Laboratorio 6: Determinacin de la actividad hidroltica de una enzima

dextransacarasa.
Ana Mara Gutirrez - Ingeniera Qumica - 201311432
Mara Alejandra Santos - Ingeniera Qumica - 201311517
Felipe Esteban Arroyave Rovida
29 de abril del 2015

Abstract
The dextransucrases are inducible and extracellular enzymes that belong to glycotransferases group and
allow the production of biopolymers called dextrans, as well as oligosaccharides of low molecular weight.
The main goal of this practice was to determine the parameters of the Michaelis-Menten equation for the
hydrolytic activity of dextransucrase enzyme produced by an acid lactic bacteria. For the develop of that
goal was performed the production of the enzyme before of the practice, to during it perform the
enzymatic reaction of the dextransucrase at a 5,5 pH with a phosphate buffer 0,5 M at 30C of
temperature and with the following concentrations of saccharose substratum: 4%, 8%, 12%, 16% y 20%,
then were incubated the samples of each concentration and were inactivated putting them at water bath at
92C. Was taken aliquots of each sample at 0, 5, 10, 20, 40 y 60 (minutes) times to then performed to
each one the determination of reducing sugars by DNS procedure.
Resumen
Las dextransacarasas son enzimas inducibles, extracelulares y pertenecientes al grupo de las
glicositransferasas, que permiten la produccin de polmeros llamados dextranos, al igual que
oligosacridos de bajo peso molecular. El objetivo principal de sta prctica fue determinar los
parmetros de la ecuacin de Michaelis-Menten para la actividad hidrolitica de la enzima dextransacarasa
producida a partir de una bacteria acido lctica. Para el desarrollo de dicho objetivo se realiz la
produccin de la enzima antes de la prctica, para durante la misma realizar la reaccin enzimtica de la
dextransacarasa a un pH de 5,5 con buffer fosfato 0,5 M, a 30C de temperatura y con las siguientes
concentraciones sustrato de sacarosa: 4%, 8%, 12%, 16% y 20%, luego se incubaron las muestras de
cada concentracin y se inactivaron ponindolas al bao Mara a 92C. Se tomaron alcuotas de cada una
de las muestras a los tiempos 0, 5, 10, 20, 40 y 60 (en minutos) para luego realizarle a cada una la
determinacin de azucares reductores mediante el procedimiento de DNS
Key words
Enzima dextransacarasa, actividad hidrolitica, Ecuacin de Michaelis-Menten, sustrato, sacarosa.
Objetivos
1.1 Objetivo General
Determinar los parmetros de la ecuacin de Michaelis Menten (Km y Vmx) para la actividad hidroltica
de la enzima dextransacarasa.
1.2 Objetivos especficos

Realizar la reaccin enzimtica de la dextransacarasa con un buffer de sulfato y a diferentes

concentraciones de sustrato (Sacarosa).
Realizar la de determinacin de azucares reductores de cada una de las muestras tomadas a diferentes
tiempos de la reaccin de dextransacarasa para determinar los parmetros de la ecuacin de MichaelisMenten.
2. Introduccin:
Las dextransacarasas son enzimas inducibles, extracelulares y pertenecientes al grupo de las
glicositransferasas (enzimas que catalizan el traslado de un residuo glicosilo de una molecula donadora
hacia diversos aceptores), las cuales transfieren un residuo glicosilo de la sacarosa a molculas aceptoras,
en ste caso una cadena de glucosa, con liberacin de fructosa, el producto de la reaccin es un polmero
de alto peso molecular llamado dextrana, el cual est compuesto por unidades de glucopiranosa con
enlace a (1-6) en la cadena principal, as como ramificaciones variables. Adicionalmente la sntesis de
polisacridos tambin catalizan reacciones de oligosacridos de bajo peso molecular, cuando hay
presencia de azucares de bajo peso molecular. Las dextransacarasas son producidas por bacterias de los
generos Strepiococcus, Leuconostoc y Lactobacillus. El principal organismo productor de
dextransacarasas
es
L.
mesenteroides.
http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/veracruz01/TRABAJOS/AREA_III/CIII-7.pdf
La importancia de la dextransacarasas se debe a la importancia biolgica de los oligosacridos y la
cinetica de sus sntesis ya que constituye la base de la ingenieria de la reaccion, con lo cual se pueden
obtener altos rendimientos y buena selectividad de productos. http://www.bioline.org.br/request?ba96112
Por otro lado es importante tener en cuenta que el mercado de produccin de dextrano es de
aproximadamente 1000 toneladas por ao y el principal comercializado es el producido por L.
mesenteroides por ser no patojeno, altamente soluble y relativamente estable. De hecho es probablemente
el primer biopolmero obtenido a escala industrial por medio de fermentacin, ya que en la sntesis de ste
polisacrido no se requieren ATP o cofactores, ya que toda la energa necesaria para llevar a cabo la
reaccin proviene de la unin entre la fructosa y la glucosa. En lo que respecta a sus aplicaciones ciertas
soluciones de dextrano pueden presentar propiedades osmticas semejantes a las del plasma sanguneo,
por lo cual se emplean para aumentar el volumen sanguneo en caso de hemorragias. El dextrano es
adems igualmente til en sus formas derivadas: dextrano-sulfato, por sus cualidades anticoagulantes y el
ferro-dextrano, por paliar las deficiencias anmicas. Por ltimo es la base estructural de numerosas
matrices de cromatografas, as como un estabilizante de emulsiones fotogrficas y como agentes
anticaries que rompen las matrices de placas cariognicas.
En cuanto al proceso de la sntesis los dextranos se obtienen mediante fermentacin en un medio rico en
sacarosa, producindose la secrecin inducida de la enzima al medio, el proceso finaliza cuando toda la
sacarosa ha sido consumida y el pH del medio alcanza valores prximos al 5,2. La reaccin de la
dextransacarasa puede simplificarse mediante la siguiente formula:
nSacarosa (Glucosa)n-m-w + (n-m)Fructosa + mLeucrosa + wGlucosa
La reaccin es irreversible. El principal producto, como se puede ver en la ecuacin son dextranos
(Glucosa)n-m-w de alto peso molecular y fructosa, los productos minoritarios son glucosa y leucrosa (donde
n>> m y w). La glucosa se produce mediante una reaccin de aceptor con agua y la leucrosa mediante la
reaccin de aceptor con la fructosa liberada en la reaccin. El mecanismo de sntesis de dextranos se basa
en la formacin de complejos covalentes glucosil o dextranosil-enzima a partir de sacarosa.
Concretamente se trata de un mecanismo de insercin de dos sitios, que permite la transferencia de
unidades glucosilo desde la sacarosa, al extremo reductor de la cadena de dextrano en crecimiento. El

