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Curso de Biologia

Bioqumica
2012/2013

Polifenoloxidase

Turma 10

ndice
ndice............................................................................................................................... 2
Resumo............................................................................................................................ 3
Resultados....................................................................................................................... 4
Tabela 1 - Reao A Ao da polifenoloxidase.........................................................4
Tabela 2 - Reao B Natureza qumica da polifenoloxidase.....................................4
Tabela 3 - Reao C Especificidade para o substrato..............................................4
Tabela 4 - Reao D Efeito da concentrao do substrato.......................................4
Tabela 5 - Reao E Efeito da concentrao do enzima..........................................4
Tabela 6 - Reao F Efeito da temperatura.............................................................5
Tabela 7 - Reao G Efeito do pH............................................................................5
Discusso/Concluso........................................................................................................ 6
Reao A Ao da polifenoloxidase (Ver Tabela 1 dos Resultados).............................6
Reao B Natureza qumica da polifenoloxidase (Ver Tabela 2 dos Resultados).........6
Reao C Especificidade para o substrato (Ver Tabela 3 dos Resultados)..................7
Reao D Efeito da concentrao do substrato (Ver Tabela 4 dos Resultados)..........7
Reao E Efeito da concentrao do enzima (Ver Tabela 5 dos Resultados)..............8
Reao F Efeito da temperatura (Ver Tabela 6 dos Resultados).................................8
Reao G Efeito do pH (Ver Tabela 7 dos Resultados)................................................9
Bibliografia..................................................................................................................... 11

Resumo
As polifenoloxidases vegetais so as enzimas responsveis pelo escurecimento
de certos produtos vegetais. Neste trabalho experimental, realizaram-se vrios ensaios
com a principal finalidade de observar, entre outros fatores, a ao destas enzimas
sobre um substrato o catecol (um difenol) e verificar a influncia de alguns fatores na
atividade das mesmas, o que nos permitiu chegar a diferentes concluses a cada
ensaio realizado como, por exemplo, o facto de um enzima ter um pH e uma
temperatura ideal de funcionamento e sempre que as condies so diferentes das
condies ideais o enzima reduz a sua atividade ou desnatura.

Resultados
Aps a realizao do procedimento experimental podemos observar vrias alteraes
no aspeto e cor das solues contidas nos tubos de ensaio, alteraes essas que se
encontram registadas nas tabelas seguintes:

