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2014

Facultad de Biología

Grado en Biología

1855: Regulación Mole- cular de los procesos Biológicos.

1855: Regulación Mole- cular de los procesos Biológicos. [ REGULACIÓN MOLECULAR DE LOS PROCESOS BIOLÓGICOS ]

[REGULACIÓN MOLECULAR DE LOS PROCESOS BIOLÓGICOS]

Adiv al Erbos

Bloque II: Regulación Molecular De Los Procesos Celulares Tema 1: Aspectos metabólicos del Citosol

13

1

Importancia del citosol en el metabolismo (Funciones)

13

Genoma y proteoma: Origen de la diversidad estructural y funcional de las proteínas

2

15

 

2.1 Splicing alternativo

16

2.2 Modificaciones post-traduccionales

17

3 Ribosomas

17

4 Síntesis de proteínas e inhibidores

1

5 Chaperonas moleculares

2

 

5.1 El descubrimiento de las Chaperonas

3

5.2 El plegamiento de las proteínas

4

5.3 Funciones de las chaperonas

5

5.4 Clasificación de las HSP

6

5.5 Modo de acción de algunas chaperonas

7

5.5.1 HSP70 y co-chaperonas (HSP20 y HSP40)

7

5.5.2 HSP90

8

5.5.3 HSP60 (GroEL y GroES)

9

5.6 Resumen

11

6 Cambios post-traduccionales (CPT)

6.1 Cambios post-traduccionales reversibles

13

13

6.1.1 Fosforilación/defosforilación

13

6.1.2 Modificación de los dominios N-terminales de las histonas

18

6.1.3 Otras modificaciones covalentes reversibles

20

6.2 Cambios post-traduccionales irreversibles

21

6.2.1 Adición de restos hidrofóbicos

21

6.2.2 Glicosilación

25

6.2.3 Cambios por proteólisis limitada

25

6.2.4 Otros cambios post-traduccionales irreversibles

25

Tema 2: Tráfico citosol-núcleo y citosol-mitocondria

27

1. Tráfico citosol-núcleo

27

1.1. El poro nuclear

28

1.2. La lámina nuclear

30

1.3. Tráfico de proteínas a través del poro nuclear

31

1.3.1.

Modelo de importación a través del poro nuclear

32

1.3.2. Modelo de exportación a través del poro nuclear

33

1.3.3. Modelo simplificado de importación/exportación de proteínas y mRNA

33

1.4. El transporte a través del poro en función del tamaño de la carga

34

1.5. Diversidad de carioferinas

34

1.6. Complejos protéicos asociados a la distrofina

35

2. Tráfico citosol-mitocondria y cloroplastos

36

2.1.

El genoma mitocondrial

36

2.2.

Destinos de las proteínas importadas a los orgánulos energéticos

38

2.3

Transporte a través de la membrana mitocondrial

39

2.3.1.

Señal de localización mitocondrial

39

2.3.2.

Modelo general de transporte a la matriz mitocondrial

41

2.3.4.

Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial interna

42

2.3.5.

Modelo general de transporte al espacio intermembrana

43

2.3.6.

Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial externa

44

2.4. Transporte citosol-cloroplasto

45

3. Tráfico de proteínas al peroxisoma

46

4. Tráfico de proteínas a los plastidios

46

Anexo I: Dinámica del complejo TIM

47

Anexo II: Señales de localización mitocondrial

48

Anexo III: Genes y Parkinson

49

Tema 3: Proteolisis intracelular

53

1. Procesos regulados por la proteolisis

53

2. El ciclo de los compuestos nitrogenados y la vida media de las proteínas

54

3. Proteólisis intracelular

55

3.1 Proteólisis intracelular en procariotas

55

3.2 Proteólisis intracelular en eucariotas

56

4. Sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) de degradación proteica

57

4.1 La ubiquitina

57

4.2 Sistema de adición de ubiquitina

58

4.2.1 Variabilidad en la actuación del complejo E2-E3

59

4.3 Destino de las unidades o polímeros de ubiquitina

61

4.4 Las proteínas de deconjugación de ubiquitina E4

61

4.4.1 Regulación de p53, el equilibrio E3/E4

62

4.5

Sistema ERAD de control de calidad y señal UPR

63

4.6 Relación con el ciclo celular del sistema UPS

64

4.7 Motivos de reconocimiento para los complejos E2-E3

65

4.7.1 Caja de destrucción de ciclinas

65

4.7.2 Secuencias PEST

65

5. El proteasoma

65

5.1 Relación entre el Alzheimer y el proteosoma

66

5.2 Inhibidores del proteasoma en el tratamiento contra el cáncer

68

Tema 4: Regulación del ciclo celular

71

1 Introducción al ciclo celular

1.1 Transducción de la señal de división y cáncer

2 Regulación del ciclo celular

2.1 El factor de maduración de los oocitos (MPF)

2.1.1 Regulación de MPF: ejemplo de cantidad de ciclinas y nivel de fosforilación

71

71

72

72

73

2.2 Proteínas inhibidoras de complejos ciclina-CDK (INKs)

74

2.3 Visión en conjunto de la actuación de los complejos Ciclina-CDK

74

2.4 La proteína del retinoblastoma (RB) y E2F

76

2.5 Puntos de control del ciclo celular

76

2.6 Visión global de la regulación del ciclo celular

78

3 La silimarina un potencial anticancerígeno

80

81

Tema 5: Retículo endoplasmático I

1 Biogénesis de lípidos en el retículo endoplasmático

81

1.1 Biosíntesis de lípidos y fosfolípidos

81

1.2 Composición lipídica de las membranas celulares

82

1.3 Biosíntesis y movimientos de lípidos a través de las membranas celulares

84

1.3.1 Topología de la síntesis de glicoesfingolípidos de mamíferos

86

1.3.2 Síntesis de fosfolípidos

86

1.4 Enfermedades ligadas al retículo endoplasmático

2 Las proteínas citocromo P450

2.1 Modo de acción y características del citocromo P450

88

89

90

2.1.1 Modo de acción de Citocromo P450 reductasa

92

2.1.2 Modo de acción de la adrenoxina reductasa

92

2.2 Otras funciones de P450

92

2.3 Enfermedades relacionadas con el citocromo P450

94

Anexo I: Aislamiento de fracciones subcelulares

96

Ejemplo: Aislamiento, caracterización y análisis proteico de la fracción microsomal del músculo de ratón

97

101

Tema 6: Retículo endoplasmático II

1

Transporte al retículo endoplasmático

101

1.1 El péptido líder o péptido señal

101

1.2 Asociación del ribosoma al retículo endoplasmático

103

1.2.1 Partícula de reconocimiento de la señal (SRP)

104

1.2.2 Componentes de los translocones y proteínas asociadas

105

1.3 Transporte post-traduccional en Escherichia coli

106

1.4 Respuesta a proteínas mal plegadas (UPR)

106

1.5 Topología de las proteínas de membrana

108

1.5.1 Incorporación de proteínas de tipo I en la bicapa

109

1.5.2 Incorporación de proteínas de tipo II, III y IV en la bicapa

109

Tema 7: Glicosilación de proteínas en el retículo endoplasmático y en las

cisternas del Golgi

111

1 Las glicoproteínas

1.1 Funciones de la glicosilación de proteínas

2 La glicosilación de proteínas

111

111

112

2.1 Introducción a los glúcidos

112

2.2 Donadores activados de azucares para la glicosilación de proteínas

113

2.3 Introducción a la N-glicosilación y la O-glicosilación

114

3 El proceso de N-glicosilación y el plegamiento en el retículo

116

3.1 La formación del oligosacárido precursor

117

3.2 Transferencia del oligosacárido precursor

119

3.3 Modificaciones generales sobre el oligosacárido precursor

120

3.4 Control de calidad en el retículo endoplasmático

121

3.4.1 Maquinaria del ERAD

125

3.5 Chaperonas del retículo endoplasmático

125

3.6 Respuesta a proteínas mal plegadas (UPR)

126

3.6.1 Regulación de los receptores por BiP

127

3.7 Otras proteínas que ayudan al plegamiento en el retículo endoplasmático

128

3.8 Ensamblado de las subunidades proteicas en el retículo endoplasmático

130

3.9 Modificaciones de la N-glicosilación a nivel del aparato de Golgi

130

3.10

Modificaciones en el Golgi con destino al lisosoma

133

3.10.1 Receptores de manosa-6-fosfato

3.11 N-glicosilación en procariotas

4 El proceso de O-glicosilación

4.1 O-glicosilación de proteoglicanos con xilosa

4.1.3 Sindecanos y glipicanos como moduladores de la acción proteica

4.2 O-glicosilación de N-acetilglucosmaina en el citosol

134

135

136

137

138

139

4.2.1 Regulación/actuación de OGT mediante O-glicosilación de N-acetilglucosamina

140

4.2.2 Relación de la O-glicosilación con N-acetilglucosamina y enfermedades

142

5 Glicosil fosfatidilinositol (GPI)

143

5.1 Síntesis de glucosil fosfatidilinosiltol

144

5.2 Beneficios de la utilización del enlace por GPI

145

6 Funciones de los glicoconjugados

146

Anexo I: Destino de las proteínas en función del oligosacárido N-unido y el plegamiento

147

Tema 8: Tráfico vesicular

149

1 Proceso general de gemación y fusión de membranas

149

1.1 Proceso de gemación

150

1.2 Proceso de fusión

152

2 Circulación de vesículas entre el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi

154

Bloque III: Regulación Molecular De La Acción Hormonal Tema 1: Hormonas liposolubles y receptores intracelulares

157

1 Acción hormonal

158

1.1 Proteínas carrier de hormonas liposolubles y fracción libre

158

1.2 Características de la interacción hormona-receptor

160

2 Agonistas y antagonistas de los receptores de andrógenos

160

3 Modelo general del receptor de hormonas liposolubles

161

3.1 Elementos de respuesta, coactivadores y localización de receptores

162

3.1.1 Co-activadores

163

3.1.2 Elementos de respuesta para los receptores de hormonas esteroideas

163

3.1.3 Localización de receptores de hormonas liposolubles

164

4 El receptor de glucocorticoides humano

4.1 Motivo de dedos de cinc en el receptor de glucocorticoides

164

164

4.2

Estructura y variantes del receptor de glucocorticoides

165

5

4.3 Modelo funcional del receptor de hGR

166

Modelos de actuación de los receptores nucleares (NR)

167

5.1 Desensibilización de receptores

168

5.2 Modelo de regulación del receptor de ácido retinoico (RAR)

169

5.3 Modelo de regulación del complejo receptor de hormonas esteroideas (SRC)

169

5.4 Estructura y dominios estructurales del receptor de vitamina D

170

5.5 Acciones genómicas y no genómicas de los receptores de estrógenos

171

Tema 2: Hormonas hidrosolubles y transducción de señales

173

1 Transmisión de señales

173

2 Características de la interacción hormona-receptor

173

2.1 Cinética interacción hormona-receptor

174

3 Modelos de transducción de la señal

176

4 Sistema adenilato ciclasa y AMPc

177

4.1 Receptores 7tm acoplados a proteínas G

177

4.2 Estructura de las proteínas G triméricas y modelo de actuación

178

4.3 Sistema Adenilato ciclasa, AMPc y PKA

180

4.4 Desensibilización de receptores

182

5 Sistema de fosfolipasa C, IP 3 y DAG

182

5.1

Sistema de la fosfolipasa C (variante β)

183

5.2

Sistema fosfolipasa C (Variante γ)

