fosfato e p-nitrofenol. O p-nitrofenol libertado proporcional
actividade da ALP da amostra (soro ou plasma) e pode ser medido fotometricamente.
ALP
Fosfato de p-nitrofenilo + H2O fosfato + p-nitrofenol
A grande dificuldade destes mtodos resulta das impurezas, quer do substracto

quer dos tampes, que originam produtos de degradao inibidores da enzima. A
utilizao de tampes amino-lcoois complica a cintica da reaco enzimtica, uma
vez que a reaco ir depender no s da concentrao de substracto, mas tambm da
concentrao do tampo aceitador de fosfato que actua como co-substracto. Os
resultados esto muito dependentes da temperatura (a enzima degrada-se com o calor),
tampo, pH. por isso uma determinao difcil de estandardizar.
10.6.1 h) Gama-glutamiltransferase (GGT)

A GGT tem origem no sistema hepatobiliar, estando a sua actividade elevada em
todas as formas de doena heptica. O seu aumento mais marcado, 5 a 30 vezes o
valor normal, em casos de obstruo biliar intra-heptica ou ps-heptica. a enzima
heptica mais sensivel na deteco de ictercia obstrutiva, colangite e colecistite. (1) (5)
Nesta determinao cintica a gama-glutamiltransferase da amostra (soro ou

plasma) transfere o grupo -glutamilo da L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida para a
- 28 -

glicilglicina. A quantidade libertada de 5-amino-2-nitrobenzoato proporcional
actividade de GGT e pode ser medida fotometricamente.
-GT
L--glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + glicilglicina L--glutamil-glicilglicina + 5amino-2-nitrobenzoato
10.6.1 i) Triglicridos
Os triglicridos constituem 95% do armazenamento de tecido gordo no
organismo. As quilomicrons contm na sua composio 85% de triglicridos. (1)
Todos os mtodos de quantificao dos triglicridos se baseiam na quantificao

do glicerol. O mtodo GPO-PAP baseia-se no trabalho de Wahlefeld, utilizando uma
lipoprotena lipase de microorganismos para a hidrlise rpida e completa dos
triglicridos da amostra (soro ou plasma) a glicerol, seguida de oxidao para fosfato de
dihidroxiacetona e perxido de hidrognio. O perxido de hidrognio produzido reage
depois com 4-aminofenazona e 4-clorofenol sob a aco cataltica da peroxidase, para
formar um corante vermelho (reaco de ponto final de Trinder), o qual ser
determinado por fotometria.
LPL
TG + 3H2O glicerol + 3 RCOOH
GK
Glicerol + ATP glicerol-3-fosfato + ADP
Mg2+
GPO
Glicerol-3-fosfato + O2 fosfato de dihidroxiacetona + H2O2
peroxidase
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-clorofenol 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona +
H2O + HCl
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Os mtodos enzimticos usam uma hidrlise enzimtica, por intermdio de uma
lipase. Como vantagens apresentam a rapidez, ausncia de reagentes casticos e
extraco com solventes orgnicos. No entanto, estes mtodos tambm tm
desvantagens, no descontando o glicerol endgeno, que poder ser mais ou menos alto,
consoante a liplise dos triglicridos ou o armazenamento no tecido adiposo. O glicerol
endgeno pode aumentar 50 a 100 vezes em situao de stress (adrenalina), doena
(diabetes, deficincia em glicerolquinase) ou infuses intra-venosas. (1)
10.7 TESTE ENZIMTICO-UV/MODULO P
O laboratrio clnico tem necessidade de avaliar alteraes na actividade ou

concentraes de enzimas no soro que so predominantemente intracelulares e esto
normalmente presentes em baixas concentraes. Pela deteco de alteraes nos nveis
destas enzimas durante situaes patolgicas, possvel inferir a localizao e natureza
da patologia. (1)
A quantidade de substracto transformado em produto durante uma reaco
catalizada por uma enzima pode ser medido por um mtodo analtico apropriado, como
por exemplo alteraes nas caractersticas de absorvncia de um componente do sistema
analtico. Os coenzimas NADH ou NADPH podem ser monitorizados por alteraes na
absorvncia a 340nm, durante a oxidao ou reduo. (1)
10.7.1 a) Alanina-aminotransferase/Transaminase glutamicapiruvica (ALT/GPT)

As transaminases permitem a deteco de hepatites, mas apesar do aumento dos
nveis sricos de AST e ALT nas situaes de leso da integridade do hepatcito, a ALT
uma enzima mais especfica do fgado e a elevao das suas concentraes persistem
por um perodo mais alargado do que a AST. (1) (5)
A enzima ALT da amostra (soro e plasma) catalisa reaco de equilbrio a seguir

descrita. O aumento do piruvato determinado numa reaco indicadora catalisada pela
lactato-desidrogenase. O NADH oxidado a NAD. A velocidade de diminuio do
NADH, medido fotometricamente, directamente proporcional velocidade de
formao do piruvato e, logo, actividade da ALT (determinao cintica).
- 30 -

ALT
L-alanina + -cetoglutarato piruvato + L-glutamato
LDH
Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
10.7.1 b) Aspartato-aminotransferase/Transaminase glutamicaoxaloactica (AST/ GOT)

A enzima AST, alm de estar associada a doena heptica, pode tambm ser um
indicador de enfarte do miocrdio, distrofia muscular e embolia pulmonar. (5)
A enzima AST da amostra (soro ou plasma) catalisa a reaco de equilbrio a

seguir descrita, com determinao cintica.. O aumento do oxaloacetato determinado
numa reaco indicadora catalisada pela malato-desidrogenase. O NADH oxidado a
NAD. A velocidade de diminuio do NADH, medida fotometricamente, directamente
proporcional velocidade de formao do oxaloacetato e, logo, actividade da AST.
AST
L-aspartato + -cetoglutarato oxaloacetato + L-glutamato
MDH
Oxaloacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+
10.7.1 c) Creatinafosfoquinase (CPK)

A actividade da CPK encontra-se elevada em diversas patologias do sistema
musculo-esqueltico, cardiaco, sistema nervoso central e tiroide. (1) (6)
O mtodo de ensaio utilizando o fosfato de creatinina e ADP foi inicialmente

descrito por Oliver. A CPK rapidamente inactivada por oxidao dos grupos sulfidrilo
no seu centro activo. A enzima pode ser reactivada pela adio de acetilcistena. A
interferncia da adenilatoquinase prevenida atravs da adio de pentafosfato de
diadenosina e AMP.
- 31 -

CPK
Fosfato de creatinina + ADP creatina + ATP
HK
Glucose + ATP glucose-6-P + ADP
G6P-DH
Glucose-6-p + NADP+ gluconato-6-P + NADPH+ + H+
Formam-se quantidades equimolares de NADPH e ATP mesma velocidade. A

taxa de formao de NADPH medida fotometricamente proporcional actividade de
creatinafosfoquinase da amostra (soro ou plasma).
10.7.1 d) Glucose
A determinao da glucose permite o despiste de patologias associadas a hiper e
hipoglicmia. A patologia mais pesquisada a Diabetes Mellitus constitui um grupo de
desordens metablicas dos carbohidratos, no qual h intolerncia glucose, originando
hiperglicmia. (1)
Segundo os ltimos critrios da Direco-Geral da Sade, o diagnstico da

Diabetes Mellitus baseia-se na glicmia em jejum 126mg/dl ou sintomas clssicos com
glicmia ocasional 200mg/dl ou glicmia 200mg/dl, na PTOG com 75g de glucose,
s 2 horas. A Tolerncia Diminuda Glucose apresenta glicmia de jejum <126mg/dl e
s 2 horas (PTOG) 140 e <200mg/dl. A Anomalia da Glicmia de Jejum consiste na
glicmia de jejum >110 e <126mg/dl.
O mtodo da hexoquinase, baseado no trabalho de Schmidt e Peterson e Young,

o mtodo de referncia para a determinao da glicmia, quando associado
desproteinizao de Somogyi. Na presena de NADP, a glucose-6-fosfatodesidrogenase oxida a glucose-6-fosfato para gluconato-6-fosfato. Nenhum outro
hidrato de carbono oxidado. A taxa de formao de NADPH durante a reaco
directamente proporcional concentrao de glucose da amostra (soro, plasma ou
urina), sendo determinada fotometricamente.
- 32 -

HK
Glucose + ATP G-6-P + ADP
A hexoquinase catalisa a fosforilao da glucose em glucose-6-fosfato por ATP.
G-6-PDH
G-6-P + NADP+ gluconato-6-P + NADPH + H+
A frutose poder interferir neste ensaio, contudo, este acar no existe em

jejum e, no ps-prandial, um indivduo normal tem nveis extremamente baixos e num
tempo reduzido. Torna-se necessrio considerar esta interferncia positiva nas provas de
sobrecarga em frutose. um mtodo muito especfico, sem interferncia dos redutores.
10.7.1 e) Lactato desidrogenase (LDH)

No laboratrio clnico, a LDH til na avaliao de enfarte do miocrdio,
miocardite, insuficincia cardaca, hemlise, doena maligna e doena renal. (1)
A LDH da amostra (soro ou plasma) catalisa a converso de piruvato em lactato

e o NADH oxidado a NAD. A velocidade de reduo de NADH directamente
proporcional actividade de LDH.
LDH
Piruvato + NADH + H+ lactato + NAD+
10.7.1 f) Ureia
A principal utilidade clnica da determinao srica da ureia baseia-se no clculo
da razo ureia/creatinina usada na discriminao da urmia pr e ps-renal. (1)
Em 1965, Talke e Schubert publicaram um mtodo totalmente enzimtico para

determinao da ureia usando o sistema enzimtico acoplado urease/glutamatodesidrogenase (GLDH). O decorrente ensaio baseia-se neste mtodo, tendo sido
optimizado para analisadores que permitem leituras cinticas.
A ureia da amostra (soro, plasma ou urina) hidrolisada pela urease e forma
CO2 e amnia. A amnia reage com o -cetoglutarato e o NADH na presena da GLDH
- 33 -

e produz glutamato e NAD+. A reduo da absorvncia causada pelo consumo do
NADH medida fotometricamente.
urease
Ureia + H2O 2NH4+ + CO2
GLDH
-cetoglutarato + NH4+ + NADH L-glutamato + NAD+ + H2O
A hidrlise enzimtica pela urease (amido hidrolase) e quantificao do io

amnio, poder originar erros diferentes consoante se trate de uma amostra de urina ou
soro porque a quantidade de amnio que existe nos dois diferente, sendo superior na
urina. Tem ainda como inconveniente o facto do io amnio ser um contaminante do
laboratrio e da gua, devendo ser desamoniada. Apresenta a vantagem de ser uma
reaco muito especfica uma vez que a urease s reage com a ureia. Tendo em conta a
possibilidade da ureia ser degradada por aco bacteriana, a amostra deve ser analisada
poucas horas aps a colheita ou conservada por refrigerao. (1)
10.8 TESTE UV/MODULO P
Consiste na deteco de variaes de absorvncia na zona dos ultra-violetas.
10.8.1 a) Fsforo
A determinao da fosfatmia permite detectar situaes patolgicas associadas
a hipofosfatmia, como o hiperparatiroidismo, alcalose respiratria, aumento da
secreo
de
insulina;
hiperfosfatmia,
como
insuficincia
renal,
hipoparatiroidismo, acidose respiratria, entre outras. (1) (4)
O mtodo do molibdato baseia-se na reaco do fosfato da amostra (soro plasma

ou urina) com o molibdato de amnio e a formao de fosfomolibdato de amnio sem
reduo. A adio de um acelerador provoca uma taxa de reaco mais rpida e a
aplicao do branco da amostra produz resultados mais precisos.
- 34 -

O fosfato inorgnico forma um complexo de fosfomolibdato de amnio,
(NH4)3PO4(MoO3)12, com molibdato de amnio na presena de cido sulfrico. O
complexo determinado fotometricamente na regio dos UV (340nm).
11. URISYS 2400 (FOTOMETRIA DE REFLECTNCIA)
A anlise de urinas envolve trs princpios bsicos: a avaliao visual da cor e

aspecto da amostra de urinas, a deteco de determinadas substncias usando tiras teste,
e o exame microscpico do sedimento urinrio. No exame microscpico do sedimento
urinrio confirmam-se alguns dos parmetros fornecidos pelas tiras teste e avalia-se a
presena de clulas epiteliais, leuccitos, eritrcitos, cilindros e cristais (com semiquantificao).
O Urisys 2400 (figura 6) um sistema totalmente automtico de anlise de

urinas, destinado determinao qualitativa ou semi-quantitativa in vitro de analitos da
urina, incluindo leuccitos, nitritos, protenas, glicose, cetonas, urobilinognios,
bilirrubina e eritrcitos, assim como o pH, a densidade especfica, a cor e o aspecto.
As principais funes deste analisador incluem a identificao de amostras,
distribuio automtica de tiras teste, pipetagem automtica de amostras e leituras
fotomtricas. Est optimizado para analisar entre 100 a 1000 amostras de urina por dia.
Figura 6
- 35 -

O Urisys 2400 um fotmetro de reflectncia, os resultados dos testes baseiamse na leitura da intensidade de luz reflectida pela tira teste. A cabea de leitura contm
dodos de emisso de luz (LED) de trs comprimentos de onda diferentes. A leitura
ocorre aps a reaco qumica e desenvolvimento de cor. A luz reflectida medida
electro-opticamente. Um LED transmite luz com um comprimento de onda definido,
num ngulo ideal, para a superfcie de uma banda reactiva. A luz incide na superfcie da
banda reactiva e reflectida com uma intensidade que depende da cor da banda
reactiva. Um detector de fotododo recebe a luz reflectida e transmite um sinal elctrico
analgico para o conversor analgico-para-digital, o qual converte o sinal analgico
num valor digital. Um microprocessador ajusta o valor digital e converte-o num valor
relativo utilizando uma escala padronizada de calibrao. O microprocessador calcula
um valor de reflectncia. O resultado semi-quantitativo da concentrao determinado,
comparando o valor da reflectncia com o valor dos limites de intervalo.
A leitura da densidade especfica efectuada numa clula de fluxo que
preenchida com a amostra de urina. Um LED transmite luz clula de fluxo. Um
dispositivo de carga acoplada determina o ngulo de reflexo total. O ndice refractivo
da amostra calculado a partir do ngulo de reflexo total, utilizando uma curva de
calibrao.
O pH determinado por intermdio dos indicadores vermelho de metilo,
fenolftalena e azul de bromotimol, que reagem especificamente com os ies H+. Os
leuccitos so revelados pela presena das esterases granulocitrias, as quais
decompem um ster indoxlico em indoxil, que reage com o sal de diaznio,
produzindo um corante violeta. O teste para deteco de protenas baseia-se no princpio
do erro proteico de um indicador de pH. O teste para nitritos baseado na prova de
Griess. A determinao da glucose baseada na reaco especfica da glucoseoxidase/peroxidase (mtodo GOD/POD). O teste para os corpos cetnicos baseia-se no
princpio da prova de Legal. Na determinao do urobilinognio e bilirrubina, estes
reagem com um sal de diaznio originando um corante azico. A hemoglobina catalisa
a oxidao do indicador atravs do perxido de hidrognio orgnico contido na zona
teste, originando uma colorao azul-esverdeada.
Nos casos em que o volume de amostra inferior a 200ml, a anlise pelo
equipamento no possvel, sendo ento realizada a tcnica manual em que uma tira
teste mergulhada na amostra e a leitura feita por comparao visual das cores obtidas
com tabela respectiva.
- 36 -

IMUNOLOGIA
Endocrinologia
Doseamentos hormonais
Hormonas do Eixo Hipotlamo-epifisrio:

FSH, LH, TSH, LH, Progesterona, Prolactina
Hormonas da Tiride: T3, T4, FT3, FT4,
Hormonas da Paratiride: Paratormona;
Hormonas das Gnadas: Progesterona, BetahCG, 17-Beta-Estradiol, Testosterona
Imunologia
Imunoqumica
Crioglobulinas (ttulo e pesquisa)

Complemento (C3 e C4)
Imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE)
Protena C reactiva (PCR)
Waller-Rose
Factor reumatide (FR)
Auto Imunidade
Anticorpos anti-nucleares (anti-ANA)

Anticorpos anti-antignios nucleares extraveis
(ENA): SS-A, SS-B, Sm, Rnp
Anticorpos anti-DNA
Anticorpos anti-tiroideus: anti-Tiroglobulina
(TG), anti-Peroxidase da Tiride (TPO)
Imunoserologia
Anticorpos anti-HVC (Virus Hepatite C)

Anticorpos anti-HBc, HBe, HBs; Antignios
Hbe e HBs (Virus Hepatite B)
Anticorpos
anti-HVA (IgG,
IgM)
(virus
hepatite A)
Anticorpos
anti-CMV
(IgG,
IgM)
(citomegalovirus)
Anticorpos anti-Clamydea Trachomatis (IgG,
IgM)
Anticorpos anti-Helicobacter pylori (IgG)
Anticorpos
anti-HIV
II
(vrus
imunodeficincia adquirida)
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Anticorpos anti-Toxoplasma (IgG, IgM)
Anticorpos anti-Rubola (IgG, IgM)
Ttulo anti-estreptolisina O (TASO)
Ag febril (Reaco de Widal)
Sfilis (RPR)
Brucelose (Rosa bengala)
Marcadores tumorais
Alfa-fetoprotena
CEA, CA-19.9, CA-125, CA-15.3
PSA, FPSA
1. AGLUTINAO DIRECTA
LE Teste em Latex
O LE Teste utilizado na deteco dos anticorpos associados ao Lpus

Eritematoso Sistmico (SLE). O soro dos doentes portadores de SLE contem quase
sempre anticorpos dirigidos contra um ou vrios antignios nucleares. Estes anticorpos
antinucleares (ANA), que podem ser da classe IgG, IgA ou IgM, esto presentes,
aproximadamente, em 95% dos pacientes no tratados, mas no so completamente
especficos para o diagnstico de SLE. Muitas vezes, a taxa de ANA em circulao
corresponde actividade do SLE, mas por vezes no existe qualquer correlao. A
utilizao deste teste permite, principalmente, excluir o diagnstico de SLE.
A nvel dos dados laboratoriais, o SLE geralmente acompanhado de
trombocitopnia, anemia hemoltica, dados compatveis com insuficincia renal,
positividade para diversos auto-anticorpos e hipocomplementmia.
As reaces de aglutinao e precipitao constituem a base de muitas das

tcnicas aplicadas no laboratrio de imunologia. Enquanto as reaces de precipitao
so quantificveis, as tcnicas de aglutinao so apenas semiquantitativas. A principal
vantagem das reaces de aglutinao inclui a capacidade de avaliao visual do ponto
final da reaco, sem necessidade de recorrer a equipamento especfico. As reaces de
aglutinao podem ser classificadas em directa ou indirecta (passiva). Na tcnica
- 38 -

directa, clulas ou partculas antignicas insolveis so aglutinadas directamente pelo
anticorpo. A aglutinao passiva refere-se aglutinao de clulas ou partculas inertes
ligadas a antignios que so transportadores passivos de antignios solveis. (7)
Este teste baseado numa reaco imunolgica entre as partculas de ltex

revestidas de DNP (desoxiribonucleoprotena) e os anticorpos anti-DNP da amostra.
Logo que a concentrao dos anticorpos nas amostras aumente, aparece uma
aglutinao visvel a olho n. Trata-se de um teste qualitativo que poder ser semiquantitativo por diluio da amostra.
Amostra: Soro
2. AGLUTINAO - ROSA BENGALA
Brucelloslide
A brucelose uma zoonose transmitida aos seres humanos por animais

infectados. Pode ser causada por qualquer uma das 4 espcies de Brucella: Brucella
melitensis (a mais comum e mais virulenta) adquirida a partir de cabras, ovelhas e
camelos; Brucella abortus, existente no gado ovino; B.suis, nos sunos, e B.canis, nos
ces. transmitida mais frequentemente atravs da ingesto de leite e lacticnios no
tratados, podendo ser contrado por inalao durante o contacto com animais, leses
cutneas, auto-inoculao ou via conjuntival. Ocasionalmente pode ser transmitida por
via interpessoal, durante o aleitamento e actividade sexual. Possui uma manifestao
febril, sem padro distinto.
O serodiagnstico clssico das infeces agudas por Brucella baseia-se na
pesquisa e titulao dos anticorpos da classe M (aglutinantes) e IgG anti-antignios
polissacardicos A e M da parede celular, utilizando as reaces imunolgicas de
aglutinao directa de Huddleson (mtodo em lmina), de Rosa de bengala (mtodo em
lmina) e de Wright (mtodo em tubo). (8)
A reaco de Rosa de Bengala uma prova de aglutinao rpida executada em
lmina que utiliza uma suspenso antignica corada pelo Rosa de bengala. um teste
recomendado como procedimento de rastreio, para pesquisar a presena de anticorpos,
essencialmente da classe IgG, anti-Brucella no soro dos doentes com suspeita clnica de
- 39 -

Brucelose. Para alm de detectar a presena de anticorpos bloqueantes (IgG1 e IgG2),
tem uma especificidade superior reaco de Huddleson e de Wright que se deve, em
grande parte, utilizao de uma meio reactivo acidificado responsvel pela
minimizao da aglutinao induzida pelos anticorpos da classe IgM. Por este facto
positiva mais tardiamente do que a reaco de Huddleson e de Wright. Uma vez que a
reaco positiva tanto nos doentes com Brucelose aguda como nos que apresentam
infeces subagudas e crnicas considerado o teste clssico e de eleio para efectuar
inquritos epidemiolgicos. (8)
As tcnicas de rastreio para a pesquisa de anticorpos contra bactrias

patognicas recorrem a reaces de aglutinao. A incubao da bactria fixada com o
soro do paciente leva aglutinao das bactrias se o paciente desenvolveu uma
resposta imune contra o agente. Estas tcnicas podem apresentar reaces cruzadas. No
entanto, a sua execuo extremamente fcil e o custo baixo, pelo que continuam a
ser utilizadas. (8)
Este teste baseia-se no serodiagnstico da brucelose por aglutinao em carta

(Ag Rosa Bengala). O antignio cido tamponado, corado com Rosa Bengala, permite
uma deteco precoce das aglutininas especficas da brucelose (Brucella melitensis, B.
abortus, B. bovis e B. suis).
Falsos Positivos: indivduos recentemente imunizados contra a clera, infectados

com Yersinia enterocolitica bitipo 9 ou Francisella tularensis.
Falsos Negativos: Presena de anticorpos bloqueantes
Amostra: Soro
3. AGLUTINAO - WIDAL
As salmoneloses so infeces provocadas por microorganismos gram-negativos

da famlia das enterobactrias, as Salmonelas. A serotipagem baseia-se na reactividade
- 40 -

imunolgica
dos
antignios
somticos,
O,
que
so
predominantemente
lipopolissacridos, e dos antignios capsulares, H.

As manifestaes clnicas e gravidade da infeco por microorganismos do
gnero Salmonela iro depender do serotipo envolvido. Estas podem distinguir-se
clinicamente em Salmonelas no tifides e tifides. O serotipo Salmonella typhi o
responsvel pela febre tifide. Esta uma infeco sistmica, que se apresenta com
febres altas, cefaleias e sem diarreia. Este serotipo tem o homem como nico
reservatrio e pode existir em portadores saudveis. A sua transmisso feita por
contacto directo homem-a-homem ou oral-fecal (alimentos e gua contaminados). Os
serotipos paratyphi A, B e C, provocam uma sndrome semelhante febre tifide. O
nico teste laboratorial especfico para o diagnstico da Salmonelose o seu isolamento
em cultura. Existem no entanto mtodos de serodiagnstico que, apesar da sua reduzida
inespecificidade e sensibilidade, continuam a ser muito solicitados, tais como o Teste de
Widal.
Antignios febris so usados em testes de aglutinao como complemento ao

diagnstico de determinadas doenas febris, tais como doenas por Salmonella spp,
Brucella spp e Ricketsieae. O soro do paciente testado directamente para anticorpos
homlogos.
O diagnstico serolgico de Widal utilizado nas febres tifo-paratifidicas

quando a bactria, salmonela, no pode ser isolada. Baseia-se na pesquisa dos
anticorpos anti-O e anti-H sricos pela utilizao das suspenses O e H da Salmonella
typhi e paratyphi A, B, C, Salmonella typhi-murium e Salmonella enteritidis. O
aparecimento das anti-O indica uma infeco recente. No indivduo vacinado apenas as
aglutininas H persistem. Uma antibioterapia precoce pode impedir o aparecimento das
aglutininas O. (9)
A prova realizada em lmina apresenta resultados positivos quando se verifica a

presena de aglutinao. Os resultados negativos traduzem-se na ausncia de
aglutinao visvel. Define-se o ttulo como o inverso da maior diluio que d
resultado positivo.
- 41 -

Tm relevncia clnica os ttulos em diluio igual ou superior a 1/80. Um
aumento de ttulo entre amostras colhidas a tempos diferentes ser sugestivo de um
diagnstico presuntivo.
Falsos Positivos: O soro de doentes normais pode apresentar aglutinao

positiva com Ags febris devido a imunizao prvia, infeco antiga ou pela presena
de anticorpos relacionados com os antignios. Em geral, os ttulos encontrados nestas
situaes sero inferiores e permanecero a um nvel constante. Os ttulos detectados
como resultado de uma infeco activa ou imunizao recente com um organismo
contendo antignios homlogos ser, geralmente, superior e tender a aumentar.
Falsos Negativos: Tal como noutros imunoensaios podero verificar-se
fenmenos de prozona. Nalgumas situaes no h desenvolvimento de aglutininas.
Amostra: Soro
4. HEMAGLUTINAO GEL - WALLER-ROSE

POLYARTEST
A artrite reumatide e doenas relacionadas esto associadas produo de um

grupo de imunoglobulinas, denominadas factores reumatides (FR).
Os factores reumatides so um grupo heterogneo de auto-anticorpos dirigidos
contra os determinantes antignicos da regio Fc das molculas de IgG. So importantes
para o diagnstico da artrite reumatide mas tambm podem ser encontrados noutras
doenas reumticas inflamatrias e em vrias doenas no reumticas: processos
inflamatrios crnicos, doenas infecciosas como endocardite bacteriana subaguda,
malria, sfilis, lepra, leishmaniose, tuberculose e variedades de doenas auto-imunes
como o LES. Tambm so encontrados em pessoas saudveis acima dos 60 anos. (7)(10)
Os auto-anticorpos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgA,
IgM monomrica) apesar dos mtodos analticos usuais serem limitados deteco dos
factores reumatides do tipo IgM pentamrica.
- 42 -

O Polyarteste utilizado como auxiliar no diagnstico imunolgico da artrite
reumatide. A reaco baseada nas propriedades de hemaglutinao especficas do
factor reumatide, como nas reaces do tipo Waller-Rose. O reagente consiste em
glbulos vermelhos de carneiro sensibilizados por um soro de coelho anti-eritrcitos de
carneiro. O factor reumatide humano aglutina estes eritrcitos de carneiro, devido a
uma reaco cruzada entre a IgG do coelho e a IgG humana.
As tcnicas de hemaglutinao utilizadas em serologia so tcnicas semiquantitativas que consistem em incubar diluies variveis de anti-soro em presena de
uma determinada concentrao de clulas.
O ttulo no apenas influenciado pela quantidade de anticorpos, mas tambm
pela sua afinidade. A multiplicidade destes factores explica porque a aglutinao
fornece uma informao relativa que permite classificar o anti-soro, sem permitir uma
estimao quantitativa dos anticorpos presentes.
Um factor reumatide negativo no exclui o diagnstico de artrite reumatide.