mecanismo
de
reaccin
sigue
un
modelo
http://biblioteca.ucm.es/tesis/19972000/X/3/X3044801.pdf

de

ping-pong

bi

bi.

Como se mencion en prrafos anteriores hay 3 generos de especies que sintetizan dextrano, a
continuacin se mencionarn las bacterias que realizan dicha sntesis para cada uno de los tres generos:
- Lactobacillus.: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. musicus, L. pastorianus y L.viridescens.
- Leuconostoc: L. dextranicum y L. mesenteroides.
- Strepiococcus: S. bovis, S. challis, S.faecalis, S. mitis, S. mutants, S. sanguis y S. viridans.
Michaelis y Menten propusieron un modelo que permite explicar la mayora de las reacciones catalizadas
por enzimas, en el cual la enzima se combina reversiblmente con su substrato para formar el complejo
enzima-substrato que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que regenera la enzima.
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/ecuacion%20de%20michaelis.html En el presente artculo
se pretende determinar los parmetros de la ecuacin de Michaelis-Menten, especficamente la constante
de Michalies-Menten (Km), la cual corresponde a la concentracin de substrato a la que la velocidad de
reaccin es la mitad de la velocidad mxima, y la velocidad mxima (Vmax), para la actividad hidrolitica
de la enzima dextransacarasa, producida por medio de una bacteria acido lctica, en un medio cultivo de
sacarosa, fosfato y sales minerales.
3. Metodologa y procedimiento
Previamente a la realizacin de la prctica se realiz la preparacin de la enzima de la siguiente manera:
Se tom una muestra con asa bacteriolgica de la bacteria cido lctica previamente crecida en medio
slido de sacarosa y se inocul un tubo con 5 ml de medio sacarosa con la bacteria cido lctica el da
martes a las 9 de la maana, para incubarla posteriormente a 30C a 200 rpm; igualmente a las 5 de la
tarde del martes se inocul un erlenmeyer con 100 ml de medio sacarosa para ser incubado
posteriormente a 30C a 200 rpm toda la noche. Por ltimo se centrifug (aproximadamente a las 9 am
del mircoles) a 6000 rpm durante 25 min y se tom el sobrenadante que es lo que contiene la enzima
para ser guardado a 4C en tubo falcon para su posterior uso.
Para la preparacin de 100 mL de buffer se pesaron 8,5 gramos de NaH2PO4 y se ajust a pH 5.5 con
NaOH 6M.
Para la determinacin de los parmetros de Michaelis-Menten (Km y Vmax) se realiz la reaccin
enzimtica a un pH de 5.5 (buffer fosfato 0.5 M), temperatura 30C, y a diferentes concentraciones de
sustrato, siguiendo el siguiente procedimiento:
En 7 beakers de 30 ml se adicionaron 5,5 mL del buffer y el volumen requerido de una solucin de
sacarosa al 40% para preparar soluciones a las siguientes concentraciones: 4% (8 mL), 8% (6,5 %) , 12%
(5 mL), 16% (3,5 mL) y 20% (2 mL) de sacarosa, para luego completar con agua y as obtener un
volumen final de 15 mL. Posteriormente con el agitador magntico en el beaker ste se ubic dentro de la
incubadora a 30C, dejndolo aclimatar por 5 minutos.
Ya atemperada la solucin que tiene el sustrato y el buffer se adicionaron 2 mL del sobrenadante de la
fermentacin que tiene la enzima, se mezcl y se tom de inmediato la muestra del tiempo 0 (400 l por
muestra), posteriormente se inactiv inmediatamente al bao mara la muestra tomada. Mientras tanto se
dej en incubacin-agitacin a 30C la solucin de reaccin.
Por otro lado para el blanco sustrato (Concentracin 20% de sacarosa) se le adicionaron 2 mL de agua a
cambio del sobrenadante de la fermentacin que tiene la enzima, y al blanco enzima (Concentracin 0%
de sacarosa) si se le adicionan 2ml del sobrenadante.

Cada muestra tomada se inactiva por calor en bao de mara a 92C durante 5 minutos. Al minuto 5, 10,
20, 40 y a la hora se realiz el mismo procedimiento de toma de muestra de reaccin e inactivacin.
A todas las muestras luego de la inactivacin se les realiz una determinacin de azcares reductores
mediante el procedimiento de DNS tomando 150 l de muestra y midiendo la absorbancia a 540 nm. Para
el clculo de la concentracin de los azucares reductores se emple la curva de calibracin de la prctica
de crecimiento celular, por lo cual su realizacin no fue necesaria.
4. Datos
6. Resultados
7. Anlisis
8. Conclusiones