Tabela 1 - Reao A Ao da polifenoloxidase


Tubo de
Ensaio
A1
A2
A3

Cor

Composio

Inicial
Laranja escuro
Creme
Incolor

Extrato + Catecol
Extrato + gua
gua + Catecol

Depois da incubao
Vermelho tijolo escuro
Creme
Incolor

Tabela 2 - Reao B Natureza qumica da polifenoloxidase


Cor
Adio de
catecol

Tubo de
Ensaio

Composio

B1

Extrato + Catecol

Laranja escuro

________

B2

Extrato + TCA

Branco opaco

Branco opaco

Branco opaco

B3

Extrato + Cristais de
Feniltioureia

Branco opaco

Branco opaco

Branco mais
opaco

Inicial

Depois da
incubao
Vermelho tijolo
escuro

Tabela 3 - Reao C Especificidade para o substrato


Tubo de
Ensaio
C1
C2
C3

Cor

Composio
Extrato + Catecol
Extrato + Fenol
Extrato +
Hidroquinona

Inicial
Laranja escuro
Creme

Depois da incubao
Vermelho tijolo escuro
Laranja

Creme

Laranja

Tabela 4 - Reao D Efeito da concentrao do substrato


Tubo de
Ensaio
D1
D2
D3

Composio
Catecol + gua
Catecol + gua
Catecol + gua

Inicial
Incolor
Incolor
Incolor

Cor
Adio de Extrato
Creme claro
Creme
Creme escuro

Depois da incubao
Vermelho tijolo claro
Vermelho tijolo
Vermelho tijolo escuro

Tabela 5 - Reao E Efeito da concentrao do enzima


Tubo de
Ensaio
E1
E2

Composio
Extrato + Catecol
Extrato + gua + Catecol

Inicial
Laranja escuro
Laranja claro

Cor
Depois da incubao
Vermelho tijolo escuro
Laranja escuro

Tabela 6 - Reao F Efeito da temperatura


Cor
Adio de catecol
mesma temperatura

Tubo de
Ensaio

Composio

F1

Extrato a 0C

Creme

Creme escuro

F2

Extrato a 37C

Creme

Vermelho tijolo

F3

Extrato a 70C

Creme claro

Creme escuro turvo

Inicial

Depois da incubao
Vermelho tijolo
escuro
Vermelho tijolo
escuro
Creme escuro turvo

Tabela 7 - Reao G Efeito do pH


Tubo de
Ensaio
G1
G2
G3
G4

Composio
HCl
Tampo acetato
Tampo de
fosfatos
Tampo Tris

Incolor
Incolor

Cor
Adio de catecol e
extrato
Esbranquiado
Creme

Incolor

Laranja escuro

Vermelho tijolo escuro

Incolor

Vermelho tijolo

Castanho

Inicial

Depois da incubao
Esbranquiado
Creme escuro

Discusso/Concluso
Antes de apresentarmos as concluses acerca das reaes e dos
resultados, consideramos oportuno esclarecer o procedimento levado a cabo
para a preparao do extrato enzimtico. A adio do fluoreto de sdio ao
extrato visou ajudar a retirar o enzima do mesmo. Alm disto, o facto de o
extrato ter permanecido num banho de gelo (aproximadamente 0C) durante
toda a atividade laboratorial teve como objetivo a inibio do polifenoloxidase.
O erlenmeyer tambm permaneceu durante toda a atividade coberto com papel
de alumnio para evitar a desnaturao da protena pela luz.
Outro ponto a salientar o facto de a incubao ter sido a 37C, o que
assegurou de certa forma a viabilidade e aceitao ou no dos nossos
resultados, pois precisamente a esta temperatura que a atividade da enzima
em estudo mxima.
A atividade permitiu tirar concluses relativas ao comportamento do
polifenoloxidase em diversas situaes:

Reao A Ao da polifenoloxidase (Ver Tabela 1 dos Resultados)


Relativamente ao tubo A1, apesar de se encontrar temperatura
ambiente, a juno do extrato enzimtico (de tom creme), contendo
polifenoloxidase ao catecol permitiu que a reao tivesse incio de imediato, o
que, portanto, teve como resultado a formao de quinonas e a consequente
aquisio de uma cor laranja escura da soluo. No entanto, a incubao a 37C
provocou a intensificao da atividade enzimtica, o que se traduziu num
aumento da formao de quinonas e na intensificao da cor para um tom
vermelho tijolo escuro.
Quanto ao tubo A2, a cor inicial pouco se alterou com a incubao, uma
vez que estvamos perante uma diluio do extrato em gua. A cor era assim
oriunda do extrato, cujo tom em condies normais era creme.
Por fim, a reao que ocorreu no tubo A3 resultou na permanncia da cor
que era visvel inicialmente, mesmo aps a incubao. Este resultado j era
esperado, visto que, semelhante ao que havia acontecido em A2, este tubo
apenas continha catecol e gua.
Os tubos A2 e A3, de certa forma, funcionaram como controlo j que
permitiram observar a no ocorrncia de uma reao quando quer o extrato
enzimtico, quer o catecol, eram adicionados gua e incubados a 37C.
Resumindo, na reao A, foi possvel inferir a ao bsica do
polifenoloxidase sobre o catecol, na medida em que a reao s se deu com
este substrato e os resultados na presena de gua foram negativos.