184

5.3

Variantes de PKC

185

5.4

Control de la cantidad de calcio libre en el citosol

186

5.4.1 Calmodulina y Calcio-Calmodulina quinasa

186

5.4.2 Proteínas reguladas por calcio y calmodulina

187

5.4.3 Canales de calcio receptores de IP 3

188

5.4.4 Evaluación experimental de los aumentos de calcio

188

6 Sistema de guanilato ciclasa

189

191

Tema 3: Factores de proliferación celular. Origen del cáncer

1

Receptores con actividad Y-quinasa

191

1.1 Modelo de activación de receptores con actividad Y-quinasa

192

1.2 Estructura de los factores de crecimiento

193

1.2.1 El factor de crecimiento transformante

193

1.2.2 Eritropoyetina (EPO)

193

1.2.3

Factor de crecimiento epidermal

194

1.2.4 Factor de crecimiento derivado de fibroblastos

194

1.3 Fosforilación de tirosinas y dominios

194

1.4 Rutas de señalización en las que intervienen Y-quinasas

197

1.4.1 La insulina como factor de crecimiento

197

1.4.2 La fosforilación de IRS-1 también activa la vía de PKB

198

1.4.3 Múltiples cascadas a partir del receptor de insulina

198

1.4.4 Detalles de la activación de la ruta de las MAPKs

199

1.4.5 Secuencia de transducción para EPO a través de JAK (receptor de citoquinas)

201

1.4.6 AKT1 (=PKB) y PTEN

203

2 Vías de señalización

205

2.1

Receptores con actividad enzimática intrínseca o asociada

206

2.2 Ruta de transducción para TGFβ-Smad

207

2.3

Rutas de transducción que involucran proteólisis

208

2.3.1

Ruta

de

Wnt

208

2.3.2

Ruta

de

Hh

209

2.3.3

Ruta

de

NFκB

210

2.3.4

Ruta

de

Notch/Delta

211

3 Anomalías que pueden producir diversas clases de cáncer

212

Anexo I: Ruta de CREB

213

Anexo II: Rutas de transducción de señales en la célula

214

Bloque IV: Regulación Molecular De La Neurotransmisión Tema 1: Canales iónicos que responden al voltaje

217

1 Extracción y purificación de canales

217

2 Tránsito de iones a través de canales

219

3 Estructura de los canales dependientes de voltaje

220

4 Dinámica temporal en la apertura de

223

5 Paso de iones a través de los canales

223

6 Experimentos electrofisiológicos con el mutante Shaker

225

Tema 2: Transmisión colinérgica

227

1

Proteínas implicadas en la transmisión colinérgica

227

1.1 Transportadores de colina (ChTs)

227

1.2 Síntesis de acetilcolina y transportador vesicular (VAChT)

227

1.3 Liberación de acetilcolina al espacio sináptico

229

1.4 Receptores muscarínicos (m-AChR)

230

2 Drogas que afectan a la sinapsis colinérgica

231

3 Colinesterasas (AChE y BuChE)

231

Tema 3: Receptores ionotrópicos

235

1 Sistema glutamatérgico

235

2 Sistema GABAérgico

237

3 Receptor de glicina

238

Tema 4: Transmisión adrenérgica y receptores metabotrópicos

239

1 Ruta de biosíntesis de catecolaminas

239

2 Rutas dopaminérgicas

240

3 Inactivación de catecolaminas

241

4 Sistema dopaminérgico

241

5 Sistema adrenérgico

242

6 Sistema serotoninérgico

242

Tema 5: Transmisión peptidérgica

245

1 Encefalinas

245

2 Síntesis y acciones de los neuropéptidos

245

3 Estructura génica de los neuropeptidos

246

4 Receptores de neuropeptidos

247

Bloque II: Regulación Molecular De Los Procesos Celulares

TEMA 1 Aspectos Metabólicos del Citosol

La construcción del ribosoma y su regulación. Destino celular de las proteínas producidas en ribosomas libres. Chaperonas moleculares: familias y diversidad funcional. Cambios post- traduccionales en las proteínas sintetizadas en ribosomas libres.

TEMA 2 Transporte de Material del Citosol al Núcleo, del Núcleo al Citosol y del Citosol a la Mitocondria

Señales peptídicas en proteínas destinadas al núcleo. Mecanismo molecular del transporte de proteínas y polinucleótidos por el poro nuclear. Proteínas Ran, importinas y exportinas. Motivos estructurales de las proteínas destinadas a la mitocondria. Translocones y ubicación de las proteínas en los compartimentos mitocondriales. El genoma mitocondrial, mutaciones y patolo- gías derivadas. Efectos de los antibióticos sobre la actividad mitocondrial.

TEMA 3 Proteolisis Intracelular

Recambio de proteínas. Degradación lisosomal y no lisosomal. Ubiquitina y proteínas relacio- nadas. El sistema ubiquitina/proteasoma y su implicación en la actividad celular y el cáncer. Proteasomas: estructura, función y aspectos evolutivos. Proteasas que se activan por calcio. Patologías derivadas del mal funcionamiento de las vías degradativas.

TEMA 4 Regulación del Ciclo Celular

Estapas del ciclo y su regulación. Ciclinas, proteín-quinasas y proteín-fosfatasas. Mecanismo de acción de los factores de crecimiento. Puntos de control de DNA dañado. Fallos en la regu- lación del ciclo y cáncer.

TEMA 5 Funciones del Retículo Endoplásmico-I

Obtención y caracterización de fracciones subcelulares. El retículo endoplásmico. Biogénesis de fosfolípidos, ceramidas y esteroides. El colectivo de proteínas citocromo P450. Su mplica- ción en la síntesis de lípidos y en la eliminación de tóxicos.

TEMA 6 Funciones del Retículo Endoplásmico-II

Síntesis de proteínas en ribosomas del retículo endoplásmico. Propiedades estructurales y funcionales del péptido líder y su receptor. Estructura y función de los translocones del retículo. Inserción de proteínas transmembranales en la bicapa lipídica.

TEMA 7 Glicosilación de Proteínas en el Retículo Endoplásmico y en las Cisternas del Golgi

Glicosilación de proteínas. Justificación. Glicosilación en el citosol. Síntesis del oligoglicano base en el retículo endoplásmico. Síntesis e incorporación a las proteínas de glicosil-fosfatidil inositol. Control del plegamiento de las proteínas y salida hacia el lisosoma o al Golgi. Glicosil- transferasas del Golgi. Clases de oligoglucanos. Lectinas vegetales y animales. Desglicosila- ción química y enzimática. Exo- y endo-glicosidasas. Glicómica y sus aplicaciones en medici- na.

TEMA 8 Tráfico Vesicular

Proteínas implicadas en la gemación. Mecanimo molecular de la fusión de vesículas con las membranas. Biogénesis del lisosoma. Exocitosis. Producción y regeneración de vesículas si- nápticas. Endocitosis inducida por receptores. Endosomas tempranos y tardíos. Transcitosis.

Tema 1: Aspectos metabolicos del Citosol

El citosol es el medio que rodea a todos los componentes subcelulares (orgánulos, ribosomas, gránulos de glucógeno, enzimas, proteínas del citoesqueleto y vesículas de triglicéridos). El volumen que ocupa el citosol depende de:

- El tipo celular pudiendo representar el 50% del volumen celular, pero gran parte de este estará ocupado por vesículas del retículo endoplasmático, del complejo de Golgi… lo que depende del tipo de célula.

- El estado celular, ya que por ejemplo, una célula del sistema inmune no tiene el mismo desarrollo de retículo endoplásmico cuando está estimulada para producir an- ticuerpos que cuando no está estimulada, por lo que también depende del estado ce- lular.

¿Dónde hay más volumen relativo de citosol, en un hepatocito o en miofibra muscular?

El volumen relativo de citosol es mayor en un hepatocito porque en la fibra muscular, aun- que el volumen celular es mayor, este está ocupado por el retículo sarcoplásmico.

La concentración de proteína presente en el citosol es muy alta, del orden del 20% (P/v, 20mg/1ml o 20g/100ml). Debido a esa gran concentración de proteínas el citosol tiene un as- pecto de gel estructurado.

1 Importancia del citosol en el metabolismo (Funciones)

El citosol es importantísimo en el metabolismo intermediario ya que gran parte de todas las reacciones fisiológicas de la célula se van a producir en él.

La glicolisis, gluconeogénesis, la biosíntesis de ácidos grasos (importante para la incorporación de restos hidrofóbicos a las proteínas de membrana), la biosíntesis de aminoácidos, las inter- conversiones de aminoácidos, la biosíntesis de nucleótidos, la biosíntesis de azucares e inter- conversiones de azúcares, la biosíntesis y degradación del glucógeno, la biosíntesis de triglicé- ridos (la degradación de ácidos grasos se realiza en la mitocondria).

Los granos de glucógeno se sitúan en el citosol y asociados a ellos están las enzimas implicadas en su síntesis y degradación. El propio gránulo de glucógeno tiene una cubierta proteica (esas enzimas de síntesis (glucógeno sintetasa) y degradación (glucógeno fosforilasa). Las unidades que salen de la degradación del glucógeno son glucosa-1-fosfato.

El metabolismo del glucógeno está fuertemente regulado por hormonas, unas que favorecen la degradación y movilización de glucógeno para aportar glucosa en situaciones en las que se necesite una elevada concentración de glucosa en sangre, y hay otras que, después de la co- mida, cuando los niveles de glucosa son muy altos en sangre, pues ese exceso de glucosa se acumula en forma de glucógeno. Y otras proteínas que responden a las señales reguladoras de acumulación o degradación de glucógeno.

También hay gotitas de grasa, que son TAGs. Las enzimas de síntesis (triglicéridos sintetasa) y degradación (triglicéridos lipasa) están siempre cerca de los TAGs, para que la acción sea in- mediata y no tengan que ir buscando esas enzimas por el citosol.

Por ejemplo, para que una proteína incorpore un resto hidrofóbico ha de ser sintetizada por los ribosomas libres del citosol. Esto se debe a que la formación de geranil-pirofosfato y far- nesi-pirofosfato, a partir del isopentenil-pirofofasto y el dimetilalil-pirofosfato (que proceden del ácido mevalonico) se produce en el citosol. Por lo tanto la única vía de incorporación de poli-isoprenos o ácidos grasos a las proteínas va a ser mediante su síntesis citosólica.

Otro de los aspectos importantes del citosol es la presencia del citoesqueleto. En el citosol tiene lugar la remodelación del citoesqueleto que por una parte determina el movimiento de algunos tipos celulares, y por otra determina la posición relativa de los orgánulos subcelula- res, lo que afecta a la eficiencia y rapidez de la respuesta a los estímulos.

La red del citoesqueleto proporciona las vías por las que van a circular los elementos del cito- sol gracias a los motores moleculares (dineinas y quinesinas). Este sistema de conducción (ac- tina, tubulina,…) contribuye a la eficiencia en el acoplamiento de la vesícula desde la mem- brana de salida hacia la membrana de llegada, garantizando, además, la complementariedad (las vesículas del retículo endoplasmático van a ser conducidas a la cara proximal del retículo de Golgi y no a la cara distal).

Puesto que la red del citoesqueleto regula la actividad celular normal, los fallos en la composi- ción, el funcionamiento o en la dinámica de los componentes pueden favorecer los problemas de supervivencia celular o incluso la transformación en célula neoplásica. El caso más extremo es la metástasis o posibilidad de que una célula migre de un tejido afectado mediante la sepa- ración, entrada al sistema circulatorio y deposición posterior en el tejido aceptor.

Otros de los aspectos por los que el citosol tiene una gran importancia en el metabolismo es por la presencia de ribosomas. En eucariotas solo existe un tipo de ribosomas que en función de la proteína en síntesis se van a encontrar libres o acoplados al retículo endoplasmático.

