INTRODUCIN

En el siguiente laboratorio se estudiara la variacin de la velocidad de

una reaccin enzimtica, que en este caso se trata de la Fosfatasa alcalina de
intestino de ternera en funcin del tiempo, para ello se determinara una curva
de progreso que cuyo objetivo es graficar la desaparicin de los reactantes o
la aparicin de productos a diferentes tiempos, hasta que alcance un equilibrio
la reaccin.
Tambin se podr calcular a travs del mtodo ya mencionado la
velocidad inicial a partir de la pendiente de la curva de progreso al comienzo
de nuestra reaccin, aqu veremos si es que se cumple que la velocidad inicial
aumenta con el incremento de la concentracin de sustrato como se ha visto
en clases.
A dems se debe observar que la velocidad de reaccin disminuye hasta
alcanzar el equilibrio, donde llega a ser cero, para ello se debe tener un buen
control de temperatura y pH.
La fosfatasa alcalina de ternera el cual se ocupara en el laboratorio, se
cataliza de la siguiente forma:

Glicerol 2-fosfato + H2O

Glicerol + Fosfato
de sodio

OBJETIVO
Estudio de la variacin de la velocidad de una reaccin enzimtica en
funcin del tiempo.
Conocer en forma experimental, lo visto en clases
ocurren una reaccin enzimtica.

PARTE EXPERIMENTAL
REACTIVOS:
Determinacin de la actividad enzimtica:
TAMPN: Glicina/NaOH 0,1M pH 9,4 NaCl 1% (p/v).
SUSTRATO: Beta glicerofosfato de sodio 0,003 M.

y observar como

 ENZIMA: Fosfatasa alcalina de intestino de ternera.

Determinacin de fosfato:
REACTIVO DE MOLIBDATO: Molibdato de amonio al 2,5% en H 2SO4 5N.
SOLUCIN REDUCTORA: Acido 1,2,4 amino naftol sulfrico (Eiconocen).
SOLUCION PATRON DE FOSFATO: Fosfato de sodio 1 mol/ml.

PROCEDIMIENTO:
1) Enumerar 10 tubos de ensayo con 3 ml de reactivo de molibdato en cada
uno, la cual sirve detener la reaccin enzimtica y reaccione con el
fosfato liberado.
2) En un tubo distinto se preparara el tubo de incubacin, el cual debe
tener los siguientes componentes:
12 ml de tampn glicina.
12 ml de sustrato de beta glicerofosfato
8,5 ml de agua destilada
3,5 ml de la enzima
3) La enzima se debe agregar cuando los componentes lleguen a una
temperatura de 37C, esto se mantiene en bao mara durante unos 5 a
6 minutos.
4) Una vez agregada la enzima se homogeniza
y se debe sacar
rpidamente 3 ml (tiempo: 0 (s), en donde no hay reaccin enzimtica)
agregndoselo al tubo de ensayo N1 con molibdato de amonio en
H2SO4.
5) Se debe mantener el tubo de incubacin dentro del bao maria de 37C
e ir retirando cada 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 y 60 minutos en alcuotas
de 3 ml, vacindolos en los tubos preparados de molibdato.
6) En cada tubo preparado se agrega 0,4 ml de solucin reductora,
completando a cada tubo con 10 ml de agua destilada. Esperar 10
minutos.
7) Luego se debe hacer una lectura en el fotocolormetro, en una longitud
de 620 nm.