Reao B Natureza qumica da polifenoloxidase (Ver Tabela 2 dos


Resultados)
No tubo B1, sabendo que tinha na sua composio o mesmo que o tubo
A1, era de esperar que os resultados fossem iguais. Assim, isto mesmo foi
verificado e a reao entre o extrato enzimtico e o catecol originou uma cor
laranja escura inicialmente, e depois da incubao, um tom vermelho tijolo
escuro. Servindo ento, este tubo, como controlo positivo.
Em relao ao tubo B2, observou-se que a reao entre o extrato e o
cido tricloroactico (TCA) determinou a mudana da soluo para uma cor
branca opaca, refletindo assim a presena de partculas em suspenso. Este
acontecimento foi provocado pela desnaturao dos enzimas do extrato como
consequncia do seu contacto com o TCA. Alm disto, a sua incubao a 37C
no alterou este resultado, uma vez que a desnaturao irreversvel.
Finalmente, no tubo B3, analogamente ao que se verificou no tubo B2, a
reao entre o extrato e os cristais de feniltioureia originou um precipitado em
suspenso que concedeu uma cor branca opaca soluo. Isto permite assim
considerar a feniltioureia como uma substncia inibidora da atividade
enzimtica. A incubao a 37C apenas intensificou a inibio referida, j que a
cor se tornou mais opaca. No entanto, a intensificao da cor tambm se
poder ter dado devido ao espao de tempo e agitao que permitiram uma
ao mais eficiente por parte dos cristais.
Concluindo, a reao B permitiu verificar a natureza qumica do
polifenoloxidase, ou seja, verificar que de facto uma enzima que desnatura na
presena de um cido (como o caso do cido tricloroactico) e que reage
como seria de esperar com uma substncia inibidora da atividade enzimtica
(cristais de feniltioureia), cessando a sua atividade cataltica.

Reao C Especificidade para o substrato (Ver Tabela 3 dos Resultados)


O tubo C1, como era esperado, confirmou mais uma vez os resultados
obtidos nos tubos A1 e B1, isto , a ao do enzima (polifenoloxidase, presente
no extrato) sobre o seu substrato (catecol) e o aumento da sua eficincia a
37C. Servindo, este tubo, novamente como controlo positivo.
De seguida, no tubo C2, foi notada a alterao da cor creme inicial
resultante da juno do extrato enzimtico com o fenol para um laranja depois
da incubao. Alm do que foi anteriormente dito, o polifenoloxidase no
catalisa apenas a oxidao aerbia de difenis, mas tambm a hidroxilao de
vrios monofenis. Deste modo, seria de esperar a ocorrncia de uma reao,
que de facto aconteceu, embora tenha sido pouco visvel. De qualquer forma
este resultado considerado positivo.
Relativamente ao tubo C3, a visualizao de um tom laranja aps a
incubao, quando inicialmente era creme revela, de novo, um resultado
positivo. Daqui se depreende que o polifenoloxidase desempenha a sua

atividade enzimtica, no s sobre difenis e monofenis, mas tambm sobre


outras espcies qumicas.

Reao D Efeito da concentrao do substrato (Ver Tabela 4 dos


Resultados)
Nesta reao, tendo em conta, por um lado, o procedimento seguido e o
consequente aumento da quantidade de catecol e decrscimo da quantidade de
gua de D1 para D3 (tubo D1: 0,05mL de catecol; tubo D2: 1mL de catecol;
tubo D3: 2mL de catecol; ou seja, diluies) e, por outro lado, a persistncia de
4mL de soluo em cada tubo, podemos observar no uma divergncia quanto
colorao das solues mas sim em relao sua intensidade de cor.
O tubo D1 visto que era o que possua menos quantidade de substrato
formou claramente menos quantidade de quinonas. O tubo D2 j produziu maior
quantidade em relao ao anterior devido ao aumento da quantidade de
substrato, por ltimo o tubo D3 foi o que produziu maior nmero que quinonas o
que era esperado visto que era o tubo que possua maior quantidade de
substrato.
Resumindo, em relao reao D, uma crescente concentrao de
catecol (substrato) originou um gradiente de escurecimento das solues como
consequncia de uma formao mais eficiente de quinonas.