Aproximadamente 20% dos pacientes com artrite reumatide so seronegativos. Alguns
destes pacientes podem ter factores reumatides IgG, IgA ou IgM monomrica.
Inversamente, os factores reumatides tambm no aparecem s na artrite reumatide.
Esto tambm presentes em 30% dos pacientes com LES, numa elevada percentagem
(90%) de pacientes com sndrome de Sjgren e tambm em pacientes com escleroderma
ou polimiosite. Os estudos epidemiolgicos mostram que um pequeno nmero de
pessoas normais tambm tem factores reumatides.
Falsos positivos: Nalgumas doenas crnicas infecciosas, como lepra e

tuberculose. Na endocardite bacteriana subaguda ambos o teste pode se positivos
durante a doena activa e reverter para negativo medida que o paciente melhora.
Amostra: Soro
5. IMUNOTURBIDIMETRIA/ MODULAR P
5.1. Imunoglobulinas
- 43 -

Observa-se uma diminuio na concentrao de imunoglobulinas em
enteropatias com perdas proteicas, atravs da pele dos queimados e nas
imunodeficincias adquirida e congnita. O aumento dos nveis de imunoglobulinas
ocorre nas hepatopatias crnicas, doenas infecciosas e perturbaes autoimunes (artrite
reumatide, LES). (10)

quantitativa de imunoglobulinas. Os anticorpos anti-Ig A, G ou M reagem com o
antignio na amostra e formam um complexo Ag-Ac. Aps a aglutinao, a
determinao feita por turbidimetria.
Podem ocorrer resultados falsamente baixos devido a um excesso de antignio

(efeito zona). Estes antignios bloqueiam o anticorpo impedindo-o de se formar o
complexo Ag-Ac. Esta situao pode ser detectada aps diluio apropriada da amostra.
As
chamadas
paraprotenas
secretadas
nas
gamopatias
monoclonais
(imunoglobulinmia monoclonal) podem diferir das respectivas imunoglobulinas de

origem policlonal, na composio e tamanho dos seus aminocidos. Tambm neste caso
a ligao ao anticorpo pode ser prejudicada.
Assim, amostras de soro de pacientes com um diagnstico clnico incerto devem

ser sujeitas a uma electroforese de protenas para identificar um eventual excesso de
antignio ou gamopatia monoclonal.
Amostra: Soro ou plasma
5.2. Anti-estreptolisina O (TASO)
Os testes imunolgicos para a determinao de anticorpos especficos dos

produtos metablicos estreptoccicos produzem informaes importantes sobre
infeces anteriores por estreptococos. Os anticorpos so produzidos contra o patognio
e os respectivos produtos metablicos. Um exemplo o anticorpo para a estreptolisina
O, uma enzima produzida pelos estreptococos -hemolticos do grupo A de Lancefield,
- 44 -

Streptococcus pyogenes, um dos principais agentes da faringite. Procede-se
determinao da anti-estreptolisina O aquando da ocorrncia de patologias txicas e
sensibilizantes, como febre reumtica e a glomerulonefrite aguda ps-estreptoccica.
Existem vrios mtodos para o doseamento da anti-estreptolisina O, como a aglutinao
por ltex e inibio da hemlise.
Este teste baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para determinao

quantitativa de anti-estreptolisina O. A estreptolisina O (antignio) que reveste o ltex
reage com os anticorpos da amostra e forma um complexo Ag-Ac por aglutinao. A
determinao final feita por turbidimetria.
possvel a ocorrncia de um efeito zona com concentraes elevadas de antiestreptolisina O.
5.3. Factor Reumatide
A artrite reumatide e doenas relacionadas esto associadas produo de um

grupo de imunoglobulinas, denominadas factores reumatides (FR).
Os factores reumatides so um grupo heterogneo de auto-anticorpos dirigidos
contra os determinantes antignicos da regio Fc das molculas de IgG. So importantes
para o diagnstico da artrite reumatide mas tambm podem ser encontrados noutras
doenas reumticas inflamatrias e em vrias doenas no reumticas: processos
inflamatrios crnicos, doenas infecciosas como endocardite bacteriana subaguda,
malria, sfilis, lepra, leishmaniose, tuberculose e variedades de doenas auto-imunes
como o LES. Tambm so encontrados em pessoas saudveis acima dos 60 anos. (8)
Os auto-anticorpos ocorrem em todas as classes de imunoglobulinas (IgG, IgA,
IgM monomrica) apesar dos mtodos analticos usuais serem limitados deteco dos
factores reumatides do tipo IgM pentamrica.
5.3.1. Fundamento do teste
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Este baseia-se no princpio da aglutinao imunolgica para a determinao
quantitativa de factores reumatides. A IgG (antignio) inactivada pelo calor, ligada a
partculas de ltex, reage com os anticorpos FR na amostra e forma complexos Ag-Ac.
Estes, aps a aglutinao, so determinados por turbidimetria.
O procedimento clssico de quantificao dos FRs recorre aglutinao com

eritrcitos de ovelha sensibilizados para IgG ou com partculas de ltex. Os problemas
prprios destes mtodos semiquantitativos so a fraca preciso e reprodutibilidade
interlaboratoriais, associadas a dificuldades de padronizao. Estes motivos levaram ao
desenvolvimento de novos mtodos de ensaio, como a turbidimetria e imunoensaios
enzimticos.
5.4. Protena C reactiva (PCR)
A PCR uma glucoprotena que normalmente no se encontra presente no soro,

sendo um indicador inespecfico de fase aguda. Esta protena aparece em infeces e
agresses com inflamao. O doseamento da PCR utilizado para detectar processos
inflamatrios sistmicos, avaliar o tratamento das infeces bacterianas com
antibiticos, fazer a distino entre a forma activa e inactiva de doenas com infeco
concomitante, por exemplo, em doentes que sofrem de SLE ou colite ulcerosa, para
controlar terapeuticamente as doenas reumticas, avaliar a teraputica anti-inflamatria
e para distinguir entre infeco e rejeio de transplante da medula ssea. (10)
Mais recentemente verificou-se a sua utilidade no prognstico de risco
cardiovascular em indivduos saudveis, com angina instvel e IAM, devido ao papel da
inflamao na fisiopatologia da aterosclerose. No entanto, a sua utilizao na avaliao
do risco cardiovascular implica a utilizao de ensaios que possuam sensibilidade igual
ou inferior a 0.1 mg/dL.
5.4.1. Fundamento do teste

quantitativa da protena C reactiva. Os anticorpos anti-PCR reagem com o antignio na
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amostra e formam um complexo Ag-Ac. Aps a aglutinao, a determinao feita por
turbidimetria.
6. REACO DE FLOCULAO
RPR
A sfilis uma infeco crnica sistmica causada por uma espiroqueta, o

Treponema pallidum subespcie pallidum. habitualmente transmitida por via sexual
(mas tambm de transmisso congnita) e caracteriza-se por episdios de doena activa
interrompidos por perodos de latncia. Aps um perodo mdio de incubao de 2 a 6
semanas, aparece uma leso primria frequentemente associada a linfoadenopatia
regional (Sfilis Primria). Um estadio bacterimico secundrio, associado a leses
cutneo-mucosas generalizadas (Sfilis Secundria) seguido por um perodo latente de
infeco subclnica que pode durar muitos anos (Sfilis Latente). Em cerca de 1/3 dos
casos no tratados segue-se um estdio tercirio, caracterizado por leses cutneomucosas, msculo-esquelticas e parenquimatosas, progressivamente destrutivas, aortite
ou patologia sintomtica do sistema nervoso central (Sfilis Terciria). O Treponema
pallidum um microorganismo fastidioso, no cultivvel em meios de cultura habituais,
sendo a sua presena normalmente demonstrada de forma indirecta por testes
serolgicos. Pode tambm ser detectado por observao microscpica directa das leses.
Os anticorpos desenvolvidos em resposta a um contacto do organismo com o T.
pallidum classificam-se como no Treponmicos e Treponmicos. Os anticorpos no
treponemais aparecem entre 1 e 4 semanas aps a infeco e permanecem elevados at
que se inicie a teraputica antimicrobiana ou quando o paciente entra na fase tardia da
infeco. Uma vez iniciada a terapia antimicrobiana eficaz, os ttulos dos anticorpos no
treponemais comeam a declinar, frequentemente atingindo nveis no detectveis antes
do final do tratamento.
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O VDRL e o RPR (Rapid Plasma Reagin Test) so os dois testes no
treponmicos mais comuns. Os anticorpos no treponmicos reagem com material
lipoproteico das clulas lesadas e com a cardiolipina do Treponema, no sendo
especficos para este (podem ser produzidos noutras situaes tais como doenas
autoimunes e gravidez). Tanto o VDRL como o RPR utilizam um Ag fosfolpidico
(cardiolipina) fortificado com lecitina e colesterol, associados a uma partcula coloidal,
e todos estes se baseiam na aglutinao como ponto final na deteco de um teste
positivo. No VDRL necessrio o aquecimento da amostra para eliminao de reaces
inespecficas e a aglutinao apenas visvel microscpicamente com objectiva de
100x. No RPR, a adio de Cloreto de Colina elimina a necessidade de aquecimento da
amostra, e a associao do antignio a micropartculas de carvo torna a aglutinao
visvel macroscopicamente. O teste habitualmente utilizado o RPR e no o VDRL.
Os testes para anticorpos no treponemais so utilizados primariamente na
triagem de pacientes e na monitorizao da resposta teraputica durante o tratamento
com antimicrobianos para a sfilis.
O ensaio qualitativo realizado de acordo com qualquer outro mtodo de

aglutinao em lmina, fazendo reagir a amostra com o Ag correspondente. Os ensaios
positivos (com aglutinao visvel ao fim de 8 minutos) devero ser repetidos
preparando-se uma srie de diluies em soro fisiolgico e retestados. O ttulo da
amostra corresponder maior diluio que ainda demonstra aglutinao. Apresentam
reactividade cerca de 6 semanas aps infeco.
Falsos Positivos: Pneumonia pneumoccica, Escarlatina, Linfogranuloma

venreo, Lepra, Endocardite bacteriana, Malria, Rickettsiose, Leptospirose, Cancride,
Tuberculose, Pneumonia a Mycoplasma, Tripanossomase, Sarampo, Mononucleose
Infecciosa, Hepatite Viral, HIV, Gravidez, Patologia Heptica Crnica, Mieloma
Mltiplo e outras patologias com elevao das imunoglobulinas, Patologias do tecido
conjuntivo, Transfuses sanguneas mltiplas, etc. Tratando-se de um resultado positivo
isolado, sem histria de patologia, e dada a elevada inespecificidade dos Testes No
treponmicos, este dever ser posteriormente confirmado por mtodos especficos como
o FTA-ABS (fluorescent treponemal antibody absortion) e TPHA (treponema pallidum
hemaglutination).
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Falsos Negativos: Sfilis Primria, Sfilis Tardia, efeito de prozona.
Amostra: Soro ou Plasma
7. IMUNODIFUSO RADIAL SIMPLES
Placa Monoteste para C3 e C4

C3 e C4 tm significado no diagnstico, deteco e monitorizao em algumas
desordens do imunocomplexo, nomeadamente, LES, vasculite, glomerulonefrite,
crioglobulinemia e anemia hemoltica autoimune.
Nas reaces de imunidade humoral identificam-se e/ou quantificam-se os

antignios e anticorpos, avaliando-se igualmente possveis alteraes na sua produo.
Destas fazem parte as reaces de precipitao que so, geralmente, reaces muito
especficas mas pouco sensveis.
A imunodifuso utilizada para a anlise qualitativa e quantitativa de antignios

e anticorpos. Baseia-se no aparecimento de uma reaco de precipitao, isto , na
formao de um complexo Ag-Ac insolvel a partir de antignios e anticorpos solveis.
Embora a formao de complexos Ag-Ac em meio semi-slido, como o gar, dependa
dos electrlitos de tamponamento, do pH e da temperatura, os determinantes mais
importantes da reaco consistem nas concentraes relativas de antignio e anticorpo.
A precipitao mxima ocorre na rea de equivalncia, com quantidades decrescentes
nas zonas de excesso de anticorpo ou excesso de antignio. Por conseguinte, a formao
de linhas de precipitao em qualquer sistema de imunodifuso depende altamente das
concentraes relativas de antignio e anticorpo. (7)(11)
Em 1965, Mancini introduziu uma nova tcnica envolvendo a difuso simples

para a determinao quantitativa de antignios, atravs da incorporao de um anticorpo
especfico na placa de gar. A difuso radial (IDRS) baseia-se na relao quantitativa
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que existe entre a quantidade de antignio colocado num orifcio da placa de gar e a
formao do halo de precipitao.
A IDRS um teste quantitativo, sendo uma tcnica utilizada, preferencialmente,

para o doseamento de protenas contra as quais se dispe de um anticorpo,
nomeadamente o doseamento de fraces do complemento. Utiliza uma gelose na qual
se incorporou o anticorpo e aplica-se (em orifcios escavados na gelose) um volume fixo
de cada amostra. A determinao da sua concentrao possvel por leitura do dimetro
do halo de precipitao da amostra comparativamente com uma tabela pr-definida em
funo do dimetro do halo/concentrao.
Amostra: Soro
8. IMUNOPRECIPITAO
Crioglobulinas
As crioglobulinas so imunoglobulinas que precipitam reversivelmente

formando um gel, quando expostas ao frio. O processo revertido pelo aquecimento.
Consistem de imunoglobulinas simples ou complexos de Igs, que podem fixar o
complemento e iniciar uma reaco inflamatria semelhante produzida pelos
imunocomplexos. Estas podem ser de origem idioptica ou relacionar-se com patologia
linfoproliferativa, infeces ou patologia autoimune. Estas classificam-se em diferentes
tipos, consoante a constituio das Igs: Tipo 1, associada a patologia dos plasmcitos ou
patologia linfoproliferativa com gamapatia monoclonal detectvel (IgM ou IgG
monoclonais); Tipo 2, o mais comum e associado a infeco por hepatite C, patologias
linfoproliferativas, doenas do tecido conjuntivo (IgM monoclonal com actividade de
FR e IgG policlonal); Tipo 3, consistindo de uma mistura de crioglobulinas policlonais,
normalmente complexos IgM-IgG, que aparece na Hepatite C, HIV, CMV, EBV,
endocardite bacteriana, patologias provocadas por espiroquetas, fungos e parasitas, e
algumas patologias autoimunes (lpus, artrite reumatide, cirrose biliar primria). (10)
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As crioglobulinas so protenas que precipitam com o frio e se redissolvem a
37C. Para a sua pesquisa coloca-se o sangue no banho a 37C, durante 30 minutos,
centrifuga-se, separa-se o sobrenadante e coloca-se no frio 3 a 7 dias. Se no se verificar
a formao de precipitado o resultado negativo. Se se formar precipitado, devem ser
doseadas IgA, IgG e IgM, cadeias leves e factor reumatide.
Amostra: Soro colhido em seringa quente, a 37C
9. IMUNOCROMATOGRAFIA
9.1. hCG-OREA
A -HCG uma hormona produzida pela placenta, constituda por uma

subunidade e uma subunidade . A primeira comum a outras hormonas como a LH,
FSH e TSH, e a segunda especfica desta hormona. utilizada nos testes qualitativos no
diagnstico da gravidez, visto os seus nveis serem detectveis 7 a 10 dias aps a
concepo.
Trata-se de um teste imunolgico de gravidez por deteco qualitativa da

gonadotrofina corinica humana no soro e urina.
Este teste imunocromatogrfico baseia-se no princpio da sandwich. A amostra

vai migrar ao longo da membrana at atingir o conjugado coloidal anti--hCG. No caso
de uma amostra positiva, a -hCG vai ser imobilizada em sandwich entre o conjugado e
o anticorpo anti-hCG. A acumulao do complexo imune imobilizado vai levar ao
desenvolvimento de uma linha cor-de-rosa na rea da linha teste, indicando que a
amostra positiva para a deteco de -hCG.
Pode produzir resultados falsos positivos noutras situaes em que existam

nveis elevados de HCG tais como, patologias trofoblsticas e tumores testiculares.
Pode produzir resultados falsos negativos na presena de nveis de HCG abaixo do
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limite de sensibilidade do teste, devendo, em caso de suspeita de gravidez, repetir o
ensaio aps 48h.
Amostra: Urina, Soro
9.2. IM-teste
A infeco pelo EBV encontra-se largamente difundida, transmitindo-se o vrus

pela saliva aps contacto directo. Possui tropismo para os linfcitos B e para as clulas
epiteliais das glndulas salivares, mantendo-se latente aps infeco primria podendo
sofrer reactivaes peridicas. A consequncia mais comum de uma infeco pelo EBV
a activao policlonal dos linfcitos B e a proliferao benigna destes linfcitos. A
Mononucleose (MI) uma infeco assintomtica ou com sintomas que duram 1 a 2
meses,
manifestando-se
por
febre,
linfoadenopatias,
faringite,
fadiga
hepatoesplenomegalia (mais raramente existir envolvimento do corao e SNC). O

diagnstico das infeces por EBV essencialmente serolgico (para alm de clnico e
hematolgico), efectuando-se a pesquisa de Acs heterfilos (IM-teste), pesquisa de Acs
especficos anti-EBV dirigidos contra a cpside viral (VCA IgG e IgM), Acs dirigidos
contra Ags precoces (anti-EA) e Acs contra Ags nucleares (anti-EBNA).
Este teste em placa utilizado no diagnstico da MI atravs da deteco de

anticorpos heterfilos IgM no soro, plasma e sangue total.
Os Acs heterfilos so Acs de classe IgM que cuja produo estimulada na

presena do EBV mas que no se ligam s protenas virais. Estes aparecem no soro ao
6 a 10 dia do incio da doena, encontrando-se ttulos mais elevados na segunda e
terceira semana. Os Acs podem-se manter detectveis entre 1 semana a 1 ano,
persistindo em mdia entre 4 a 8 semanas. O nvel de Acs no se encontra relacionado
com a severidade da infeco.
O mtodo contempla a combinao de um conjugado colorido anti-IgM e

extracto de eritrcitos de cavalo para uma deteco especfica de anticorpos heterfilos
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de EBV com um alto grau de sensibilidade. A amostra depositada na placa flui atravs
do absorvente de forma que o complexo Ag-Ac (anti IgM-conjugado-Ac heterfilo)
fixado na zona onde h um extracto de eritrcitos de cavalo produzindo uma banda de
cor rosada. Os complexos no ligados a anticorpos fluem atravs do absorvente at uma
zona de controle onde so capturados por anti-imunoglobulinas, produzindo uma banda
de cor rosada.
Amostra: Soro, plasma ou sangue total
9.3. HCVSCAN
A hepatite C causada pelo Vrus da Hepatite C (VHC), um vrus com genoma

RNA. A transmisso ocorre por via parenteral (transfuses, hemodilise, exposio
ocupacional, utilizao de seringas contaminadas). A transmisso perinatal e por via
sexual so pouco frequentes. A infeco evolui para a cronicidade em cerca de 80% dos
casos e na maioria dos casos assintomtica. A Hepatite C crnica caracteriza-se por
nveis flutuantes de alanina aminotransferase (ALT), alteraes da histologia heptica
evoluindo para cirrose em 20% dos casos. O diagnstico da Hepatite C efectuado por
meio de tcnicas serolgicas e directas.
Trata-se de um teste qualitativo para a deteco de anticorpos do HVC, em soro

ou plasma humano.
Os anticorpos presentes na amostra so capturados e imobilizados pelo antignio

que se encontra imobilizado na membrana da placa. A presena de anticorpos ligados
revelada pelo tratamento posterior com um conjugado, Proteina A-Gold, que se liga aos
anticorpos anti-HVC adsorvidos formando uma colorao vermelha na membrana da
placa. Este teste deve ser usado apenas como rastreio inicial.
- 53 -

10. ENSAIO IMUNOENZIMTICO (EIA)
Imunoensaio em que se utiliza como marcador um enzima. Permite o estudo de

anticorpos e antignios em circulao ou fixados nos tecidos. Conhecem-se duas
modalidades de EIA:
-
EMIT (Enzyme Multiple Immunosorbent Technique) ou EIA em fase

homognea, no qual no necessrio separar a fraco ligada da fraco livre.
uma modalidade com um campo de aplicao restrito, sendo utilizado no
doseamento de certos frmacos. Apresenta uma menor sensibilidade.
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ou EIA em fase heterognea,

no qual se procede separao da fraco ligada e da fraco livre. A verso
mais comum de ELISA recorre ao princpio sandwich. O anticorpo ou o
antignio encontra-se fixo a uma superfcie e a amostra a testar aplicada, sendo
detectado o componente ligado. O mtodo de ELISA permite dosear anticorpos
ou antignios procedendo marcao de um deles com uma enzima (por
exemplo, peroxidase, fosfatase alcalina ou -galactosidase). A actividade final
avaliada pela adio de um substrato sobre o qual a enzima de marcao vai
actuar dando origem a um cromogneo. Esta tcnica rpida, simples e
facilmente adaptvel a analisadores automticos.(8)(11)
As enzimas mais utilizadas na deteco so a peroxidase e a fosfatase alcalina,

podendo ser ligadas covalentemente a anticorpos sem afectar a sua capacidade de
ligao ao antignio e sem inibir a actividade da enzima. Muitos autoanalisadores usam
substractos da peroxidase que produzem produtos quimioluminiscentes, aumentando a
sensibilidade.
A utilizao de anticorpos monoclonais e antignios recombinantes promoveu o

uso mais amplo de ELISA, permitindo obter uma maior especificidade.
Podem ocorrer falsos positivos por causas de natureza no-imunolgica,
relacionadas, por exemplo, com a actividade pseudoperoxidase encontrada nos grupos
hemo dos eritrcitos.
10.1. ImmunoDOT (GenBio workstation)
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Autoanticorpos so imunoglobulinas contra auto-antignios intracelulares
(ANA), membranares ou extra-celulares. Actualmente no est padronizada nenhuma
tcnica, nem unidades, para a deteco de autoanticorpos. Assim, difcil a comparao
de valores de laboratrios diferentes. Um outro problema que se verifica a nvel
laboratorial a variabilidade entre indivduos.
Trata-se de um teste de rastreio imunoenzimtico para a deteco de

autoanticorpos contra diversos antignios especficos nucleares: anticorpos totais
antinucleares (ANA), anticorpos para os antignios nucleares cido desoxirribonucleico
(DNA), antignio A do sndroma de Sjogren (RO), antignio B (La), ribonucleoprotena
(RNP) e antignio Smith (Sm).
Os anticorpos dos doentes reagem com os antignios ligados a uma membrana

slida; aps remoo dos materiais no ligados, a fosfatase alcalina conjugada com
anticorpos anti-humanos vai reagir com os anticorpos dos doentes fixados. Um
substrato enzimtico reage com a fosfatase alcalina formando um produto final corado.
Esta tcnica no deve ser usada como critrio nico a estabelecer na doena
autoimune, sendo necessrias informaes adicionais laboratoriais, clnicas e
epidemiolgicas.
Amostra: Soro
10.2. ImmunoComb
A Chlamydia trachomatis uma bactria de gram-negativo intracelular

obrigatria. Existem vrios imunotipos responsveis por diferentes tipos de infeces:
A, B, Ba e C, so normalmente responsveis por infeces oculares (tracoma); B, D, E,
F, G, H, I, J, K so responsveis por infeces genito-urinrias; e os L1, L2 e L3 so os
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responsveis pelo linfogranuloma venreo. As infeces genitais causadas por
Chlamydia trachomatis so das doenas sexualmente transmissveis mais comuns. Esta
manifesta-se por uretrite, proctite e conjuntivite nos dois sexos, epididimite nos
homens, e cervicite mucopurulenta, salpingite aguda e bartolinite nas mulheres. Na
maioria dos casos estas infeces so no entanto assintomticas. A infeco na gravidez
est associada a parto prematuro, endometrite puerperal, conjuntivite neonatal e
pneumonia dos lactentes.
O Helicobacter pylori considerado actualmente como o principal agente

etiolgico das doenas gastroduodenais. um bacilo gram-negativo, de forma
espiralada, responsvel pelas gastrites e implicado na lcera gastroduodenal e no cancro
gstrico. A sua prevalncia a nvel da populao portuguesa bastante elevada,
atingindo cerca de 80% de indivduos em idade adulta. O diagnstico laboratorial da
infeco por Helicobacter pylori complexo, podendo-se recorrer a mtodos de
diagnstico directos e indirectos. Os mtodos directos, como a cultura, o exame
histolgico e a deteco da actividade uresica baseiam-se na deteco desta bactria a
partir de biopsias gstricas obtidas por endoscopia. Dentro dos mtodos indirectos so
largamente utilizados o teste respiratrio com ureia marcada e a serologia.
Recentemente foi desenvolvido um novo teste no invasivo, consistindo na deteco de
Ags de Helicobacter pylori nas fezes.
O presente teste utilizado para a determinao semiquantitativa de anticorpos

IgA para Chlamydia trachomatis e determinao semi-quantitativa de IgG para
Chlamydia trachomatis e Helicobacter pylori. Trata-se de um EIA indirecto em fase
slida.
O kit contm placas reveladoras com todos os reagentes necessrios para a
realizao do teste e um pente (fase slida com Ag inactivados) que inserido
sucessivamente nos poos da coluna da placa. Na coluna A ocorre a reaco Ag-Ac,
seguindo-se a lavagem dos componentes livres na coluna B; na coluna C d-se a reaco
de conjugao com Ac marcados com fosfatase alcalina; procede-se a uma nova
lavagem dos componentes livres nas colunas D e E e, por fim, na coluna F verifica-se
reaco de colorao (a fosfatase alcalina reage com componentes cromognicos).

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11. ENSAIO ENZIMO-FLOURESCENTE (ELFA) / MINI VIDAS
O Mini-Vidas utiliza o mtodo imunoenzimtico por sandwich com deteco

final por fluorescncia. A reaco decorre em fase slida (cone); os determinantes
antignicos/anticorpos
da
amostra
so
capturados
pelas
imunoglobulinas
monoclonais/antignios fixadas no cone e, aps lavagem dos componentes no fixados,

o anticorpo marcado com fosfatase alcalina liga-se aos determinantes antignicos. Uma
segunda lavagem elimina o conjugado no fixado. Durante a etapa final de revelao, o
substrato (4-metil-umbeliferil fosfato) hidrolisado a 4-metil-umbeliferona, sendo a
reaco catalisada pela enzima do conjugado. O produto final emite fluorescncia
proporcional concentrao dos determinantes antignicos.
O Mini-VIDAS um sistema multiparamtrico de imunoensaio com 5 seces

diferentes, tendo cada uma 6 posies de testes, o que permite que diversos parmetros
sejam efectuados em simultneo (figura 7). As anlises podem ser realizadas teste a
teste ou em srie.
O sistema VIDAS utiliza testes unitrios prontos a usar. Os cones so o suporte

de pipetagem e a fase slida da reaco, estando sensibilizados com Ag ou Ac. A
barrete contm todos os reagentes necessrios reaco. Os reagentes unitrios so de
uso nico, tendo a vantagem de ausncia de contaminao.
Tem capacidade para a realizao de 60 testes/hora, sendo a identificao do
doente feita manualmente, sem cdigo de barras. Cada lote tem uma calibrao que
memorizada pelo aparelho.
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Figura 7
Este equipamento utilizado na anlise quantitativa de -hCG, alfafetoprotena, CA-15.3, CK-MB, CMV IgG e IgM, Anti-HAV total e IgM, HIV DUO
(Ag-p24 do HIV1, HIV 1 IgG e HIV 2 IgG), Ac anti-Rubola IgG e IgM, Ac antiToxoplasmose IgG e IgM, IgE total, IgE especficas (por exemplo, Dermatophagoides
farinae, Caspa de gato, Epitlio de co, Clara de ovo, Leite de vaca, Bacalhau, Barata,
Plen de Oliveira, Plen de Parietria) e Testosterona.
Alfa-fetoprotena (AFP):
A AFP uma glicoprotena sintetizada pelo fgado, saco vitelino e em menor
quantidade pelo trato gastrointestinal do feto. Foi identificada como antignio oncofetal.
Durante a gravidez a concentrao de AFP no lquido amnitico atinge o
mximo na 13 semana e diminui rapidamente at 22 semana, diminuindo depois
progressivamente. O ttulo de AFP no soro materno ou lquido amitico tem interesse
na deteco de anomalias do fecho do tubo neural, anencefalia e espinha bfida.
Em 70% dos casos de carcinomas hepatocelulares a AFP encontra-se elevada.
tambm um marcador de escolha para os tumores germinais no seminomatosos.
Amostra: Soro, plasma (heparina ou EDTA)
-hCG:
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A biossntese da hCG assegurada principalmente pelo sinciciotrofoblasto
placentrio. Durante os trs primeiros meses de gravidez, a concentrao srica da hCG
vai aumentar progressivamente at atingir um mximo, depois vai diminuir at 16
semana estabilizando at ao final da gravidez. O papel fisiolgico da hCG de manter o
corpo amarelo, permitindo a sua transformao em corpo amarelo gestacional e de
estimular a produo da progesterona e de estrognios durante o primeiro trimestre da
gravidez. Por outro lado, parece que a hCG intervm na diferenciao do tracto genital
fetal. O doseamento da hCG um elemento essencial do diagnstico e do
acompanhamento da gravidez (gravidez extra-uterina, embrio hidatiforme). utilizada
no rastreio Pr-Natal para rastreio de Defeitos do Tubo Neural e Sndrome de Down.
A hCG pode tambm ser produzida por alguns tecidos tumorais, principalmente
os de origem trofoblstica (coriocarcinoma). Neste mbito, a hCG pode ser um
marcador biolgico de importante utilidade clnica, tanto para o prognstico como para
o acompanhamento teraputico.
CA-15.3:
O CA-15.3 um teste complementar no prognstico e seguimento do tratamento
de pacientes com tumores malignos diagnosticados. O valor do teste pode diminuir aps
tratamento e aumentar em caso de recada, doena residual e metstases. Est mais
associada a cancros da mama, e alguns cancros do pulmo.
CK-MB:
A creatina quinase (CK) uma enzima essencial do metabolismo muscular. Est
presente em todos os tecidos, mas com concentraes variveis e sob isoformas
diferentes. A fraco MB localiza-se sobretudo no miocrdio. Na ausncia de um
traumatismo muscular maior, um aumento de CK-MB sinnimo de aparecimento de
leses cardacas que tiveram origem durante um enfarte do miocrdio. Geralmente
detecta-se a partir da 5 hora a seguir s does torcicas, atingindo o mximo entre a 11 a
18 hora. Outras situaes com aumento de CK-MB incluem a doena de Duchenne,
hiperactividade muscular, miocardite, hipo e hipertermia.
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CMV IgG e IgM:
O CMV, vrus pertencente famlia Herpesviridae, encontra-se largamente
distribudo na espcie humana. A sua transmisso ocorre por via vertical (durante a
gestao, no trabalho de parto ou no aleitamento), ou por contacto com lquidos
biolgicos onde o vrus pode estar presente, nomeadamente urina, saliva, sangue, smen
e fluidos vaginais. A transmisso pode ainda ocorrer em consequncia de transfuses ou
transplantes. Na maior parte dos casos a infeco pelo CMV est associada ausncia
de sintomatologia ou a situaes benignas, podendo nalguns casos ocorrer uma
sndrome mononuclesico com febre ou ainda hepatite. Aps a infeco primria, o
vrus fica latente podendo sofrer reactivaes ao longo da vida do hospedeiro. No
entanto, em certos grupos de risco, a infeco pelo CMV pode tornar-se extremamente
preocupante. Exemplos destes grupos so os imunodeficientes e a mulher grvida, esta
ltima pelo risco de transmisso de infeco para o feto. Durante a gravidez, o maior
risco para o feto provm de uma primo-infeco congnita (adquirida durante a
gestao).
Nos indivduos imunocompetentes, o diagnstico da infeco feito apenas pela
serologia. Os critrios de diagnstico so a seroconverso das IgG (verificada em duas
amostras colhidas com um intervalo de 2 semanas) e a presena de uma IgM positiva.
Esta IgM positiva confirmada pela avidez das IgG. Uma avidez elevada relaciona-se
com uma infeco com mais de 3-4 meses. Nos indivduos imunodeprimidos, positivos
para o HIV e transplantados, so mais importantes as tcnicas de deteco directa do
vrus (tcnica de antigenmia e de biologia molecular). A serologia importante para o
pr-transplante.
Na mulher grvida, o despiste de infeco primria efectuada essencialmente
com recurso serologia. A presena de IgM negativas e IgG positivas manifesta uma
infeco antiga, sem risco de primo-infeco na gravidez, e como tal esta mulheres no
necessitam de acompanhamento adicional. A presena de IgM e IgG negativas revelam
uma situao em que ainda no houve contacto com o vrus, existindo risco de primoinfeco na gravidez, pelo que a grvida deve ser vigiada at 20 semana. A presena
de IgM positiva e IgG negativa poder significar uma de duas coisas: um falso positivo
para a IgM ou o incio de uma primo-infeco. Neste caso dever repetir-se a
determinao aps 2 semanas, e caso se trate de uma primo-infeco haver
seroconverso das IgG. Por fim, a situao em que tanto IgM como IgG se encontram
positivas. Estes caso pode manifestar uma primo-infeco aguda recente, uma primoJoana Selada Domingues
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infeco antiga, uma reactivao ou um falso positivo para IgM. Um resultado destes
exige confirmao. Esta confirmao efectuada pela determinao da avidez das IgG,
com o objectivo de situar a infeco no tempo. A presena de uma avidez elevada
indica-nos que a infeco ter ocorrido h mais de 4 meses. Se confirmada a infeco
congnita, procurar-se- confirmar se existiu transmisso para o feto. Esta feita pela
deteco directa do vrus (PCR ou cultura) pela amniocentese. Na existncia de infeco
congnita com gravidez no interrompida, ser importante a realizao do diagnstico
ps-natal. Este dever ser feito nas primeiras 3 semanas de vida, pois caso contrrio no
se conseguir distinguir uma infeco congnita de uma infeco ps-natal. Este feito
por pesquisa directa do vrus numa amostra de urina colhia at s primeiras 3 semanas.
Amostra: Soro
Ac anti-HAV total e IgM:

A hepatite A causada pelo Vrus da Hepatite A (VHA), um vrus com genoma
RNA da famlia Picornaviridae. A infeco manifesta-se clinicamente por uma
patologia moderada anictrica ou hepatite severa com ictercia prolongada. Transmite-se
predominantemente por via oral-fecal, sendo rara a sua transmisso sangunea (virmia
transitria), sexual (contactos anais) e saliva (objectos contaminados). O seu perodo de
incubao de 28 dias em mdia, ao fim do qual surgem a febre, fadiga, mialgia,
anorexia, nuseas, vmitos, ictercia, com urina escura e fezes plidas. A durao da
infeco varivel mas normalmente os indicadores clnicos e bioqumicos regridem ao
fim de 4 a 8 semanas, podendo o indivduo manter-se transmissor por um perodo de
tempo superior. No evolui para a cronicidade. Existem alguns casos de hepatite
fulminante atribudos ao VHA. A hepatite provocada pela destruio do hepatcito
por aco directa do sistema imunitrio e no por aco do vrus sobre os hepatcitos
infectados.
O diagnstico da infeco pelo VHA comea por ser clnico e bioqumico
(aumento das transaminases e bilirrubina). No entanto a confirmao da etiologia
baseia-se essencialmente na determinao de Acs anti-VHA. A determinao do Ac-anti
HVA IgM o mtodo de eleio para diagnstico de uma infeco aguda pelo VHA. O
Ac-anti HVA IgG positiva durante a hepatite aguda e mantm-se positivo
indefinidamente.
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IgE:
As Imunoglobulinas de classe IgE medeiam muitas das reaces alrgicas,
actuando como pontos de ligao entre os alergenos e a superfcie dos mastcitos e
basfilos, e a subsequente ligao dos alergenos s IgEs ligadas resulta na
desgranulao destas clulas, com libertao de histamina e outras substncias
vasoactivas, iniciando deste modo o quadro conhecido como reaco alrgica. Na
presena de reaces alrgicas mediadas pela IgE, torna-se depois importante distinguir
qual ou quais as IgE especficas que se encontram aumentadas, de forma a localizar qual
o alergeno que provocou a sensibilizao e reaco alrgica. Geralmente os nveis de
IgE apresentam ligeiros aumentos durante a infncia (fase de sensibilizao em que
surgem os primeiros contactos com os alergenos). Nesta fase traduz-se normalmente por
problemas gastrointestinais e dermatites atpicas, podendo persistir por toda a vida. Na
adolescncia predominam as dificuldades respiratrias, com risco de vir a desenvolver
asma na idade adulta.
Pode observar-se aumentos significativos noutros quadros no alrgicos:
mieloma a IgE, aspergilose pulmonar, fase activa de infeces parasitrias, etc.
HIV DUO (Ag-p24 do HIV1, HIV 1 IgG e HIV 2 IgG):