Al ser sintetizadas, las proteínas pueden portar un péptido señal que provoca el acopla- miento al RE a través de un receptor de la señal, que posibilita que el péptido sea introduci- do en el RE mediante un translocon.

El destino de una proteína está determinado por la secuencia de aminoácidos que contiene en el extremo amino-terminal (N-terminal) donde puede situarse una señal de tránsito que la dirigirá:

- Si se trata de un ribosoma libre al citosol, la mitocondria, el núcleo, el peroxisoma o el cloroplasto.

- Si se trata de un ribosoma asociado al RE, al propio retículo, al complejo de Golgi, a la membrana plasmática, al lisosoma o exportación por exocitosis (constitutiva o regula- da).

La albumina es una parte fundamental del plasma sanguíneo que interviene en el transporte de

La albumina es una parte fundamental del plasma sanguíneo que interviene en el transporte de hormonas (Triyodotironina, tiroxina,…) y que es una secreción constitutiva en el hígado. Por el con- trario, la secreción de insulina desde las células islotes del páncreas es una secreción regulada.

2 Genoma y proteoma: Origen de la diversidad estructural y fun- cional de las proteínas

Entre 1990 y 2001, se realizó un proyecto con el fin de conocer la secuencia de bases de todo el DNA humano (Proyecto Genoma Humano). El ser humano tiene 3.000millones de pares de bases (aprox. 25.000 genes) y 46 cromosomas

No hay relación entre el tamaño del genoma (en pares de bases) y el número de genes y número de cromosomas entre las distintas especies animales y vegetales. No hay tal corres- pondencia, lo que determina la plasticidad y las capacidades de una célula y la posibilidad de establecer comunicación con otras células son los genes.

La unidad funcional es la proteína y la unidad informativa es el gen. La ventaja evolutiva y la capacidad de supervivencia de una célula es cuanto mayor cuanto mayor sea la diversidad de las proteínas.

Organismo

Tamaño (pb)

Nº de genes

Nº cromosomas

Homo sapiens (humano)

3.274

millones

~25.000

46

Mus musculus (ratón)

3.420

millones

~25.000

40

Canis familiaris (perro)

2.385

millones

~20.000

78

Gallus gallus (gallo)

1.050

millones

~18.000

66

Danio rerio (pez cebra)

1.563

millones

~22.000

48

Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)

168

millones

~13,000

8

Oryza sativa (arroz)

487

millones

~44.000

24

Caenorhabditis elegans (gusano)

103

millones

~19.000

12

Saccharomyces cerevisiae (levadura)

12 millones

~6.000

32

El conjunto de genes de un organismo señala la información que puede expresar la célula (la capacidad que tiene), la variedad de proteínas expresa la capacidad de la célula para hacer frente a una situación concreta, la variedad de proteínas es altamente variable. Los genes son los mismos en todas las células, pero la composición de proteínas (el proteoma de la célula) varía y depende del tipo celular, del organismo, del momento del desarrollo del organismo, del estado celular en ese momento, etc. El proteoma va cambiando para ir adaptándose a cada situación, pero los genes son siempre los mismos.

No se sabe cuántas proteínas es capaz de fabricar el ser humano (100.000 proteínas distintas), pero esto tiene mucho interés, ya que comparando las proteínas de una persona sana con otra enferma, podríamos ver qué proteínas son causantes de esa enfermedad o qué proteínas, en su ausencia, causan esa enfermedad.

Se sospecha que la mayoría de los 25.000 genes sufren splicing alternativo (90%). Se calcula que debe de haber unas 100.000 proteínas distintas, ya que por cada splicing suelen formarse unas 4 variantes de la proteína.

Hasta la fecha se han identificado 20.000 proteínas distintas, que son las más abundantes. Como cada año se van mejorando las técnicas de identificación y análisis de proteínas, por tanto cada año se irán descubierto cada vez más proteínas. Unas 1.000 proteínas distintas se han identificado en la mitocondria. En el suero sanguíneo se han encontrado 3000 proteínas y en el líquido cefalorraquídeo unas 1000 proteínas.

La diversidad de proteínas aparece por resultado de Splicing alternativo (ensamblado alterna- tivo de los exones y eliminación de intrones) y transformaciones (o modificaciones) post- traduccionales.

2.1 Splicing alternativo

El Splicing alternativo es la capacidad de producir variantes de la misma proteína que proce- den del ensamblado de exones comunes y exones no comunes.

En un mismo tipo celular pueden coexistir dos variantes distintas de la misma proteína puesto que pue- den presentar diferente afinidad por el ligando. El plegamiento de estas variantes será diferente y el sitio de unión al ligado también. Esto hace que dos variantes res- pondan de diferente manera a un mismo ligando o a concentraciones diferentes del mismo.

a un mismo ligando o a concentraciones diferentes del mismo. Este fenómeno de maduración alternativa también

Este fenómeno de maduración alternativa también puede provocar una variante con idéntica funcionalidad pero diferente localización.

Una variante del splicing alternativo puede localizarse en el citosol, mientras que la otra se localice en la membrana plasmática. Aunque ambas se sintetizaran mediante ribosomas li- bres, la variante de la membrana plasmática podría estar recibiendo un resto de ácido palmíti-

16

co o poli-isopreno, adquiriendo una naturaleza anfifílica y por lo tanto siendo incorporada en

la cara citosólica de la membrana plasmática. En caso de que el resto hidrofóbico fuera incor- porado en el retículo endoplasmático esta quedará orientada hacia la matriz extracelular.

2.2 Modificaciones post-traduccionales

Otro de los aspectos que aumentan extraordinariamente la diversidad de las proteínas pro- ducidas a partir de un número limitado de genes son las modificaciones post-traduccionales, que pueden ser reversibles o irreversibles.

Los cambios post-traduccionales reversibles son:

- La fosforilación (Quinasas/Fosfatasas)

- Acetilación (acetilasas/desacetilasas o acetiltransferasas) como en el caso de las histo- nas y la expresión de genes.

- Metilación (metilasas/desmetilasas o metiltransferasas)

- Oxidación (oxidasas/reductasas)

- Adición de ubiquitina

Este tipo de cambios provocan cambios conformacionales en la estructura de las proteínas modulando o modificando su actividad. Además según sea la estructura tridimensional, la pro- teína estará capacitada para alcanzar su destino o no.

Los cambios post-traduccionales irreversibles son:

- Adición de restos hidrofóbicos como el ácido palmítico (16C) o poli-isoprenos. Por ejemplo la proteína del oncogén RAS se encuentra asociada a la membrana y manda señales para la proliferación y división celular.

- Glicosilación entre la que podemos distinguir dos clases, la O-glicosilación (adición de un oligosacárido mediante interacciones con los grupos hidroxilo de serina y/o treoni- na) y N-glicosilación (adición de los restos al grupo amino de asparragina o glutamina)

- Proteólisis

Una proteína que pierde los restos añadidos durante los cambios post-traduccionales irre- versibles pierde su actividad biológica al perder su estructura tridimensional. En ciertos casos esta proteína puede llegar a ser tóxica dando lugar a agregados como es el caso de los priones.

3 Ribosomas

Uno de los compuestos más abundantes en el citosol son los ribosomas que varían dependien- do de si la célula es eucariota o procariota.

- Ribosomas Procariotas (70S, 2.800 kD)

o

Subunidad 60S

o

Subunidad 50S

rRNAs 28S, 5.8S y 5S

rRNAs 23S y 5S

45 proteínas

34 proteínas

o

Subunidad 40S

o

Subunidad 30S

rRNA 18S

rRNA 16S

33 proteínas

21 proteínas

- Ribosomas Eucariotas (80S 4.500 kD)

En los organismos procariotas encontramos unos 20.000 ribosomas, mientras que en una célula eucario- ta podemos encontrar unos 10.000.000 lo que supone mucho más de la mitad. Estos ribosomas están com- puestos por dos subunidades indicadas en la página anterior, cada una de las cuales compuestas por varios rRNAs y proteínas asociadas (55 en procariotas y 78 en ecuariotas).

proteínas asociadas (55 en procariotas y 78 en ecuariotas). La síntesis de estas proteínas asociadas a

La síntesis de estas proteínas asociadas a ribosomas tiene que estar muy controlada por dos motivos. En primer lugar por la energía necesaria para sintetizar una proteína, y en segundo lugar porque hay que producir las copias necesarias de acuerdo con la cantidad de rARN dis- ponible. Si esta síntesis no estuviese controlada tendríamos dos problemas fundamentales:

- Las proteínas que se asocian con el ribosoma pueden llegar a tener unos 80 kD, lo que supone un despilfarro energético.

- La sobreproducción de cualquiera de ellas supone problemas, ya que a grandes con- centraciones de una proteína, esta puede desplazar a otras del lugar que le corres- ponde, a pesar de tener menos afinidad por el sitio de unión. Esto provoca ribosomas no operativos o de baja eficiencia.

En el cuadro se representan las interacciones de las proteínas relacionadas con el ARNr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma procariota (S = Small). Podemos clasificar estas proteínas en función de su relación entre ellas y el ARN.

- Las proteínas de la primera fila son aquellas que interaccionan directamente con el ARNr.

- Las proteínas de la segunda fila son aquellas que interaccionan con e ARNr y con las proteínas de primera línea.

- Las proteínas de la tercera fila, no interaccionan con el ARNr, sino que se asocian con las proteí- nas anteriores.

ARNr, sino que se asocian con las proteí- nas anteriores. Por ello en estas condiciones, el

Por ello en estas condiciones, el desplazamiento que podría provocar una desregulación de la expresión de las proteínas del ribosoma afectaría gravemente a la funcionalidad ya que, si por ejemplo la proteína S20 desplazara a S7, ninguna de las que interaccionan con S7 podrían unir- se. Por ello en los procariotas, las proteínas están organizadas en operones.

Un operón es un conjunto de genes que se van a expresar de manera coordinada, es decir, que la expresión del primer gen conlleva la expresión de los genes que le siguen. Todas las proteí- nas que intervienen en la biosíntesis de las subunidades del ribosoma están agrupadas en ope- rones de 2 o 3 proteínas.

Además la primera de las proteínas expresadas por el operón tiene la facultad de unirse a su lugar en el ARNr correspondiente y de actuar como un represor de su propio operón unién- dose al mensajero. Por ello, cuando todos los sitios correspondientes de los ARNr sean ocupa- dos se inhibirá la expresión de más subunidades.

El ritmo de síntesis de proteínas es de 15 aa/s, es decir, que el ribosoma se desplaza sobre la cadena de mRNA a una velocidad de 45 b/s. Por ejemplo, una proteína de 75.000 Da, consi- derando que la masa promedio de un aminoácido es de 100 Da, contiene unos 750 aminoáci- dos. Por lo tanto serán necesarios 50 segundos para sintetizar una proteína. Pero puesto que se forma un polisoma en el que varios ribosomas leen el mismo mensajero al mismo tiempo con cierto desfase entre ellos, en 100 segundos no tendremos 2 copias, sino muchísimas más.

4 Síntesis de proteínas e inhibidores

Uno de los aspectos más importantes para el control de patógenos y la investigación básica es la inhibición de la síntesis de proteínas en procariotas y eucariotas.

Se conocen una serie de inhibidores que afectan a la síntesis de proteínas en procariotas, mitocondrias y cloroplastos, ya que estos orgánulos proceden de los procariotas (teoría endo- simbiotica) y presentan los mismos ribosomas.

- El Cloranfenicol inhibe a la peptidiltransferasa, una ribozima (ARN con acción catalíti- ca no proteica) que transfiere la cadena polipeptídica desde el sitio peptidil (P) al sitio aminoacídico, para que se vaya formando la cadena.