Reao E Efeito da concentrao do enzima (Ver Tabela 5 dos


Resultados)
Quanto ao tubo E1, averiguou-se, novamente, a existncia de reao
entre o extrato e o catecol e a passagem de laranja escuro para vermelho tijolo
escuro. Todavia, uma cor to escura inicialmente, resultante da juno do
extrato e do catecol invulgar, comparativamente aos outros tubos que
continham apenas estas duas componentes. Isto pode ser explicado pelo
aumento da quantidade de extrato (o dobro em relao ao catecol) que
provocou uma reao mais eficiente do que as outras, mesmo temperatura
ambiente. Aquando da incubao do tubo a 37C, a temperatura tima para o
funcionamento do polifenoloxidase, a reao, como j era esperado, decorreu
normalmente: a atividade enzimtica aumentou e surgiu uma cor vermelho
tijolo escura.
No tubo E2, alm de ter sido colocada uma quantidade menor de extrato,
a soluo foi ainda mais diluda graas adio de gua. Assim, a cor inicial no
era to forte quanto do tubo E1, tendo passado de um laranja claro para um
laranja escuro que marcava a presena de quinonas numa concentrao
bastante inferior ao que havia acontecido anteriormente.
Relativamente reao E, o objetivo encerrado nesta reao foi cumprido
e foi possvel observar-se o efeito da concentrao do enzima. Concluiu-se
ento que uma maior concentrao provoca uma catlise enzimtica mais
eficiente e portanto uma maior velocidade na formao dos metabolitos. Esta
8

afirmao baseia-se na comparao no s dos resultados obtidos nos tubos E1


e E2, mas tambm no tubo A1. Assim, verifica-se que, por exemplo,
temperatura ambiente a reao foi mais rpida de E2 (mais diludo), passando
por A1, at E1 (soluo com uma maior concentrao de extrato enzimtico).

Reao F Efeito da temperatura (Ver Tabela 6 dos Resultados)


Em relao ao tubo F1, a colocao do extrato no banho de gelo, e
portanto a aproximadamente 0C, levou visualizao, no incio, de um tom
creme do extrato enzimtico, como j havia sido descrito anteriormente.
Quando o catecol foi adicionado ao extrato, ainda a esta temperatura, deu-se
uma pequena reao que, contudo, conduziu alterao da primeira cor para
um creme escuro, revelando, um pouco inesperadamente, a atividade do
polifenoloxidase a esta temperatura. A inibio parcial causada pela baixa
temperatura foi eliminada a partir do momento em que o tubo foi incubado e
medida que se foi dando o aquecimento at aos 37C, o enzima voltou a um
estado ativo e transformou o substrato em quinonas que concederam soluo
o tom vermelho tijolo escuro caracterstico.
De seguida, o tubo F2 que foi mantido a uma temperatura constante de
37C, produziu igualmente um resultado positivo. A colorao creme oriunda do
extrato, rapidamente deu origem a um vermelho tijolo quando foi adicionado o
catecol. A permanncia da soluo a esta temperatura de incubao durante
algum tempo originou um tom igual ao que havia aparecido no tubo F1 aps
esta etapa da reao.
Por fim, o tubo F3 foi colocado durante um curto espao de tempo numa
incubao a 70C. Ao fim deste tempo, verificmos que a cor creme natural do
extrato havia dado lugar a um creme mais claro (devido desnaturao de
alguns enzimas). Quando se juntou o catecol a cor ficou ligeiramente mais
escura e turva, consequncia de uma reao muito pouco eficiente entre o
polifenoloxidase e o catecol. A incubao a 37C no surtiu qualquer efeito
positivo ao nvel da formao de quinonas, tendo a reao findado com uma
soluo de tom creme escuro turvo.
Concluindo, na reao F, o efeito da temperatura foi facilmente
determinado com base nos resultados que foram obtidos. Segundo os nossos
dados, foi possvel concluir que aos 0C e a temperaturas baixas a atividade
enzimtica diminui drasticamente, ficando grande parte dos enzimas inibidos
at que a temperatura aumente. Trata-se portanto de uma inibio reversvel.
Aos 37C a atividade enzimtica mxima, sendo esta temperatura a mais
favorvel para a catlise. No entanto, se a temperatura aumentar demasiado,
at aos 70C ou mais, por exemplo, como foi o caso, grande parte dos enzimas
desnaturam e nunca mais retornam sua conformao funcional. portanto
uma inibio irreversvel.