O Vrus da Imunodeficincia Humana (VIH), o qual pode ser de dois tipos,
HIV1 e HIV2, o agente etiolgico do Sndrome de Imunodeficincia Adquirida
(SIDA). transmitido por contacto sexual (homo e heterossexual), parenteral, perinatal,
transplacentrio. A infeco pelo HIV uma infeco dita crnica/persistente, uma vez
que o hospedeiro infectado incapaz de eliminar o agente infeccioso. O percurso
patognico desta infeco passa por trs fases: Fase primria, caracterizada por uma
elevada replicao viral e ausncia de resposta imunolgica por parte do hospedeiro;
Fase assintomtica, caracterizada por cargas virais baixas devido forte resposta
imunolgica do hospedeiro; Fase sintomtica, com aparecimento de infeces
oportunistas devidas diminuio da resposta imunolgica, causada pela diminuio
dos linfcitos T-CD4+. Os mtodos de diagnstico da infeco pelo HIV dividem-se em
dois grupos: Mtodos directos, onde se pe em evidncia a presena da partcula viral
ou de componentes dessa partcula viral (isolamento viral, PCR, Agp24), e mtodos
indirectos, onde se pe em evidncia a presena de Acs especficos para os Ags virais
(Testes de rastreio e Testes confirmatrios). A presena de Acs numa amostra
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suficiente para concluir que se trata de algum infectado pelo HIV. Isto apenas no se
verifica no caso de crianas recm-nascidas (idade inferior a 18 meses) cujas mes
sejam seropositivas para o HIV, uma vez que os Acs maternos (IgG) so transferidos
passivamente atravs da placenta.
A deteco combinada da antigenmia p24 e dos Acs anti-HIV1 e anti-HIV2
(ensaios de 4 gerao) reduz o tempo de deteco da infeco aps exposio para
cerca de 16 dias. Os testes de rastreio apresentam como caractersticas principais o facto
de terem sensibilidade de 100% (no devero ocorrer falsos negativos) e uma
especificidade abaixo dos 100%. Esta ltima faz com que possam ocorrer resultados
falsos positivos, da que qualquer resultado positivo num teste de rastreio imponha a sua
confirmao por testes com maior especificidade (Western blot).
Amostra: Soro, plasma (heparinato de ltio ou EDTA)
Ac anti-Rubola IgG e IgM:

A rubola uma infeco viral de curta durao, geralmente discreta e benigna,
quer no adulto quer na criana. Caracteriza-se por linfadenopatias, erupes
maculopapulosas, febre e um mal-estar geral. A importncia desta doena est
relacionada com a sua capacidade de levar a malformaes graves no feto cuja me foi
infectada durante a gravidez, mais particularmente quando a primo-infeco se produz
durante o primeiro trimestre.
O vrus da rubola transmite-se por gotculas de saliva ou pelas secrees
nasofarngeas. O indivduo infectado contagioso 8 dias antes a 8 dias aps o incio dos
sinais clnicos. No perodo de incubao ocorre virmia e disseminao do vrus.
A serologia para a rubola utiliza-se para verificao da existncia de imunidade
aps vacinao, avaliao da imunidade antes ou durante a gravidez, e avaliao da
existncia de infeco aguda. Neste ltimo caso, os Acs possuem um pico mximo 2
semanas aps o aparecimento da erupo, sendo necessria a demonstrao do aumento
de ttulo de IgG durante 3 semanas e aparecimento de Acs de classe IgM. No entanto
por vezes ocorrem IgM falsas negativas e falsas positivas, e mais raramente, aparecer na
reinfeco. Se no houver aumento da percentagem de IgG, este facto no permite
excluir totalmente uma infeco de rubola activa. S a avidez das IgG permitir
afirmar o diagnstico da infeco da rubola em curso.
As amostras com ttulos superiores a 400 UI/ mL so novamente doseadas aps
diluio a 1/3 com soro fisiolgico. Qualquer amostra que se situe na zona equvoca
- 63 -

novamente analisada e se permanecer repetidamente equivoca a anlise repetida num
soro colhido aps 2 a 3 semanas.
Testosterona:
A testosterona uma hormona que existe em maiores concentraes no homem
que na mulher, e que circula no plasma 60% ligada fortemente (SHBG), cerca de 40%
ligada albumina e cerca de 2% na forma livre. A sua secreo controlada no homem
pela LH, que se liga os receptores das clulas de Leydig nos testculos, aumentando a
converso de colesterol em testosterona. Na mulher, a maioria da testosterona deriva do
metabolismo da androstenediona, sendo secretadas pequenas quantidades directamente
pelos ovrios e glndulas suprarrenais. O mecanismo de retroaco ao nvel do
hipotlamo e pituitria ir depender dos nveis de testosterona livre e seus metabolitos.
A testosterona utilizada no homem para avaliao da funo das clulas de
Leydig, monitorizao da teraputica de substituio com testosterona, etc. Pode
tambm encontra-se aumentada nalguns tumores das clulas de Leydig e Sertoli, e em
caso de resistncia aos androgneos. Nas mulheres, a deficincia em androgneos no
possui significado clnico, mas o seu excesso disturba o ciclo menstrual, conduz a
hirsutismo e virilizao. Os nveis de testosterona total podero ainda aumentar ou
diminuir sempre que existir um aumento ou diminuio dos nveis de SHBG,
respectivamente.
Amostra: Soro, plasma (heparina)
Ac anti-Toxoplasmose IgG e IgM:

A toxoplasmose uma parasitose provocada pelo parasita intracelular
obrigatrio Toxoplasma gondii, o qual possui como hospedeiro definitivo o gato. uma
afeco extremamente frequente e habitualmente benigna, com excepo da infeco
primria na grvida (pelo risco de contaminao e leso para o feto) e da
infeco/reactivao nos imunodeprimidos. A infeco no homem pode ocorrer por via
alimentar (quistos na carne mal cozinhada), por via ambiental (oocistos libertados nas
fezes dos gatos) ou transmisso vertical atravs da placenta lesada.
Para alm do diagnstico, ser importante na primo-infeco na grvida,
determinar a data da contaminao para determinar o risco de contaminao fetal ( a
incidncia de infeco fetal varia de acordo com a altura do perodo gestacional em que
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ocorreu a contaminao, sendo superior a partir da 29 semana e inferior na fase prconcepcional) e o prognstico.
Na infeco primria verifica-se o aparecimento de Acs anti-Toxoplasma gondii
IgM, que desaparecem ao fim de 8 meses a 2 anos. A ausncia prvia de Acs antiToxoplasma gondii IgG e um aumento do seu ttulo entre duas colheitas realizadas com
um intervalo de cerca de 2 semanas so a favor de uma primoinfeco. No caso de
suspeita de infeco, a serologia pode tambm ser utilizada no controlo do recmnascido: existindo infeco, aps diminuio das IgGs maternas verificar-se- um novo
aumento, correspondendo agora s IgG produzidas pelo recm-nascido.
12. ELECTROQUIMIOLUMINISCNCIA/ MODULAR E
Trs princpios do teste esto disponveis:

-
competitivo
Para analtos de baixo peso molecular (por exemplo, FT3)

Ao Ac anti-T3, ligado ao complexo de rutnio, so adicionadas micropartculas de
estreptavidina e T3; os Ac ainda livres so ocupados e os complexos Ac-haptenos
ligam-se s micropartculas; o reagente livre removido; a quantidade de luz produzida
inversamente proporcional quantidade de Ag na amostra do paciente
-
sandwich
Para analtos de elevado peso molecular (por exemplo, TSH)

A amostra do paciente combinada com Ac anti-TSH biotinilado e um Ac especfico
para TSH ligado a rutnio; os Ac capturam a TSH presente na amostra. Num segundo
passo, as micropartculas so adicionadas e o reagente livre lavado; a quantidade de
luz produzida directamente proporcional quantidade de TSH.
-
bridging
Deteco de anticorpos
Princpio similar sandwich, excepo da deteco de Ac em vez de Ag
As reaces decorrem em fase slida com Ac monoclonais.
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O Modular E permite a quantificao dos parmetros da tiride (TSH, T3, T4,
FT3, FT4, Anti-TPO, Anti-TG), hormonas (estradiol, FSH, LH, progesterona,
prolactina), marcadores tumorais (CA125, CA 19.9, CEA, FPSA, PSA) e marcadores de
hepatite B (Anti-HBc, Anti-Hbe, Anti-HBs, AgHBe, AgHBs).
Parmetros da tiride (TSH, T3, T4, FT3, FT4, Anti-TPO, Anti-TG):
A TSH constitui o principal factor de estimulao da glndula da tiride que

determina a produo das hormonas T3 e T4. Em contrapartida, estas hormonas
exercem um retrocontrolo na hipfise anterior que trava a secreo de TSH. A secreo
da TSH est, alm disso, sob o controlo do sistema nervoso central pelo intermdio da
TRH e de neuromediadores como a somatostatina ou a dopamina.
A medio da concentrao de TSH o parmetro mais fivel para excluir uma
disfuno tiroideia. No caso de hipertiroidismo, a concentrao de TSH diminui
fortemente. Nos casos de hipotiroidismo primrio, a concentrao da TSH sempre
nitidamente muito superior ao normal, acompanhada por uma diminuio das hormonas
da tiride.
A Tiroxina (T4) e a triiodotironina (T3) so conjuntamente conhecidas como

hormonas da tiride. So sintetizadas na glndula tiride pela iodinao e acoplamento
de duas molculas de tirosina enquanto ligadas a uma protena complexa chamada
tiroglobulina. A glndula tiride secreta a maioria da T4 mas s cerca de 20% da
triiodotironina (T3) de origem tiroideia. Os tecidos perifricos, especialmente o fgado
e rim, desionizam a T4 para produzir aproximadamente dois teros da T3 circulante. A
maioria das clulas capaz de captar a T4 e desioniz-la na forma biologicamente mais
activa, T3. a T3 que se liga aos receptores e desencadeia os efeitos nos rgos alvo
das hormonas da tiride. As hormonas da tiride so essenciais para a maturao normal
e metabolismo de todos os tecidos no organismo, influenciando as taxas de sntese de
protenas e carbohidratos.
No plasma, mais de 99,95% da T4 transportada ligada a protenas. A TBG
transporta cerca de 70% da T4, a albumina aproximadamente 25% e a transtiretina
(designada antigamente por pr-albumina) cerca de 5%. Mais de 99,5% da T3
transportada pelas mesmas protenas. a concentrao da forma no ligada, livre, da T3
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e T4 que importante para os efeitos biolgicos das hormonas, incluindo o feedback da
hipfise e hipotlamo.
O hipertiroidismo caracterizado pelo aumento da produo de hormonas da
tiride. O hipotiroidismo caracterizado pela diminuio da produo de hormonas da
tiride.
Os anticorpos antitiroideus so encontradas em vrias patologias da tiride e
outras doenas auto-imunes, dirigindo-se contra vrios antignios da glndula e das
hormonas tiroideias. Estes incluem os anticorpos anti- tiroglogulina (Anti-TG),
anticorpos anti-peroxidase (anti-TPO), anticorpos contra os receptores da TSH, etc.
Os Anti-TG aparecem aumentados em indivduos com tiroidite de Hashimoto
(patologia autoimune que cursa com a destruio da glndula tiride que se manifesta
clinicamente sob a forma de hipotiroidismo); doena de Graves (forma de
hipertiroidismo causado pelo aparecimento de anticorpos contra receptores da TSH) e
outras patologias autoimunes, aparecendo tambm em muitos indivduos eutiroideus.
No entanto, nveis elevados de Anticorpos anti-TPO surgem aumentados com mais
frequncia que estes. Como tal, a avaliao dos ATG torna-se mais til na interpretao
de resultados da determinao dos nveis de tiroglobulina visto que podem interferir
com os imunoensaios utilizados para a sua determinao.
Amostra: Soro, plasma (EDTA), citrato sdio possvel para FT4, T3 e TSH
Estradiol:
O estradiol (E2) faz parte dos trs estrogneos cuja avaliao utilizada na
prtica clnica. O E2 corresponde ao estrogneo mais abundante na mulher em idade
frtil, sendo quase totalmente de origem ovrica; na grvida, o estrogneo mais
abundante o estriol (metabolito da estrona e dos estradiol) e na ps-menopausa passa a
ser a estrona (de origem ovrica e parte resultante da converso perifrica da
androstenediona). No homem, a maioria do E2 produzido nos testculos.
O E2 encontra-se no plasma maioritariamente na forma conjugada: 60% ligado
albumina, 38% globulina de ligao s hormonas sexuais (SHBG) e 2 a 3% na forma
livre. O seu papel fisiolgico relaciona-se com o desenvolvimento das caractersticas
femininas secundrias. A sua avaliao pode ser utilizada para diagnosticar estdios
hiperestrognicos, como os tumores das clulas de Leydig nos testculos e tumores das
clulas granulosa-tecais, para confirmao da menopausa, na avaliao da ovulao, e
na avaliao das alteraes do ciclo menstrual ou fertilidade.
- 67 -

Amostra: Soro, plasma (EDTA, citrato)
FSH:
A FSH produzida de forma pulstil pelas clulas gonadotrficas da hipfise
anterior sob controlo do hipotlamo. assegurado um retrocontrolo negativo
principalmente pela inibina, cuja produo estimulada pela FSH.
No homem, a FSH exerce a sua aco em algumas clulas do tubo seminfero, as
clulas de Sertoli. Na mulher em idade frtil, a FSH em sinergia com a LH, intervm
directamente no desenvolvimento dos folculos ovarianos aumentando a sua produo
esteroideia, e determina a ovulao. Alm disso, a FSH estimula algumas clulas
foliculares (clulas da granulosa) levando produo de inibina. No incio da
menopausa, a produo de inibina diminui e observa-se um aumento importante do
nvel srico de FSH.
O doseamento de FSH, associado ou no da LH, um parmetro essencial da
explorao da funo da reproduo. Tanto no homem como na mulher amenorreica,
taxas elevadas demonstraro um hipogonadismo primrio e taxas baixas devem levar
pesquisa de um hipogonadismo secundrio.
Amostra: Soro, plasma EDTA
LH:
A LH produzida de forma pulstil pelas clulas gonadotrficas da hipfise
anterior, sob o controlo do hipotlamo. Uma regulao negativa assegurada pelas
hormonas esterides, cuja produo estimulada pela LH: testosterona no homem,
estradiol na mulher. No homem, a LH exerce a sua aco nas clulas clulas de Leydig
do testculo, estimulando assim a produo de testosterona. Na mulher, em idade frtil,
a LH em sinergia com a FSH intervm directamente no desenvolvimento dos folculos
ovarianos aumentando a sua produo esteroidiana, e determina a ovulao. Na
menopausa, a produo de estradiol diminui provocando o aumento da taxa srica de
LH.
Progesterona:
A PRG essencialmente uma hormona feminina. produzida principalmente
pelo corpo lteo nas mulheres no grvidas e pelas glndulas suprarrenais nos homens e
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mulheres aps menopausa. Durante a gravidez a placenta a principal fonte desta
hormona. Circula no soro ligada globulina de ligao ao Cortisol (18%), ligada
albumina (79%) e na formal livre (cerca de 3%). A sua importncia fisiolgica
relaciona-se com as alteraes cclicas produzidas no endomtrio necessrias nidao
e desenvolvimento do embrio. Ao nvel do diagnstico, a sua avaliao utilizada para
estudo da funo lutenica (cujos defeitos podero estar relacionados com infertilidade,
menorragias, etc.), verificao da eficincia da induo da ovulao (um valor elevado
no 21 a 22 dia do ciclo menstrual indicativo de ovulao), monitorizao da
teraputica de substituio com progesterona, avaliao do risco de aborto espontneo
nas primeiras semanas de gravidez (encontra-se reduzida nestas situaes), etc. Poder
encontrar-se aumentada na hiperprolactinmia e nos tumores das clulas de Leydig.
Os seus nveis so normalmente baixos durante a fase folicular, aumentam
significativamente aps a ovulao e atingem o mximo 5 a 9 dias depois ( 21 a 23
dia). Aps este pico, e se no houver gravidez h um declnio dos nveis plasmticos de
PRG
Prolactina:
A PRL uma hormona produzida pelas clulas lactotrficas da pituitria. O
controlo da sua secreo essencialmente inibitrio, pela dopamina, existindo no
entanto alguns factores que induzem a sua secreo como a TRH. A sua secreo
pulstil (da que por vezes se recomende a determinao em amostras colhidas
sequencialmente com intervalo de cerca de 30 minutos) e sofre variao circadiana, com
concentraes mais reduzidas ao meio-dia e mais elevadas durante o sono. A sua
libertao estimulada pela amamentao e por factores que induzem a inibio da
dopamina, tais como frmacos antidopaminrgicos. O seu papel a nvel fisiolgico
relaciona-se essencialmente com a induo e manuteno da lactao, podendo, quando
em concentraes elevadas inibir a actividade das gnadas, tanto no homem como na
mulher.
A determinao das concentraes de PRL especialmente til na avaliao da
hiperprolactinmia. A hipoprolactinmia no parece ter significado clnico, excepto na
confirmao do panhipopitutitarismo. Na mulher, a determinao da prolactinmia
utilizada sobretudo na avaliao da amenorreia primria e secundria, galactorreia,
infertilidade, suspeita de prolactinomas e hirsutismo. No homem, o seu doseamento
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utiliza-se na avaliao da ginecomastia, hipospermia, oligospermia, impotncia e
tambm na suspeita de prolactinomas.
Marcadores tumorais (CA125, CA 19.9, CEA, FPSA, PSA):

O CEA uma protena oncofetal cuja presena no plasma em determinadas
concentraes poder estar associada presena de tumores gastrointestinais,
essencialmente do clon. portanto considerado um marcador tumoral, sendo
recomendado como indicador de prognstico, deteco de recorrncias e monitorizao
de teraputica no cancro do clon, pela American Society for Oncology, no devendo
ser utilizado como rastreio dada a elevada sobreposio de valores em estados malignos
e no malignos. Nveis elevados de CEA so tambm encontrados noutras situaes no
malignas como algumas patologias hepticas, leses inflamatrias do tracto
gastrointestinal, infeces, nos fumadores, etc. Sendo a sua metabolizao heptica,
leses a este nvel podero conduzir a um aumento das concentraes sricas de CEA.
O PSA -Total uma serina protease sintetizada pelas clulas epiteliais da
glndula prosttica, responsvel pela liquefaco do smen de forma a promover a
libertao e motilidade dos espermatozides. Cerca de 540% do PSA-total encontra-se
na forma livre. A sua determinao til no rastreio, monitorizao do tratamento e
prognstico de doentes com cancro da prstata. Ao contrrio da maioria dos marcadores
tumorais apresenta uma elevada especificidade para o tecido prosttico, no entanto no
exclusivamente indicador de malignidade, podendo encontrar-se elevado tambm na
Hiperplasia Prosttica Benigna (HPB), prostatite aguda e crnica, reteno urinria,
massagem prosttica, etc.
A determinao do PSA-livre aumenta a especificidade do PSA-total na
deteco do cancro da prstata, especialmente quando os valores de PSA-total se
encontram entre 4 e 10 ng/mL. A utilizao da razo PSA-livre/PSA-total poder
reduzir o nmero de biopsias desnecessrias. Quanto mais baixa a % de PSA-livre,
maior a a probablidade de cancro da prstata.
O CA125 est associado ao carcinoma do epitlio do ovrio e a sua utilidade
clnica aplica-se no follow-up de de tumores uterinos.
O CA19.9 encontra-se associado aos carcinomas gstricos e pancreticos, sendo
um bom indicador na eficcia do tratamento e na deteco de recidivas.
Amostra: Soro, plasma (EDTA)
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Marcadores de hepatite B (Anti-HBc, Anti-Hbe, Anti-HBs, AgHBe, AgHBs):

O vrus da Hepatite B pertence famlia Hepadnaviridae e transmitido por via
parentrica, sexual e vertical. O perodo de incubao tipicamente cerca de 100 dias
(pode variar de 2 a 6 meses). As manifestaes clnicas da hepatite B podem variar de
assintomticas a hepatite fulminante fatal. Pode evoluir para cronicidade e conduzir a
uma situao de hepatite crnica que, por sua vez, pode conduzir a cirrose heptica e a
carcinoma hepatocelular.
O vrus da hepatite B contm vrios antignios que so importantes no
diagnstico: antignio HBs (superfcie), HBc (core) e HBe. O ltimo pode ser visto
como um precursor do antignio HBc. encontrado livre no soro e um marcador de
infecciosidade. Todos os trs antignios induzem a formao dos anticorpos
correspondentes.
A hepatite B aguda pode ser diagnosticada imunologicamente. O marcador
imunolgico mais importante o AgHBs que detectvel no soro durante o perodo de
incubao, mesmo antes do aparecimento dos sintomas tpicos. Na doena no
complicada o AgHBs diminui continuamente e desaparece do soro em 5 a 6 semanas.
assim um marcador para a monitorizao do processo de cura. Aps o aparecimento do
AgHBs, o AgHBe torna-se positivo. S deve ser medido em doentes positivos para o
AgHBs. Um AgHBe positivo indica uma elevada virmia e uma elevada infecciosidade.
Contudo, na infeco com mutantes precore do VHB, o AgHBe permanece indetectvel
apesar de estar presente uma hepatite B grave.
Dos anticorpos, o anti-HBc aparece precocemente no soro e permanece positivo
durante anos. detectvel na hepatite B aguda e crnica, mesmo aps resoluo da
infeco.
O anti-HBe torna-se positivo aps 3 a 4 meses durante a seroconverso. Este
teste importante na avaliao do nvel de virmia. A replicao viral geralmente
baixa se o anti-HBe est presente no soro.
O ltimo dos anticorpos o anti-HBs, que se torna detectvel aps cerca de 6
meses, ou seja na fase de recuperao. A deteco do anti-HBs significa imunidade aps
doena ou imunizao activa ou passiva.
Amostra: Soro, plasma EDTA e citrato de sdio (excepto para Anti-HBs)
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HEMATOLOGIA
Parmetros pesquisados
Contagem de reticulcitos
Tcnicas/equipamentos utilizados
Azul Brilhante de Cresil
Estudo morfolgico do sangue perifrico
May-Grunwald-Giemsa
Fibrinognio
Trombolyser Compact XR (impedncia)
Grupo sanguneo
Hemaglutinao
Hemograma/Leucograma/Eritrograma
Pentra
80
(impedncia,
fotometria,
difuso de luz)
Pesquisa de clulas falsiformes
Manual
Plaquetas
Pentra 80 (impedncia)
Tempo de Coagulao (TC)
Manual
Tempo de Hemorragia
Manual
Tempo Protrombina (TP)
Trombolyser Compact XR (impedncia)
Tempo Tromboplastina Parcial Activada Trombolyser Compact XR (impedncia)

(PTT)
Teste antiglobulina Indirecto e Directo
Hemaglutinao
Velocidade Sedimentao
Test 1
Velocidade Sedimentao 1 e 2 hora
Westergreen modificado
Para diferentes objectivos, diferentes anticoagulantes esto disponveis. O

EDTA e citrato de sdio removem o clcio essencial para a coagulao. A heparina
actua de forma diferente, neutralizando a trombina ao inibir a interaco de vrios
factores coagulantes na presena do cofactor antitrombina III.
cido etilenodiamino tetra-actico (EDTA):
Conserva a morfologia dos leuccitos e eritrcitos e permite a correcta contagem

de plaquetas. O excesso de EDTA afecta os eritrcitos e leuccitos, causando alteraes
degenerativas. Deste excesso pode tambm resultar uma diminuio no hematcrito e
aumento da concentrao de hemoglobina globular mdia. As plaquetas tambm so
afectadas, aumentando de volume com posterior desintegrao, levando a uma
contagem falsamente elevada de plaquetas.
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Citrato de sdio (sal trissdico, 2H2O, 32g/L):
Anticoagulante de escolha para estudos da coagulao. So adicionados 9

volumes de sangue a 1 volume de citrato de sdio. tambm um dos anticoagulantes
usados para a velocidade de sedimentao eritrocitria. Neste caso so adicionados 4
volumes de sangue a 1 de citrato de sdio.
Heparina:
No altera o tamanho dos eritrcitos e minimiza a lise. o anticoagulante de

escolha nos estudos de fragilidade osmtica e imunofenotipagem. Nas restantes
situaes no dever ser a primeira escolha, no sendo adequado o seu uso na contagem
de leuccitos.
Vrias alteraes ocorrem no sangue anticoagulado temperatura ambiente. As

alteraes na morfologia das clulas sanguneas ocorrem facilmente mesmo pouco
tempo aps a conservao. Os eritrcitos, leuccitos e plaquetas so normalmente
estveis por 8 horas aps a colheita, mas os eritrcitos vo aumentando de volume e a
fragilidade osmtica aumenta tambm. Quando a amostra conservada a 4C, os efeitos
na contagem das clulas sanguneas so insignificantes durante 24 horas. Os testes de
coagulao devem ser realizados em 2 horas quando o sangue ou plasma mantido
temperatura ambiente, e em 4 horas se conservado a 4C.
1. CONTAGEM DE RETICULCITOS
Na linha eritrocitria, o reticulcito segue o eritroblasto ortocromtico e precede
o eritrcito. Conserva algumas mitocndrias e restos de substncias basfilas (restos
ribossomais), sob a forma de finas estruturas reticulo-granulosas, as quais so postas em
evidncia com a ajuda de uma colorao postvital. (12) (13)
Sobre os esfregaos corados com Giemsa, difcil reconhecer os reticulcitos
que se distinguem das hemcias por uma ligeira policromatofilia, a qual desaparece
progressivamente nos reticulcitos mais maduros. Emprega-se para a sua identificao
corantes vitais, como Azul Brilhante de Cresil ou Novo Azul de Metileno. Estes
corantes, em concentraes elevadas, coram a clula e provocam a aglutinao em rede
- 73 -

dos ribossomas e a degenerescncia das mitocndrias. O reticulcito aparece como uma
clula ligeiramente maior que o eritrcito maduro, contendo uma rede de substncia
reticulo-filamentar.
A contagem de reticulcitos o exame mais simples e directo para avaliar a taxa

efectiva de produo dos eritrcitos. O nmero de reticulocitos no sangue perifrico
reflecte a actividade eritropoitica medular, partindo do princpio que h uma libertao
normal dos reticulcitos da medula, e que estes permanecem em circulao o perodo de
tempo normal (24-48h). (12)
Quando se estuda uma anemia e a sua provvel etiologia, a contagem de
reticulcitos um exame de 1 linha, a par das constantes globulares e do estudo
morfolgico dos glbulos vermelhos. Permite diagnosticar se se trata de uma anemia
regenerativa, em que h estimulao da medula e h uma resposta medular com
aumento do nmero de reticulcitos e consequente aumento da produo de eritrcitos,
ou de uma anemia arregenerativa, em que h um defeito na produo dos glbulos
vermelhos e no h um aumento do nmero de reticulocitos. (12)
Tcnica de Dacie:
O corante utilizado o seguinte:

Azul brilhante de cresil - 1 g
Citrato de sdio a 3% - 20 ml
Cloreto de sdio a 0,85% - 80 ml
Recolher aps filtrao duas a trs gotas de corante num eppendorf. Juntar duas
a trs gotas de sangue e misturar por inverso. Deixar repousar temperatura ambiente
durante mais ou menos 24 horas. Em seguida colocar os glbulos em suspenso por
agitao e preparar uma srie de esfregaos finos e regulares.
Nestas condies, as hemcias aparecem coradas de cinzento azulado e a
substncia reticulo-filamentosa em azul escuro.
O nmero de reticulcitos encontrados relativo a 100 glbulos rubros (valor
percentual). Com a objectiva de imerso e a ocular com um papel cortado de forma a
limitar o campo. Contar at 1000 glbulos rubros para obter uma preciso conveniente.
- 74 -

Alguns aspectos devero ser tomados em considerao:
-
O tempo decorrente entre a colheita e a colorao no deve ultrapassar as 2 horas,

uma vez que o processo maturativo dos reticulcitos ocorre "in vitro".
O volume de sangue a adicionar ao corante para obter a melhor colorao depende

do n total de glbulos vermelhos e hematcrito. Em caso de anemia, deve-se
aumentar a quantidade de sangue a adicionar, enquanto que existindo uma
policitmia, deve-se diminuir.
Uma boa qualidade do corante (sem impurezas ou precipitados) essencial, bem

como uma boa execuo do esfregao ( necessrio que haja uma distribuio
uniforme das clulas).
A principal causa de erro reside na contagem de um n insuficiente de clulas. O

mnimo 1000.
Dever ser feita diferenciao dos reticulocitos com outros corpsculos

intraeritrocitrios, nomeadamente corpsculos de Pappenheimer, corpsculos de
Heinz, ou precipitados de Hemoglobina H.
Amostra: sangue total
2. ESTUDO MORFOLGICO DE SANGUE PERIFRICO

Baseia-se na observao do esfregao de sangue perifrico tendo em ateno as
trs linhagens:
- Eritroctica (alteraes morfolgicas, tais como tamanho, forma, cor e
incluses; alteraes do estado de maturao)
- Leucoctica (alteraes morfolgicas; alteraes do estado de maturao)
- Plaquetria (alteraes morfolgicas; alteraes numricas)
A tcnica para o estudo morfolgico do sangue perifrico consiste na execuo

do esfregao de sangue e colorao pelo mtodo de May-Grunwald-Giemsa.
2.1 Execuo do Esfregao de Sangue:
Colocar uma pequena gota de sangue na extremidade de uma lmina.

Manter a lmina horizontalmente entre os dedos polegar e mdio.
- 75 -

Com a outra mo segurar a lamela e colocar o rebordo livre contra a superfcie da
lmina, frente da gota de sangue, formando um ngulo de cerca de 45.
Tocar o rebordo da lamela contra a gota de sangue.
Fazer deslizar a lamela num s movimento firme e uniforme.
Secar a lmina ao ar, identificar o nmero de tubo do utente no prprio esfregao.
Corar pelo mtodo de May-Grunwald-Giemsa.
2.2 Colorao de May-Grunwald-Giemsa:
Consiste na colorao sucessiva dos esfregaos com uma mistura de eosinato de

azul de metileno (May-Grunwald) e a mistura de Giemsa (azur eosina), corando todos
os elementos celulares.
Cobrir o esfregao com May-Grunwald, deixar actuar durante 2 minutos. Neste

primeiro tempo actua somente o lcool metlico como fixador.
Passados os 2 minutos, juntar tampo. Misturar por aspirao e expulso dos
lquidos com uma pipeta de Pasteur. Deixar actuar durante 2 minutos. Neste segundo
tempo entra em aco o princpio corante (eosinato de azul de metileno), que
permaneceu inactivo durante o primeiro tempo. O tampo dissocia o corante em eosina
e azul de metileno. O azul de metileno cora de azul os elementos basfilos e a eosina
cora de vermelho os acidfilos, mas no diferencia a cromatina das granulaes,
corando-as indistintamente.
Decorridos os 2 minutos, escorrer a mistura que cobre os esfregaos e, sem
lavar, recobrir com soluo diluda de Giemsa, preparado no momento da colorao
(uma gota para cada mililitro de tampo). O azur de metileno e azul de metileno
presentes no Giemsa actuam depois de dissociados por aco do tampo, e o azur de
metileno cora granulaes azurfilas de vermelho. Um esfregao satisfatrio deve
apresentar cor rosa-mate uniforme.
Deixar actuar durante 10 minutos. No fim deste tempo, lavar as preparaes,
abundantemente, em gua corrente. Deixar secar expontaneamente em posio vertical.
Os esfregaos de cor vermelha intensa de eosina esto excessivamente cidos, o

corante actuou pouco tempo. Os esfregaos de cor cinza, cinza azulada ou esverdeado
esto muito alcalinos, o corante actuou muito tempo.
- 76 -

A colorao May-Grunwald Giemsa tambm se aplica pesquisa de eosinfilos

no exame nasal.
3. GRUPO SANGUNEO E RH
A determinao de um grupo sanguneo consiste em verificar a presena ou

ausncia dos antignios A, B e Rhesus (antignio D) na superfcie dos glbulos
vermelhos. O teste serolgico consiste em pesquisar a presena ou ausncia dos
anticorpos anti-A e anti-B, devendo haver concordncia entre os dois testes. (12)
3.1 Determinao dos antignios A e B:
Numa lmina colocar 1 gota dos reagentes anti-A e anti-B.