- La Puromicina es un análogo estructural del Tyr-tRNA (aminoacil de tRNA), de manera que se engaña al ribosoma, ya que incorpora a la puromicina creyendo que es la Tyr- tRNA y por tanto ya no puede continuar la elongación de la cadena polipeptídica. También puede afectar a eucariotas.

- La Tetraciclina y la Estreptomicina se unen a la Subunidad 30S y provoca la lectura errónea del mRNA.

- La Eritromicina se liga al rRNA 23S y detiene la translocación del ribosoma a lo largo del mRNA.

En cuanto a los Eucariotas:

- La Ciclohexidimida actúa como el cloranfenicol en procariotas.

La utilización de Ciclohexidina nos permite determinar si la recuperación de actividad de una proteína, previamente inhibida, se produce por la síntesis de novo o mediante su recuperación a partir de un pool o reservorio. Para ello se comienza el ensayo inhibiendo a la enzima en cues- tión (p.e. AChE con isopropil-pirofosfato) y a continuación se bloquea la síntesis de proteínas añadiendo Clicloheximida al cultivo. Si tras un tiempo la actividad proteica se recupera querrá decir que hay una reserva de proteína inactiva que ha sido movilizada por acción de las chape- ronas, pero si no se recupera, querrá decir que la recuperación se debía a la expresión del gen.

Además la combinación en experimentos secuenciales con Ciclohexmida, Cloranfenicol y ambos, nos permiten determinar si una proteína procede del genoma nuclear, mitocondrial o de un reservorio.

1

Puesto que las mitocondrias se ven afectadas por los inhibidores procarióticos, los efectos del consumo de estos compuestos sobre una persona dependerán de la cantidad, del genoma y el proteoma del individuo, así como de la naturaleza del antibiótico y del tejido.

Cualquier agente antibacteriano que pueda afectar a nuestras mitocondrias afecta al resto de

la

célula también. Dependiendo de la naturaleza química de estos compuestos, tendrán mayor

o

menos dificultad para atravesar la membrana (cuanto más polar sea, pasará con menos faci-

lidad; cuanto menos polar sea, pasará con mayor facilidad). También depende de la naturaleza

de la membrana mitocondrial externa e interna, que tienen distinta permeabilidad.

Se puede utilizar la Eritromicina, porque no puede cruzar (o casi no puede entrar) la membrana mitocondrial interna.

Las células que se dividen muy activamente tienen muchas más mitocondrias, por lo son mu- cho más vulnerables a estos inhibidores. La vida media de una mitocondrial en una célula nor- mal es de 5 o 6 días. Por eso, para que se afectaran de manera notable las células del organis- mo, tendría que someterse a un tratamiento con antibióticos durante unos 5, 6 o 7 días, para afectar gravemente a las células. Si el tratamiento es de un par de días, por ejemplo, es posible que solo el 20 o 30% de las mitocondrias de una célula se vean afectadas, pero aun así la célula seguiría funcionando más o menos de forma aceptable (con el 80% de mitocondrias funcio- nando). Pero si por ejemplo se ven afectadas más del 50-60% de las mitocondrias, pues la célu-

la se verá gravemente afectada por esa disminución de mitocondrias.

Los tratamientos con antibióticos bacterianos tienen que ser lo más breves posible para que no afecte mucho a las células y además, que no se cree resistencia por parte de las bacterias.

Tetraciclinas: No pueden pasar a través de la membrana plasmática de las células de la médula ósea, porque se crea el complejo tetraciclina-Ca, debido a que en el hueso hay una gran concentración de calcio (los huesos están formados por fosfatocálcico).

Los tratamientos con antibióticos pueden causar trastornos en tejidos del epitelio intestinal, apareciendo diarreas, se muere la flora intestinal, y algunos antibióticos pueden ocasionar estado de anemia, porque se dañan células sanguíneas que sufren un recambio rápido y nece- sitan multiplicar sus mitocondrias.

También hay que destacar que cuando estamos sometidos a un tratamiento con antibióticos, nos sentimos débiles y sin fuerzas, porque con el antibiótico se ve reducido la síntesis de ATP en las mitocondrias.

5 Chaperonas moleculares

En la construcción del ribosoma, intervenía los RNA ribosomales y además un montón de proteínas, donde unas 55 para el ribosoma bacteriano y en torno a 78 para el ribosoma de eucariotas.

2
2

Estas proteínas se sintetizan en ribosomas libres, y después entran al núcleo (a través de los poros nucleares), llegando al nucleolo (que es la fábrica de ribosomas). A continuación se for- man las partículas pre-ribosomales (uniéndose al RNA ribosomal), que salen por los poros nu- cleares hacia el citosol. Una vez fuera, terminan la maduración, uniéndose al RNA mensajero ambas subunidades ribosomales (pequeña y grande) y empieza la síntesis de proteínas.

Para que todo esto ocurra de forma rápida y eficiente, hacen falta unas proteínas de ayuda que son las chaperonas.

La secuencia de aminoácidos de una proteína determina su estructura tridimensional, lo que quiere decir, que al concluirse la síntesis de la cadena polipeptídica la proteína debería estar plegada. Pero lo que sucede en realidad es que los determinantes estructurales se pueden situar en el extremo central o en el carboxilo, y por lo tanto, la proteína no pueda plegarse hasta que se haya completado la síntesis.

Cuando una proteína presenta los determinantes estructurales en la secuencia N-terminal, esta se irá plegando conforme sea sintetizada pero si se sitúan más adelante, la proteína co- menzará a plegarse de forma errónea formando un ovillo. Para evitar este fenómeno, las cha- peronas van a mantener la estructura de la proteína en síntesis desplegada hasta que los determinantes estructurales permitan el plegamiento correcto.

5.1 El descubrimiento de las Chaperonas

En 1960, Anfinsen puso de manifiesto que la información necesaria para la estructura de una proteína se encontraba en la secuencia de aminoácidos en sus experimentos con la ribonu- cleasa, pero los datos fueron malinterpretados.

El experimento consistía en ver como la actividad de la ribonucleasa se desplomaba al añadir urea (agente desnaturalizante) al medio. Si ahora se introducía la mezcla en una bolsa de diáli- sis, la urea abandonaba el medio y al poco tiempo la ribonucleasa recuperaba su actividad biológica.

Este experimento desembocó en un dogma de la biología molecular que posterior mente tuvo que ser matizado: La secuencia de aminoácidos de una proteína determina la estructura tridi- mensional.

Pero las condiciones en el interior celular son más complejas que in vitro. En primer lugar no hay un solo tipo de proteínas, sino miles, y en segundo lugar un mensajero está siendo tradu- cido a la vez por muchos ribosomas, por lo que varias copias de la misma proteína se están sintetizando progresivamente y muy próximas, por lo que si presenta dominios hidrofóbicos, estas podrán asociarse para formar agregados.

Por lo tanto, en muchas ocasiones, será necesaria la participación de otras proteínas, denomi- nadas chaperonas, para proteger las regiones hidrofóbicas e impedir estos procesos. Las cha- peronas, al igual que las demás proteínas, van a actuar reduciendo la energía necesaria, o facilitando el plegamiento, pero sin intervenir al final de la reacción.

El nombre de Heat shock protein (HSP) o proteínas de choque térmico, que reciben las chape- ronas, proviene de la observación de su síntesis cuando se somete un cultivo celular a una temperatura mayor a la que presenta un funcionamiento óptimo.

Si se introduce un cultivo de linfocitos en una cabina de flujo a 42 °C durante 10 minutos, aunque la célula sigue viviendo, muchas de sus proteínas comienzan a desnaturalizarse, lo que provoca las señales de estrés térmico que desembocan en la sobreexpresión de chape- ronas para favorecer el replegamiento y la recuperación de proteínas.

En condiciones normales siempre existe una expresión basal de chaperonas, ya que, como veremos más adelante, estas van a tener muchas más funciones. Para ejercer dichas funciones precisan de un aporte de ATP, puesto que va a ser su hidrólisis la que produzca la variación de energía libre necesaria para dar lugar a procesos desfavorables termodinámicamente.

En general, las chaperonas van a ser inducibles por todos los factores que faciliten el unfol- ding 1 como:

- Variaciones de temperatura.

- Disolventes orgánicos (etanol, propiodioxano,…)

- Elementos metálicos (Zn, Pb,…)

Otra de las funciones que desarrollan las chaperonas es el mantenimiento de la cadena de aminoácidos desplegada para aquellas proteínas cuyo destino son los orgánulos celulares, y que por lo tanto precisan atravesar translocones con un diámetro de poro pequeño (TON y PIN en la mitocondria). Esta es una función tan importante que aquellas levaduras que no sinteti- zan chaperonas son inviables.

Finalmente, los fallos en la síntesis de ciertas chaperonas están asociados con enfermedades como el Alzheimer, la fibrosis quística o la mucolipidosis (acumulo de material lipídico en los lisosomas). Quizás no es el agente causal, pero es un factor de riesgo para el desarrollo de la enfermedad.

5.2 El plegamiento de las proteínas

En el entorno celular las proteínas se sintetizan como cadenas de aminoácidos desplegadas cuyo estado de energía interna es máximo y por lo tanto muy inestable. Por ello existe la tendencia natural de reducir esta energía mediante el plegamiento que puede realizarse co- rrecta o incorrectamente, dando lugar a diferentes estados conformacionales.

La parte izquierda de la gráfica de la siguiente página representa como una proteína desplega- da va a ir adquiriendo diferentes estructuras conformacionales de plegamiento parcial, hasta alcanzar el estado nativo en el que posee una estructura tridimensional que le permite llevar a cabo su actividad catalítica. Cada uno de los sucesivos estados presentan una menor energía interna, y por lo tanto una mayor estabilidad en los que la proteína se estabiliza per se median- te interacciones intramoleculares.

1 Pérdida de estructura nativa, desnaturalización.

En algunas ocasiones las proteínas se pliegan de manera errónea cayendo en un estado de energía interna inferior por el que necesitarán de la participación de las chaperonas para al- canzar el estado de transición y superar la barrera energética que les impide alcanzar la estruc- tura nativa. Las chaperonas actúan por tanto como catalizadores que reducen la energía nece- saria para pasar de un estado a otro, facilitando la adquisición de la estructura nativa e impi- diendo que fruto del plegamiento incorrecto las proteínas comiencen a desarrollar interaccio- nes intermoleculares para estabilizarse.

Las proteínas admiten cierta flexibilidad conformacional ya que cuando estas interaccio- nan con el sustrato sufren un cambio conformacional y por lo tanto la estructura nativa no es un estado fijo e inmóvil. Esta flexibilidad es lo que se conoce como ajuste inducido.

Muchas proteínas, en su variación por los estados parcialmente plegados, comienzan a desa- rrollar interacciones intermoleculares con proteínas de la misma clase que conducen a la for- mación de agregados, tal y como se repre- senta a la derecha de la gráfica inferior.

Los estados de agregación son peligrosos ya que suelen ser tóxicos para muchos tipos celulares, aunque las chaperonas van a ser capaces de actuar sobre aquellos que no sean insolubles, recuperándose las proteínas.

Los agregados pueden ser amorfos, pero también pueden ser oligómeros muy es- tructurados y estos pueden polimerizarse para formar fibrillas amiloides muy inso- lubles. Todos estos estados serán reversi- bles, siempre y cuando las chaperonas sean capaces de acceder a ellos.

y cuando las chaperonas sean capaces de acceder a ellos. 5.3 Funciones de las chaperonas Como

5.3 Funciones de las chaperonas

Como ya se puede intuir, las chaperonas presentan muchas funciones en el entorno celular.