Reao G Efeito do pH (Ver Tabela 7 dos Resultados)


As reaes finais visavam a observao dos diferentes acontecimentos
nas solues consoante ocorria a variao do pH. Numa ordem crescente de pH,
as mesmas propores de extrato e catecol foram sujeitas a quatro diferentes
reaes com quatro reagentes distintos nas mesmas quantidades (2mL):
soluo de HCl (pH 1), tampo acetato (pH 5), tampo de fosfatos (pH 7)
e tampo Tris (pH 9).
O tubo G1, alm das quantidades equivalentes de extrato enzimtico e
catecol que, alis, todos os seguintes tubos possuem igualmente, continha uma
soluo incolor de HCl. A reao inicial entre estes trs reagentes conduziu
observao de uma cor esbranquiada na soluo. De seguida, seguiu-se a
incubao temperatura habitual. No fim do espao de tempo destinado a esta
etapa, verificou-se que a cor se mantinha, isto deve-se desnaturao
irreversvel que o enzima sofreu devido ao pH cido da soluo de HCl.
No tubo G2, o tom incolor inicial do tampo acetato passou a creme
aquando da juno do catecol e do extrato, revelando uma reao muito fraca
entre a enzima e o seu respetivo substrato. O aquecimento a 37C alterou de
forma visvel o resultado inicial, j que a soluo adquiriu um tom creme escuro.
Relativamente ao tubo G3, mais uma vez, o tom incolor do tampo de
fosfatos foi modificado pela adio do catecol e do extrato. A surgida cor laranja
escuro revela, tal com em G2, a formao de quinonas mas, desta vez,
temperatura ambiente. A ltima cor vermelha tijolo escura que apareceu aps a
incubao a 37C provou, de novo, que esta temperatura torna a reao mais
extensa e mais eficiente na catalise enzimtica do polifenoloxidase.
Finalmente, o constante tom incolor dos tampes usados, que tambm se
verificou com o tampo Tris, deu lugar a um tom vermelho tijolo escuro no exato
momento em que foram acrescentados o extrato e o catecol. Daqui se infere
que a reao foi bastante positiva e que o tampo Tris tornou a catalise
enzimtica extremamente eficiente mesmo temperatura ambiente. Da
incubao que se seguiu, surgiu um tom castanho que demonstra a formao
de quinonas e que confirma os efeitos quer do pH, quer da temperatura na
catlise enzimtica.
Findando as concluses que inferimos acerca desta atividade laboratorial
encontra-se a reao G que tinha o intuito verificar o efeito do pH sobre os
enzimas e a sua atividade. Os resultados obtidos foram bastante positivos e
comprovaram que a atividade enzimtica favorecida por nveis de pH mais
bsicos, sendo bastante prejudicada por nveis fortemente cidos. Alm disto,
uma comparao entre a temperatura tima de funcionamento dos enzimas e
os nveis de pH mais favorveis, permite concluir que estes ltimos
desempenham uma papel mais positivo e determinante na atividade
enzimtica. Esta deduo advm da comparao dos resultados do tubo A1, por
exemplo, e do tubo G4: com as mesmas concentraes de enzima e substrato,
temperatura ambiente o pH favoreceu mais a atividade do polifenoloxidase.
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Bibliografia
M. Dixon, E. C. Webb, Enzymes, 3rd ed.; Longman: London, 1979.
T. Aniszewskl, R. Lieberei, K. Gulewicz, Acta Biol. Crac. Ser. Bot. 2008, 50, 718.

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