ESQUEMA DE TRABAJO
componentes

Tiempo de
incubacin (min)

10

15

Molibdato de NH4
(ml)
Alicuotas de mezcla
de incubacin (ml)

Solucion patrn
Fosfato 1M (ml)

Solucion Reductora
(ml)
Agua destilada

Tubos N
6

10

11

12

20

25

30

40

50

60

Blanc
o

Patr
n
fosfat
o
3

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

3,6

3,6

3,6

3,6

3,6

3,6

3,6

3,6

3,6

3,6

5,6

6,6

RESULTADOS

Tabla de curva de progreso:

Tub
o N
1

Tiem
po
(min)
0

10

15

20

25

0,08
2
0,23
1
0,31
7
0,42
5
0,47
8
0,51
9

moles
totales de
PO4H=
0,208

moles PO4H= menos

moles totales de
PO4H= tiempo 0
-

moles
PO4H= /
5 min
-

0,585

0,377

0,377

0,802

0,594

0,214

1,075

0,868

0,274

1,210

1,002

0,135

1,314

1,106

0,104

30

40

50

10

60

11

Patrn

0,59
3
0,62
7
0,67
7
0,71
0
0,39
5

1,501

1,293

0,187

1,587

1,379

0,043

1,714

1,506

0,064

1,797

1,589

0,042

GRAFICOS

moles

Concentracin de PO4H-2 en

Grfico N1:
Concentracin de sustrato en moles versus el Tiempo en minutos

Grafico N2:

5min)

/
Velocidad moles PO4H-2

Nota: Para que se pueda realizar una buena curva, se eliminaron

algunos puntos para obtener un optimo grafico de velocidad versus
tiempo.

CALCULOS
Para la tabla N1 (tubo 2):
Clculo para moles totales de PO4H=: al realizar la solucin patrn
de fosfato a 1 moles se obtiene una absorbancia de 0,327
1 moles 0,395
X
0,317

X = 0,802 moles totales de PO4H= del tubo 2

Clculo de los moles de PO4H= menos tiempo 0:
moles 10 min - moles 0 min
0,802 moles 0,208 moles= 0,594

Clculos de la velocidad de reaccin cada 5 minutos:

moles 10 min - moles 5 min
0,594 0,377= 0,217

Para el grafico N1:

La velocidad inicial (pendiente) = S(concentracin de producto en
moles)/ T (tiempo en minutos). Se considerando los puntos a los 5 (min) y a
los 10 (min), en donde la curva es lineal

Pendiente (Vi) = (S2 - S1)/ (T2 - T1) = (0,594 0,377) / (105) = 0,0434

DISCUSIN
Para calcular la aparicin del producto de la reaccin catalizada por la
enzima fosfatasa alcalina se utilizo la formacin de un complejo coloreado
entre el fosfato liberado y la solucin reductora, el cual acta como reactivo
cromognico, por lo tanto este complejo se puede cuantificar por
Absorsiometra Visible, utilizando un fotocolormetro, y de esta forma a travs
de la medida de Absorbancia determinar los micromoles de fosfato liberado a
distintos tiempo de reaccin.
En la curva de progreso se puede observar que la concentracin de
fosfato liberado, que corresponde al producto de la reaccin, aumenta a
medida que transcurre la reaccin, aumenta hasta un lmite, luego del cual se
observara una meseta que corresponde al equilibrio de la reaccin, es decir,
donde la velocidad de formacin de productos es igual a la velocidad de
formacin de reactivos.
La velocidad inicial de reaccin corresponde al cambio de concentracin
de producto durante los primeros minutos de la reaccin y se determina como
la pendiente de la curva de progreso en su fase lineal. De la curva de progreso
obtenida se establece que el rango de tiempo en que se obtiene la pendiente,
que corresponde a la velocidad inicial.

En el grfico donde se analiza la velocidad en funcin del tiempo, se

observa que a medida que transcurre el tiempo, la velocidad de reaccin va
disminuyendo, esto porque se va consumiendo el sustrato, la velocidad
disminuye hasta hacerse cero, lo que indica que la reaccin alcanz el
equilibrio

Universidad de concepcin
Facultad de Cs. Biolgicas
Dpto. bioqumica y biologa molecular

Informe de laboratorio 1:

ENZIMAS I

Alumno: Antonio Guzmn

Gutirrez
Carrera:
Qumica y Farmacia
Asignatura: Bioqumica
Fecha de realizacin: 08 de abril
de 2014
Fecha de entrega: 15 de abril de
2014