1)

Facilitan el plegamiento del polipéptido para alcanzar la estructura nativa.

2)

Previenen el plegamiento en aquellas proteínas cuyo destino no es el citosol y precisa atravesar translocones.

3) Importantes en las interacciones proteína-proteína, proteína-RNA y proteína-DNA

4)

(histonas). Renaturalización de proteínas parcialmente desnaturalizadas.

5)

Conversión de agregados en unidades proteicas.

6)

Colaboración a la proteólisis participando de manera activa en el ciclo de la ubiquiti-

7)

na-proteosoma y en la autofagia. Formación de agregados con diversos receptores, como el de cortisol, que se sitúa en el citosol secuestrado por una chaperona que tapa su sitio de reconocimiento nuclear

8)

9)

hasta que la llegada del cortisol produce un cambio conformacional que libera el sitio y permite su importación al núcleo y la búsqueda de su elemento de respuesta (secuen- cia de nucleótidos). Transporte de proteínas por translocones como en el caso de las chaperonas SecA en procariotas y BiP en eucariotas. La proteína de unión o Binding protein (BiP) facilita la entrada de proteínas al lumen del retículo endoplasmático en el transporte post- traduccional (no confundir con la introducción co-traduccional mencionada anterior- mente). BiP es por tanto una chaperona que va a empujar proteínas sintetizadas, me- diante gasto de ATP, al interior del retículo. Control de calidad (plegamiento correcto) a través de los distintos pasos hasta el des- tino final de una proteína. Las chaperonas son capaces de forzar a las proteínas a con- seguir su estructura nativa aunque sea necesaria la desnaturalización completa para volver a realizar el plegamiento.

seguir su estructura nativa aunque sea necesaria la desnaturalización completa para volver a realizar el plegamiento.

Además, las chaperonas participan en la progresión del ciclo celular, mantenimiento de los telómeros, apoptosis, transducción de señales mitóticas, transporte vesicular, inmunidad inna- ta y degradación proteica.

Conforme aumenta la edad, disminuye la capacidad de síntesis de chaperonas, lo que genera problemas con la proteostasis (homesotasis del proteoma) dando lugar a neurodegeneración, demencias, diabetes tipo-2, patologías por depósitos de material en lisosomas, fibrosis quísti- ca, patologías cardiovasculares y cáncer.

5.4 Clasificación de las HSP

El número de chaperonas que se conoce es enorme y está en constante aumento conforme aumenta las investigaciones al respecto. La tabla con algunas de estas chaperonas puede ser consultada en el documento anexo donde se indica la localización tisular, celular, los sustratos y algunas enfermedades relacionadas con cada chaperona.

En cualquier caso se han agrupado en varias familias en función del tamaño molecular en kDa.

- HPS20

- HSP40

- HSP60

- HSP70

- HSP90

- HSP100

Para establecer la identidad (parecido) entre las chaperonas de una misma familia se elige una como prototipo o estándar y se calcula el parecido de secuencia con respecto a las demás.

Puesto que se encuentra en todos los orgánulos debieron aparecer en un momento temprano de la evolución, y puesto que están representadas por muchas familias, su función es muy importante ya que nos encontramos con un sistema de redundancia.

Esta diversidad también puede explicarse si se considera que la diana de acción son miles de proteínas con multitud de dominios estructurales diferentes. Cuando una chaperona detecta

una proteína parcialmente desplegada que ha dejado expuesto un dominio hidrofóbico, desa- rrolla su actividad catalítica golpeando a la proteína hasta que recupera su forma nativa. De esta manera se evita la formación de agregados insolubles. Pero esto puede pasar con cual- quier proteína, por lo que es necesario que el centro activo sea flexible para abarcar una gran cantidad de motivos. Además, la combinación de varias chaperonas aportará una cierta especi- ficidad, pero relativa, para establecer una unión de baja afinidad que permitirá la salida poste- rior de la proteína.

5.5 Modo de acción de algunas chaperonas

Veamos ahora el modo de acción de algunas chaperonas representativas de la mayoría casos en los que van a participar.

Una proteína desplegada pasa por varios estados de plegamiento parcial (estados de Molten o glóbulos de modulo fundido) en los que presenta varias alternativas favorables termodinámicamente. Por un lado la proteína puede alcanzar la estructura nativa, que es el camino favorecido termodinámicamente (en menor medi- da la reversión), por otro lado, puede formar agregados cuya reversión es muy desfavorable.

puede formar agregados cuya reversión es muy desfavorable. En cualquier caso, el plegamiento es un proceso

En cualquier caso, el plegamiento es un proceso espontáneo y termodinámicamente favora- ble (ΔG < 0), pero el hecho de que el proceso ocurra no conlleva un tiempo definido y por ello en muchas ocasiones las chaperonas van a intervenir para que el plegamiento se produzca rápidamente.

Además, es muy probable que las proteínas que presenten los determinantes estructurales en los extremos C-terminales precisen de la colaboración de las chaperonas.

5.5.1 HSP70 y co-chaperonas (HSP20 y HSP40) La HSP70 es una chaperona que presenta tres dominios funcionales:

- Dominio de unión a nucleótidos (ATP/ADP) o nucleotide binding domain con actividad ATPasa.

- Dos dominios de unión a proteínas con estados de baja y alta afinidad.

El dominio de unión a nucleótidos, en verde, presenta una actividad ATPasa basal pero la unión a la proteína diana por medio de los dos dominios de unión, en gris y amarillo, provoca un cambio conformacional que provoca la actividad ATPasa. La hidrólisis de ATP a ADP provo- ca un tirón molecular que aumenta la afinidad de los dominios de unión por la

La hidrólisis de ATP a ADP provo- ca un tirón molecular que aumenta la afinidad de

proteína diana que es “golpeada” una y otra vez hasta alcanzar su estado nativo. Por lo tanto la HSP70-ADP presenta una alta afinidad por la proteína diana.

Para que se pueda llevar a cabo cada ciclo la proteína NEF (Nucleotide Exchange Factor) inter- cambia el ADP por ATP, haciendo que los dominios de unión a proteínas de HSP70 cambien de alta a baja afinidad. HSP70-ATP es el estado de baja afinidad por la proteína diana.

Si la proteína sigue presentando regiones hidrofóbicas al medio, y por ende, está mal plegada, entonces aún presenta la afinidad suficiente por los dominios de unión a proteínas y permane- ce en lugar activo para recibir un nuevo “golpe”. Pero si ha adquirido su estructura nativa en- tonces el cambio de HSP70 a un estado de baja afinidad le permite liberarse.

La HSP40 y HSP20 son co-chaperonas que median en el reconocimiento de proteínas mal ple- gadas, caracterizadas por la exposición de regiones de al menos 8-10 o 12 aminoácidos hidro- fóbicos 2 , transportándolas hasta las proximidades de la HSP70 ejecutora y además promueven su actividad ATPasa.

Si observamos un ejemplo en el que interviene la proteína J (co-chaperona), cuando esta in- teracciona con una proteína desplegada o mal plegada (1), se une a ella y la traslada hasta la HSP70, formándose un complejo ternario (2) entre la proteína J, la proteína diana y HSP70.

(2) entre la proteína J, la proteína diana y HSP70. A continuación se produce la hidrolisis

A continuación se produce la hidrolisis de ATP en HSP70 (3) lo que provoca su aumento de afinidad por la proteína diana y un descenso de afinidad por la proteína J.

Ahora NEF interviene y se une a HSP70 (4) provocando la salida del ADP (5) y la entrada de ATP (6) con el consiguiente cambio conformacional, pasando a un estado de baja afinidad y favore- ciendo además la salida de NEF (7).

Este ciclo puede tener éxito y conseguirse la estructura nativa de la proteína o puede fracasar. Cuando tras varios intentos no se consigue plegar correctamente a la proteína esta es deriva- da hacia la degradación a través del sistema de ubiquitina-proteosoma o a través de la auto- fagia.

5.5.2 HSP90 La HSP90 (Apo-HSP90) es un dímero que presenta tres dominios funcionales:

- Dominio de unión C-terminal (CD) por donde los monómeros se unen a través de sus extremos C-terminales y en ocasiones es denominado pinza molecular.

2 Arginina y lisina

- Dos dominios (uno por monómero) intermedios de unión a proteínas (MD).

- Dos dominios (uno por monómero) N-terminales de unión a nucleótidos (ND).

Esta chaperona presenta tres estados conformacionales diferentes en función de los ligandos a los que se encuentre unida.

La primera conformación o con- formación de alta afinidad es la que se produce cuando la HSP90 no interacciona con sus ligandos (ATP/ADP y una proteína desple- gada). Se encuentra en un estado relajado con los monómeros unidos a través de CD separados y exponiendo al medio algunos residuos hidrofóbicos con alta afinidad por las proteínas mal plegadas.

con alta afinidad por las proteínas mal plegadas. La segunda conformación o de baja afinidad se

La segunda conformación o de baja afinidad se produce cuando HSP90 incorpora ATP en los dominios ND y una proteína desplegada en los dominios MD. La estructura se cierra y el sus- trato queda secuestrado por interacciones no covalentes de baja afinidad.

La tercera conformación o conformación compacta se produce cuando otras proteínas como AHA1 interaccionan con HSP90 de baja afinidad, provocando la aproximación de los dominios ND con ATP unido, que dimerizan y “aplastan” a la proteína que se encuentra unida en MD.

Finalmente se produce la hidrólisis del ATP a ADP +P i que provoca la vuelta al estado de alta afinidad inicial, la separación de los dominios ND y la liberación de la proteína plegada. Poste- riormente se libera el ADP + P i y la chaperona vuelve al estado más desplegado de alta afini- dad.

Tal y como se puede observar en la imagen, el paso de un estado a otro está muy regulado por proteínas que comprueban que la proteína unida a HSP90 necesita o no plegarse impi- diendo o permitiendo el avance del proceso.

5.5.3 HSP60 (GroEL y GroES) La familia de chaperonas HSP60, a diferencia de las anteriores, forman estructuras poliméricas de oligómeros (Chaperoninas 3 ) que en procariotas dan lugar a una estructura don forma de barril compuesto por:

- GroEL que es un cilindro con 14 subunidades proteicas (HSP60) cuyo interior da lugar a dos cámaras, una superior y otra inferior separadas por una barrera.

- GroES es una especie de tapadera con 7-8 subunidades de HSP60 que interacciona con los huecos de las cámaras de GroEL.

3 Existe una tendencia a denominar Chaperonas a las monoméricas y Chaperoninas a las poliméricas.

Cuando una proteína resulta resistente al plegamiento por HSP70, entonces esta se la cede a GroEL, mediante un intercambio de ADP por ATP (cambio de alta afinidad a baja afinidad), que la introduce en la cámara abierta (cis).

Puesto que cada complejo presenta dos cámaras están actuaran de manera cíclica y alternativa por lo que mientras que una cámara puede presentar ATP unido, la otra podrá presentar ADP o el sitio vacío.

ATP unido, la otra podrá presentar ADP o el sitio vacío. Al mismo tiempo que la

Al mismo tiempo que la proteína va entrando en la cámara cis de GroEL, se promueve la salida de 7 ADP en la cámara trans y la separación de su unidad GroES, al mismo tiempo que 7 ATP se unen a la cámara cis y promueve la unión de GroES.

Ahora la actividad ATPasa de las subunidades HSP60 se activa e hidroliza el ATP provocando un cambio conformacional que presionan la proteína dentro de la cámara cis hasta conseguir su estructura nativa. En este estado con ADP, la cámara cis tiene una alta afinidad por la proteína, pero la unión del ATP a la cámara trans provoca la salida del ADP y de GroES de la cámara cis.