Juntar uma pequena gota de sangue anticoagulado a cada reagente.
Com uma vareta, misturar o reagente e o sangue uniformemente numa rea de cerca de
20mm de dimetro.
Incubar durante alguns segundos.
Rodando lentamente a lmina, observar macroscopicamente a aglutinao. Se os
antignios esto presentes, a reaco ocorre imediatamente.
Completar o teste com outra observao aps 3 minutos. (bula Diagast)
3.2 Determinao do antignio D:
Numa lmina colocar 1 gota de anti-D.

Juntar uma pequena gota de sangue anticoagulado.
Com uma vareta misturar o reagente e o sangue uniformemente sobre uma rea de
15mm de dimetro.
Incubar durante 30 segundos, girando suavemente a lmina; continuando este
movimento giratrio, colocar a lmina sobre uma luz indirecta e observe
macroscopicamente a aglutinao.
Esperar 3 minutos para efectuar uma segunda leitura de modo a no omitir os antignios
fracos. (bula Diagast)
- 77 -

3.3 Determinao dos anticorpos A e B:
Numa lmina colocar duas gotas de soro do doente.

Juntar a cada gota de soro uma pequena gota de sangue anticoagulado, e previamente
lavado com soro fisiolgico, do grupo A e do grupo B.
Com uma vareta misturar o soro e o sangue uniformemente sobre uma rea de 15mm de
dimetro.
Incubar durante 30 segundos, girando suavemente a lmina; continuando este
movimento giratrio, colocar a lmina sobre uma luz indirecta e observe
Esperar 3 minutos para efectuar uma segunda leitura.
Anti-A
Anti-B
Glob A
Glob B
AB
Grupo Sanguneo
A
necessrio ter em conta algumas limitaes deste teste em placa (lmina), uma
vez que os fentipos A e B fracos podem ser mais difceis de detectar. No caso de haver
desacordo entre o teste de determinao dos antignios e anticorpos, conveniente
confirmar por testes mais sensveis.
4. PENTRA 80/HEMOGRAMA E PLAQUETAS

O sistema Pentra 80 (figura 8) consiste num analisador hematolgico totalmente
automatizado que se usa para testes de diagnsticos in vitro de amostras de sangue total.
Tem uma capacidade para 80 amostras por hora, permitindo a identificao dos tubos
por teclado ou leitor interno ou externo de cdigo de barras.
41 Parmetros analisados:
- 78 -
- Glbulos Brancos (GB), nomeadamente Linfcitos, Moncitos, Neutrfilos,

Eosinfilos, Basfilos, Clulas Imaturas e Linfcitos Atpicos;
- Glbulos Vermelhos (GV), a Concentrao de Hemoglobina (Hb), o
Hematcrito (Htc), o Volume Globular Mdio (VGM), a Hemoglobina Globular Mdia
(HGM), a Concentrao de Hemoglobina Globular Mdia (CHGM), o Coeficiente de
Disperso Eritrocitria (RDW);
- Plaquetas (Plq), o Coeficiente de Disperso Plaquetria (PDW), o Volume
Plaquetrio Mdio (VPM) e o Plaquetcrito (Pct).
Figura 8
4.2 Tcnica:
Este equipamento baseia-se no princpio da impedncia para a medio de GB,

GV, Plq e basfilos, fotometria para a determinao de Hb, impedncia e difuso de luz
para linfcitos, moncitos, neutrfilos, eosinfilos, linfcitos atpicos e clulas
- 79 -

imaturas. O Htc e ndices eritrocitrios (VGM, HGM, CHGM, RDW) e plaquetrios
(VPM, Pct e PDW) so obtidos por clculo.
A contagem de impedncia, descrita por Wallace Coulter em 1956, fundamentase na deteco e medio da resistncia elctrica produzida pelas clulas quando passam
por pequenas aberturas. Os glbulos (maus condutores) so suspensos numa soluo
electroltica tamponada (boa condutora). Um volume constante de amostra passa entre
dois elctrodos, entre os quais existe uma corrente contnua. Cada clula que passa no
orifcio desloca um volume idntico de soluo electroltica, ou seja, proporcional ao
volume da partcula, originando um aumento da resistncia elctrica (impedncia). A
diferena de potencial gerada entre os elctrodos traduzida em picos, sendo a
amplitude de cada pico proporcional ao volume da clula que lhe deu origem. O nmero
de picos, correspondendo ao nmero de clulas, captado por um circuito electrnico
que os amplifica e transforma em grfico de distribuio de frequncia (histograma) e
em dados numricos.
Existem diferentes dimetros de abertura de contagem, para basfilos de

80m, leuccitos com excepo dos basfilos de 60m, GV e Plq de 50m. A
diferenciao entre os basfilos e os outros leuccitos obtida por meio da aco de lise
promovida pelo reagente Basolyse.
A contagem de GB baseia-se em trs principios essenciais: a campnula

cilndrica hidrodinmica dupla - DHSS, double hydrodinamic sequencial system (figura
9); a medio de volumes (impedncia); a medio da luz transmitida num ngulo de 0,
que permite uma resposta de acordo coma estrutura interna de cada elemento e sua
absorvncia por meio da difuso da luz incidente.
- 80 -
Figura 9
Figura 10
O sangue fornecido para a cmara de linfcitos, moncitos, eosinfilos e

neutrfilos, em fluxo no reagente de Eosinofix. Esse reagente lisa os GV, estabiliza os
GB e cora o ncleo dos eosinfilos com uma colorao especfica. A soluo ento
estabilizada com diluente e transferida para a cmara de medio. Cada clula medida
em relao a absorvncia (citoqumica) e resistncia (volume). Nessas medies,
elaborada uma matriz com volumes no eixo X e transmisso ptica no eixo Y. O estudo
da imagem da matriz permite a clara diferenciao de 4 entre 5 populaes de leuccitos
(figura 10).
A anlise de fotometria para medio de Hb utiliza o mtodo Drabkin

modificado. Este mtodo baseia-se na diluio do sangue com uma soluo contendo
cianeto de potssio e ferricianeto de potssio. A hemoglobina, metahemoglobina e
carboxihemoglobina,
mas
no
sulfohemoglobina,
so
convertidas
em
cianometahemoglobina (HiCN). A fonte de luz um diodo eletroluminescente e a

leitura da absorvncia ocorre a um comprimento de onda de 550nm.
A altura do impulso gerado pela passagem de uma clula atravs da microabertura directamente proporcional ao volume de GV analisado. O hematcrito
medido como uma funo da integrao numrica do VGM.
- 81 -

O VGM calculado directamente a partir do histograma de GV.
O clculo do HGM feito a partir do valor de Hb o nmero de GV. Corresponde

quantidade de hemoglobina na quantidade de glbulos vermelhos na amostra de
sangue.
HGM = Hb (gr/dl)
10 pg
G.V. ( 1012/l)
A CHGM a concentrao de Hb por unidade de volume. Indica-nos o teor de

Hb; se os glbulos tem ou no o contedo normal. calculado de acordo com os
valores de Hb e Htc.
CHGM = Hb (gr/dl) gr/dl

Htc (l/l)
O clculo do RDW permite detectar anomalias relacionadas com a anisocitose.

A largura da distribuio de GV permite o acompanhamento da evoluo da largura da
curva em relao ao volume mdio e ao nmero de clulas.
RDW= K SD / VGM
K constante do sistema
SD desvio-padro da distribuio de clulas
4.3 Interferncias:
Os contadores electrnicos so precisos, mas pode haver inexactido por

situaes pontuais como a passagem de duas clulas em simultneo que so
contabilizadas como uma s, pela recirculao de clulas j contadas, pela sua
aglutinao, pela contagem de bolhas de ar, gotas lipdicas, microorganismos ou outras
partculas como clulas.
A verificao de qualquer resultado de teste anormal (incluindo resultados
sinalizados ou fora da faixa normal) deve ser confirmada em lmina para concluses
- 82 -

definitivas quanto aos resultados. Algumas limitaes conhecidas dos contadores de
clulas sanguneas automatizados que usam a impedncia e a absorbncia de luz como
princpios de medio so referidas de seguida.
Interferncias nos GB:

Os resultados de GB que excedem os limites de linearidade do sistema exigem
diluio da amostra de sangue. A repetio da anlise com a diluio da amostra
permite a obteno do valor de anlise correcto.
Uma contagem falsamente elevada de GB pode ocorrer pela presena de

eritrcitos no lisados, assim como pela precipitao de protenas em pacientes com
mieloma mltiplo. O aumento nos nveis de crioglobulina decorrente de mieloma,
carcinoma, leucemia, macroglobulinemia, distrbios linfoproliferativos, tumores
metastticos, doenas auto-imunes, infeces, aneurisma, gravidez, fenmenos
tromboemblicos, diabetes, etc., podem elevar as contagens de GB e diminuir as de GV
ou Plq. A amostra deve ser aquecida at 37C e reanalisada de seguida. Uma outra
interferncia resulta da presena de macrotrombcitos em nmero elevado podendo
aumentar a contagem de leuccitos.
A leucemia pode provocar uma contagem muito baixa de GB devido ao aumento

da fragilidade dos leuccitos, o que leva destruio de algumas dessas clulas durante
a contagem. Esses fragmentos tambm interferem com os parmetros diferenciais dos
leuccitos. As drogas citotxicas e imunossupressoras tambm podem ser uma das
causas de aumento da fragilidade dos leuccitos.
Interferncias nos GV:
A aglutinao dos eritrcitos pode diminuir a sua contagem.
As imunoglobulinas da classe IgM (aglutininas frias) podem interferir

negativamente na contagem de GV e Plq e aumentar o VGM. As aglutininas frias
promovem a aglutinao dos GV, devendo a amostra ser aquecida antes da anlise.
Interferncias na Hb:
- 83 -

Os GV mal lisados provocam um resultado falsamente elevado de Hb, mas que
pode ser detectado atravs da observao de valores anormais na HGM e da CHGM e
do aumento da linha de base na borda de referncia do histograma de GV.
Uma contagem extremamente elevada de GB causa uma disperso excessiva de

luz.
Uma concentrao elevada de lipdos na amostra de sangue confere uma

aparncia leitosa ao plasma. Outros factores de interferncia so as hiperproteinmias
e hiperbilirrubinmias.
Interferncias no Htc:
A aglutinao de hemcias pode produzir valores inexactos de Htc e VGM. A

aglutinao de glbulos vermelhos pode ser detectada atravs da observao de valores
anormais de HGM e CHGM, como tambm atravs do exame microscpico.
Interferncias na contagem de Plq:
Eritrcitos muito pequenos (micrcitos), fragmentos de eritrcitos (esquizcitos)

e fragmentos de GB podem interferir na contagem adequada de Plq, provocando
resultados elevados. Amostras hemolisadas podem aumentar as contagens de Plq.
Tambm a presena de eritrcitos com incluses leva contagem das incluses como
Plq.
A aglutinao de eritrocitos pode capturar Plq, diminuindo a sua contagem.

Assim como, a presena de plaquetas gigantes leva a que estas no sejam contadas por
excederem o limiar mximo do parmetro correspondente. As drogas citotxicas e
imunossupressoras podem aumentar a fragilidade plaquetria, o que pode causar
contagens baixas de Plq.
As Plq aglomeradas podem causar uma reduo na contagem de Plq. A amostra

deve ser recolhida em anticoagulante de citrato de sdio para garantir o carcter
- 84 -

anticoagulante e deve ser reanalisado apenas quanto contagem de Plq. O resultado
final deve ser corrigido para o efeito de diluio do citrato de sdio.
Interferncias nos Linfcitos:
A presena de eritroblastos, certos parasitas e eritrcitos resistentes lise pode

interferir na preciso da contagem de linfcitos.
Interferncias nos moncitos e polimorfonucleares:
A presena de linfcitos grandes, atpicos, blastos e um nmero excessivo de

basfilos pode interferir na preciso da contagem de moncitos. Os eosinfilos,
metamielcitos, mielcitos, promielcitos e blastos podem alterar a contagem de
neutrfilos. A presena de grnulos anormais (grnulos txicos, etc.) pode interferir na
contagem de eosinfilos.
4.4 Reagentes:
Os reagentes utilizados para a anlise dos diferentes parmetros no Pentra 80 so

o Diluent, Cleaner, Eosinofix, Basolyse II e Lyse.
ABX Basolyse II o reagente de lise de eritrcitos para contagem de glbulos

brancos e diferenciao de basfilos nos contadores de glbulos sanguneos. Consiste
em cido clordrico e surfactante.
ABX Cleaner uma soluo enzimtica com aco proteoltica para limpeza dos
contadores de glbulos sanguneos. Combina uma soluo tampo orgnica e enzima
proteoltica.
ABX Lysebio utilizado nos contadores de glbulos sanguneos para efectuar a

lise dos glbulos vermelhos e determinar a concentrao de hemoglobina. composto
por sal de amnio quaternrio e surfactante de base no inica.
- 85 -

ABX Eosinofix o reagente utilizado para diferenciao das sub-populaes de
leuccitos nos contadores de glbulos sanguneos. A sua composio consiste em
propano 1,2 diol e corante frmico.
5. PESQUISA DE CLULAS FALCIFORMES

A drepanocitose uma hemoglobinopatia qualitativa resultante da alterao de
estrutura de uma cadeia globnica, devida a uma mutao gentica, que tem como
consequncia a cristalizao da Hb sob a forma de fibras longas que vo de um lado ao
outro do eritrcito adquirindo o glbulo a forma de foice designada por drepanocito ou
clula falsiforme. A HbS produz efeitos deletrios porque, em desoxigenao, h
reduo da sua solubilidade e ocorre polimerizao, deformando o glbulo vermelho.
O indivduo heterozigtico praticamente assintomtico, o homozigtico
apresenta uma anemia hemoltica crnica com gravidade varivel que pode incluir vasoocluses recurrentes, acidente vascular cerebral, necrose da cabea do fmur e hmero,
lceras nas pernas, infeces pulmonares, etc. (12)
Tcnica:
Para demonstrar a formao de drepancitos, emprega-se o mtodo de Daland e

Castle, executado em preparao hmida e cujo agente redutor da tenso de oxignio
o metabissulfito de sdio.
Colocar uma gota de sangue no centro de uma lmina.

Adicionar duas gotas de soluo de metabissulfito de sdio e mistur-las.
Cobrir a mistura com lamela removendo o excesso com papel de filtro.
Observar ao microscpio para verificar se os glbulos se encontram uniformemente
distribuidos. Se os glbulos se apresentarem crenados rejeitar a preparao.
Selar a preparao com parafina lquida ou colocar em cmara hmida (placa de Petri
com algodo humedcido) na estufa a 37C durante 30 minutos.
- 86 -

O sangue do paciente portador de HbS comea a formar drepancitos imediatamente.
Os glbulos apresentam-se sob a forma elptica, de crescente ou de foice. Se no ocorrer
a formao de drepancitos aps 30 minutos, deixar a preparao temperatura
ambiente e examin-la de novo aps 3, 6 e 24 horas, antes de considerar a prova
negativa.
6. TEMPO DE COAGULAO
Tempo de coagulao o perodo de tempo que o sangue extrado do organismo
demora a coagular completamente. A determinao do tempo de coagulao do sangue
total pode revelar deficincias de qualquer um dos onze factores que participam no
sistema da coagulao. Esta determinao , no entanto, pouco sensvel, visto ser
necessrio que o factor deficiente esteja em concentrao extremamente baixa para
alterar o tempo de coagulao.
O tempo de coagulao pode estar alongado nas situaes de hemofilia,
deficincia em vitamina K, doena hemorrgica do recm-nascido, teraputica com
heparina ou dicumarol, deficincia em factores V, VII, IX, XI e XII, afibrinogenmia e
presena de anticoagulantes circulantes. (12)(14)
Tcnica:
Aps a colheita desprezar as primeiras gotas e colocar uma gota no centro da lmina.
Disparar o cronmetro.
Com o auxlio de uma agulha ir verificando se o cogulo se forma.
Quando comearem a aparecer fragmentos de fibrinognio parar o cronmetro.
A coagulao comea quando aparecem pequenos filamentos de fibrina que aderem
extremidade da agulha.
O espao de tempo decorrido entre a colheita de sangue e a formao de fibrina na
lmina, representa o tempo de coagulao do doente.
- 87 -

7. TEMPO DE HEMORRAGIA
Tempo de hemorragia o tempo necessrio para a paragem da hemorragia

ocasionada por uma pequena inciso praticada artificialmente. Quando os vasos so
lesados ou seccionados, as plaquetas aderem membrana subendotelial do vaso e ao
colagnio que ficaram expostos. Aps a adeso, as plaquetas comeam a aglomerar-se
formando o trombo hemosttico primrio. (12)
A determinao do tempo de hemorragia est indicada antes de qualquer
interveno cirrgica e em todos os estados hemorrgicos ou purpricos, com a
finalidade de se detectar possveis alteraes ao nvel da hemostase primria,
essencialmente anomalias ao nvel do nmero e funo das plaquetas e anomalias
vasculares.
Um tempo de hemorragia alongado pode ocorrer nas seguintes condies:
- deficincia quantitativa das plaquetas (trombocitopnias), prpura hemorrgica
secundria (leucemias, anemia perniciosa, anemia aplsica)
- deficincia qualitativa ou funcional das plaquetas, como na tromboastenia hemorrgica
hereditria de Glazmann e na trombopatia constitucional (doena de von Willebrand)
- deficincia congnita dos factores I e V
- estados fibrinolticos
- estados urmicos
- casos de uso excessivo de certos medicamentos, como o cido acetilsaliclico. (12)
Tcnica - Mtodo de Duke:
Fazer a assepsia do lbulo da orelha do utente.

Com um lancete fazer uma pequena inciso de cerca de 3 mm de profundidade e deixar
o sangue fluir espontaneamente.
Accionar no cronmetro o incio do tempo no momento do aparecimento da primeira
gota.
Com um fragmento de papel de filtro, absorver de 30 em 30 segundos a gota de sangue
formada, sem tocar a inciso.
Quando parar o fluxo de sangue, parar o cronmetro.
O intervalo decorrido entre a primeira e ltima gota representa o tempo de hemorragia
do paciente.
- 88 -

8. TESTE ANTIGLOBULINA DIRECTO E INDIRECTO
A reaco de aglutinao imunolgica a que se verifica entre antignios (Ags)

insolveis de uma suspenso, localizados natural ou passivamente superfcie de
elementos figurados (clulas ou partculas inertes), e um meio contendo os anticorpos
(Acs) especficos. Traduz-se pelo aparecimento de agregados enquanto que o meio se
torna lmpido. uma reaco mais sensvel que a precipitao, permitindo anlises
qualitativas e quantitativas.
Existem diversos tipos de aglutinao:

-
aglutinao directa, os Ags existem naturalmente superfcie da clula; Ex:

determinao de um grupo sanguneo. Existem superfcie dos glbulos
vermelhos determinadas substncias antignicas que permitem pela sua ausncia
ou presena, caracterizar 4 tipos de grupos sanguneos
aglutinao passiva ou condicionada
Acs incompletos, se na sua combinao com o Ag especfico no derem origem

a agregados visveis. A formao de agregados pode ser, no entanto, provocada
recorrendo aos seuintes mtodos:
Utilizao de meio macromolecular
Utilizao de enzimas proteolticas
Utilizao de um soro contendo Ac dirigidos contra o Ac incompleto em estudo.
Como exemplo desta situao cita-se o teste de Coombs.
aglutinao lise
inibio da hemaglutinao
O teste de hemaglutinao detecta anticorpos para os antignios dos glbulos

vermelhos. Se estiver presente uma quantidade de anticorpos para aglutinar (cross-link)
as clulas verifica-se um resultado positivo para o teste de Coombs directo. Alguns
anticorpos no aglutinam os glbulos vermelhos de forma eficaz e podem ser detectados
no teste de aglutinao indirecta (teste de Coombs indirecto) pela adio de um segundo
anticorpo que se liga ao anticorpo do glbulo vermelho. (11)
As antiglobulinas so utilizadas em imuno-hematologia para:
- 89 -

- testes de antiglobulina directos, que revelam a sensibilizao dos glbulos vermelhos
in vivo quer por auto-anticorpos (anemia hemoltica auto-imune), ou por alo-anticorpos
(screening do DHRN, Doena hemoltica do recm-nascido, diagnstico de acidentes
hemolticos em transfuses sanguneas, anemia hemoltica imuno-alrgica por drogas)
- testes antiglobulina indirectos, que detectam in vitro anticorpos incompletos de
grupagem fixados nos glbulos vermelhos, mas impedem a sua aglutinao
(fenotipagem, screening de anticorpos no esperados, testes de cross matching)
A antiglobulina utilizada no teste de Coombs a antiglobulina poliespecfica que

contm antiglobulinas anti-IgG e anti-C3d monoclonal.
8.1 Indirecto:
Amostra: soro
Tcnica:
Lavar os glbulos vermelhos de sangue total O+, 3 vezes em soluo salina isotnica,
por centrifugao a 1200g (3000rpm) e preparar uma suspenso de glbulos vermelhos
a 5% em soluo salina isotnica.
Num tubo teste, colocar 1 gota desta suspenso e 2 gotas do soro a testar.
Agitar suavemente o tubo e incubar durante 45 minutos a 37C.
Lavar o boto de clulas 3 vezes em soluo salina isotnica, decantar toda a soluo
salina de lavagem e juntar 2 gotas de antiglobulina.
Agitar suavemente o tubo, centrifugar durante 1 minuto a 120g.
Retirar suavemente o boto de clulas do tubo e observar macroscopicamente a
aglutinao.
8.2 Directo:
Amostra: sangue total com EDTA
Tcnica:
- 90 -

O sangue anti-coagulado, colhido num tubo estril fechado, tem que ser testado no
espao das 2 horas seguintes aps a sua colheita. Se o teste no puder ser realizado neste
intervalo de tempo, o sangue colhido ser colocado a 37C e nunca a 4C, de modo a
evitar falsas reaces positivas (possvel revestimento de aglutininas frias implicando
uma activao do complemento).
Lavar os glbulos vermelhos 6 vezes em soluo salina isotnica por centrifugao a
1200g (3000rpm) e preparar uma suspenso de glbulos vermelhos a 5% em soluo
salina isotnica.
Num tubo teste, colocar 1 gota desta suspenso e 2 gotas de antiglobulina.
Agitar suavemente os tubos.
Centrifugar durante 1 minuto a 120g (1000 rpm).
Agitar suavemente o tubo de modo a re-suspender os glbulos e observar
9. THROMBOLYZER COMPACT XR/ FIBRINOGNIO, TP E PTT

O Thrombolyzer Compact XR (figura 11) efectua de forma automtica medies
cronomtricas. A identificao da amostra efectua-se por leitura de cdigo de barras. A
amostra incubada com o reagente em simultneo numa cubeta. Dispe de uma estao
refrigerada para reagentes e controlos, sendo quatro destas posies magnetizadas
permitindo a homogeneizao permanente dos reagentes.
Figura 11
- 91 -

Tcnica:
O sistema de medio consiste numa esfera que gira durante a totalidade do

tempo de medio, no caso da formao do cogulo a fibrina pra o movimento rotativo
da esfera que detectado por um sensor (impedncia).
Amostra: plasma citratado
9.1 Fibrinognio:
O fibrinognio, ou factor I, por aco da trombina e clcio d origem a dois

fibrinopptidos (A e B) e a monmeros de fibrina. Atravs de ligaes por pontes de
hidrognio ocorre a dimerizao desses monmeros e posterior polimerizao formando
um tetramero cujas ligaes so estabilizadas custa do factor XIIIa e Ca2+, formando
um polmero estvel de fibrina com ligaes covalentes.
O reagente para a determinao do fibrinognio consiste numa suspenso de

trombina e caolino.
O ensaio de fibrinognio apresenta os resultados em mg/dl. O resultado

apresentado determinado atravs da transformao do tempo de coagulao do
fibrinognio utilizando uma curva de referncia. A curva de referncia preparada
automaticamente com base nas diluies de um material de referncia.
9.2 Tempo de Protrombina ou Tempo de Quick:
Mede o tempo de coagulao do plasma na presena de uma concentrao

ptima de extracto tecidual (tromboplastina) e de ies clcio, medindo o tempo at
formao do cogulo de fibrina, dando uma indicao geral da via extrnseca. Este teste
depende dos factores II, V, VII e X e ainda da concentrao de fibrinognio no plasma.
O reagente Simplastin consiste em tromboplastina tecidular liofilizada, ies

clcio e conservantes.
- 92 -

O resultado da medio expresso em segundos, percentagem do valor normal
ou razo normalizada internacional (INR). O resultado do teste, em segundos,
convertido em percentagem de actividade normal (% PT) utilizando uma curva de
referncia. A curva de referncia preparada automaticamente com base nas diluies
de teste de um pool de plasmas citratados.
INR o tempo de reaco da amostra/tempo de reaco do plasma normal

elevado a ISI (ndice de sensibilidade internacional) - consiste no valor numrico entre a
tromboplastina de referncia e a comercializada, o valor ideal ser 1.
Razo da protrombina
Tempo do doente
Tempo do controle
As tromboplastinas variam na sua resposta ao efeito anticoagulante dos

anticoagulantes orais, dependendo da sua provenincia, contedo fosfolipdico e
preparao. Para ultrapassar este problema e padronizar os resultados do TP, a OMS
designou um lote de tromboplastina como a primeira preparao de referncia
internacional, o que permite fazer a calibrao das tromboplastinas utilizadas como
reagentes, caracterizando-se cada lote por um ndice de sensibilidade internacional por
calibrao com o padro da OMS. As vantagens da utilizao do sistema INR so
permitir comparaes fiveis entre determinaes feitas em diferentes laboratrios,
diminuir o risco de hemorragia ou complicaes trombticas por um melhor controlo e
facilitar a uniformizao internacional de intervalos teraputicos.
Para os doentes submetidos a uma teraputica com anticoagulantes orais para a

profilaxia de trombose venosa profunda recorrente, recomenda-se que o intervalo
teraputico se situe entre uma INR de 2,0 e 3,0 e entre 3,0 e 4,5 relativamente
teraputica com anticoagulantes orais para prevenir a embolia sistmica recorrente e
para vlvulas cardiacas protsicas mecnicas.
As causas comuns de prolongamento do TP so a anticoagulao oral

(antagonistas da vitamina K), patologia heptica (obstructiva), dficit de vitamina K,
coagulao intravascular disseminada, dficit de factor VII, X, V ou Protrombina.
- 93 -
9.3 Tempo de Tromboplastina Parcial Activada:
Destina-se verificao do sistema intrnseco da coagulao, permitindo

detectar deficincias graves dos factores VIII, IX, XI, XII, fibrinognio e protrombina.
Baseia-se na utilizao de um activador dos factores de contacto que na presena de ies
de clcio e fosfolpidos causam uma cascata de reaces enzimticas culminando na
formao de fibrina.
O reagente activador consiste em fosfolpidos em conjunto com slica

micronizada (contacto com a superfcie) e tampo N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-cido
etanosulfnico.
O tempo de tromboblastina parcial activada expresso em segundos.
As causas comuns de TTPa prolongado so a coagulao intravascular

disseminada, patologia heptica, transfuso massiva, administrao de heparina ou
contaminao com heparina, anticoagulante circulante, dficit de factor de coagulao
com excepo do factor VII, teraputica com anticoagulantes orais e dficit de vitamina
K. um teste para vigilncia teraputica com heparina.
10. VELOCIDADE DE SEDIMENTAO/TEST 1
O Test 1 (figura 12) um analisador automtico que consiste num

microfotmetro capilar para a determinao da velocidade de sedimentao dos
eritrcitos. Baseia-se no princpio da fotometria capilar de fluxo (anlise cintica). Tem
uma capacidade mxima para 60 amostras/ciclo e permite a leitura de cdigos de barra.
Amostra: sangue total com K3EDTA

Tcnica:
- 94 -

A determinao da velocidade de sedimentao consiste em medir a velocidade
de separao entre os glbulos vermelhos e o plasma, no sangue tornado incoagulvel
pela adio de um anticoagulante.
Aps agitao, a amostra automaticamente transferida para um capilar mantido
a 37C. O dispositivo usa feixes infra-vermelhos com um comprimento de onda 950nm
que atravessam o capilar. O detector de fotododo detecta o feixe exterior e regista o
sinal por um perodo de tempo fixo, o que permite a construo da curva de
sedimentao para cada amostra. Atravs de um modelo de regresso linear, o sinal
transformado num valor comparvel com os valores de Westegren.
Figura 12
Velocidade de Sedimentao 1 e 2 hora
A determinao da velocidade de sedimentao consiste na avaliao da queda

espontnea dos glbulos vermelhos em suspenso no plasma. Ocorre em trs etapas, na
primeira h agregao dos GV com formao de rouleaux (cerca de 10 minutos), na
segunda ocorre a queda dos rouleaux a velocidade constante (cerca de 40 minutos), por
ltimo d-se a sedimentao final com empilhamento dos glbulos vermelhos no fundo.
O aumento da velocidade de sedimentao pode ocorrer em infeces, necrose
tecidular, doenas reumticas, leucemias, neoplasias, mielomas, anemias e gravidez. A
- 95 -

sua diminuio verifica-se nas poliglobulias, hipofibrinogenemia e anomalias da forma
dos eritrcitos.
Amostra: sangue total com EDTA
Tcnica:
Mtodo de Westergreen modificado (figura 13):
Colocar 1 ml da amostra de sangue com anticoagulante (EDTA de potssio) e depois

diludo em citrato de sdio na proporo de 4 volumes de sangue para 1 volume de
anticoagulante no tubo para encaixe da pipeta.
Introduzir a pipeta de Westergren, graduada de 0 a 150mm, no suporte adequado e em
posio vertical.
Iniciar a contagem no cronmetro e deixar 1 hora temperatura ambiente.
No final da 1 hora fazer a leitura em milimetros, ao nvel da coluna dos glbulos que se
separam do plasma.
realizada esta tcnica para confirmar resultados muito elevados obtidos com o
Test 1 e quando a quantidade de amostra no suficiente para proceder determinao
no equipamento automtico.
Figura 13
- 96 -

MICROBIOLOGIA
A valncia de microbiologia executada numa rea restrita, adaptada ao exerccio da

mesma e separada das restantes reas. As instalaes esto equipadas com:
- Renovao de ar;
- Extraco directa de ar para o exterior;
- Equipamento especfico
Estufa de incubao calibrada;
Dispositivo que permite a obteno de atmosfera pobre em oxignio ou

enriquecida em dixido de carbono;
- Equipamento diverso
Frigorifico para conservao dos materiais armazenados;
Microscpio;
Bico de bunsen
Autoclave
- Bancadas e materiais diversos adequados.

Os ensaios de serologia efectuam-se na rea comum da imunologia e bioqumica.
1 TCNICAS LABORATORIAIS USADAS NO ESTUDO DE BACTRIAS
1.1 EXAME A FRESCO

Colocar o produto numa lmina, cobrir com uma lamela e observar ao microscpio com
objectiva de 40. Permite apreciar a presena de elementos celulares e microrganismos
(bactrias, fungos e parasitas).
1.2 EXECUO DE ESFREGAOS

Espalhar sobre uma lmina, com auxlio de uma ansa ou zaragatoa, uma gota do produto
a examinar, de modo a formar uma camada to fina quanto possvel.
Deixar secar a preparao ao ar.
Fazer aderir a preparao superfcie do vidro e fixar os elementos figurados, por aco
do calor, passando a lmina trs vezes sobre uma chama.
- 97 -

Proceder colorao de Gram ou Ziehl-Neelsen.
1.3 COLORAO DE GRAM

Cobrir a lmina com soluo de cristal violeta e deixar corar 2 minutos. Deitar fora o
excesso do corante e passar por gua em pequeno dbito.
Fazer actuar sobre a lmina a soluo de Lugol durante 2 minutos. Passar por gua em
pequeno dbito.
Juntar gota a gota a mistura lcool-acetona na lmina inclinada, lavando
simultaneamente com gua corrente em fio, at o esfregao ficar sem corante agarrado.
Corar pela Fucsina de Ziehl diluda durante 2 minutos. Deitar fora o corante e lavar com
gua.
Deixar secar ao ar.
Neste mtodo realiza-se primeiro uma colorao simples com o cristal violeta. Para
fixar o corante e impedir que ele seja dissolvido pelo lcool-acetona, intercalar entre a
colorao pelo cristal violeta e a descolorao pelo lcool-acetona, o Lugol. Assim
tratadas, as bactrias dividem-se em dois grupos: um que no descorado sob aco do
lcool-acetona (Gram-positivo) e outro que descorado (Gram-negativo). Estes ltimos
so postos em evidncia por aco da Fucsina diluda que os cora de vermelho.
1.4 COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN
Cobrir a lmina, previamente fixada, com a fucsina de Ziehl.