Puesto que la cámara presenta el interior tapizado por aminoácidos hidrofóbicos, en el caso de que la proteína esté plegada, la salida de GroES provoca la expulsión inmediata de la proteína.

Cabe destacar que la etapa más larga del ciclo es el plegamiento de la proteína.

inmediata de la proteína. Cabe destacar que la etapa más larga del ciclo es el plegamiento

10

5.6 Resumen

Hemos visto en los apartados anteriores como las chaperonas participan en el plegamiento de las proteínas, pero no hay que olvidar, que esta es solo una de sus acciones.

En la imagen se ha realizado una síntesis de

la importancia de las chaperonas en el ple-

gamiento de proteínas en procariotas. Cuando la cadena polipeptídica comienza a

emerger del ribosoma esta se encuentra

con unas chaperonas unidas que mantienen

la estructura desplegada en el caso de que

se trate de una región hidrofóbica.

A partir de aquí se abren dos posibilidades.

Por un lado la proteína puede sintetizarse completamente y plegarse per se, como ocurre en el 70% de los casos. Por otro lado

la proteína necesitará de la participación de

chaperonas que la mantengan desplegada hasta encontrarse con HSP70 (20%) o que además necesiten de la participación de los complejos GroEL-GroES para finalizar el

plegamiento (10%).

complejos GroEL-GroES para finalizar el plegamiento (10%). Puesto que es más rentable no utilizar chaperonas, la

Puesto que es más rentable no utilizar chaperonas, la mayoría de las proteínas se pliegan a la estructura nativa espontáneamente, seleccionándose evolutivamente la presencia de los determinantes estructurales en las regiones N-terminales de la secuencia de aminoácidos.

Volviendo a las distintas posibilidades que tiene una proteína para plegarse vamos a integrar lo visto junto con las vías de degradación. Una proteína recién sintetizada pasa a un estado de plegamiento parcial del que puede derivar en una proteína con estructura nativa, paso facilita- do por las chaperonas con una importancia relativa de 180, o puede formar estructuras mal plegadas o “misfolded” y agregados protéicos.

mal plegadas o “misfolded” y agregados protéicos. Tal y como se muestra en la imagen, l

Tal y como se muestra en la imagen, la importancia relativa de la degrada- ción de proteínas vía ubiquitina-proteosoma es de 600, unas 20 veces mayor que la degrada- ción de agregados vía autofágia que tiene una importancia relativa de

30.

Si una célula tiene problemas para conseguir ATP, ¿se acorta la vida celular?

Puesto que la célula tiene dañada la función mitocondrial y depende de un aporte conti- nuo de ATP la célula va a sufrir, y uno de los problemas se localizará en la falta de chape- ronas, lo que provocará un acortamiento de la vida.

Finalmente, en cuanto a la regulación de la expresión de las chaperonas, tenemos que consi- derar que su actividad no siempre tiene por qué ser beneficiosa. Un ejemplo de ello es la regulación de HSP70 y HSP90 por parte del factor HSF-1 (Factor de transcripción de chapero- nas 1) en el estudio del Parkinson.

El Parkinson se caracteriza por la presencia de estructuras anómalas de α-sinucleina que van desde oligomeros solulbes hasta largos agregados denominados cuerpos de Lewy que apare- cen por la polimerización de fibrillas insolubles.

apare- cen por la polimerización de fibrillas insolubles. Las chaperonas están muy implicadas en el correcto

Las chaperonas están muy implicadas en el correcto plegamiento de estas proteínas, pero HSP90 parece promover la formación y el crecimiento de las fibrillas y agregados, mientras que HSP70 estabiliza las formas monoméricas, inhibiendo la oligomerización.

Cuando la célula detecta un aumento en la cantidad de proteínas mal plegadas o neurotoxinas entonces se promueve la actividad de HSP70 y su síntesis a través de la modulación positiva de

HSF-1.

La rotenona y el amital son dos toxinas capaces de inhibir el transporte electrónico en la cadena respiratoria mitocondrial provocando un descenso en la producción de ATP que afecta gravemente al sistema nervioso. Esto se debe a que la neurona necesita el ATP para repolarizar la membrana a expensas de la bomba Na/K

Pero HSP90 actúa como un secuestrador de HSF-1, evitando la producción de HSP70, por lo que parece que promueve la formación de los cuerpos de Lewis.

Por casos como este, la relación entre las distintas chaperonas está siendo objeto de profunda investigación ya que, por ejemplo, el mantenimiento de la vida útil de p53, el guardián del genoa, mediante una chaperona específica alargaría la vida.

6 Cambios post-traduccionales (CPT)

Los cambios post-traduccionales afectan a la mayoría de las proteínas, sino a todas. Actual- mente se conocen más de 200 clases de CPTs clasificados reversibles e irreversibles.

El 5% del genoma humano (1200 genes) está dedicado a codificar proteínas implicadas en CPTs

y hay que considerar que esto no hace referencia 1200 genes, ya que si consideramos la posi-

bilidad de la maduración alternativa podríamos estar hablando de unas 5000 proteínas dife- rentes, lo que nos indica que estos cambios tienen una importancia trascendental para que la proteína cumpla su función. Actualmente se han identificado 250 genes (1000 proteínas) de-

dicadas a la glicosilación.

Una misma proteína puede sufrir varios CPTs diferentes y una proteína encargada de realizar los CPTs puede actuar sobre muchos sustratos.

6.1 Cambios post-traduccionales reversibles

Los cambios post-traduccionales reversibles son aquellos que modifican la estructura tridimen- sional de las proteínas modulando su actividad. Entre ellos destacan la fosforila- dión/defosforilación, acetilación/desacetilación, metilación/desmetilación, oxida- ción/reducción y adición de ubiquitina. Se trata de modificaciones por enlaces covalentes.

En este ámbito profundizaremos en la fosforilación/defosforilación y en las modificaciones de las colas N-terminales de las histonas.

6.1.1 Fosforilación/defosforilación

El grado de fosforilación de las proteínas está mediado por quinasas y fosfatasas que regulan el

fosfoproteoma, que hace referencia al espectro de proteínas con fosfato que hay en un tipo

celular en cada momento en función de la circunstancia fisiológica.

En el genoma humano se han anotado genes para más de 500 protein quinasas (PKs) y más de 150 protein fosfatasas (PPs). El motivo por el que hay menos PPs es porque estas actúan a través de proteínas adaptadoras que amplían el rango de sustratos sobre los que pueden ac- tuar. Se cree que estas proteínas actúan sobre más de un tercio del proteoma humano, es decir, sobre unas 30.000-40.000 proteínas distintas, ya que, por ejemplo la proteín quinasa A (PKA) es capaz de fosforilar a más de 100 proteínas diferentes.

Existen dos tipos fundamentales de quinasas y sus fosfatasas con proteínas adaptadoras al- ternativas.

- Las Serín/Treonin (S/T) quinasas/fosfatasas que actúan sobre residuos de serina y treonina como PKA, PKC, Calcio calmodulina quinasa (CCK)

- Las Tirosin (Y) quinasas/fosfatasas que actúan sobre residuos de tirosina como el re- ceptor de insulina y Abl. Pueden ser solubles o estar asociadas a la membrana. Todos los receptores de factores de crecimiento desarrollan esta actividad.

En cuanto a los sustratos de las PKs tenemos que considerar el ATP-Mg y las proteínas sobre las que actúan.

El Mg es un catión divalente que interacciona con las cargas negativas de la molécula de ATP dando lugar a una geometría que le permite acceder al sitio activo de la quinasa.

Quinasas y fosfatasas regulan casi todos (si no todos) los procesos celulares a través de pun- tos clave en el metabolismo, la transcripción, la traducción, el ciclo celular, la estabilidad de proteínas, el movimiento celular, la apoptosis, exocitosis regulada, la dinámica del citoesquele- to, la contracción muscular, la acción hormonal, la transducción de señales, etc.

Patologías asociadas con la pérdida o ganancia de función de quinasas/fosfatasas Existen muchas patologías asociadas a los fallos relacionados con estas enzimas clave para las células.

- La diabetes de tipo 2 está producida por un fallo en la cascada de quinasas mediada por insulina.

- Las mutaciones en los genes para las proteínas SrC (oncogen), Abl (oncogen), fos- foinositol-3 quinasa (PI3K, cataliza el paso de fosfatidil inositol-4,5-bifosfato a fosfatidil inositol-3,4,5-trifosfato) y factor activado por Ras (Raf), producen cáncer.

La quinasa Abl es una proteína oncogénica con actividad tirosina quinasa (Y-quinasa) que presenta en su estructura 1 serina, 1 treonina y 9 tirosinas, capaces de ser fosforiladas dando lugar a unas 2000 variantes. La hiperfosforilación de la quinasa Abl provoca leucemia mieloi- de crónica cuyo tratamiento actual consiste en la utilización de inhibidores como el Imatinib.

- Procesos inflamatorios, como artritis y asma, se producen por la activación defectuosa de algunas PKs, como JAK, JNK e IKK.

- La hiperfosforilación de tau en Alzheimer y Parkinson.

La proteína tau (τ) está asociada a la regulación de la polimerización de la tubilina y presenta unos 40 sitios de fosforilación en su cadena polipeptídica. La hiperfosforilación de esta proteína está relacionada con las enfermedades mencionadas porque se impide su estabilización de los microtúbulos e interrumpe el transporte vesicular. Además comienza a formar placas amiloides.

- Anomalías en alguna de un total de 30 quinasas pueden llevar a la hipertensión.

Concepto de secuencia consenso o secuon Si analizamos la secuencia fosforilada por la PKA en las proteínas a las que regula observamos que siempre son fosforiladas en un residuo de serina o de treonina. Pero en una proteína de unos 70 kDa con una media de 700 aminoácidos puede haber muchos residuos de serina o treonina.

Por ello la actividad S/T quinasa de PKA y de cualquier quinasa/fosfatasa no se va a realizar por la mera presencia del resto diana, sino porque este se encuentra situado en un entorno tal, que la proteína ejecutora pueda reconocer un punto de actuación. Estos entornos no son más que secuencias de aminoácidos concretas que están expuestas u orientadas de tal manera que el resto a fosforilar pueda ser reconocido.

Estas secuencias de aminoácidos se conocen como secuencias consenso o secuon, y en el caso de que en el caso de PKA es

xR[RK]x[ST]B

Donde el aminoácido fosforilado es la serina (S), menos frecuente treonina (T), seguidas de un resto hidrofóbico y precedidas por cualquier aminoácido (x), una lisina (K) o arginina (R), una arginina y cualquier aminoácido (x).

o arginina (R), una arginina y cualquier aminoácido (x). Ejemplos de regulación por fosforilación: Cascada de

Ejemplos de regulación por fosforilación: Cascada de adrenalina en hepatocito Un ejemplo típico de regulación por fosforilación es la cascada de amplificación de la señal que produce la adrenalina al interaccionar con su receptor β 1 -adrenérgico en el hepatocito y que desencadena la movilización de glucosa al activar la glucogenolisis.

La unión de una hormona a su receptor es probabilística, es decir, cada vez que la molécula toca el receptor se activa, pero cuanto mayor sea la concentración de hormona, más toques de producirán. Este concepto es muy importante ya que las uniones nunca serán de carácter covalentes.

Esta cascada comienza con un aumento de la concentración de adrenalina en las inmediacio- nes del hepatocito que provoca la interacción (choques) entre la hormona y el receptor. Estos choques provocan un cambio conformacional que permite la interacción con la proteína G que desencadena la liberación de la subunidad G sα .

La subunidad G sα es a su vez una activadora de la adenliato ciclasa (AC) con la que interacciona para producir unas 20 moléculas de AMPc, y son necesa- rias dos de estas para pasar a PKA a un estado activo.

La PKA ahora fosforila a la fosforilasa b kinasa acti- vándola y esta a su vez a la glucógeno fosforilasa a activándola para permitir la degradación del glucó- geno a glucosa-1-fosfato que será liberada como glucosa a la sangre.

La cascada de amplificación ha posibilitado que por cada molécula de adrenalina se liberen hasta 10.000 moléculas de glucosa a la sangre. Pero además, al mismo tiempo se ha fosforilado la glucógeno sinteta- sa inactivándola y las fosfatasas son inhibidas por las proteínas inhibidoras de fosfatasa, consiguiéndose una para de la glucogenosíntesis.

consiguiéndose una para de la glucogenosíntesis. Ejemplos de regulación por fosforilación: Cascada de

Ejemplos de regulación por fosforilación: Cascada de insulina en hepatocito Los modelos de difracción de rayos X del dominio con actividad quinasa del receptor de insulina (IRK) muestran dos conformaciones diferentes. Este re- ceptor es un dímero en sí mismo, (no dimeriza tras la activación) que pivota entre una conformación acti- va e inactiva.

que pivota entre una conformación acti- va e inactiva. En estado inactivo el receptor de insulina

En estado inactivo el receptor de insulina presenta una estructura compacta con un dominio pseudosutrato en el centro activo que ocluye el sitio catalítico. Cuando la insulina choca con el receptor este sufre un cambio conformacional que libera el centro activo de la subunidad y desarrolla una actividad tirosina quinasa (Y-quinasa), en primer lugar sobre la otra subunidad (fosforilación cruzada) y posteriormente con los sus- tratos con tirosina de la proteína.

Una de las primeras proteínas fosforiladas por el receptor de insulina es la proteína sustrato del receptor de insulina 1 (IRS-1) en una tirosina. Ahora IRS-1-P es reconocida por la fosfatidil inositol 3 kinasa (PI3K) unida a la membrana, estimulando su actividad para fosforilar fosfatidil inositol-4,5-bifosfato (PIP 2 ) a fosfatidil inositol-3,4,5-trifosfato (PIP 3 ).

El PIP 3 es un fosfolípido de membrana que al tener los tres fosfatos se carga mucho y es reconocido por la quinasa dependiente de fosfoinositol 1 (PDK-1), que al anclarse a

tres fosfatos se carga mucho y es reconocido por la quinasa dependiente de fosfoinositol 1 (PDK-1),

la membrana es reconocida por la protein quinasa B (PKB).

La PKB es una también es una S/T quinasa que es capaz de fosforilar a la glucógeno sintetasa quinasa 3 (GSK3), pasándola a un estado inactivo. Esto permite la desfosforilación de la gluco- geno sintasa a través de la protein fosfatasa 1 (PP1, presente en todos los tejidos).

Integración de la señal de adrenalina e insulina en hepatocitos El hecho de que en un momento determinado se active o inhiba la glucogenosíntesis y la glu- cogenolisis, va a depender de la cantidad de interacciones positivas o negativas que reciba el conjunto de receptores.

Los hepatocitos presentan receptores de adrenalina e insulina en grandes cantidades, pero va

a ser el número de interacciones de es-

tos con su sustrato (que depende de su

concentración exterior de hormonas) lo que determine que vía predomina.

exterior de hormonas) lo que determine que vía predomina. Si observamos al conjunto de proteínas descritas

Si observamos al conjunto de proteínas descritas sobre el gránulo de glucógeno, vemos que todas están asociadas y mo-

duladas por quinasas sensibles a insulina

o adrenalina según los mecanismos des- critos.

Papel de la insulina como factor de crecimiento y proteínas G Hemos visto la actuación de la insulina como hormona reguladora de los niveles de glucosa en sangre, pero esta es además un factor de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas, la somatostatina, el factor de crecimiento epidermal, etc.

En cualquier caso, el término factor de crecimiento puede hacer referencia tanto al crecimien- to de la propia célula, como al de la masa de células en sí, por lo que algunos denominan a estos últimos factores mitóticos o factores de proliferación.

Al igual que en los apartados anteriores, la acción de la insulina como factor de crecimiento comienza con la activación de la actividad Y-quinasa del receptor que sufre una fosforilación cruzada en los restos de tirosina de sus extremos carbo- xilo terminales.

Al igual que en el caso anterior, el IRS-1 reconoce estos fosfatos y es fosforilado en varios de sus residuos de tirosina. Ahora a diferencia de en el caso anterior

o al mismo tiempo, los residuos de fosfa- to van a poder ser reconocidos por la proteína de unión a Grb2 (Growth factor

mismo tiempo, los residuos de fosfa- to van a poder ser reconocidos por la proteína de

17

receptor-bound protein 2), que cambia de conformación y se une a la proteína Sos (Son of Se- venless).

La unión de la proteína Sos a Grb2 la capacita para actuar como un intercambiador de GDP por GTP en Ras unida a la membrana. La proteína Ras-GTP es reconocida por el factor activado por Ras 1 (Raf-1) y este fosforila a MEK (Mitogen-activated protein kinase kinase) que pasa a fosforilar a la quinasa regulada por señales externas (ERK).

La ERK fosforilada tiene la capacidad de trasladarse al núcleo porque su fosforilación libera la señal de localización nuclear que activa el sistema carioferinas (transportadores del poro nu- clear), y allí comienza la fosforilación de los factores de transcripción diana que se unirán a su secuencia de reconocimiento activando o inhibiendo la expresión de un gen.

La importancia de las proteínas G radica en su actividad como intercambiadoras de nucleóti- dos de guanina. Estas son diferenciadas en dos clases:

- Las proteínas G monoméricas como:

o

Ras que es una proteína de la cara citoplasmática de la membrana plasmática y actúa como “pivote” de la transducción de señales al núcleo.

o

Rho que está implicada en la dinámica del citoesqueleto.

o

Ran que participa en el ciclo de transporte de proteínas citosol-nucleo.

- Las proteínas G triméricas como:

o

G s(α,β,γ) estimuladoras del sistema adenliato ciclasa

o

G i(α,β,γ) Inhibidoras de la adenilato ciclasa.

Las mutaciones en proteínas como Ras que provocan la pérdida de su actividad GTPasa dan lugar a una activación constante que desregula completamente la expresión de proteínas desembocando en un cáncer.

6.1.2 Modificación de los dominios N-terminales de las histonas Las histonas son unas proteínas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol que entran al núcleo para estabilizar a la fibra de DNA polimerizándose en octámeros. Estas proteínas pre- sentan a pH fisiológico una gran abundancia de cargas positivas en sus extremos N-terminales, situándose su punto isoeléc- trico a un pH superior a 10. Aminoácidos tales como la lisina (K) o la arginina (R) proporcionan estas cargas que son idóneas para estabi- lizar a la hebra de DNA, car- gada negativamente por sus enlaces fosfodiéster a pH fisiológico.

por sus enlaces fosfodiéster a pH fisiológico. Uno de los puntos de regulación de la compactación

Uno de los puntos de regulación de la compactación de la cromatina van a ser las modificacio- nes covalentes reversibles sobre las colas N-terminales de las histonas, tales como la acetila- ción, metilación y fosforilación.

La acetilación de histonas conlleva una neutralización de carga positiva mediante la adi- ción de un grupo acetilo (acetato), donado por el Acetil-CoA procedente de la mitocondria a través de la lanzadera de Citrato.

Cuando hay abundancia de Acetil-CoA la histona acetil transferasa (HAT) incorpora un res- to de acetato al grupo ε-amino de la lisina y permitiendo la expresión de ciertos genes aso- ciados a un estado de energía disponible.

Cuando los niveles de energía disminuyen, la histona desacetilasa (HDAC) puede realizar la reacción contraria liberando el resto acetilo y condensándose de nuevo la cromatina.

(HDAC) puede realizar la reacción contraria liberando el resto acetilo y condensándose de nuevo la cromatina.

La cola de una histona es susceptible de sufrir muchas modificaciones diferentes al mismo tiempo y además un mismo aminoácido puede sufrir varias diferentes. En la imagen se repre- sentan las diferentes modificaciones que pue- den sufrir diferentes aminoácidos de una histo- na en lisinas y argininas (ac = acetilación, me = metilación, PS = fosforilación y u = ubiquitiniza- ción).

Esto establece un código de modificaciones de histonas que van a variar para expresar o silen- ciar una determinada región génica o van a facilitar la reparación del DNA. Pero el signifi- cado de este código todavía no se ha estableci- do.

cado de este código todavía no se ha estableci- do. Estas modificaciones responden al hecho de

Estas modificaciones responden al hecho de que en función de los restos presentes en un determinado aminoácido y de su entorno, una proteína podrá o no reconocer la secuencia, favoreciendo o impidiendo la expresión. Por ejemplo, la el factor de transcripción BPTF es ca- paz de reconocer lisinas acetiladas o metiladas en la cola N-terminal de la histona H3, pero en esta puede haber muchas lisinas con esta modificación, por lo que lo que reconoce la proteína es una secuencia que presenta la lisina modificada, no solo el resto.

El paso de la estructura compacta (heterocromatina) o abierta (eucromatina) depende de la acción conjunta

El paso de la estructura compacta (heterocromatina) o abierta (eucromatina) depende de la acción conjunta de proteínas que “escriben” sobre las histonas, las que “leen” la información y las que “borran” los cambios. La acción cooperativa de estas proteínas decide cuándo de- ben expresarse o silenciarse genes y por cuánto tiempo. También regulan los mecanismos de reparación del DNA.

6.1.3 Otras modificaciones covalentes reversibles Otras modificaciones covalentes reversibles son:

- Incorporación de ácido adenílico (AMP) en glutamina sintetasa de E. coli por adenilil- transferasa, una actividad regulada a su vez por uridil-transferasa.

- Adición de metilo (SAM) en restos de ácido glutámico de receptores que regulan la quimiotaxis bacteriana.

- Adición de ubiquitina a histonas y otras proteínas de manera reversible (histonas) me- diante unos pocos restos, o de manera irreversibles (degradación proteica).

- Incorporación de ADP-ribosa en histonas, factor de elongación EF2, subunidades αs yαi de las proteínas Gs y Gi del sistema adenilatociclasa (reversible o irreversible).

6.2 Cambios post-traduccionales irreversibles

Entre los cambios post-traduccionales más importantes son:

- Adición de restos hidrofóbicos.

- Glicosilación

- Proteólisis

6.2.1 Adición de restos hidrofóbicos La observación de la membrana plasmática revela la existencia de dos localizaciones proteicas de diferente origen.

Las proteínas situadas en la cara citosólica de la membrana plas- mática presentan restos de áci- dos grasos (palmítico, mirístico, farnesilo o geranil-geranilo) hi- drofóbicos, mientras que las proteínas situadas hacia el espa- cio extracelular (ectoproteínas) presentan glicosil fosfatidil inosi- tol (GPI) en su extremo C- terminal.

fosfatidil inosi- tol (GPI) en su extremo C- terminal. Las ectoproteínas van a ser sintetizadas en

Las ectoproteínas van a ser sintetizadas en ribosomas asociados al retículo endoplasmático donde incorporarán a la fosfoetanolamina C- terminal varios residuos de un oligosacáridos de manosa y N-acetil-glucosamina. A continuación el conjunto proteína-oligosacárido es unido al fosfatidilinositol (fosfolípido) que porta un par de diacilglicerol insertos en la membrana, formando el puente de GPI. La proteína anclada ahora viaja por las cisternas intracelulares hasta ser incorpo- rada a la membrana por exocitosis.

hasta ser incorpo- rada a la membrana por exocitosis. La molécula de inositol es un alcohol

La molécula de inositol es un alcohol que no debe de ser confundido con un glúcido, a pesar de que su estructura cíclica recuerde a estos. Nótese que a diferencia de los glúci- dos, el inositol no presenta una molécula de oxígeno en el ciclo.