Com o auxlio de uma chama colocada sobre a lmina, aquecer lentamente at
emisso de vapores e manter durante 15 minutos. necessrio evitar que o corante
seque sobre a lmina e entre em ebulio porque, a esta temperatura, as propriedades
tintoriais do bacilo alteram, e a sua morfologia pode variar.
Lavar rapidamente com gua.
Tratar a preparao com a mistura lcool-cido, deixando-a gotejar sobre a lmina
inclinada, e passar simultaneamente por gua fria corrente, at que todo o corante seja
removido.
Corar pelo azul de metileno durante 1 minuto.
Lavar com gua. Secar ao ar.
- 98 -
Os bacilos lcool-cido resistentes coram de vermelho pela fucsina, pois so os nicos

elementos que resistem aco descorante do lcool-cido. Para facilitar a sua
vizualizao, cora-se o fundo com azul de metileno, ficando assim um contraste ntido.
2 MEIOS DE CULTURA USADOS NO EXAME BACTERIOLGICO
2.1. BRAIN-HEART
Classificao: Meio no selectivo.
Finalidade: Utiliza-se como meio de enriquecimento.
O crescimento da maioria das bactrias, incluindo bactrias fastidiosas como Neisseria e

Streptococcus, promovido pelos nutrientes proporcionados pela peptona proteose,
infuso de crebro de vitelo, infuso de corao de boi e pela presena de glucose.
A inoculao feita directamente a partir da amostra.
Incubao: 37C durante 24 a 48 horas. (bula oxoid)
2.2 CANDISELECT4
Classificao: Meio de isolamento selectivo diferencial.
Finalidade: Isolamento selectivo e identificao de leveduras.
O meio consiste numa base nutritiva com peptonas, acares, extractos de leveduras,
dois substractos cromognicos para a deteco da actividade da hexosaminidase e
fosfatase, e uma mistura de antibiticos (cloranfenicol e gentamicina) que inibem o
crescimento bacteriano.
A identificao directa de Candida albicans (C. albicans) feita pela deteco de
actividade enzimtica especfica (hexosaminidase) resultando em colnias cor-de-rosa;
identificao presumvel de C. Tropicalis, C. glabrata e C. krusei, de acordo com o tom
turquesa (conferido pela actividade da fosfatase) e morfologia das colnias.
As limitaes deste meio devem-se ao facto de, assim como C. albicans, C. dubliniensis
apresentar actividade hexonaminidase. Algumas estirpes de C. albicans podem
- 99 -

apresentar colnias brancas. Amostras complexas (expectoraes, fezes) podem corar o
meio de azul.
Incubao: 35 a 37C durante 24 a 48 horas. (bula biorad)
Figura 14: Incubao de C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei em

Candiselect4
2.3 GELOSE CHAPMAN
Classificao: Meio selectivo diferencial.

Finalidade: Isolamento de Staphylococcus spp e identificao presuntiva de S. aureus.
No meio manitol salgado, a elevada concentrao de NaCl inibe a maior parte dos Gram
negativo permitindo o isolamento de Staphylococcus spp. A fermentao do manitol
induz uma acidificao, a qual torna o meio amarelo na presena de vermelho de fenol,
permitindo o diagnstico presuntivo de S. aureus. Uma minoria de S. epidermidis
capaz de fermentar o manitol.
Incubao: 24 a 48 horas a 37C. (bula biomrieux)
- 100 -
Figura 15: Incubao S. aureus em gelose de Chapman (imagem retirada de catlogo da

Biomrieux)
2.4 GELOSE DE CHOCOLATE
Classificao: Meio de enriquecimento selectivo.

Finalidade: Isolamento de bactrias fastidiosas (Neisseria e Haemophilus).
O crescimento da maioria das bactrias promovido pelos nutrientes proporcionados

por este meio e pela hemoglobina.
A gelose de chocolate enriquecida com suplemento polivitaminico (PVS) destina-se a
ser utilizada no isolamento de bactrias fastidiosas como o caso de Neisseria
(gonococos e meningococos) e de Haemophilus.
Neisseria gonococos: colnias de aspecto acizentado, com 0,5 a 1 mm de dimetro. Ao

fim de 48 horas, as colnias tornam-se maiores e apresentam papilas.
Neisseria meningococos: colnias de aspecto acizentado, transparentes, com margens
regulares, apresentando um dimetro superior ao das colnias de gonococos.
Haemophilus: colnias pequenas, com 0,5 a 1 mm de dimetro, acizentadas, que
apresentam logo um aspecto mucide e translcido.
Incubao: 24 horas a 37C em CO2. (bula Biomrieux)
- 101 -
Figura 16: Incubao de N. gonorrhoeae, N. meningitidis e H. influenza em gelose de

Chocolate. (imagem retirada de catlogo da Biomrieux)
2.5 GELOSE COLUMBIA + 5% DE SANGUE DE CARNEIRO

Classificao: Meio de isolamento no selectivo.
Finalidade: Isolamento e deteco de hemlise de bactrias fastidiosas.
O crescimento da maioria das bactrias promovido pelos nutrientes fornecidos pela

mistura de peptonas. O sangue fornece outros nutrientes essenciais a algumas bactrias
fastidiosas.
Caracteristicas hemolticas:
Sem hemlise o meio no muda de cor;
Alfa-hemlise presena de uma zona verde volta da colnia;
Beta-hemlise presena de uma zona clara volta da colnia.
Uma das limitaes deste meio deve-se ao facto dos enterococos geralmente
apresentarem alfa-hemlise.
- 102 -
Figura 17: Isolamento de Streptococcus -hemolticos em gelose columbia + 5% de

sangue de carneiro a partir de uma amostra de exsudado farngeo.
2.6 GELOSE CPS ID3

Classificao: Meio no selectivo diferencial.
Finalidade: Isolamento e identificao dos agentes mais frequentes na infeco urinria.
Meio cromognico para contagem de microrganismos urinrios e identificao directa

de Escherichia coli, Enterococcus, Proteus e identificao do grupo de bactrias KESC
(Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter).
constituido por uma base nutritiva rica que associa diferentes peptonas e dois
substractos cromognicos que permitem revelar a actividade enzimtica correspondente:
Escherichia coli, colorao rosa a vermelho escuro das estirpes produtoras de glucuronidase;
Enterococcus, colorao turquesa das estirpes produtoras de -glucosidase;
Klebsiella, Enterobacter, Serratia e Citrobacter, colorao verde a castanha-esverdeada
das estirpes produtoras de -glucosidase;
Proteus, colorao castanha das estirpes produtoras de desaminase.
- 103 -
Figura 18: Incubao de Enterococcus spp, Escherichi coli e Klebsiela spp em meio
CPS ID3 a partir de amostras de urina (da esquerda para a direita).
Figura 19: Incubao de Staphylococcus saprophyticus e Proteus mirabilis em meio

CPS ID3 a partir de amostras de urina (da esquerda para a direita).
2.7 GELOSE HEKTOEN
Classificao: Meio selectivo diferencial para Salmonella spp. e Shigella spp.

Finalidade: Meio de isolamento selectivo e de diferenciao destinado pesquisa de
Salmonella e Shigella a partir de colheitas de fezes.
Os sais biliares inibem o crescimento dos Gram positivos e retardam o crescimento de

algumas Enterobacteriaceae.
A fermentao dos acares contidos no meio permite detectar a presena de colnias
caractersticas: as colnias de Salmonella so verdes ou azuis-esverdeadas sem ou com
centro negro (produtoras de H2S); as colnias de Shigella so verdes ou azuis
esverdeadas sem centro negro.
- 104 -

Figura 20: Incubao Salmonella spp e Shigella spp em gelose Hektoen. (imagem
retirada de catlogo da Biomrieux)
2.8 GELOSE MUELLER HINTON 2
Classificao: Meio no selectivo para testes de sensibilidade a antimicrobianos.

Finalidade: Meio destinado realizao de antibiogramas por difuso.
Este meio permite o crescimento de bactrias no fastidiosas. Aps incubao, medir o

dimetro de inibio do crescimento volta do disco de antibitico. Os valores obtidos
permitem definir a sensibilidade da estirpe a cada um dos antibiticos testados (sensvel,
intermdia e resistente) de acordo com as normas do CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute). (bula biomrieux)
- 105 -
Figura 21: Teste de sensibilidade a antimicrobianos em meio Mueller Hinton a partir de

uma estirpe de Escherichia coli isolada de uma amostra de urina.
2.9 HEMOLINE PERFORMANCE DIFSICO
Classificao: Meio no selectivo bifsico.

Finalidade: Pesquisa de microrganismos aerbios (bactrias e leveduras) responsveis
por septicmias, pela cultura de colheitas sanguneas.
composto por dois meios de cultura, um caldo enriquecido em factores de crescimento

e uma gelose cobrindo uma das faces do frasco. A presena de peptonas, de extracto de
levedura, de hemina, de NAD e de vitaminas permite um crescimento satisfatrio dos
principais microrganismos aerbios encontrados nas septicmias (bactrias e leveduras)
e particularmente de espcies exigentes. Um resultado positivo traduz-se pela presena
de colnias ou produo de gs na gelose, presena de um depsito, hemlise ou
turvao no caldo.
Incubao: 37C durante 7 dias, examinando todos os dias. Alternar a posio entre
horizontal e vertical. (bula biomrieux)
2.10 SABOURAUD
Classificao: Meio de isolamento selectivo
Finalidade: Isolamento selectivo de fungos (filamentosos e leveduras).
- 106 -

A presena de peptonas e glucose permite o desenvolvimento das estirpes
fngicas. O pH cido da gelose (5.6) favorece o crescimento dos fungos face ao
desenvolvimento bacteriano.
Incubar a 35 C durante 48 a 72 horas. Para a pesquisa de fungos filamentosos,

incubar a 25C e observar o crescimento at 6 semanas de incubao. (bula oxoid)
2.11 SELENITO
Classificao: Meio lquido de enriquecimento para Salmonella spp.
Finalidade: Utilizado para cultura primria de amostras de fezes.
A composio do meio promove o crescimento de espcies de Salmonella. A

selectividade do meio baseia-se na presena de selenito que inibe bactrias Grampositivas e a maioria dos Gram-negativos fecais com excepo da Salmonella.
Incubao: 24 horas a 37C. (bula biomrieux)
3 IDENTIFICAO DE BACTRIAS
3.1 TESTES BIOQUMICOS
3.1.1 API20E
Sistema de identificao de Enterobacteriaceae e outros bacilos Gram negativos no
fastidiosos que utiliza 21 mini-testes bioqumicos padronizados e uma base de dados. A
galeria API20E comporta 20 microtubos que contm substractos desidratados. Os
microtubos so inoculados com uma suspenso bacteriana que reconstitui os meios. As
reaces produzidas durante o perodo de incubao traduzem-se pelas mudanas de cor
espontneas ou reveladas atravs da adio de reagentes. A leitura destas reaces
efectua-se utilizando o Quadro de Leitura e a identificao consultando o Catlogo
Analtico.
- 107 -

Os microrganismos a identificar so previamente isolados num meio de cultura
adaptado a Gram negativos e uma das colnias utilizada para preparar a suspenso
bacteriana, a qual ir encher os tubos e cpulas dos testes. (bula biomrieux)
3.1.2 MYCOPLASMA IST 2
Este kit permite o diagnstico de micoplasmas urogenitais (Ureaplasma urealyticum e

Mycoplasma hominis), incluindo a sua cultura, identificao, contagem indicativa e
teste de sensibilidade a antibiticos.
A presena de substractos especficos (ureia para U. urealyticum e arginina para M.
hominis) e de um indicador (vermelho de fenol) permite, em caso de cultura positiva,
visualizar uma mudana de cor do caldo associada a um aumento de pH.
A selectividade em relao flora contaminante eventualmente presente na amostra
fornecida pela associao de 3 antibiticos e de um antifngico.
Proceder leitura dos resultados s 24 e 48 horas de incubao. (bula biomerieux)
Figura 22: Incubao de uma amostra uretral no kit Mycoplasma IST 2
3.1.3 TESTE DA OXIDASE

O teste da oxidase permite distinguir as Pseudomonadeceae (oxidase positiva) das
Enterobacteriaceae (oxidase negativa). As Neisseriaceae so tambm oxidase positiva.
- 108 -

Este teste coloca em evidncia a actividade citocromo oxidase, a qual cataliza a
reaco de oxidao do citocromo C pelo oxignio molecular e intervm na cadeia
respiratria da bactria. Na presena de oxignio na atmosfera e de citocromo C, esta
enzima oxida o reagente fenilenodiamina, para formar um composto colorido violeta, o
indofenol. O cido ascrbico, incorporado no reagente, age enquanto agente redutor
para limitar a auto-oxidao e melhorar a estabilidade do reagente.
Deitar 1 a 2 gotas do reagente da oxidase sobre papel de filtro. Colocar sobre o

papel de filtro a colnia retirada da cultura bacteriana a testar.
Leitura:
Resultado Positivo, cor violeta a prpura em cerca de 10 a 30 segundos.
Resultado Negativo, reaces tardias ou ausncia de colorao. (bula
biomrieux)
3.1.4 UREIA INDOL

O teste ureia indol permite demonstrar a presena de urease, triptofano desaminase e
produo de indol, contribuindo para a demonstrao das caractersticas de identificao
das Enterobactrias.
As bactrias que possuem urease transformam a ureia em carbonato de amnio,
induzindo uma alcalinizao do meio que adquire uma colorao vermelha violcea na
presena de vermelho de fenol.
A produo de indol demonstrada pela adio do reagente de Kovacs, o qual reage
com indol dando origem formao de uma colorao vermelha na parte superior.
A triptofano desaminase (TDA) demonstrada pela adio de cloreto frrico, o qual
induz uma colorao vermelha acastanhada.
Colocar o meio de ureia-indol em tubos de hemlise, um para a demonstrao de urease

e produo de indol e outro para a pes
quisa de TDA. Inocular cada tubo com uma
cultura pura, incubar 24 horas a 37C.
Leitura:
Na presena de urease o meio torna-se violceo,
- 109 -

- em 5 a 10 minutos para Proteus morganii e Yersinia enterocoltica;
- em 2 a 4 horas para outras estirpes de Proteus;
- em 12 a 18 horas para Klebsiella e Citrobacter.
Aps 24 horas de incubao adicione 4 a 5 gotas de reagente Kovacs, a presena de

indol revelada pelo desenvolvimento de uma colorao vermelha superfcie.
Aps 24 horas de incubao adicione 1 a 2 gotas de cloreto frrico:

- colorao vermelha-acastanhada, TDA positivo;
- colorao laranja-amarelada, TDA negativo. (bula Biorad)
3.2 IDENTIFICAO RPIDA EM LMINA
3.2.1 PASTOREX STAPH-PLUS
O Staphylococcus aureus (S. aureus) um dos microrganismos mais frequentes nas

amostras clnicas. A rpida distino entre esta espcie e outras menos virulentas
importante para o tratamento adequado do doente. O teste para a produo de coagulase
permite a identificao de S. aureus, no entanto, demora 4 a 24 horas e a reaco pode
variar de lote para lote. Este teste foi desenvolvido para dar uma resposta mais rpida.
Consiste num teste de aglutinao em ltex para a identificao de S. aureus, com

deteco simultnea do factor de afinidade para o fibrinognio (clumping factor),
protena A (com afinidade para o fragmento Fc das IgG) e polissacridos capsulares.
A combinao de fibrinognio, IgG e anticorpos monoclonais anti-capsulares no mesmo
reagente permite o reconhecimento de estirpes muito e pouco encapsuladas. Para
estirpes muito encapsuladas, os anticorpos contra os polissacridos capsulares
aglutinam a bactria. Para estirpes que perderam o polissacrido capsular, a bactria
aglutinada pelo fibrinognio e IgG.
Os isolados de S. aureus so misturados no ltex com o reagente, visualizando-se a
presena de aglutinao, que indica a presena de S. aureus. (bula Biorad)
3.2.2 SLIDEX STREPTO-KIT
- 110 -

Os Streptococcus -hemolticos contm frequentemente antignios especficos de grupo
que podem ser extrados e identificados com anti-soros. Assim, os reagentes
constitudos por partculas de ltex sensibilizadas com anticorpos dirigidos contra os
antignios fixam-se aos antignios correspondentes, produzindo uma aglutinao visvel
das partculas de ltex.
O Slidex Strepto-kit um teste de aglutinao de partculas de latex para o agrupamento
e identificao dos Streptococcus -hemolticos dos grupos A, B, C, D, F e G.
Aps cultura em gelose de sangue, as colnias isoladas de Streptococcus -hemolticos
so colhidas e colocadas num tubo que contm o reagente de extraco. O antignio
especfico do grupo contido na parede extrado de forma enzimtica. O antignio
extrado identificado pelas partculas de latex sensibilizadas com um anticorpo antiantignio de grupo dos Streptococcus. Se o antignio estiver presente, o reagente ltex
correspondente aglutinado. Se estiver ausente, o reagente ltex permanece em
suspenso homognea. (bula biomrieux)
Figura 23: Slidex Strepto-Kit com identificao de Streptococcus grupo B (imagem

retirada de catlogo da Biomrieux)
3.2.3 TESTE DA CATALASE
A enzima catalase desdobra o perxido de hidrognio em gua e oxignio. Esta

caracterstica permite fazer a distino entre os Staphylococcus spp., catalase positiva, e
os Streptococcus spp., catalase negativa, e assim orientar a identificao definitiva.
Com a ponta da ansa descartvel, transferir a colnia em estudo para a lmina de vidro.
Adicionar uma gota de perxido de hidrognio a 3% e observar imediatamente se existe
ou no formao de bolhas de ar (reaco positiva).
- 111 -
A prova deve ser interpretada com cuidado quando efectuada a partir de colnias
retiradas de meios contendo sangue devido existncia de catalase nos eritrcitos,
havendo a possibilidade de falso positivo. Por outro lado, culturas com mais de 24 horas
podem dar falsos negativos.
3.3 OUTROS MTODOS DE IDENTIFICAO

3.3.1 TESTE DA CEFALOSPORINA CROMOGNICA
Este mtodo detecta as mais conhecidas -lactamases incluindo as dos Enterococcus

spp, Neisseria spp e Moraxella catarrhalis.
Discos com papel de filtro so impregnados com Cefinase (cefalosporina cromognea).

A -lactamase hidrolisa a ligao amido do anel -lactmico e produz alterao de cor.
Humedecer com gua destilada e esterilizada o disco de Nitrocefin (cefinase em disco,

guardado a -20C) previamente colocado em lmina de vidro. Usando uma ansa,
remover 4 a 5 colnias morfologicamente semelhantes da cultura e depositar na
superfcie do disco. Verificar se h modificao da cor: resultados positivos aparecem
15 segundos a 5 minutos depois (algumas estirpes de Staphylococcus spp podem dar
reaces tardias, at 1 hora). Se no houver alterao de cor o teste negativo.
3.3.2 TESTE DA NOVOBIOCINA
O Staphylococcus saprophyticus resistente novobiocina (disco de 5 g); outras

estirpes de Staphylococcus coagulase negativa com significado clnico so susceptveis.
Efectuar uma suspenso (0,5 MacFarland) da colnia em estudo em NaCla 0,85%, e

inocular em placa de Muller-Hinton. Colocar o disco de novobiocina na placa e incubar
16 a 18 horas a 35C em aerobiose. Examinar e medir o halo de inibio em volta do
disco.
- 112 -

Uma zona de inibio 16 mm indica resistncia e identifica presuntivamente S.
saprophyticus.
3.3.3 TESTE DA OPTOQUINA
A optoquina inibe o crescimento de Streptococcus pneumoniae, provocando um halo de

inibio da cultura na placa de gelose de sangue.
Semear uma colnia isolada na placa e colocar o disco no centro da rea semeada.
Incubar 18 a 24 horas a 35C em CO2. O crescimento de S. pneumoniae
caracteristicamente inibido pelo disco de optoquina produzindo um halo 15 mm.
4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS PARA EXAME BACTERIOLGICO
A seleco das amostras deve ser feita com base nos sinais e sintomas, deve ser
representativa do processo de doena e deve ser colhida antes da administrao de
agentes antimicrobianos. A anlise de um produto biolgico deixa de ter valor se a
amostra no representativa do local da infeco ou se se encontra contaminada com
flora comensal. A colheita e transporte influenciam os resultados obtidos.
4.1 COLHEITA
Uma hemocultura deve ser realizada quando h febre sem causa aparente, crnica ou
intermitente, acessos hipotrmicos, infeces localizadas graves, suspeita de
salmoneloses, bruceloses ou leptospiroses. Habitualmente, so suficientes trs
hemoculturas em 24 horas, colhidas separadamente. Uma s hemocultura pode levar a
que uma bacterimia intermitente no seja diagnosticada ou dificultar a interpretao
clnica do isolamento de determinados microrganismos. (15)
A colheita de sangue no deve ser feita no pico febril. O volume de sangue crtico
porque a concentrao de microrganismos baixa na maioria das bacterimias. Nas
crianas, a concentrao dos microrganismos muito mais alta do que nos adultos, por
isso so necessrios menores volumes de sangue: adultos 10 a 30 ml por puno
venosa, crianas 1 a 5 ml por puno venosa. (15)
- 113 -

Nas leses superficiais, lceras e lquidos de drenagem, a colheita feita com zaragatoa
aps desinfeco da zona externa, estando a maior dificuldade relacionada com a
colonizao por flora comensal. (15)
Em relao ao aparelho respiratrio, ao realizar a colheita na orofaringe deve evitar-se

contaminaes com saliva, colhendo nos pontos inflamados ou com ps.
No exsudado farngeo, baixar a lngua com esptula e colher com zaragatoa na faringe
posterior, amgdalas e qualquer rea inflamada ou ulcerada evitando tocar na mucosa
bucal e lngua. (15)
No exsudado nasal inserir uma zaragatoa em cada narina at encontrar resistncia, rodar
a zaragatoa contra a mucosa nasal. (15)
A expectorao, primeira amostra da manh, proveniente de um acesso de tosse
profunda, deve se colhida para um recipiente estril de boca larga e tampa de rosca.
Uma expectorao com predominio de saliva deve ser rejeitada. Para a pesquisa de
micobactrias, devem ser colhidas trs amostra de dias consecutivos. (15)
A urina um produto estril e um bom meio de cultura. A urina colhida aps lavagem
do meato urinrio com produto assptico e posterior eliminao deste com gua. A
colheita feita directamente para um recipiente estril. A primeira parte da mico deve
ser rejeitada. Nos doentes algaliados, a amostra deve ser retirada da juno entre o
catter e o saco colector, e nunca do saco colector. Nas crianas usa-se um saco
colector. (15)
Para efectuar o exsudado vaginal, a colheita deve ser realizada com a mulher, em
posio ginecolgica e introduzindo o espculo no colo vaginal. Com zaragatoa colher a
amostra do fundo do saco vaginal posterior e endocolo, colocar em meio transporte
apropriado. Repetir a operao com uma segunda zaragatoa para execuo dos
esfregaos. Para pesquisa de Chlamydia trachomatis e Micoplasmas genitais, deve ser
feita raspagem celular com zaragatoa de alginato de clcio, aps remover o excesso de
muco. A avaliao microscpica requer a avaliao de trs caractersticas: aspecto das
clulas epiteliais, aspecto dos microrganismos dominantes e presena de leuccitos.
O exsudado uretral deve ser realizado aps limpeza da mucosa circundante com
gaze esterilizada, introduzir na uretra cerca de 2 cm uma zaragatoa fina e flexvel, e com
- 114 -

movimento de rotao colher o exsudado. Repetir a operao com uma segunda
zaragatoa para execuo dos esfregaos. (15)
Para a coprocultura devem ser obtidas at um total de trs amostras de fezes, colhidas
em dias diferentes para um recipiente estril, sendo cada amostra processada no mesmo
dia da colheita. (15)
Na espermocultura, a amostra de esperma deve ser colhida para um recipiente estril.
4.2 TRANSPORTE
A utilizao de meios de transporte tem como objectivo permitir a viabilidade dos

microrganismos nos produtos biolgicos quando no podem ser processados
imediatamente aps a colheita.
Os meios de transporte de que dispomos consistem no meio de Amies com carvo e
meio de transporte de colheita de amostras endocervicais de Chlamydia.
As amostras e os meios de cultura devem adquirir a temperatura ambiente antes de

serem inoculados. Acender o bico de bunsen 30 minutos antes da sementeira para criar
uma rea estril. No falar durante o processamento das amostras.
Esterilizar a ansa pelo calor antes da sua utilizao ou usar ansas descartveis. A
sementeira das amostras feita com ansa segundo o mtodo clssico dos quatro
quadrantes. No caso das amostras colhidas com zaragatoa, inocular previamente o meio
de cultura com a zaragatoa.
As amostras devem ser semeadas no mais curto espao de tempo aps a sua recolha.
4.3 CONDIES DE INCUBAO

Atmosfera: possvel obter diferentes atmosferas com o GENbag que consiste num
envelope transparente, para incubao de amostras singulares, permitindo incubar uma
ou duas placas, galerias de identificao ou antibiograma, criando uma atmosfera de
CO2 ou microaerofilia, consoante o gerador.
- 115 -

Temperatura: existe uma temperatura ptima para o desenvolvimento da maioria dos
microrganismos, que ronda os 35-37C; importante prevenir a flutuao da
temperatura.
Humidade: a maioria dos microrganismos tem desenvolvimento optimizado com uma

humidade igual ou superior a 70%, os meios de cultura tm de se manter hidratados
durante o perodo de incubao.
5 PROCESSAMENTO LABORATORIAL NO EXAME BACTERIOLGICO
5.1 COPROCULTURA
As infeces do aparelho gastrointestinal tm uma alta incidncia na populao em

geral, com grande morbilidade em alguns grupos de etrios, como o caso das crianas
e idosos. Os antecedentes epidemiolgicos, a existncia de factores predisponentes, a
presena de sinais e sintomas clnicos e o tipo de diarreia devem orientar na pesquisa do
agente etiolgico.
As enterocolites agudas so infeces do intestino delgado ou do clon devidas a
bactrias entero-invasivas, bactrias toxinognicas no invasivas e a exotoxinas
bacterianas produzidas nos alimentos.
As bactrias com caractersticas invasivas, capazes de destruir a mucosa, aderem s
clulas epiteliais, penetram e multiplicam-se, originando o sndroma desintrico com
ulceraes caractersticas, que do origem a fezes mltiplas com sangue e pus (Shigella,
Salmonella, Campylobacter jejuni, Yersinea enterocolitica, Escherichia coli). As
bactrias produtoras de exotoxinas ou enterotoxinas fixam-se superfcie da mucosa,
mas no penetram no epitlio e produzem uma exotoxina. Verifica-se um fluxo de
lquidos atravs da parede celular com aumento de secreo dos sucos digestivos
(Vibrio cholerae, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Clostridium difficile,
Bacillus cereus produtor de enterotoxina termolbil, Campylobacter jejuni).
Nas enterocolites necrosantes, a necrose causada por uma isquemia intestinal que
favorece a proliferao bacteriana, por exemplo, enterocolites do recm-nascido por
Escherichia coli enteropatognica, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,
Clostridium butyricum, e enterocolites do adulto por Clostridium perfringens. As
enterocolites crnicas so infeces pouco dolorosas com evoluo lenta, com crises
- 116 -

febris levando a uma m absoro e perda de peso, devidas principalmente ao
Mycobacterium tuberculosis. (15)
As amostras de fezes devem ser examinadas e semeadas o mais rapidamente possvel

aps a colheita, uma vez que a descida do pH inibe o crescimento de algumas espcies
patognicas de Salmonella e Shigella.
Escolher as pores que contenham muco, sangue ou ps.

Fazer uma suspenso em gua destilada esterilizada.
Desta suspenso semear em meio Hektoen, CPS ID3, Sabouraud (quando pedido exame
micolgico) e meio lquido de Selenito.
Incubar em estufa a 37C, durante 18 a 24 horas.
No dia seguinte inoculao fazer passagem do meio lquido de Selenito para meio de
Hektoen. Incubar em estufa a 37C, durante 18 a 24 horas.
Das colnias suspeitas, no fermentadoras de lactose com ou sem produo de H2S,
efectuar subcultura para Ureia-indol. Observar o meio Ureia-indol no dia seguinte e se
padro compatvel com Salmonella spp e Shigella spp (urease negativa), efectuar
identificao bioqumica (API 20E).
Quando a prescrio
mdica indicar especificamente pesquisa de Yersinia
enterocolitica, fazer sementeira em gelose columbia + 5% sangue carneiro. Na

eventualidade de haver crescimento procede-se identificao das colnias pelo API
20E e subsequente antibiograma se houver confirmao de se tratar de Yersinia
enterocolitica.
5.2 ESPERMOCULTURA
A espermocultura serve de auxiliar de diagnstico nas infeces do trato genital

masculino. Os microrganismos mais frequentemente valorizados so Neisseria
gonorrhoeae, Enterococcus spp, Staphylococcus aureus e Enterobacteriaceae. (15)
Realizar o exame a fresco. Pesquisar ao microscpio ptico a presena clulas,

leuccitos, eritrcitos, formas leveduriformes e filamentosas de fungos.
- 117 -

Execuo de 2 lminas para colorao de Gram. Pesquisar ao microscpio ptico a
presena de bactrias (Gram positivas ou negativas) e suas caractersticas morfolgicas.
Sementeira da amostra em Sabouraud, gelose Columbia + 5% de sangue e gelose de

Chocolate. Se suspeita de:
- Neisseria gonorrhoeae: efectuar teste de oxidase (positiva) e identificao em
laboratrio exterior.
- Staphylococcus aureus: identificao em Pastorex Staph-plus
- Enterobacteriacea: identificao em API 20E
- Enterococcus spp: identificao em laboratrio exterior.
5.3 EXAME MICOLGICO
sempre semeado o meio de Sabouraud ou Candiselect4 aquando da cultura das

amostras dos seguintes produtos: exsudado vaginal, exsudado uretral, espermocultura,
exsudado purulento, exsudado auricular e exsudado ocular.
Das amostras dos restantes produtos s realizado exame micolgico quando
especificamente prescrito pelo mdico.
O exame micolgico segue o seguinte procedimento:

- Sementeira em meio Sabouraud/Candiselect4, a 37C durante 48 horas ;
- Sabouraud: se se verificar a presena de colnias suspeitas proceder ao exame a
fresco, se se verificar a presena de elementos leveduriformes no exame a fresco
realizar a prova de filamentao a partir da cultura; se positiva trata-se de Candida
albicans (C. albicans), se negativa identificar como Candida spp;
- Candiselect: no necessrio fazer prova filamentao, identificao directa de C.
albicans e identificao presumvel de C. Tropicalis, C. glabrata e C. krusei.
A prova de filamentao ou blastese consiste em verificar a formao de tubos

germinativos em soro humano em menos de 4 horas. Cerca de 98% das estirpes de C.
albicans produzem tubos germinativos neste tempo.
A partir de uma colnia de leveduras isoladas em meio Sabouraud, realizar uma
suspenso num tubo de hemlise contendo 1 ml de soro humano. Incubar a 35 C, 3 a 4
horas no mximo. Recolher uma gota do sedimento e observar ao microscpio entre
- 118 -

lmina e lamela. No caso de se tratar de C. albicans, observam-se tubos de germinao,
no apresentando nenhuma constrio na base do filamento.
necessrio ter em ateno que C. dubliniensis tambm emite tubos germinativos

nestas condies. Alm desta caracterstica, C. dubliniensis e C. albicans tm em
comum a produo de clamidsporos, crescimento de colnias com caractersticas
semelhantes nos meios Sabouraud e Candiselect, e crescimento a 37C. C. dubliniensis,
ao contrrio de C. albicans, no tem capacidade de crescimento a temperaturas de 42 a
45C.
Para a pesquisa de fungos filamentosos colocar o meio Sabouraud a 25C. Se se

verificar o crescimento de fungo filamentoso, a sua identificao feita com base nas
suas estruturas morfolgicas caractersticas.
5.4 EXPECTORAO
Nas vias areas inferiores, as infeces pulmonares crnicas podem resultar de
numerosas bactrias no parnquima pulmonar. Manifestam-se por sinais pulmonares
discretos e variveis consoante o agente infeccioso (por exemplo, Mycobacterium
tuberculosis). A pleurisia resulta de infeces da cavidade pleural acompanhada de um
exsudado inflamatrio, as quais podem ser devidas a Streptococcus pneumoniae ou
Staphylococcus aureus. (15)
O diagnstico das infeces respiratrias inferiores frequentemente dificultado pela

contaminao das amostras por flora comensal da orofaringe durante a colheita. O
laboratrio deve processar apenas amostras de boa qualidade.
Uma amostra de boa qualidade definida pelo exame directo. Observar ao microscpio,
com objectiva de 10, cerca de 10 campos para avaliar a qualidade da amostra tendo em
conta a presena de clulas epiteliais pavimentosas da orofaringe e leuccitos.
- 119 -

Classificar as amostras segundo o critrio de Murray e Washington:
Clulas epiteliais
Leuccitos
(ampliao 10)
10)
Grupo 1
25
10
Grupo 2
25
10-25
Grupo 3
25
25
Grupo 4
10-25
25
Grupo 5
<10
25
(ampliao
Segundo este critrio, processar as amostras que se englobam nos grupos 4 e 5, pois so
as de boa qualidade para o exame bacteriolgico habitual.
No dever ser aplicado este critrio em doentes neutropnicos e na pesquisa de outros
agentes especficos, tais como Mycobacterium spp, Legionella spp, Mycoplasma spp,
etc. Estes agentes no fazem parte da flora normal da orofaringe e no a colonizam.
Escolher uma poro purulenta da amostra e efectuar dois esfregaos. Proceder

colorao de Gram num dos esfregaos e no outro colorao de Ziehl-Neelsen, se
pedida a pesquisa de micobactrias, nomeadamente Bacilo de Koch (B.K.).
Seleccionar uma poro purulenta da amostra e semear, com ansa, nos meios de gelose
Columbia + 5% de sangue e gelose de Chocolate.
Incubar a 37C durante 18 a 24 horas. A gelose de chocolate deve ser mantida em
atmosfera de 5% de CO2.
Em caso de pedido de exame cultural de micobactrias enviar para laboratrio exterior.
- 120 -
5.5 EXSUDADO AURICULAR/OCULAR

A otite mdia uma infeco muito frequente em bebs e crianas, sendo os agentes
mais frequentes S. pneumoniae, S. pyogenes e H. Influenzae.
As infeces oculares incluem infeces das estruturas externas do olho (blefarites,

conjuntivites e queratites), das estruturas internas do olho (endoftalmites) e infeces do
sistema lacrimal (canaculites, dacriocistites, dacrioadenites). A nvel do saco conjuntival
existe uma flora saprfita constituda principalmente por Staphylococcus epidermidis,
S. aureus, Corynebacterium spp e Propionibacterium acnes.
Efectuar esfregao em lmina de vidro e proceder colorao de Gram.

Semear os meios de gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro, gelose de Chocolate
e Sabouraud. De seguida colocar a zaragatoa com a amostra no meio BHI.
Incubar em estufa a 37C durante 18 a 24 horas. Colocar a gelose de Chocolate em
atmosfera CO2.
No dia seguinte, se necessrio, fazer nova passagem do BHI para gelose de sangue e
gelose de Chocolate.
- 121 -
5.6 EXSUDADO NASAL

A flora comensal das vias areas superiores inclui bactrias aerbias, aero-anaerbias e
anaerbias. As bactrias patognicas especficas incluem Streptococcus do grupo A, C
e G, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza e
Staphylococcus aureus.

Semear a amostra em meio de gelose Columbia + 5% de sangue e Chapman. De seguida
colocar a zaragatoa com a amostra no meio BHI.
Incubar em estufa em aerobiose a 37C, durante 18 a 24 horas.
Valorizar a presena de Staphylococcus aureus e avaliar a sensibilidade (MSSA) ou

resistncia (MRSA) oxacilina.
5.7 EXSUDADO OROFARNGEO
As infeces das vias respiratrias superiores so muito frequentes, sendo a maior parte
de etiologia viral. O diagnstico bacteriolgico dessas situaes representa uma
tentativa de identificar, entre uma flora indgena abundante, o(s) agente(s) implicado(s)
- 122 -

na infeco. Vrios agentes patognicos tais como o S. pneumoniae, S. pyogenes, H.
influenza, N. meningitidis, leveduras e membros das Enterobacteriaceae, podem
constituir uma flora transitria ou estar presente em pequeno nmero na orofaringe de
indivduos saudveis. (15)
A principal causa de faringite viral. Na faringite bacteriana o principal agente causal

o Streptococcus -hemoltico do grupo A. Outras causas de faringite so a Neisseria
gonorrhoeae, Corynebacterium diphtheriae, Bordotella pertussis, devendo a pesquisa
destes agentes ser feita exclusivamente quando existe suspeita clnica e por solicitao
especfica do mdico. Assim, por rotina s ser investigada a presena de Streptococcus
-hemolticus dos grupos A, C e G de Lancefield. A possvel investigao de outros
agentes s ser feita por prescrio orientada.
A angina de Vincent um tipo de infeco da faringe devido a dois anaerbios, Borrelia
vincentii e Fusobacterium spp, sendo o diagnstico laboratorial feito por exame directo
do esfregao de material da faringe colhido com zaragatoa e corado com fucsina de
Ziehl diluda a 1:10. A observao de muitas espiroquetas e bacilos fusiformes com
muitos polimorfonucleares confirma o diagnstico. (15)

Semear o meio de Gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro. Colocar a zaragatoa
em BHI.
Incubar em estufa em atmosfera de aerobiose, a 37C, durante 18 a 24 horas.
- 123 -

5.8 EXSUDADO VAGINAL/URETRAL
A determinao de amostras apropriadas para o diagnstico de infeces do aparelho

genital depende do local de infeco e dos microrganismos. Algumas infeces do
aparelho genital feminino so devidas a microrganismos endgenos cuja patogenicidade
activada por factores do hospedeiro ou por desequilibrio da flora saprfita.
Nas cervicites, infeces do epitlio do endocolo marcadas por uma leucorreia
purulenta, os principais microrganismos associados so Chlamydia trachomatis e
Neisseria gonorrhoeae.
As uretrites so infeces da uretra com sintomatologia mais marcada no homem que na
mulher, a quaL podem apresentar infeces assintomticas (Chlamydia trachomatis,
Neisseria gonorrhoeae). As vaginites e bartolinites, infeces do epitlio vaginal e das
glndulas de Bartholin, esto associadas flora comensal (Gardnerella vaginalis). (15)
Figura 24: Observao microscpica (100) de Gardnerela vaginalis a partir de um

esfregao vaginal com colorao Gram.
Habitualmente pesquisa-se a presena de fungos (nomeadamente Candida spp),

parasitas (Trichomonas vaginalis) e bactrias (Gardnerella vaginalis). A possvel
pesquisa de outros agentes, nomeadamente Streptococcus -hemolticos do grupo B de
Lancefield (Streptococcus agalactiae), Neisseria gonorrhoeae, Chlamydea trachomatis,
Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum, s sero efectuadas mediante
prescrio orientada.
Em grvidas, fazer sempre sementeira em gelose de sangue para pesquisa de
Streptococcus agalactiae.
Em crianas, mulheres no ps-parto e sempre que seja prescrito pelo mdico fazer
sementeira em gelose de sangue para pesquisa de Streptoccocus grupo A.
- 124 -
Sero feitas trs colheitas com zaragatoa: uma para sementeira em Candiselect4 e gelose
Columbia + 5% de sangue de carneiro, outra para exame a fresco e a ltima para
execuo de duas lminas para colorao de Gram.
5.9 HEMOCULTURA
A grande maioria das doenas infecciosas podem decorrer com bacterimia transitria,
intermitente ou persistente. Como o sangue um produto estril, o isolamento de um
microrganismo a partir duma hemocultura indica, geralmente, ser este o agente
etiolgico da infeco. (15)
Incubar em atmosfera de aerobiose a 35C durante 7 dias ou at 28 dias quando suspeita

de Brucella, no meio bifsico.
Efectuar o exame macroscpico duas vezes por dia nos primeiros dois dias e depois
diariamente. Observar a presena de colnias, produo de gs, depsito, hemlise ou
turvao.
Em caso de positividade, fazer subcultura da hemocultura em meio slido, geralmente
gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro.
- 125 -
5.10 PS E EXSUDADOS PURULENTOS
Muitas so as situaes clnicas e muitos so os respectivos microrganismos

responsveis por infeces localizadas que conduzem formao de exsudados
purulentos. Perante a variedade de situaes clnicas e de agentes microbianos
implicados, os procedimentos a seguir descritos aplicam-se maioria das situaes, no
entanto, no se pode excluir a necessidade de mtodos especficos quando a situao
nosolgica indique a probabilidade de se tratar de um agente especfico, por exemplo
pesquisa de bactrias anaerbias. (15)
Semear o primeiro quadrante dos meios slidos, gelose Columbia + 5% de sangue de

carneiro, CPS-Id3 e Sabouraud, com a zaragatoa. Efectuar a sementeira dos restantes
quadrantes com ansa.
De seguida colocar a zaragatoa no meio de BHI.
Incubar em estufa a 37C, durante 18 a 24 horas.
Com a segunda zaragatoa executar um esfregao e cor-lo pelo mtodo de Gram.
- 126 -
5.11 URINA
As infeces do aparelho urinrio so uma das infeces mais frequentes no Homem. A
infeco urinria aguda geralmente causada por bactrias da flora intestinal saprfita
que invadem o aparelho urinrio por via ascendente atravs da uretra, aps
contaminao atravs da flora fecal e perineal. No entanto, a via de contaminao
tambm poder ser descendente ou hematgenea (secundria a uma septicemia),
iatrognea (flora comensal) ou exgenas (introduzidas por cateter ou sondas vesicais).
Os agentes etiolgicos mais frequentes nas crianas e adultos so as Enterobacteriacea
com grande destaque para a Escherichia coli. Em doentes com factores de risco como
algaliao permanente, clculos urinrios e outras patologias do aparelho urinrio, o
leque de agentes etiolgicos alarga-se a outros microrganismos, como Pseudomonas
spp, Staphylococcus spp, Enterococcus spp e fungos. (15)
Semear com ansa calibrada de 10 l o meio de CPS Id3.

Incubar em aerobiose, em estufa a 37C durante 18 a 24h.
Aps executada a sementeira, retirar uma parte de urina para um tubo de ensaio e
centrifugar a 1500 rotaes/minuto, durante 5 a 10 minutos.
- 127 -

Rejeitar o sobrenadante e colocar uma gota de sedimento para observao a fresco.
Se for pedida a pesquisa de bacilos lcool-cido resistentes ou houver piria sem
bacteriria, colocar uma terceira gota do sedimento numa lmina, deixar secar e fixar
chama. Corar pelo mtodo Zeihl-Neelsen.
Avaliao dos resultados de urinas asspticas:
Leucocitria/ml
Bacteriria/ml
3
104
< 10
> 104
105
Interpretao
Urina normal
Infeco
urinria,
antibiograma
obrigatrio
> 104
103 105
Infeco urinria possvel (prostatite,

uretrite)
> 104
103
Infeco urinria tratada, prostatite,

uretrite, nefrite, tuberculose
104
103
Contaminao
- 128 -

6 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIBITICOS (TSA)
O TSA deve ser efectuado nas seguintes situaes:
Para qualquer microrganismo que seja responsvel por um processo

infeccioso e que necessite de teraputica antimicrobiana
Estudos epidemiolgicos de resistncia e em estudos de novos agentes

antimicrobianos
Em todos os microrganismos isolados de locais geralmente estreis

(sangue, por exemplo);
Nas situaes clnicas que requerem teraputicas prolongadas;
Na ausncia de resposta teraputica emprica instituda.(16)
6.1 TESTE DE KIRBY-BAUER
No laboratrio, para testar a susceptibilidade do antimicrobiano face estirpe, executase o Teste de Difuso pelo mtodo de Kirby-Bauer.
Os Testes de Difuso utilizam uma suspenso bacteriana padronizada que semeada em
meio slido, com posterior colocao de discos de papel de filtro impregnados em
antimicrobianos.
O mtodo de Kirby-Bauer um mtodo de difuso em agar, testando in vitro a
susceptibilidade das bactrias aos antimicrobianos.
6.2 PRINCPIO DO MTODO
Um inculo padronizado do microrganismo aplicado na superfcie de uma placa de

gelose de Mueller-Hinton, onde se colocam discos impregnados de antimicrobianos.
Aps incubao, em geral durante 16-18 horas, so medidos os dimetros dos halos de
inibio de crescimento para cada disco. O tamanho do halo inversamente
proporcional CIM (concentrao mnima inibitria) do microrganismo e, baseando-se
nas recomendaes do CLSI, obtido um resultado qualitativo que se exprime em
sensvel, intermdio ou resistente:
- Estirpe sensvel: quando a CMI nitidamente inferior concentrao sangunea obtida
aps administrao de uma dose utilizada na teraputica;
- 129 -

- Estirpe resistente: quando a CMI superior s concentraes mximas que se possam
obter in vivo sem utilizar doses txicas;
- Estirpe intermdia: quando a CMI se situa entre os dois extremos.
6.3 INDICAES DO MTODO
Este mtodo est indicado para qualquer microrganismo responsvel por um processo
infeccioso em que seja necessria a teraputica antimicrobiana. Devem ser utilizadas
colnias isoladas do microrganismo em causa, obtidas a partir de uma cultura pura.
Esto desaconselhados testes de susceptibilidade feitos directamente a partir do produto
biolgico.
A seleco dos antimicrobianos a serem testados uma deciso de cada laboratrio em

conformidade com a eficcia do agente no microrganismo isolado e local onde foi
isolado, isto , capacidade de penetrao do agente.
6.4 REAGENTES E MATERIAL
Meios de cultura slidos
Gelose de Mueller-Hinton
Gelose de Mueller-Hinton com 5% sangue carneiro
Gelose Haemophilus Test Medium
Estes dois ltimos meios, a aplicar em isolados de Pneumococos e Haemophilus, no

so usados no laboratrio pelo reduzido nmero de estirpes isoladas, assim, estes
isolados so enviados para um laboratrio exterior.
Soluo NaCl 0,9% para preparao do inculo.
Discos de papel de filtro impregnados com antimicrobiano concentrao especificada.

(oxoid)
6.5 A ESCOLHA DO ANTIBITICO
- 130 -

Os antibiticos preferencialmente usados so aqueles que tm uma boa excreo no
local da infeco (por exemplo, urina, olho) ou que atingem altas concentraes nesse
local (por exemplo, sangue). (16)(17)
Nas infeces urinrias, testa-se preferencialmente ampicilina, amoxicilina com cido

clavulnico, cefuroxima, ceftriaxone, norfloxacina, ciprofloxacina, nitrofurantoina e
trimetroprim-sulfametoxazol. Em situaes especiais, podero tambm ser testados
aminoglicosidos (gentamicina) e cabapenemes (meropenem).
Enterobacteriaceae:
Agentes de infeces do tracto urinrio testar ampicilina, amoxicilina

com
cido
clavulnico,
cefuroxima,
ceftriaxone,
norfloxacina,
nitrofurantoina, ciprofloxacina, trimetroprim-sulfametoxazol.
Agentes de gastroenterites nas estirpes de Salmonella e Shigella spp

isoladas nas fezes s deve ser testada a ampicilina, uma quinolona e o
cotrimoxazol. Para estirpes isoladas em infeces extra-intestinais testar
tambm o cloranfenicol e uma cefalosporina de 3 gerao. No testar
cefalosporinas de 1 e 2 gerao e aminoglicosdeos. Os resultados para a
Salmonella spp no devem ser fornecidos aos clnicos nas gastroenterites
sem gravidade.
Pseudomonas aeruginosa:
So naturalmente resistentes ampicilina, amoxicilina com cido

clavulnico, trimetroprim-sulfometoxazol.
Testar ceftazidima, ciprofloxacina, gentamicina, imipenem e meropnem.
Staphylococcus spp:
O disco de oxacilina deve ser utilizado para testar a susceptibilidade s

penicilinas resistentes penicilase (metacilina, nafcilina, cloxacilina,
- 131 -

dicloxacilina e flucloxacilina) por ser mais resistente degradao do
armazenamento e por detectar melhor as estirpes heteroresistentes.
Os Staphylococcus metacilina-resistentes (MRSA) so resistentes in vivo a

todos os -lactmicos, associaes -lactmico+inibidor, cefalosporinas e
carbapenemes, independentemente do resultado in vitro para estes
antibiticos. Um dado suspeito de estirpe MRSA a presena frequente de
multiressitncia a outras classes de antimicrobianos (aminoglicosdeos,
macrlidos, clindamicina e tetraciclina).(15)(17)
As estirpes resistentes penicilina so quase sempre produtores de lactamases. Deve ser utilizado o disco de penicilina 10 U, e os resultados
so extrapolveis para todas as penicilinas sensveis penicilinase
(ampicilina,
amoxicilina,
azlocilina,
carbenicilina,
mezlocilina,
piperacilina e ticarcilina).(15)(17)
O cloranfenicol, macrlidos e clindamicina no devem ser referidos nos

isolados da urina.
Enterococcus spp:
O disco de ampicilina representativo de ampicilina, amoxicilina e

combinaes com inibidores de -lactamases para as estirpes no
produtoras de -lactamase.
recomendada a deteco da resistncia penicilina ou ampicilina

exclusivamente pela produo de -lactamase pelo mtodo Nitrocefin
(cefinase).
No devem ser testados cefalosporinas, clindamicina, cotrimoxazol e

aminoglicosidos devido a serem potencialmente errneos. (15)
Streptococcus pneumoniae:
Deve ser utilizado o disco de oxacilina 1 g para detectar a resistncia

penicilina: sensvel 20 mm (CIM 0,06 g/ml), resistente 19 mm
Este mtodo no distingue a resistncia intermdia (CIM entre 0,06-1

g/ml) da alta resistncia (CIM 2 g/ml). Em estirpes com um halo a
- 132 -

19 mm deve ser determinada a CIM (E-test) da penicilina e do ceftriaxone
ou cefotaxime; nestas situaes enviar a estirpe para um laboratrio
externo.
A resistncia penicilina no por produo de -lactamase por isso o

teste da cefinase no deve ser utilizado.
O disco de oxacilina representativo para as aminopenicilinas e

cefalosporinas orais (1 e 2 gerao). Se a estirpe fr sensvel penicilina
tambm sensvel a todas as cefalosporinas e cabapenemes
Haemophilus spp:
Deve ser feita a pesquisa de -lactamases (cefinase), e as estirpes positivas

devem ser dadas como resistentes ampicilina e amoxicilina,
independentemente do tamanho dos halos
As raras estirpes resistentes ampicilina -lactamases negativas, teste

cefinase negativo (alterao da PBP) devem ser consideradas resistentes s
associaes -lactmico+inibidor das -lactamases, cefaclor, cefetamet,
cefonicid, cefprozil, cefuroxime, loracarbet e piperacilina/tazobactam,
independentemente dos resultados in vitro para estes agentes.(15)
Nas estirpes isoladas em hemoculturas em infeces graves s deve ser

dado o resultado da ampicilina, cefalosporina de 3gerao e cloranfenicol.
O resultado dos antibiticos administrveis por via oral s deve ser dado
nas infeces localizadas pouco graves.
O quadro seguinte indica a possibilidade de utilizao de antibiticos na gravidez:
Antibitico
1 trimestre
2 trimestre
3 trimestre
Penicilinas
Sim
Sim
Sim
Cefalosporinas
Sim
Sim
Sim
Macrlidos
Sim
Sim
Sim
Aminoglicosidos
No
No
No
Sulfonamidas/Trimetroprim No
No
No
Quinolonas
No
No
No
- 133 -

Nitrofuranos
No
Sim
No
7. TCNICAS LABORATORIAIS USADAS EM PARASITOLOGIA

7.1 EXAME DE FEZES
As fezes devem ser recolhidas no laboratrio ou, na impossibilidade, lev-las

rapidamente para o laboratrio para pesquisa de amibas. Repetir a colheita de amostras
duas as trs vezes para evitar um perodo negativo.
Algumas informaes relativas ao paciente so indispensveis para as tcnicas a
escolher: viagens, sintomas, eosinofilia, tratamentos prescritos.
Avaliar a mostra quanto a:

Aspecto das fezes, consistncia e cor;
Aspecto macroscpico para pesquisa de vermes adultos (oxiro, tnia, ascaris);
Exame microscpico directo (aspecto sumrio da digesto, formas vegetativas de
amibas e flagelados) e concentrado (ovos quistos e larvas).
Na pesquisa de amibas, o exame a fresco sobre placa aquecida permite ver formas
hematfagas em actividade.
Devem ser executadas duas tcnicas diferentes de concentrao dos mtodos de

flutuao e difsicos.
7.1.1 MTODO DE FAUST (MTODO DE FLUTUAO)

Objectivo: pesquisa de ovos pesados, principalmente ovos de Schistossoma mansoni e
Schistossoma intercalatum.
Dissolver 10 gr de fezes em 100 ml de gua.

Filtrar para um copo cnico a suspenso utilizando 2 gazes humedecidas em gua.
Ao fim de 60 minutos decantar o sobrenadante.
Juntar mais 100 ml de gua e emulsionar.
Ao fim de 45 minutos, decantar o sobrenadante e emulsionar o sedimento com 100 ml
de gua e 5c.c. de glicerina.
- 134 -

Deixar sedimentar durante 30 minutos e decantarr o sobrendante.
Observar ao microscpio o sedimento entre lmina e lamela com objectiva de 10.
7.1.2 MTODO DE KATO QUALITATIVO (EM CAMADA ESPESSA)
Objectivo: pesquisa de ovos (helmintas).
Com uma vareta fazer um esfregao em lmina da amostra de fezes.

Colocar sobre o esfregao uma tira de celofane embebida no soluto de glicerina-verde
malaquite.
Rolar com a vareta de vidro o esfregao para homogeneizar a preparao.
Colocar papel absorvente por cima da preparao, comprimindo suavemente com a
mo, para absorver o excesso de soluto.
Colocar 20 minutos na estufa a 40C-60C ou 60 minutos temperatura ambiente, para
aclarar as fezes.
Examinar ao microscpio com objectiva de pequena ampliao 10.
Nota: para pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni, S. intercalatum e Ancylostoma

duodenale, as preparaes devem ser vistas de imediato, uma vez que o soluto interfere
na morfologia dos ovos.
7.1.3 MTODO DE RITCHIE (MTODO DIFSICO)

Objectivo: concentrao de quistos de protozorios, ovos de helmintas e deteco de
ovos de Schistossoma mansoni ou Schistossoma intercalatum.
Num tubo cilindrico emulsionar 1 gr de fezes em 8 ml de soro fisiolgico.

Filtrar para o tubo de centrifuga atravs de 2 camadas de gaze humedecida em gua.
Centrifugar cerca de 5 minutos a 800 rotaes por minuto.
Decantar o sobrenadante. Repetir a operao com soro fisiolgico.
Decantar novamente o sobrenadante e misturar o sedimento com 8 ml de formalina a
10%. Repousar 5 minutos.
Juntar 3 ml de ter e agitar fortemente durante 1 minuto.
Centrifugar a cerca de 1500 rotaes durante 5 minutos
- 135 -

Formao de 4 camadas: a superior, ter, a segunda de matrias fecais, a terceira de
formalina e a quarta de sedimento rico em quistos e ovos pesados.
Num movimento rpido, inverter o tubo de centrifuga, a fim de desperdiar as 3
primeiras camadas e reter somente a aderente ao fundo do tubo, isto , o sedimento.
Observar ao microcpio, entre lmina e lamela, 1 gota de sedimento corado com 1 gota
de lugol, com objectiva de 40
7.1.4 MTODO DE WILLIS (MTODO DE FLUTUAO)

Objectivo: pesquisa de ovos
Emulsionar 1 a 2 gr de fezes em soluto saturado de cloreto de sdio dentro de um

pequeno tubo de vidro.
Encher o restante tubo.
Colocar horizontalmente uma lamela sobre a abertura do tubo de modo a que o lquido
fique em contacto com a face inferior da lamela.
Aguardar 5 minutos.
Retirar rapidamente a lamela e coloc-la, com a face inferior para baixo, sobre a lmina.
Examinar ao microscpio com objectiva de 10.
Repetir a operao com nova lamela, caso necessrio.
7.1.5 MTODO DE ZIEHL-NEELSEN MODIFICADO

Objectivo: pesquisa de Cryptosporidium
Fazer um esfregao do sedimento de fezes resultante do mtodo de Ritchie.

Deixar secar bem o esfregao e fixar com metanol absoluto durante 2 minutos.
Secar ao ar.
Cobrir o esfregao com fucsina fenicada para Crytosporidium. Deixar actuar 5 minutos.
Cobrir com lcool etlico a 50% e lavar imediatamente com gua corrente.
Descorar com cido sulfrico a 2% durante 2 minutos.
Lavar com gua corrente. Deixar secar.
Observar ao microscpio com objectiva de 100.
- 136 -
7.2 EXAME NO SANGUE
7.2.1 PESQUISA DE MICROFILRIAS (MTODO DA 2 CENTRIFUGAO DE MARTIN)
Objectivo: Pesquisa de microfilrias no sangue

Centrifugar o sangue durante cerca de 5 minutos a 300 rotaes por minuto.
Pipetar o plasma sobrenadante juntamente com a camada de separao junto aos
glbulos vermelhos (rica em leuccitos e microfilrias) para outro tubo de centrifuga.
Centrifugar o segundo tubo durante 8 minutos a 500 rotaes por minuto.
Observar o sedimento, rico em glbulos vermelhos e microfilrias, em gota espessa.
Caso seja positivo deixar secar bem a gota espessa e proceder hemlise com a
colorao pelo Giemsa. Classificar ao microscpio com objectiva de 40.
7.2.2 PESQUISA DE PROTOZORIOS (ESFREGAO E GOTA ESPESSA)
Objectivo: pesquisa de plasmdios. A gota espessa permite uma leitura rpida mesmo
com fraca parasitmia.
Depois de bem seca a gota espessa, hemolisar com gua tamponada.
Escorrer a lmina suavemente para a gota no resvalar.
Cobrir a gota com soluto de Giemsa e corar durante 20 minutos.
Lavar, secar e observar ao microscpio com objectiva de imerso 100.
Figura 25: Observao microscpica (100) de Plasmodium falciparum num esfregao

de sangue de controlo de qualidade externo.
- 137 -

7.2.3 PESQUISA DE TRIPANOSSOMAS (MTODO DA 3 CENTRIFUFAO DE MARTIN)
Objectivo: pesquisa de tripanossomas no sangue.
Centrifugar o sangue durante cerca de 5 minutos a 300 rotaes por minuto.

Pipetar o plasma sobrenadante juntamente com a camada de separao junto aos
glbulos vermelhos (rica em leuccitos e tripanossomas) para outro tubo de centrifuga.
Centrifugar o segundo tubo durante 8 minutos a 500 rotaes por minuto.
Pipetar todo o plasma e um pouco de sedimento (glbulos vermelhos) para outro tubo
de centrifuga.
Centrifugar o terceiro tubo durante 30 minutos a 1500 rotaes por minuto.
Decantar o plasma e observar ao microscpio o sedimento em preparaes muito finas
entre lmina e lamela com objectiva de 40.
7.3 EXAME DE URINA (MTODO DE SEDIMENTAO)
Objectivo: pesquisa de ovos de Schistossoma haematobium.
O utente dever estar sem urinar 2 horas antes da recolha.

Antes do exame, o utente dever fazer exerccio fsico (saltar ou subir e descer escadas).
Verificar se o doente tem hematria terminal.
Recolher toda a urina da mico para um copo cnico de 500 ml.
Deixar sedimentar pelo menos 60 minutos.
Decantar o sobrenadante, restando s o sedimento.
Observar ao microscpio o sedimento entre lmina e lamela com objectiva de 10.
8 TCNICAS LABORATORIAIS USADAS NO EXAME MICOLGICO

O diagnstico das infeces fngicas depende da combinao da observao clnica e
investigao laboratorial. As infeces fngicas superficiais frequentemente apresentam
leses caractersticas que sugerem o diagnstico, mas pode observar-se uma
modificao na leso com aspecto atpico devido a tratamentos prvios. Os testes
laboratoriais podem ajudar a estabelecer ou confirmar o diagnstico de uma infeco
fngica, a prever respostas aos tratamentos e a monitorizar a evoluo da infeco. (18)
- 138 -

O sucesso do diagnstico laboratorial de uma infeco fungica depende em grande parte
da colheita correcta da amostra. A amostra deve ser incubada a 25-30C, sendo as
amostras profundas e subcutneas tambm incubadas a 37C.
importante reconhecer que o crescimento de um microrganismo em cultura no

estabelece necessariamente o seu papel como agente patognico. A maioria dos fungos
so patognicos oportunistas e o seu isolamento pode no ter relevncia clnica. O
isolamento de fungos de locais estreis, como lquido-cefaloraquidiano, geralmente
fornece evidncia significativa de infeco, mas o seu isolamento de amostras como
ps, expectorao ou urina deve ser interpretado com precauo. (18)
No diagnstico laboratorial micolgico o exame directo importante na orientao da

escolha dos meios de cultura, na execuo de exames adicionais, no diagnstico
definitivo quando os elementos fngicos so patognmicos da infeco (por exemplo,
Malasszia furfur). No entanto, a sensibilidade do exame directo inferior do exame
cultural.
Os procedimentos relativos ao exame micolgico esto indicados em 2.5.3, e as

especificaes do meio de cultura em 2.2.2 e 2.2.10.
- 139 -

CONTROLO DE QUALIDADE
O Controlo de Qualidade Interno o conjunto de procedimentos postos em

prtica num laboratrio com vista a permitir um controlo de qualidade dos resultados
das anlises medida que as mesmas so executadas. Tem como objectivo garantir a
deteco de anomalias, avaliao de erros e sua imediata correco. (19)(20)
Autoanalisadores e anlises em geral:

- Utilizao de controle universais de dois nveis diferentes (normal e patolgico) no
incio de cada dia de trabalho
- Repetio de amostras de utentes no mesmo dia retiradas aleatriamente e executados
em diferentes fases do dia de trabalho
Serologia: o CQI realizado quando da abertura de novos lotes, e sempre que se

justifique.
Meios de cultura, cada lote de novos meios deve ser submetido ao seguinte controlo:
Esterilidade observao de desenvolvimento bacteriano (colocar uma placa a 37C
durante 48 horas) e fngico (colocar uma placa durante 5 dias temperatura ambiente)
Exame macroscpico observao de desidratao, cor e transparncia do meio.
Teste de sensibilidade a antibticos (TSA):

Utilizao de estirpes de referncia (Staphylococcus aureus 24923, Escherichia coli
25922, Pseudomonas aeruginosa 27853)
A avaliao externa da qualidade corresponde avaliao, por um organismo

exterior, da qualidade dos resultados fornecidos pelo LAC: INSA (Instituto Nacional de
Sade Dr. Ricardo Jorge); Quality Control Service, Roche; NEQAS (United Kingdom
National External Quality Assessment Services); AEFA (Associao Espanhola de
Farmacuticos Analistas).
INSA, controlo mensal:

- PCR, FR, IgG, IgA, IgM, IgE, TASO, transferrina, C3 e C4
- endocrinologia: LH, FSH, progesterona, prolactina, estradiol, testosterona
- 140 -

- -Amilase, Albumina, Bilirrubina Total, Clcio, Cloretos, Colesterol total, Creatinina,
Creatinaquinase, Desidrogenase Lctica, Ferro, Folatos, Fosfatos, Fosfatase Alcalina,
Fosfatase cida, Glicose, Gamaglutamiltransferase, Globulina 1, Globulina 2,
Globulina , Globulina , HbA1c, Magnsio, Potssio, Sdio, Protenas Totais,
Transaminase glutamicaoxaloactica, Transaminase glutamicapiruvica, Triglicridos,
Uratos, Ureia, Urina II, Vitamina B12
NEQAS:
- controlo externo do PSA total e livre e dos marcadores de hepatite B
- Controlo mensal de eritrograma, contagem de glbulos brancos totais e plaquetas
- Controlo trimestral de leucograma.
Quality Control Service, Roche:

- controlo mensal de -Amilase, cido rico, Bilirrubina Total e Directa, Clcio,
Colesterol total, Creatinina, Creatinaquinase, Desidrogenase Lctica, Fsforo, Fosfatase
Alcalina,
Glicose,
Gamaglutamiltransferase,
Protenas
Totais,
Transaminase
glutamicaoxaloactica, Transaminase glutamicapiruvica, Triglicridos, Ureia
AEFA:
- Controlo mensal de tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial activada e
fibrinognio.
- Anlise de 6 amostras bacteriolgicas e parasitolgicas ao ano: cultura, estudo
morfolgico, estudo bioqumico, identificao de estirpe bacteriana, TSA.
- Anlise de uma amostra de soro trimestral: sfilis, IgG anti-toxoplasma, brucella,
TASO, IgG anti-rubola, HBsAg, IgG anti-citomegalovrus, anticorpos anti-HIV,
mononucleose infecciosa.
- 141 -

CONCLUSO
A actividade profissional consistiu em:

-
testar e controlar os mtodos usados na execuo das anlises;
colaborar na obteno das amostras e sua manipulao, informao e preparao

dos doentes para a correcta obteno das mesmas;
elaborao dos procedimentos de trabalho, para os equipamentos e

procedimentos analticos;
controlar a qualidade tcnica e instrumental e a manuteno dos equipamentos;
colaborar na implementao de novos procedimentos;
participar nos programas de formao nos quais esteja implicado o laboratrio;
- 142 -

RESUMO
A histria da evoluo do vrus Influenza A durante a ltima dcada complexa.

A 23 de Abril foi identificado pela OMS (Organizao Mundial de Sade) um novo
vrus influenza de origem suna: (H1N1)v. A 11 de Junho de 2009, a OMS elevou o
nvel de alerta para fase 6, declarando estar perante uma nova pandemia por influenza.
Segundo a OMS, o diagnstico molecular actualmente o mtodo de escolha
para a deteco de (H1N1)v. A metodologia implementada, RT-PCR na plataforma
LightCycler 2.0, utiliza o Influenza A/H1N1 Detection Set da Roche. A identificao de
Influenza A baseada no gene conservado da protena de matriz (M2). A identificao
do subtipo (H1N1)v baseada na deteco do gene da hemaglutinina (HA).
Os resultados obtidos permitem verificar que a percentagem de infeces por
(H1N1)v inferior nos grupos com mais de 60 anos (45,16%). O grupo etrio dos 0 aos
20 anos aquele que apresenta um maior nmero de pedidos de pesquisa de (H1N1)v,
sendo igualmente o grupo com maior percentagem de casos positivos. Os resultados
demonstram ainda a prevalncia de infeco por (H1N1)v em detrimento de outros vrus
Influenza A sazonais (0,61%). A percentagem de resultados positivos para (H1N1)v,
60,08%, est em concordncia com os dados fornecidos por outros laboratrios na fase
de pandemia.
Os objectivos deste trabalho, a implementao da tcnica de RT-PCR para
deteco especfica e rpida de (H1N1)v, foram atingidos.
ABSTRACT
The history of the evolution of Influenza A viruses during the last decade is
complex. A new Influenza virus of swine origin: (H1N1)v was first identified on April
23rd 2009 by the WHO (World Health Organization), declaring latter a pandemic alert
stage 6 on June 11th 2009, wich indicates an ongoing influenza pandemic.
According to the WHO, molecular diagnosis is currently the method of choice
for (H1N1)v detection. The methodology implemented, RT-PCR on a LightCycler 2.0
platform, was performed with Influenza A/H1N1 Detection Set by Roche.
The procedure for testing Influenza A is based on the detection of M2 gene. The
identification of (H1N1)v is based on the specific hemaglutinin gene detection.
- 143 -

Results have shown that the percentage of infection is lower in the over 60 age
group (45,16%). The 0 to 20 age group is the one showing a higher number of requests
for (H1N1)v testing as well as being the age group with the highest incidence of
positive cases.
(H1N1)v infection has a prevalence over other seasonal Influenza A viruses
(0,61%). The positive results for (H1N1)v, 60,08%, are in agreement with other
laboratories investigating the pandemic.
The purposes of this experiment, the implementation of a RT-PCR for a specific
and quick detection of (H1N1)v, was accomplished.
INTRODUO
VRUS INFLUENZA
A gripe uma doena infecciosa aguda resultante da infeco pelo vrus Influenza
e que atinge o tracto respiratrio superior e inferior. Ocorre tipicamente nas estaes de
Outono e Inverno. uma doena de elevado contgio cuja transmisso ocorre por
aerossis das secrees respiratrias ou por contacto directo com objectos contaminados
com essas secrees. (21)
Os vrus Influenza pertencem famlia Orthomyxoviridae. So vrus com

invlucro e genoma RNA negativo ( necessria a sntese da cadeia complementar
positiva atravs da enzima vrica previamente formada RNA polimerase - RNA
dependente). (22)
O virio Influenza (isto , a partcula viral completa com o core e o invlucro)

uma partcula globular com uma bicamada lipdica, proveniente da membrana
citoplasmtica do hospedeiro. Duas protenas integrais de membrana (hemaglutinina,
HA, e neuraminidase, NA) esto inseridas na bicamada lipdica, passando a superfcie
do virio e formando as espculas caractersticas. A matriz localiza-se abaixo do
invlucro, e contm 8 segmentos de RNA genmico, associado a nucleoprotenas e
protenas no estruturais e vrias molculas de RNA polimerase. (23)
- 144 -

H trs tipos de vrus Influenza, designados de A, B e C, sendo a classificao
baseada nas caractersticas internas da nucleoprotena e protenas da matriz, uma vez
que so muito estveis. (21)
Os oito segmentos do genoma dos vrus Influenza A e B codificam para 11

protenas. (21)
As protenas PB1, PB2 e PA do complexo polimerase sintetizam os RNAs
necessrios replicao viral. A protena PB1-F2 resulta de um reading frame
alternativo da PB1. (21) (24)
A HA e NA so as duas glicoprotenas de superfcie. A HA responsvel pela
fuso clula hospedeira e contra esta que se dirigem os anticorpos. A NA tem uma
funo enzimtica, cliva os resduos de cido silico contidos nas glicoprotenas ou
glicolpidos que funcionam como receptores celulares e medeia a libertao de viries
recm-formados a partir da superfcie da clula infectada, sendo o alvo para os antivirais
oseltamivir e zanamivir. (21) (24)
A nucleoprotena (NP) tem um papel estrutural na formao da ribonucleoprotena
e est envolvida na replicao. (21)
A protena de matriz M1 tem uma funo estrutural estando envolvida no controlo
da actividade da RNA polimerase viral. A protena M2 do Influenza A e a
correspondente protena BM2 do Influenza B formam um canal inico essencial
maturao do vrus. (23) (24)
As duas protenas no estruturais (NS1 e NS2) acumulam-se no ncleo e so
fosforiladas nas clulas infectadas. (21)
Os vrus Influenza do tipo C so formados por apenas sete segmentos de RNA e

no apresentam actividade de neuraminidase. (21)
O vrus Influenza A tem diferentes subtipos, baseados nas glicoprotenas de

superfcie: 16 hemaglutininas (H1 a H16) e 6 neuraminidases (N1 a N6). Destes, apenas
trs subtipos hemaglutininas (H1, H2, H3) e dois subtipos neuraminidases (N1 e N2)
estabeleceram linhagens na populao humana. (23) (25)
Os vrus Influenza do tipo A desenvolve antigenic shift (variaes major) e

antigenic drift (variaes minor), estando associado a epidemias e pandemias. Tem
- 145 -

como hospedeiros o Homem e os animais. Ao contrrio, o tipo B apenas sofre antigenic
drift, e o nico hospedeiro o Homem, estando associado a epidemias. O tipo C
relativamente estvel, no causando habitualmente patologia no Homem. (22) (25)
As variaes minor resultam da acumulao de mutaes nos genes que
codificam para a HA e/ou NA dos vrus influenza do tipo A ou B. Como consequncia
deste processo, os anticorpos do hospedeiro no reconhecem as glicoprotenas de
superfcie (HA e NA) e surgem as epidemias sazonais. (22)
As variaes major ocorrem quando dois vrus diferentes, pertencentes a
espcies distintas, co-infectam um nico hospedeiro que actua como reservatrio de
recombinao. Os vrus resultantes tm um potencial pandmico por possurem
antignios de superfcie contra os quais a populao humana no tem imunidade. (22)
As pandemias por Influenza ocorrem tipicamente em cada 10 a 40 anos, e podem
afectar at 50% da populao mundial. (21)
As aves so reconhecidas como o reservatrio natural de Influenza A, e como tal

representam uma via potencial para a emergncia de novas estirpes de vrus que podem
causar doena humana. (26)
Alm das aves aquticas, os vrus Influenza A tm a capacidade de infectar uma

variedade de espcies hospedeiras, incluindo os sunos e humanos. Apesar de exibirem
especificidade de espcie, esta restrio no absoluta, havendo por vezes interaco
entre diferentes linhagens que se desenvolvem em espcies hospedeiras diferentes. (24)
Os vrus Influenza A so capazes de recombinao se uma clula for infectada

com mais de um vrus. Este evento pode alterar dramaticamente a evoluo dos vrus
num dado hospedeiro. As duas pandemias mais recentes por vrus Influenza A
resultaram da recombinao entre vrus avirios e humanos, em 1957 o H2N2 (continha
HA, NA e PB1 de origem aviaria e os restantes segmentos do H1N1 humano), e em
1968 o H3N2 (continha HA e PB1 avirio e os restantes segmentos do H2N2). (24)
Os vrus avirios ligam-se preferencialmente aos receptores de cido silico com

ligaes 2,3-galactose, enquanto as estirpes humanas se ligam preferencialmente ao
cido silico 2,6-galactose. No entanto, muitos rgos dos patos e galinhas expressam
- 146 -

receptores de cido silico 2,3-galactose e cido silico 2,6-galactose. Em relao s
clulas epiteliais da traqueia, as das galinhas, mas no as do pato, expressam receptores
de cido silico 2,6-galactose. (26)
O porco tem um papel importante na ecologia dos vrus Influenza A porque

susceptvel a vrus de linhagens humana e aviaria. As clulas do tracto respiratrio do
porco tm receptores sialico-oligossacridos com cido N-acetilneuraminico-2,3galactose e cido N-acetilneuraminico-2,6-galactose. Este facto levou hiptese do
porco ser o reservatrio onde ocorre a recombinao de vrus Influenza de diferentes
linhagens. (27)
Mais recentemente, as infeces no Homem foram causadas pela emergncia de

vrus avirios H5N1, em Hong Kong em 1997. Estes casos demonstraram que os vrus
avirios podem infectar directamente os humanos sem a necessidade de um hospedeiro
intermedirio como o porco. (26)
A histria da evoluo do vrus Influenza A (H1N1) suno durante a ltima dcada

complexa. Durante muitas dcadas, o vrus Influenza H1N1 suno do Norte da
Amrica (H1N1 clssico) teve uma baixa taxa de mutao, mas em 1997 surgiu um
novo recombinante contendo trs segmentos (HA, NA e PB1) do vrus H3N2 humano e
os restantes cinco do H1N1 clssico. Pouco tempo depois, o primeiro vrus
recombinante triplo foi documentado, com substituio dos segmentos clssicos PA e
PB2 do H3N2 por avirios. Este recombinante triplo rapidamente se espalhou por
populaes sunas, com recombinaes adicionais, incluindo um recombinante triplo
H1N2 resultante do segmento HA clssico (H1) com o triplo H3N2. (28)
Em Abril de 2009, um vrus com dois segmentos (NA, M) do H1N1 suno
Europeu e seis segmentos similares aos vrus recombinante triplo H1N1/N2 suno do
Norte da Amrica, foi detectado em humanos no Mxico. (27) (28)
Os subtipos de Influenza A em circulao mudam todos os anos. Presentemente h

dois subtipos de H1N1, um sazonal e pandmico, e um H3N2 sazonal.
- 147 -
Figura 1: As cores indicam a origem do segmento. Os isolados da Tailndia representam

os nicos exemplos sequenciados, anteriores ao (H1N1)v, de recombinaes contendo o
segmento HA do H1N1 clssico suno e o segmento NA da linhagem suna Europeia-Asitica.
(28)
At actual pandemia, houve apenas casos espordicos de infeco humana pelo

recombinante triplo. Uma hiptese a de terem ocorrido mutaes posteriores nas
protenas NA ou HA que facilitaram a transmisso Homem-Homem do (H1N1)v.
Alternativamente, algumas combinaes de protenas internas, que promoveram
alteraes nas protenas de superfcie, deram ao (H1N1)v a capacidade de causar a
pandemia no Homem. (28)
UMA NOVA PANDEMIA
Entre Maro e Abril de 2009, foram reportados no Mxico surtos de doena

respiratria, com 2155 casos de pneumonia e 100 mortes.
A 23 de Abril foi identificado pela OMS (Organizao Mundial de Sade) um
novo vrus Influenza de origem suna: (H1N1)v. O vrus rapidamente se espalhou a
- 148 -

outros pases por transmisso humana. A OMS anunciou mais de 15000 casos
confirmados de infeco por (H1N1)v em 54 pases, incluindo 99 mortes.
A 11 de Junho, a OMS elevou o nvel de alerta para fase 6, declarando estar
perante uma nova pandemia por Influenza. Pandemia define-se como transmisso
intensa e mantida na populao geral.
Ao contrrio do vrus Influenza sazonal, as crianas e jovens adultos foram os

mais atingidos. O grupo etrio entre os 5 e 59 anos contribuiu para 87% das mortes (na
gripe sazonal contribuem para 17%) e 71% dos casos de pneumonia severa (na gripe
sazonal seria de 32%). Este facto pode ser explicado, em parte, pela possibilidade de
alguma imunidade ao novo vrus das pessoas que foram expostas pandemia de 1957
(tambm com H1N1). Poucos casos foram reportados em idosos, mas este grupo tem a
mais elevada taxa de mortalidade. (25)
No pas Basco, nas 10 ltimas gripes sazonais, as infeces pelo subtipo H3 foram
3.5 vezes superiores s H1. Esta razo foi detectada em todos os grupos etrios
inferiores a 59 anos, mas triplicou nos doentes com mais de 60 anos. Este estudo
demonstrou que um tero dos doentes com H1N1, pandmico e sazonal, tinham entre 30
a 59 anos. A imunidade residual ao H1N1 daqueles que nasceram antes de 1950 pode
dever-se baixa capacidade de variaes minor do subtipo H1N1, combinada com a
circulao deste vrus entre 1918 e 1957. (29)
Em resumo, a actual pandemia por (H1N1)v tem caractersticas epidemiolgicas

distintas.: a distribuio de casos similar em mltiplas reas geogrficas, a distribuio
de casos por grupos etrios marcadamente diferente do vrus influenza sazonal. (25)
A maioria dos casos de infeco por (H1N1)v so relativamente moderados e sem

complicaes. No entanto, algumas pessoas apresentam um risco elevado de
complicaes, incluindo crianas, grvidas, doentes com imunodeficincia ou com
patologias concomitantes. (25)
- 149 -

MEIOS DE DIAGNSTICO
Adultos em ambulatrio excretam o vrus durante 3 a 6 dias, no caso dos doentes

hospitalizados mais prolongado e o seu estado de doena tambm se prolonga. A
teraputica com agentes antivirais, quando iniciada at 4 dias aps o incio da gripe,
aumenta a eliminao do vrus. Assim, necessrio testar e isolar os casos suspeitos de
influenza num curto espao de tempo. (25)
Os sintomas de uma infeco por (H1N1)v incluem febre, tosse, dor de garganta,
rinorreia, cefaleias, mialgia, e cerca de 25% dos doentes apresentam vmitos e diarreia.
Os sinais e sintomas indicam se o paciente tem uma doena do tipo influenza-like, mas
no confirmam ou excluem o diagnstico de infeco por influenza. A maioria dos
doentes no so tratados nem testados para (H1N1)v. Em caso de suspeita, o teste para
deteco de (H1N1)v s dever ser pedido se o resultado alterar a abordagem ao doente,
por exemplo, isolamento de doentes internados e tratamento com oseltamivir, uma vez
que o vrus Influenza A sazonal resistente ao oseltamivir e o H1N1 pandmico
sensvel. No entanto, esto j descritos casos de resistncia ao oseltamivir, envolvendo a
substituio de uma histidina por tirosina na posio 275 (H275Y) na neuraminidase.
(25)
O clnico deve estar familiarizado com os testes disponveis:

- ensaio antignico rpido, resultado em 15 minutos, 20-30% sensibilidade (um
resultado negativo no exclui o diagnstico), valor preditivo positivo elevado.
- pesquisa directa de anticorpos por fluorescncia, resultado em 2,5 horas, sensibilidade
de 47%, valor preditivo positivo de 95%, valor preditivo negativo de 92%
- PCR (Polymerase Chain Reaction), resultado em 6 horas, sensibilidade de 98%, valor
preditivo positivo de 100%, valor preditivo negativo de 98%.
- cultura, resultado em 2 a 3 dias, sensibilidade de 89%, valor preditivo positivo de
100%, valor preditivo negativo de 88%. (25)
Estes testes determinam se o doente tem ou no Influenza A, mas o teste

confirmatrio para o (H1N1)v s possvel por PCR, uma vez que os anticorpos
monoclonais para a tipificao de (H1N1)v ainda esto em estudo. (25)
- 150 -

Segundo a OMS, o diagnstico molecular actualmente o mtodo de escolha para
o vrus Influenza A(H1N1)v. A utilizao de diferentes regies do genoma mais
apropriado para a correcta identificao do vrus. Os seguintes alvos so importantes:
gene da matriz para Influenza A, gene para hemaglutinina especfica (H1N1)v e gene
para hemaglutinina especfica H1/H3 sazonal. (30)
Vrias metodologias de biologia molecular tm sido propostas para a deteco de

(H1N1)v. A maioria baseia-se numa reaco de RT-PCR (Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction), com primers e sondas especficos para (H1N1)v. Outros
ensaios utilizam sondas SYBR Green e anlise das curvas de fuso para distinguir o
(H1N1)v de outros vrus. (31) (32)
Tm sido feitas vrias tentativas para desenvolver ensaios de multiplex RT-PCR

aplicveis a vrios subtipos de vrus, mas apresentam geralmente custos muito elevados,
falta de sensibilidade ou falsos positivos devido a competio dos primers, formao de
dmeros de primers ou diferentes temperaturas de fuso dos primers. No entanto, alguns
ensaios conseguiram detectar e diferenciar os vrus Influenza A e B, assim como
classificar os seis subtipos. (33) (34)
Uma limitao dos mtodos PCR o facto de poderem ocorrer resultados
falsamente negativos, devido a variaes nas sequncias alvo do primer e sonda, sendo
particularmente relevante na deteco de vrus emergentes. A utilizao de mltiplos
alvos pode reduzir esta limitao, e permite confirmar resultados positivos. Como
exemplo, temos os dois ensaios de TaqMan dirigidos para os genes da HA1 e NA1 do
novo vrus (H1N1)v desenvolvidos por Whiley et al. (35)
A anlise HRM (High-resolution melting) por RT-PCR permite a identificao de
vrus pela formao de heteroduplexes entre os produtos de PCR de vrus a testar e
isolados de vrus de referncia, sendo os custos do ensaio inferiores aos ensaios com
sondas TaqMan ou de hibridao. Baseia-se na anlise filogentica, que revela uma
associao preferencial entre os genes M e HA dos vrus Influenza A e permite a
diferenciao e classificao dos subtipos de Influenza A. (36)
Alguns dos ensaios desenvolvidos para o novo vrus (H1N1)v detectam tambm
vrus sunos H1 da mesma linhagem. Apesar dos vrus sunos terem infectado o Homem
no passado, estas situaes so raras. (37)
- 151 -

PCR
A PCR um mtodo de sntese de cidos nucleicos in vitro, atravs do qual um

determinado fragmento de DNA pode ser especificamente replicado. Requer a presena
de dois oligonucletidos (primers) que ladeiam o fragmento de DNA a amplificar, e que
so usados como iniciadores de uma srie de reaces sintticas cclicas catalisadas por
uma DNA polimerase. (38)
Este processo de amplificao enzimtica de DNA, imitando em parte o
processo de replicao que ocorre in vivo, permite teoricamente, existindo condies de
reaco ptimas, duplicar em cada ciclo a quantidade de fragmento de DNA, do qual
resulta um aumento exponencial de produto. (38)
A PCR decorre em trs passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que
se repete um nmero especfico de vezes. Assim, um ciclo de PCR consiste nos
seguintes passos: 1) Desnaturao, 2) Hibridao, 3) Extenso. A PCR ocorre num
termociclador, um equipamento que automaticamente controla e alterna as temperaturas
durante perodos programados de tempo para o nmero apropriado de ciclos de PCR
(geralmente entre 30 a 40 ciclos). (38)
1) Desnaturao:
A temperatura elevada (geralmente superior a 90C) separa a cadeia dupla de
DNA em dois filamentos. Os dois filamentos ou cadeias de DNA so mantidos juntos
por ligaes de hidrognio que, por serem relativamente fracas, quebram a altas
temperaturas, ao passo que as ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose, por
serem ligaes covalentes mais fortes, permanecem intactas. (38)
Figura 2: Desnaturao.
- 152 -

2) Hibridao:
O objectivo da PCR no replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas replicar a
sequncia de interesse (normalmente com tamanho entre 100 e 600 pares de bases). Os
iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequncia alvo, e consistem em
curtas sequncias sintticas de nucletidos, entre 20 e 30 bases. Numa reaco de PCR
so includos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida
durante o passo de desnaturao. O incio da sequncia de DNA alvo marcada pelos
primers que se ligam com a sequncia complementar. A temperatura de hibridao
normalmente encontra-se entre 40 C e 65 C, dependendo do comprimento dos primers
e da sua sequncia. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequncias
iniciadoras se liguem sequncia alvo com elevada especificidade. (38)
Figura 3: Hibridao
3) Extenso:
Aps a ligao dos primers s sequncias complementares de DNA, a temperatura
eleva-se a aproximadamente 72 C e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de
DNA. A Taq polimerase uma polimerase de DNA termo-estvel recombinante do
organismo Thermus aquaticus que, ao contrrio de outras polimerases, se mantm activa
a temperaturas elevadas. O processo de sntese iniciado numa zona com cadeia dupla
(onde esto ligados os primers), incorporando os nucletidos complementares
sequncia alvo e utilizando os dNTPs em soluo. A extenso inicia-se sempre na
extremidade 3 do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias
simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direco 5 para 3. (38)
- 153 -
Figura 4: Extenso
No final do primeiro ciclo da PCR, encontramos duas novas cadeias de DNA

idnticas original. (38)
RT-PCR
A RT-PCR um mtodo muito sensvel e especfico para deteco de RNA. Uma

vez que o RNA no um subtrato eficaz para a Taq polimerase, necessrio proceder
transcrio reversa antes de iniciar a amplificao. Um primer liga-se sequencia alvo
do RNA e a transcritase reversa cria uma nova cadeia de DNA complementar (cDNA),
que pode ser usada como substrato de amplificao. (38)
PCR EM TEMPO REAL
A PCR em Tempo Real consiste em monitorizar o processo de amplificao do

DNA medida que este ocorre. Tanto o processo enzimtico de PCR como a deteco
do produto de PCR ocorrem no mesmo capilar de reaco. Os instrumentos medem o
produto de PCR formado atravs de marcadores fluorescentes, directamente com
marcadores que se ligam dupla cadeia de DNA (ex. SYBR Green I), ou indirectamente
com oligonucletidos marcados com fluorescncia (sondas fluorescentes), que
reconhecem e se ligam por emparelhamento de bases a uma regio especfica da cadeia
de DNA. A quantidade de fluorescncia proporcional quantidade de produto no
- 154 -

capilar de reaco. O nmero de ciclos necessrio para gerar um sinal detectvel
depende da concentrao inicial de DNA na amostra. (39)
Deste processo resulta uma curva com perfil sigmoidal, na qual o perodo de
mxima actividade enzimtica (fase de crescimento exponencial ou fase log linear)
seguido de um perodo de baixa actividade (fase de plateau), em que h uma reduzida
concentrao de substratos (dNTPs). (38)
O paramtro Cp (crossing-point) refere-se ao ciclo, ou tempo, no qual o alvo a
amplificar detectado pela primeira vez, e representa o incio da fase exponencial. H
uma correlao entre o Cp e a concentrao. (38)
A PCR tradicional analisada na fase de plateau (end-point) enquanto na PCR em

Tempo Real os dados so recolhidos na fase exponencial da reaco. A PCR em Tempo
Real tem como vantagens um limite de deteco superior e ausncia de manipulao
ps-PCR, minimizando a hiptese de contaminao. (39)
A PCR em Tempo Real pode ser usada para a deteco de patognios, por
descriminao positiva ou negativa, com utilizao de um controlo positivo, mas
tambm permite a sua quantificao. (39)
Figura 5: Fases da PCR
- 155 -

Existem vrios mtodos de deteco de marcadores fluorescentes, uns no
especficos: intercalao (SYBR green), amplifluor, lux, DNA-zymes; e outros
especficos: sondas de hidrlise (Taqman), sondas de hibridao, beacons, scorpions,
eclipse. (39)
Os ensaios com sondas baseiam-se na FRET (Fluorescence Resonance Energy

Transfer), que consiste numa transferncia de energia dependente de distncia entre dois
fluorforos adjacentes. Esto descritas duas formas de FRET:
- ensaios com sondas de hidrlise, fluorescncia quenching
- ensaios com sondas de hibridao, emisso de fluorescncia. (38)
A sonda de cido nucleico usada no ensaio de sondas de hidrlise, sonda TaqMan,

est duplamente marcada com um fluorocromo reprter (dador) e um quencher
(receptor). Esta sonda consiste num oligonucletido de 18-22 pb, fosforilada na
extremidade 3. O reprter excitado por absoro de um foto de comprimento de
onda especfico. Isto causa a excitao de alguns electres do reprter para um grau de
energia mais elevado. O reprter excitado tem vrias formas de libertar a energia
capturada: emisso de fluorescncia ou transferncia da energia para o quencher se este
estiver prximo. Se ocorrer esta ltima hiptese, absoro da energia pelo quencher,
certos electres do quencher aumentam o seu nvel de energia e podem voltar ao estado
basal pela libertao de energia na forma de vibrao, calor ou baixa fluorescncia. O
resultado final a no observao do sinal de fluorescncia do reprter. (38)
Enquanto a sonda no hidrolisada, o quencher e o reprter permanecem
prximos um do outro, separados apenas pela extenso da sonda. No entanto, esta
proximidade no inibe completamente a fluorescncia do reprter e possvel observar
uma fluorescncia residual. Durante a PCR, a sonda liga-se especificamente entre o
primer forward e reverse a uma zona especfica do produto de PCR. A polimerase inicia
a extenso do primer e replica o molde ao qual a TaqMan est ligada. A actividade
5exonuclease da polimerase cliva a sonda, libertando o fluorocromo reprter da
proximidade do fluorocromo quencher. Como consequncia, a intensidade de
fluorescncia aumenta. Este processo repete-se em cada ciclo. (38)
- 156 -

A sequncia da sonda, o seu tamanho e a localizao do reprter e do quencher
deve ser desenhada de forma a que a Temperatura de fuso (Tm) da sonda seja superior
Tm dos primers. (38)
Figura 6: Representao de uma sonda de hidrlise
DESIGN DE UM ENSAIO DE RT-PCR EM TEMPO REAL
Antes da implementao de um novo ensaio necessrio proceder ao seu Design,

Optimizao e Validao
1) Preparao da amostra
Tem dois objectivos principais: libertao de cidos nucleicos e remoo de
inibidores da PCR. um dos pontos crticos da RT-PCR, pois essencial obter RNA
no degradado pelas RNases, sem protenas, e com mnima quantidade de DNA
contaminante.
necessrio avaliar a qualidade de RNA obtido com o mtodo de extraco
escolhido.
2) Escolha do alvo
3) Escolha dos primers
Assegurar que cada um dos primers se liga especificamente sequncia alvo
escolhida, que no se liga a posies com estrutura secundria, e que no forma
dmeros.
- 157 -

A regio mais importante do primer a 3, uma vez que a amplificao comea
aqui. Em geral, esta extremidade deve ser livre de estrutura secundria, sequncias
repetitivas, palindromas e sequncias altamente degeneradas. As sequncias dos primers
forward e reverse no devem ser complementares uma outra e devem ter igual
contedo GC, idealmente entre 40 e 70%.
Deve fazer-se um BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) da sequncia dos
primers para assegurar que so especficos para as espcies/gene alvo.
A temperatura de hibridao dos primers deve estar entre os 55-60C.
4) Escolha das sondas
Escolher o mtodo de deteco tendo em conta as caractersticas de cada mtodo:
SYBR Green I necessita optimizao mas no necessrio desenhar uma sonda pelo
que os custos so mais reduzidos; sondas TaqMan tm pouca optimizao devido
elevada especificidade, mas necessrio a sntese de diferentes sondas para diferentes
sequncias.
5) Escolha do controlo positivo
Na anlise qualitativa no so necessrios calibradores, mas devem ser includos
controlos positivos e negativos.
Obter amostras com significado estatstico por grupo experimental.
6) Optimizao das condies de reaco
Especificidade, sensibilidade, eficincia e preciso so critrios importantes na
optimizao do ensaio.
Para aumentar a especificidade da reaco, a seleco correcta do primer
essencial. As condies para a hibridao dos primers, como temperaturas de hibridao
mais elevadas e concentraes de MgCl2 mais baixas, aumentam a especificidade de
amplificao. A concentrao de primer e enzima, assim como o tempo de hibridao,
tempo de extenso e nmero de ciclos afectam a especificidade da reaco.
Eficincia a expresso quantitativa da qualidade do processo de PCR. Para
determinar a eficincia da PCR para cada alvo, fazer diluies seriadas de cada molde e
determinar o valor de Cp para cada diluio. Verificando como a Cp varia com o log
da concentrao permite determinar a qualidade da PCR (E=10-1/declive).
Para determinar a sensibilidade, devem ser realizadas diluies e a linha de
regresso da curva padro revela se o ensaio fornece resultados consistentes com
determinadas concentrao do alvo.
- 158 -

Para a optimizao do ensaio ter em conta que a concentrao ptima de primer e
sonda a mais baixa concentrao que resulta no mais baixo valor de Cp e dinmica de
fluorescncia adequada para uma determinada concentrao alvo.
A concentrao de MgCl2 pode afectar de forma significativa o comportamento de
ligao dos primers.
Para a RT-PCR, o RNA deve ser transcrito em cDNA. H duas estratgias
possveis que combinam a transcrio reversa e a PCR. A RT-PCR num s passo reduz
a manipulao e tempo de anlise, mas requer reaces separadas de RT-PCR para cada
RNA estudado e exige primers especficos para o alvo. A RT-PCR em dois passos
separa a transcrio reversa e a PCR em duas reaces, permite mltiplas PCR a partir
de uma reaco e diferentes opes de escolha para os primers.
7) Validao
Validar o ensaio atravs da anlise da reprodutibilidade, comparao com outros
testes laboratoriais e/ou ensaios de proficincia
8) Assegurar as boas prticas de laboratrio
Optimizar o fluxo de trabalho para minimizar o risco de contaminao cruzada
entre amostras. O risco de contaminao minimizado por correctos procedimentos
laboratoriais:
- controlo negativo
- pontas com filtro
- pipetas diferentes para preparao de reagentes, extraco de amostra e preparao da
reaco
- separao fsica da rea preparao da amostra, preparao de reagentes e PCR.
(19)(20)
Os objectivos propostos para o presente estudo so a rpida implementao da

tcnica de RT-PCR para deteco de H1N1v, numa fase de pandemia, permitindo dar
uma resposta especfica num tempo til, de 24 a 48 horas.
Fui responsabilizada pela Professora Doutora Laura Brum, directora da GeneralLab Portugal, pela implementao da tcnica de RT-PCR para a deteco de H1N1v e
pela posterior coordenao da mesma.
- 159 -

MATERIAL/MTODOS
A tcnica foi instalada na General-Lab Portugal, com sede na Rua Dom Dinis, 61
A, Lisboa.
O espao destinado execuo desta tcnica consiste em trs salas, equipadas com
luz UV: uma sala para preparao de reagentes, uma sala com cmara de segurana
biolgica de nvel II para a extraco das amostras, e uma sala de PCR.
AMOSTRAS
As amostras mais apropriadas so as do tracto respiratrio superior, podendo ser

colhidas por zaragatoa nasofaringea, aspirado nasofaringeo ou brnquico. (30)
Executar a colheita da amostra com zaragatoa estril. Introduzir a zaragatoa no

tubo contendo o meio de transporte, Vircell. Cortar a extremidade da zaragatoa e fechar
o tubo. Se no for possvel processar imediatamente a amostra, conserv-la a 2-8C at
48 horas. Se demorar mais de 48 horas conservar a -70C (evitar a conservao -20C).
Vircell: soluo BSS (Balanced Salt Solution) de Hank contendo HEPES,

gelatina, BSA (bovine serum albumine), sacarose e antibiticos.
O BSS mantm o balano osmtico, e o HEPES tem a funo de tampo
mantendo o pH 7,2-7,6.
EXTRACO
Reagentes:
1) High pure viral nucleic acid kit (Roche, cat n: 11858874001)

O princpio de purificao baseia-se na adsoro slica (vidro) dos cidos nucleicos na
presena de NaI saturado.
A lise dos vrus realizada pela incubao da amostra com um tampo de lise na
presena de proteinase K, que cinde os complexos cidos nucleicos-protenas. Os cidos
nucleicos ligam-se especificamente superfcie das fibras de vidro em condies de
salinidade caotrpica. A adsoro s fibras de vidro ocorre em segundos e estes so
- 160 -

depois purificados de impurezas, protenas e sais por passos de lavagem e finalmente
eluidos.
2) Etanol absoluto
Material:
1) pipetas e pontas com filtro RNase-free

2) tubos de microcentrifuga
3) microcentrifuga (Spectrafuge 24D, Modelo C2400)
4) Placa de aquecimento (AccuBlockDigitalDryBath, Modelo D1100)
5) Cmara de Classe II (Modelo BIO-II-A/P)
Procedimento:
1) Preparao dos reagentes de extraco manual
Poly A + 0.5 ml Tampo de eluio alquotas 50l congelar (-20C)

(no agitar no vortex)
Proteinase K + 5ml Tampo de eluio vortex alquotas 50l congelar (-20C)
Tampo de remoo de inibidores + 20ml etanol absoluto guardar 20C (T ambiente)
Tampo + 40ml etanol absoluto guardar 20C (T ambiente)de lavagem
2) Extraco
Poly A liga-se ao RNA
Lise pela incubao com Proteinase K (digesto das protenas) e Tampo de ligao
Ligao dos cidos nucleicos s fibras de vidro do filtro
Lavagem dos cidos nucleicos com Tampo de remoo de inibidores
Os cidos nucleicos purificados so recolhidos atravs do Tampo de eluio
- 161 -
Poly A 50 l + 2,5ml Tampo de ligao
+ 200l Tampo de ligao + 50l Proteinase K
+ 200l Vircell (rodar as zaragatoas)
Misturar e incubar 10 min a 72C, depois misturar amostras com 100 l Tampo de ligao
Pipetar a amostra para o Tubo de Filtro com Tubo de Recolha
Centrifugar 1 min a 8000g
Eliminar o Tubo de Recolha com o seu contedo
Adicionar 500l Tampo de remoo de inibidores
Adicionar 450l Tampo de lavagem
Adicionar 450l Tampo de lavagem
- 162 -
Centrifugar 10 seg a 13000g
Adicionar 50l Tampo de eluio
cidos Nucleicos Virais Purificados
Nota: A 7 de Dezembro de 2009, foi iniciada a extraco automtica no

equipamento COBAS AmpliPrep
Reagentes:
1) COBAS AmpliPrep Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, cat n: 03337928190)
O princpio de purificao consiste em 5 passos:
A soluo de proteinase K faz a digesto das protenas para facilitar a libertao do
RNA e DNA.
A adio do reagente de lise amostra resulta na lise completa por desnaturao das
protenas, libertao do DNA e RNA e estabilizao simultnea.
Os cidos nucleicos libertados ligam-se superfcie de slica das partculas magnticas
devido s condies de salinidade caotrpica e elevada fora inica do reagente de
lise.
O reagente de lavagem remove impurezas no ligadas slica, tais como protenas
desnaturadas, resduos celulares, potenciais inibidores da PCR como a hemoglobina, e
reduz a concentrao de sal.
Os cidos nucleicos purificados so eludos a temperaturas elevadas.
AMPLIFICAO
Equipamento:
A metodologia implementada utiliza uma plataforma comercial, o LightCycler 2.0
(Roche)
- 163 -

O LightCycler possui uma plataforma de ciclos trmicos com deteco por
fluorescncia. O sistema usa a PCR em Tempo-Real para quantificar o material inicial
alvo, isto , correlaciona o aumento do sinal de fluorescncia, medido em cada ciclo de
amplificao, com a quantidade de produto de PCR formado. As caractersticas de
flexibilidade do software combinadas com os formatos de qumica fluorescente
facilitam a disponibilidade de diferentes metodologias. Os produtos de PCR podem ser
detectados por fluorescncia, utilizando um marcador fluorescente intercalado, SYBR
Green I, ou sondas alvo especificas marcadas com fluorescncia. (38)
Figura 7: LightCycler 2.0 (Roche)
A rapidez das reaces de PCR uma das caractersticas do LighCycler 2.0. A

combinao do sistema de aquecimento/arrefecimento por ar e a reaco em tubos
capilares que optimizam a relao volume-superfcie, possibilitam que uma reaco de
PCR de 35 ciclos seja completada em aproximadamente 30 minutos. A alta velocidade
de variao trmica minimiza o tempo necessrio para cada ciclo de PCR, incluindo a
medio de fluorescncia da amostra. O ciclo rpido ainda tem a vantagem de diminuir
a amplificao de produtos no desejados. Para evitar a contaminao, os capilares so
fechados, no sendo necessria a sua abertura durante a anlise. (38)
A amplificao do produto de PCR monitorizada simultaneamente em tempo

real com sondas marcadas com fluorescncia. Os seis canais de deteco da
fluorescncia permitem uma grande flexibilidade de formatos de deteco e possibilita,
por exemplo, reaces de PCR multiplex. Um fluorimetro usado para quantificar os
produtos de amplificao. Para a passagem das molculas a um estado energtico
- 164 -

superior usado um LED azul que emita luz a 470 nm. A unidade de deteco, com 6
canais, mede comprimentos de onda de 530, 555, 610, 640, 670, e 705 nm. (38)
Figura 8: Unidade de deteco do LightCycler 2 (Roche)
Para alm da utilizao de kits de Investigao e Desenvolvimento (IVD) nas

reas de microbiologia, virologia ou genmica, o LightCycler 2.0 pode ser adaptado
para aplicaes desenvolvidas pelo operador recorrendo a uma variedade de mtodos de
anlise: deteco, quantificao absoluta ou relativa, genotipagem ou anlise de curvas
de melting. (38)
Reagentes:
1) Influenza A/H1N1 Detection Set (Roche, cat n: 05640393001)

A deteco de Influenza A baseada no gene conservado que codifica para a protena
de matriz (M2).
A identificao do subtipo (H1N1)v baseada na deteco do gene que codifica para a
HA1.
Os primers e sondas de hidrolise usados para detectar os genes RNA virais do Influenza
so combinados com um controlo de extraco interno para cidos nucleicos humanos.
Os primers e sonda para a deteco do gene da protena M2 e da HA1 do Influenza A

foram recomendadas pela OMS para a deteco de vrus da gripe de origem aviaria.
Os primers e sondas para a deteco de HA1 do (H1N1)v (Mxico) foram
recomendadas pelo Robert Koch Institute.
- 165 -

O kit inclui:
Controlo Inf A/H1, Controlo Inf A/M2, Primer/Probe Mix para Inf A/H1, Primer/Probe
Mix para Inf A/M2, Primer/Probe para Controlo de extraco de cido nucleicos
humanos, gua para PCR.
A sonda de hidrlise para deteco do gene da protena M2 est marcada com FAM
(leitura 530).
A sonda de hidrlise para deteco do gene da HA est marcada com FAM (leitura 530)
A sonda de hidrlise para deteco de cidos nucleicos humano est marcada com
Yellow 555 (leitura a 560).
2) RNA Virus Master (Roche, cat n: 05619416001)

Para anlise de RNA viral por RT-PCR.
Mistura de transcritase, Taq DNA polimerase, tampo contendo dNTPs e MgCl2.
O tampo permite o incio da reaco sem a pr-activao da Taq polimerase a 95C.
O kit est optimizado para sondas de hibridao, sondas de hidrlise e UPB (sondas
Universal ProbeLibrary).
A transcritase utilizada consiste na enzima Transcriptor reverse, que tem como
propriedades a actividade RNase H (remove o RNA do hbrido RNA-cDNA,
aumentando a sensibilidade da PCR), transcreve moldes longos (at 14kb), raros e
difceis, tem uma temperatura ptima dos 42 aos 65C.
O kit contm:
Mistura de enzimas (Enzyme blend) transcritase reversa, Taq polimerase
Tampo de reaco (Reaction buffer) dATP, dCTP, dGTP, dUTP, MgCl2
Material:
1) pipetas e pontas com filtro RNase-free

2) Capilares
3) adaptadores de microcentrifuga
4) microcentrifuga (Spectrafuge 24D, Modelo C2400)
5) placa aquecimento (AccuBlock Digital DryBath, Modelo D1100)
- 166 -

Preparao de reagentes:
RNA Vrus Master (congelado e pronto a usar)
Primer/Probe Inf A/M2 + 300L gua para PCR alquotas 55L

Primer/Probe Human + 300L gua para PCR alquotas 55L
Primer/Probe Inf A/H1 + 300L gua para PCR alquotas 55L
Controlo Inf A/M2 + 400L gua para PCR alquotas 40L
Controlo Inf A/H1 + 400L gua para PCR alquotas 40L
Procedimento:
Aquecer previamente Primer/Probe 1min/85C

Preparar a Mistura RT-PCR na placa de frio
Dispensar nos capilares a Mistura e as amostras/controlos
Selar os capilares
Centrifugar 700g (3000 rpm)/5 seg
Preparao de RT-PCR Mix

Componentes
Mistura reaco
Mistura reaco Inf
Inf A/M2
A/H1
Mistura de enzima
6,8 L
6,8 L
Tampo de reaco
68 L
68 L
Primer/Probe Inf A/M2 pr-aquecida
51 L
Primer/Probe controlo extrao cidos

nucleicos humanos pr-aquecido
51 L
51 L
Primer/Probe Inf A/H1 pr-aquecido

Water PCR grade
78,2 L
129,2 L
5 L
5 L
Amostra para pesquisa de RNA viral

ou Controlo Positivo
ou Controlo Negativo
Volume de Mistura reaco por capilar
15L
15 L
Volume total por capilar
20L
20 L
- 167 -

Colocar os capilares no LightCycler 2.0 e programar a RT-PCR segundo o seguinte
esquema:
Ciclos
T C
Tempo (mm:ss)
58
00:08
95
00:30
Desnaturao
95
00:01
Hibridao
60
00:20
Extenso
72
00:01
40
00:30
Trascrio reversa
Desnaturao inicial
1
Amplificao
45
Arrefecimento
1
RESULTADOS
O programa de software Roche Macro inclui o protocolo da corrida, anlise e

relatrio. Os resultados so reportados de acordo com o seguinte quadro decisional:
Interpretao resultados
Controlo extraco
Inf A / M2
Inf A / H1
Resultado
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo (H1N1)v
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo Influenza A
Negativo (H1N1)v
Positivo
Negativo
Positivo
Invlido
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo Influenza A
Negativo (H1N1)v
Negativo
Negativo
Negativo
Invlido
Negativo
Negativo
Positivo
Invlido
Resultados da pesquisa de (H1N1)v de 10 de Novembro a 10 de Dezembro de

2009:
- 168 -

Grupos
Negativo para Positivo para Positivo para Influenza /
etrios
H1N1v
H1N1v
Negativo para H1N1v
% Positivos
0 - 10 anos
181
285
61,12
11 -20 anos
50
114
69,51
21-30 anos
31
44
58,67
31-40 anos
55
47
46,07
41 - 50 anos
26
47
64,38
51 - 60 anos
24
36
60
> 61 anos
17
14
45,16
Total (977)
384
587
39,31%
60,08%
0,61%
Distribuio etria
N casos
700
600
500
400
NEGATIVO
300
POSITIVO
200
100
0
0 - 10
anos
11 -20
anos
21-30
anos
31-40
anos
41 - 50 51 - 60
anos
anos
> 61
anos
TOTAL
(977)
Grupos etrios
Figura 9: Grfico da distribuio etria dos resultados positivos e negativos de (H1N1)v
Total pedidos
Positivos
10-17 Nov
187
131
18-24 Nov
319
188
26 Nov - 2 Dez
272
166
3-10 Dez
199
102
- 169 -
Distribuio temporal
350
n casos
300
250
200
Total pedidos
150
Positivos
100
50
0
10-17 Nov
18-24 Nov 26 Nov 2 Dez
3-10 Dez
Semanas
Figura 10: Grfico da distribuio temporal dos pedidos de pesquisa de (H1N1)v e

resultados positivos para (H1N1)v
DISCUSSO
Com a pandemia por (H1N1)v, tornou-se necessrio desenvolver uma tcnica

rpida de deteco deste vrus porque, apesar de existirem vrios ensaios de RT-PCR
para o Influenza A e que so igualmente capazes de detectar (H1N1)v, estes tm falta de
sensibilidade e no diferenciam entre os vrus Influenza A sazonais e (H1N1)v.
O diagnstico molecular de Influenza geralmente dividido num processo de duas
fases: uma fase de rastreio que tem como alvo genes conservados, e uma fase de
identificao da estirpe por deteco de sequncias especficas do genoma.
O gene M normalmente o alvo usado para a fase de rastreio, assim como as NP,
cujas sequncias so altamente conservadas entre os subtipos de Influenza A e distintas
do Influenza B. Alguns estudos j demonstraram que a associao da pesquisa do gene
M e NP permite a uma melhor definio de estirpes que so positivas para primers
genricos de influenza A. (40)
A interpretao dos resultados, segundo o CDC (Centers for Disease Control and
Prevention), deve ter em considerao que uma amostra considerada positiva se os
resultados dos testes de RT-PCR, utilizando dois alvos diferentes (primers especficos
- 170 -

para gene M universal e gene da HA do (H1N1)v), forem positivos. Um resultado de
RT-PCR negativo no exclui a possibilidade do doente estar infectado com (H1N1)v.
Em caso de resultados duvidosos recomenda-se a confirmao por sequenciao do
produto da RT-PCR.
Os primers e sonda para a HA do (H1N1)v desenvolvidos por Panning et al, que

serviram de base tcnica da Roche, foram os seguintes: Primer H1SWS
(CATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC; nt
380-404; GenBank
Accession n
FJ966082, gene da HA, segmento 4, vrus Influenza A (A/Califrnia/04/2009(H1N1));

Primer H1SWA (ATGCTGCCGTTACACCTTTGT; nt 457-437); Sonda H1SWP
(FAM-ACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCG-BBQ; nt 409-435). (41)
(380)
(461)
catcatttgaaaggtttgagatattccccaagacaagttcatggcccaatcatgactcgaacaaaggtgtaacggcagcatgtcctcat
Figura
11:
Gene
da
HA (hemaglutinina),
segmento 4,
vrus
Influenza
(A/Califrnia/04/2009(H1N1)). Identificao dos Primers a azul e Sonda a vermelho.
Neste ensaio de Panning, foi determinado o declive da curva com diluies

decimais, sendo de 3.15, o que equivale a uma eficincia de E=1.0, ou seja, 100% de
eficincia na amplificao da PCR. De seguida determinaram o LOD (lower limit
detection) 95%, ou seja, a concentrao abaixo da qual o ensaio detecta o analto com,
pelo menos, 95% de probabilidade. O clculo do LOD 95% deu um resultado de 384
cpias de RNA/mL. (41)
A especificidade do ensaio para (H1N1)v foi confirmada com um painel de
amostras clnicas contendo adenovrus, vrus respiratrio sincicial, coronavrus,
metapneumovrus, parainfluenza e entero/rinovrus. Nenhum deste vrus interferiu com
a PCR, indicando a sua elevada especificidade. Tambm foram testadas amostras de
Influenza A de origem suna, H1N1 e H3N2 humano sazonal, sendo todos negativos no
ensaio para (H1N1)v. (41)
Relativamente nossa experincia, e tal como descrito em estudos anteriores, a

percentagem de infeces por (H1N1)v inferior nos grupos com mais de 60 anos
(45,16%), sendo tambm neste grupo muito inferior o nmero de pedidos. Os resultados
- 171 -

permitem verificar a prevalncia de infeco por (H1N1)v em detrimento de outros
vrus Influenza A sazonais (0,61%).
O grupo etrio dos 0 aos 20 anos aquele que apresenta um maior nmero de
pedidos de pesquisa de (H1N1)v, sendo igualmente o grupo com maior percentagem de
casos positivos.
A percentagem de resultados positivos para (H1N1)v, 60,08%, est em
concordncia com os dados fornecidos por outros laboratrios na fase de pandemia
(Servio Patologia Clnica do Hospital Curry Cabral comunicao pessoal).
Na ltima semana includa neste relatrio, verificou-se uma diminuio do

nmero de pedidos e dos casos positivos, o que acompanha os dados da DGS (Direco
Geral de Sade) que indicam j ter sido ultrapassado o pico de pandemia, pelo menos
nesta fase.
O tempo mdio de resposta foi de 30 horas utilizando a extraco manual e de 20

horas utilizando o mtodo de extraco automtica, pelo que a ltima opo foi
escolhida para a rotina desta anlise.
O LOD descrito pelos ensaios da Roche Applied Science para o ensaio utilizado
de 175 cpias/PCR para a deteco do gene da protena M2 de Influenza A e de 54
cpias/PCR para a deteco do gene da protena HA de (H1N1)v.
Esta diferena nos limites de deteco pode trazer problemas na interpretao de
resultados de amostras com baixa concentrao de RNA. Na deteco final, em alguns
destes casos, observa-se um sinal de fluorescncia da sonda para a o gene de HA do
(H1N1)v, mas no da sonda para o gene da protena M2.
Este problema pode ter vrias solues:

- Melhorar a eficincia de extraco, de forma a obter uma maior quantidade de RNA,
revendo os procedimentos de extraco, atendendo possibilidade de presena de
RNases; avaliar outros kits de extraco disponveis no mercado; optar por uma
extraco automtica em vez da extraco manual. A extraco automtica,
implementada a 7 de Dezembro, demonstrou um igual rendimento na extraco de
RNA, quando comparada a leitura da fluorescncia a 560 nm com a extraco manual.
- 172 -

- Adicionar (por exemplo, NP) ou alterar (por exemplo, M1) os primers para a deteco
de Influenza A, de forma a obter um melhor limite de sensibilidade. No ensaio de
Panning et al a deteco de Influenza A baseava-se na deteco do gene da protena M1,
que de acordo com o estudo de Ward et al apresentava um LOD de 10 cpias/PCR. (43)
- Optimizar as condies da reaco de forma a aumentar a sensibilidade da deteco
para o gene da protena M2
Figura 12: Anlise da fluorescncia a 530nm de RT-PCR para pesquisa de (H1N1)v. CP

M2 (controlo positivo do gene da protena M2), CN M2 (controlo negativo do gene da protena
M2), CP H1 (controlo positivo do gene da HA do H1N1v), CN H1 (controlo negativo do gene
da HA do H1N1v), 973 (resultado positivo para H1N1v), 981 (resultado equvoco para H1N1v).
Uma vez que ainda no est descrito um ensaio de RT-PCR considerado de

referncia, necessrio confirmar estes resultados equvocos por outros mtodos.
Os resultados inconclusivos so confirmados por outro laboratrio que utiliza a
metodologia do CDC. A anlise confirmatria identificou as amostras como positivos
fracos.
- 173 -

Um estudo comparativo desenvolvido pela Roche Applied Science entre o ensaio
do CDC e o ensaio da Roche, demonstrou uma concordncia de 98% na deteco de
(H1N1)v.
O protocolo do CDC para a deteco de (H1N1) utiliza primers e sondas
desenhados para a deteco de vrus Influenza H1N1v, numa regio diferente do ensaio
da Roche (nt 902-1017). No entanto, estes no apresentam uma correspondncia directa
com a sequencia do novo vrus (H1N1)v. Os pares de base 6 e 13 do primer reverse
alteraram de T para C e o 16 de G para A. Este facto pode diminuir a afinidade de
hibridao e ttulos mais baixos podem originar falsos negativos.(24) Este facto est
demonstrado num estudo comparativo entre 4 ensaios de RT-PCR: Health Protection
Agency, HPA, deteco do gene HA e gene NA do (H1N1)v, Center for Disease
Control and Prevention, CDC, deteco do gene HA (H1N1)v, National Virus
Reference Laboratory deteco do gene M para vrus Influenza A no sazonais (H1N1 e
H3N2). Este estudo demonstrou no haver reaco cruzada nos ensaios do CDC e HPA,
excepto para o NA do HPA que detectou um caso de H5N1. O ensaio do CDC, em 42
amostras, detectou 4 falsos negativos. (44)
CONCLUSO
Os principais objectivos pretendidos foram atingidos: rapidez na implementao
do mtodo e assegurar a deteco e diferenciao de (H1N1)v. Assim, os casos
infectados podem ser rapidamente identificados de forma a garantir a interveno
teraputica, se clinicamente justificvel, e accionado o plano para minimizar o risco de
sade pblica.
- 174 -

BIBLIOGRAFIA
1) Burtis C, Ashwood E. Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry. Elsevier Science,

2001
2) Alada M, Azevedo I, Reis C. Prticas de Bioqumica para Cincias da Sade. Lidel;

2002
3) Braunwald E. Harrison Medicina Interna. McGrawHill ; 2002
4) Henry J. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. W B Saunders

Company; 2001
5) Laso FJ. Patologia General. Masson; 2004

6) Jacobs D, DeMott W, Oxley D. Laboratory Test Handbook. 5th edition. Lexi-Comp,
Inc; 2001
7) Stites D, Terr A, Parslow T. Imunologia Mdica. Guanabara Koogan; 2000
8) Lowell C. Medical Immunology Section II. Immunologic Laboratory Tests. Lange

Medical Books; 2001
9) Dieusaert P. Como prescrever e interpretar um exame laboratorial, Guia prtico de

anlises mdicas. Andrei Editora; 2001
10) Gorina A. La Clnica y el Laboratorio. Masson; 2004
11) Roitt I, Brostoff J, Male D. Immunology. Mosby; 1993
12) Hoffbrand A, Pettit J, Moss P. Essencial Haematology. Blackwell Science; 2001
13) Heckner F, Freund M. Hematologia Microscpica Prtica. Santos Editora; 2000
- 175 -

14) Lewis S, Bain B, Bates I. Dacie and Lewis, Pratical haematology. Churchill
Livingstone; 2001
15) Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge, Programa Nacional de Controlo da
Infeco. Orientaes para a elaborao de um manual de boas prticas em
Bacteriologia. PNCI, ONSA; 2004
16) Jehl F, Chomarat M, Weber M, Gerard A. De lantibiogramme la prescription.

Biomerieux, 2004
17) Lago J. Antibiticos e Mecanismos de Resistncia Bacterianos. Biomrieux. 2005
18) Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection, diagnosis and management.
Blackwell; 2003
19) Cooper W. Lies Bsicas sobre Controlo da Qualidade. Bio-Rad Laboratories;

2000
20) Frade M. Acreditao 15189, Garantia de Competncia Tcnica e Fiabilidade dos

Resultados. 17 Encontro Cientfico APAC; 2005
21) Murray P, Baron E, Pfaller M, Tenover F, Yolken R. Manual of Clinical

Microbiology. 7th edition. Washington: American Society for Microbiology; 1999
22) Rebelo de Andrade H. Gripe Sazonal, Gripe Pandmica, Gripe Aviara. V CEAC.
2007 Jan 31; Lisboa
23) Goh G, Dunker A, Uversky V. Protein intrinsic disorder and influenza virulence:
the 1918 H1N1 and H5N1 viruses. Virol J. 2009; 6:69-81
24) Webster R, Bean W, Gorman O, Chambers T, Kawaoka Y. Evolution and ecology

of influenza A viruses. Microbiol Rev. 1992; 56(1):152-79
- 176 -

25) Gordon S. Update on 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus. Cleve Clin J Med.
2009; 76(10):577-82
26) Kuchipudi S, Nelli R, White G, Bain M, Chang K, Dunham S. Differences in

influenza virus receptors in chickens and ducks: implications for interspecies
transmission. J Mol Genet Med. 2009; 3(1):143-51
27) Brockwell-Staats C, Webster R, Webby R. Diversity of influenza viruses in swine

and the emergence of a novel human pandemic influenza A (H1N1). Influenza Other
Respi Viruses. 2009; 3(5):207-13
28) Kingsford C, Nagarajan N, Salzberg S. 2009 Swine-origin influenza A (H1N1)

resembles previous influenza isolates. PLos ONE. 2009; 4(7): e6402
29) Perez E, Pineiro L, Vicente D, Montes M, Cilla G. Residual immunity in older

people against the influenza A (H1N1)-recent experience in northern Spain. Euro
Surveill. 2009; 14(39):pii13944
30) WHO; Information for Laboratory Diagnosis of New Influenza A (H1N1) Virus in
Humans; 21 May 2009
31) Yang J, Lo J, Liu J, Ho Y, Chen C, Wu H. Rapid SYBR Green I and modified probe
RT-PCR assays identify influenza H1N1 viruses and distinguish between pandemic and
seasonal strains. J Clin Microbiol. 2009; 47(11):3714-6
32) Lau S, Chan K, Yip C, Tsang O, Woo P, Yuen K. Confirmation of the first Hong
Kong case of human infection by novel swine-origin influenza A (H1N1) vrus using
ultra-rapid & real time RT-PCR. J Clin Microbiol. 2009; 47(7):2344-6
33) He J, Bose M, Beck E, Fan J, Tiwari S, Metallo J. Rapid multiplex reverse

transcription-PCR typing of influenza A and B vrus, and subtyping influenza A vrus
into H1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 N1 (Human), N1 (animal), N2; and N7, including typing of
novel swine origin influenza A (H1N1) virus during the 2009 outrbreak in Milkwaukee,
wisconcin. J Clin Microbiol. 2009; 47(9):2772-8
- 177 -
34) Lee C, Kang B, Lee D, Lyou S, Park B, Ann S. One-step multiplex RT-PCR for
detection and subtyping of swine influenza H1, H3, N1, N2 viruses in clinical samples
using a dual priming oligonucleotide (DPO) system. J Virol Methods. 2008; 151(1):304
35) Whiley D, Bialasiewicz, Bletchly C, Faux C, Harrower B, Gould A. Detection of

novel influenza A (H1N1) virus by real-time RT-PCR. J Clin Virol. 2009; 45(3):203-4
36) Lin J, Tseng C, Chen Y, Lin C, Chang S, Wu H. Rapid differentiation of influenza

A virus subtypes and genetic screening for virus variants by HMR analysis. J Clin
Microbiol. 2008; 46(3):1090-7
37) Poon L, Chan K, Smith G, Leung C, guan Y. Molecular detection of a novel human
influenza (H1N1) of pandemic potencial by conventional and RT-PCR assays. Clin
Chem. 2009; 55:1555-8
38) Hoffmann M, Obermaier I, Tellmann G, Goldenstein C. LightCycler Real-Time

PCR Systems Application Manual. Germany: Roche Diagnostics GmbH; 2009
39) Gomes A. PCR em Tempo Real no limite da sensibilidade. I Mestrado Anlises

Clnicas. 2009 Julho 19; Lisboa
40) Lalle E. Design and clinical application of a molecular method for detection and
typing
of
the
influenza
A/H1N1pdm
virus.
Virol
Methods.
2009;
doi:10.1016/j.jviromet.2009.10.004
41) Panning M, Eickmann M, Landt O, Monazahhian M, Olschlager S, Baumgarte S.

Detection of influenza A (H1N1)v by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2009;
14(36).pii:19329
42) Ward C, Dempsey M, Ring C, Kempson R, Zhang L, Gor D. Design and

performance testing of quantitative real time PCR assays for influenza A and B viral
load measurement. J Clin Virol. 2004; 29:179-188
- 178 -

43) Dong H, Zhang Y, Xiong H, Yan A, Ding G, Chen Y. Detection of human novel
influenza A (H1N1) viruses using multi-fluorescent real-time RT-PCR. Virus Res.
2009; doi:10.1016/j.virusres.2009.10.011
44) Ellis J, Iturriza M, Allen R, Bermingham A, Brown K, Gray J. Evaluation of four

real-time PCR assays for detection of influenza A (H1N1)v viruses. Euro Surveill.
2009; 14(22):pii19230
- 179 -

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I Mestrado Anlises Clnicas

A actividade profissional decorreu no Laboratrio de Anlises Clnicas (LAC)

Este LAC possui um corpo tcnico qualificado para executar as valncias de

Os servios encontram-se completamente informatizados, possuindo uma rede

O laboratrio encontra-se apetrechado com moderno equipamento automatizado.

O funcionamento passa pelo atendimento dos utentes com a organizao do

O LAC adoptou um Sistema de Gesto da Qualidade, so aplicados e cumpridos

Joana Selada Domingues

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Modular Analytics SWA

Joana Selada Domingues

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1.1. Fundamento do mtodo

Determinao semi-quantitativa dos componentes mais importantes do clculo

Clcio: a determinao titrimtrica com soluo titriplex (sal dissdico do cido

I Mestrado Anlises Clnicas

Os componentes determinados encontram-se na forma dos seguintes elementos,

2.1. Fundamento do mtodo

A contagem de Addis uma medida quantitativa da excreo de eritrcitos,

Medir o volume da amostra de urina de 12 horas. Homogeneizar e medir 10ml.

Joana Selada Domingues

I Mestrado Anlises Clnicas

= n de cada elemento no volume total

= vol. cm3 da suspenso soro fisiolgico (1 cm3)

= vol. cm3 onde foi feita a contagem (0.0009 cm3)

= volume total de urina

= n cilindros (pequena ampliao), n hemcias (grande ampliao),

3.1. Fundamento do mtodo

Amostra:esperma colhido at 30 min antes. Abstinncia de 3-4 dias.

espermatognese, cristais de fosfato de espermina, muco e Trichomonas.

Joana Selada Domingues

I Mestrado Anlises Clnicas

4. GRAU DE DIGESTO DAS FEZES

Exame macroscpico, microscpico, caracteres fsicos

Para este exame o utente deve submeter-se a um regime alimentar em que

4.1. Fundamento do mtodo

O estudo do grau de digesto das fezes permite apreciar o estado da funo

Resduos alimentares de origem animal (fibras musculares, gorduras)

Resduos alimentares de origem vegetal (amido, cristais, celulose digestvel e

Substncias de origem intestinal (muco, leuccitos, hemcias e clulas epiteliais)

5. PESQUISA DE DROGAS DE ABUSO

5.1. Fundamento do mtodo

I Mestrado Anlises Clnicas

6. PESQUISA DE PROTENAS DE BENCE JONES

6.1. Fundamento do mtodo

As protenas de Bence Jones so protenas anormais que apresentam

Centrifugar a amostra de urina de 24 horas. Em tubo de ensaio colocar cerca de

I Mestrado Anlises Clnicas

7.1. Fundamento do mtodo

Proteinria definida como o aumento da quantidade de protenas na urina.

A pesquisa protenas realizada pela adio de cido sulfossalicilico amostra

Se o resultado da pesquisa anterior for positivo dever proceder-se ao

8. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES

8.1. Fundamento do mtodo

As causas mais comuns de sangue oculto nas fezes so a lcera pptica, a

I Mestrado Anlises Clnicas

9. MICROTECH 672 PC (DENSITOMETRIA)

9.1. Fundamento do mtodo

O termo electroforese refere-se migrao de partculas com carga num meio

Joana Selada Domingues

I Mestrado Anlises Clnicas

A electroforese de zona em acetato de celulose ocorre em vrias etapas:

10. MODULAR ANALYTICS SWA (FOTOMETRIA/EQL/ISE)