En cuando a las proteínas que quedan mirando hacia el interior celular, estas se sintetizan en ribosomas libres en el citosol donde son modificados por la presencia de secuencias de reco- nocimiento para transferasas específicas y según el resto hidrofógico que incorporen las vamos a diferenciar en tres clases:

- Las proteínas que incorporan el ácido palmítico (16C) en una cisteína (C) o serina (S), siempre interna en la cadena de aminoácidos.

- Las proteínas que incorporan el ácido mirístico (14C) en una glicina (G) N-terminal.

- Las proteínas que incorporan restos de poliisopreno como Farnesil (15C) o geranil- geranilo (20C) en cisteínas (C) C-terminales que posteriormente pueden incorporar un resto metilo.

La adición de los restos hidrofóbicos aporta un carácter anficílico a la proteína que la desplaza hasta la membrana más cercana desde donde se desplazará hasta su localización definitiva.

La adición de restos hidrofógicos como cambio post-traduccional irreversible es un proceso que en humanos afecta a más de 700 proteínas entre las que 500 incorporan poliisoprenos, 100 incorporan ácido palmítico y otras 100 ácido mirístico. En el género Tripanosoma se han identificado más de 100 proteínas unas a la membrana a través de puentes GPI.

Δ 3 -Isopentenil pirofosfato y la síntesis de poliisoprenos El Δ 3 -Isopentenil pirofosfato (5C) es la molécula precursora de toda la familia de los isoprenos presentes en gran cantidad de proteínas celulares. Además es el precursor de muchas molécu- las como el dolicol (relacionado con la N-glicosilación) que acepta los azúcares que serán trans- feridos a las proteínas.

El dolicol es una molécula anfipática con un resto alcohol que puede mirar hacia el interior o el exterior del retículo endoplasmático gracias a los movimientos de flip-flop. Cuando el dolicol es cargado en la cara citosólica con la N-acetil-glucosamina y la manosa, se interna- liza para glicosolar proteínas.

es cargado en la cara citosólica con la N-acetil-glucosamina y la manosa, se interna- liza para

En el citosol encontramos un equilibrio entre los isómeros de dimetilalil pirofosfato y Δ 3 - Isopentenil pirofosfato, condensados por la preniltransferasa (cabeza-cola) para dar lugar al geranil pirofosfato (10C).

La condensación del ge- ranil pirofosfato con una nueva molécula de Δ 3 - Isopentenil pirofosfato da lugar al farnesil piro- fosfato (15C) o la con- densación de dos molé- culas de geranil pirofos- fato (cabeza-cabeza) da lugar al geranil-geranilo.

(15C) o la con- densación de dos molé- culas de geranil pirofos- fato (cabeza-cabeza) da lugar

Adición de restos hidrofóbicos a proteínas G sintetizadas en ribosomas libres Las proteínas G monoméricas (Ras, Ran y Rho) son sintetizadas en ribosomas libres y poste- riormente son modificadas para anclarse a la cara citosólica de las membranas internas en las que desarrollarán su actividad.

Las proteínas Ras y Rho son sintetizadas con la secuencia CAAX 4 en su extremo C-terminal, que es reconocida por la farnetil o geranil-geranilo transferasa para producir la adición del resto hidrofóbico en la cisteína (1, prenilación).

La adición del farnesilo o del geranil-geranilo provoca su anclaje en la cara citosólica del retícu-

lo endoplasmático, donde se le retiran parte de los aminoácidos de la secuencia C-terminal

(2) quedando la cisteína (C) unida al resto hidrofóbico.

(2) quedando la cisteína (C) unida al resto hidrofóbico. A continuación se produce una carboximetilación (3)

A continuación se produce una carboximetilación (3) en la cisteína (C) donde la S-Adenosil

metionina (SAM) actúa como donador de grupos metilo y ahora en función de la proteína (y de

la variante concreta) seguirá un camino u otro:

- Si la proteína de partida era de la familia Rho, la adición del poliisopreno le impide sa- lir al citosol libremente, por lo que la chaperona GDI (GDP-dissociation inhibitor) la carga (4a) y la desplaza hasta la cara citosólica de la membrana plasmática donde par- ticipara en la reorganización del citoesqueleto.

- Si la proteína de partida era de la familia Ras, se abren dos posibilidad en función de la variante.

4 Cisteína, alanina, alanina y cualquier aminoácido.

o

Las proteínas K-Ras4A, N-Ras y K-Ras 5 viajan en vesículas al Golgi (4b) donde la palmitoiltransferasa añade un residuo de palmítico (5, palmitolación) y va en vesículas a la cara citosólica de la membrana plasmática. Pero aquí se estable- ce una dinámica donde la pérdida del residuo de palmítico (6, despalmitola- ción) la devuelve al Golgi para ser palmitolada nuevamente.

o

Las proteínas K-Ras4B se desplazan directamente del retículo endoplasmático hasta la cara citosólica de la membrana plasmática gracias a interacciones ió- nicas de sus cargas positivas con las cabezas polares de los fosfolípidos, carga- dos negativamente.

Raft lipídico A diferencia de lo que se pensaba años atrás, la membrana plasmática no presenta una com- posición homogénea de lípidos y proteínas. En ella encontramos los raft lipídicos o balsas lipí- dicas que son dominios de membrana muy estructurados.

Los raft lipídicos son dominios muy ricos en colesterol y esfigolípidos, es decir, moléculas an- fipáticas que se organizan de manera muy compacta gracias a que no presen- tan insaturaciones. Estos dominios son pobres en fosfolípidos. En función de la presencia o no de ca- veolina, se van a diferen- ciar dos tipos de raft:

no de ca- veolina, se van a diferen- ciar dos tipos de raft: - Los raft

- Los raft caveolares son aquellos cuya proteína estructural es la caveolina.

- Los raft no caveolares son aquellos cuya proteína estructural no es la caveolina, como por ejemplo la flotilina.

- Además existen otros raft que no presentan proteína estructural pero contienen mu- cho colesterol entre las cadenas de esfigolípidos saturados.

Las proteínas de membrana solo alcanzan su funcionalidad en el entorno lipídico adecuado, de la misma manera que el lípido al que se unen solo alcanza sus propiedades termodinámicas y termotrópicas en su entorno adecuado. Por ello la relación lípido-proteína es indisoluble.

Por alguna razón ciertos grupos de proteínas solo se dirigen a los raft lipídicos como las unidas a través de GPI.

El mensajero m de la acetilcolinesterasa (AChE) produce una proteína que incorpora GPI y se sitúa en la cara externa de los rafts lipídicos, junto a los receptores muscarínicos.

La existencia de los tres mensajeros (m, h y t) se justifica por la necesidad de llevar a la enzima a diferentes espacios.

5 Las variantes K-Ras presentan cuatro residuos de lisina (K) en el extremo C-terminal cargados positiva- mente a pH fisiológico.

Los raft lipídicos son dominios dinámicos que se unen y separan constantemente por lo que solo cuando interaccionen un dominio con, por ejemplo, el receptor de adrenalina y otro con la proteína G, se producirá la señal.

6.2.2 Glicosilación

La

glicosilación y la O-glicosilación.

glicosilación

de

proteínas

como

cambios

post-traduccionales

irreversibles

son

la

N-

La N-glicosilación se produce en el retículo endoplasmático donde los restos son incorporados a asparaginas (N) o glutaminas (Q) internas en un único oligosacárido.

La O-glicosilación puede tener lugar tanto en el retículo como en el citosol y consiste en la introducción de monosacáridos en los restos de serina (S) y/o treonina (T), uno por uno a tra- vés de interacciones con los grupos hidroxilos.

6.2.3 Cambios por proteólisis limitada

Los cambios post-traduccionales asociados a la proteólisis hacen referencia a la degradación

selectiva de parte de la cadena de aminoácidos con el fin de permitir que esta adquiera su estructura tridimensional final o pueda desarrollar su actividad catalítica.

El gran ejemplo es la activación de zimógenos, como el pepsinogeno a pepsina, los factores de coagulación de la sangre, del complemento, apoptosis (Caspasas), proinsulina y otras hormo- nas polipeptídicas, como las del hipotálamo e hipófisis, encefalinas, endorfinas, neuropéptidos, etc.

También se incluyen aquí los cortes de péptidos de destino a orgánulos como aquellas que entran al retículo y cuya secuencia hidrofóbica inicial es cortada, o las señales de tránsito a los orgánulos energéticos y el peroxisoma.

6.2.4 Otros cambios post-traduccionales irreversibles

Otros cambios irreversibles que afectan a las pueden ser:

- La conversión de formilmetionina en metionina es un proceso típico en procariotas donde el inicio de la traducción siempre comienza con este aminoácido. De la misma manera, en eucariotas todas las proteínas comienzan por metioinina, pero luego no la portan en su secuencia por lo que este resto es retirado en muchos péptidos.

- La adición de grupos prostéticos (hemo, biotina,…) y metales (Cu, Zn, Mn,…) en las pro- teínas permite que estas puedan realizar su actividad catalítica.

- La hidroxilación de residuos, como la prolina y la lisina en el colágeno aporta resisten- cia a la fibra.

- La adición de carboxilato (-COO) en la posición γ de restos de glutamato de la pro- trombina da lugar a un nuevo aminoácido (no proteogénico). Esto aporta dos cargas negativas importantes en la formación de complejos con calcio que inmovilizan a la proteína en los sitios con heridas para que se convierta en trombina y el tripsinogeno en tripsina, provocando la coagulación de la sangre.

En la reacción de coagulación interviene la vitamina K 1 y K 2 que presenta colas isopréticas. La enzima clave es la carboxilasa que se ve fuertemente inhibida por la warfarina (también un rodenticida).

En medicina este inhibidor se utiliza en personas que han sufrido una angina de pecho o infar- to de miocardio para evitar la formación de trombos. Análogamente se ha utilizado el sintrom, un medicamento que en bajas dosis no realiza su efecto, pero que en dosis altas es muy perju- dicial. Es muy complicado ajustar la dosis.

Tema 2: Trafico citosol-núcleo y citosol-mitocondria

El tráfico entre el citosol y los distintos orgánulos subcelulares hace referencia al tránsito de vesículas o proteínas generadas por los ribosomas libres del citosol y que luego van a ser tras- ladados hasta sus sitios funcionales ya sea el núcleo, los orgánulos energéticos o el peroxiso- ma.

1. Tráfico citosol-núcleo

El núcleo es el destino de numerosas proteínas sintetizadas en los ribosomas libres del citosol, como es el caso de las proteínas histónicas, no histónicas, los componentes de la cromatina, enzimas como las RNA-polimerasas y DNA-polimerasas, factores de transcripción… Todas ellas presentan en común un dominio de aminoácidos conocido como secuencia de localización nuclear (NLS, Nuclear localization sequence). La NLS es una secuencia de pequeño tamaño (≈20 aminoácidos) que puede presentar dos tipos de epítopo reconocido por las proteínas de transporte:

- Un epítopo secuencial es aquel reconocido como secuencia de aminoácidos lineal. Es- te tipo de secuencias son reconocidas por los anticuerpos cuando la proteína está des- naturalizada o plegada de manera que se muestre completamente.

- Un epítopo conformacional es aquel que puede ser reconocido al plegarse la secuen- cia y por lo tanto no tiene porqué ser lineal, los diferentes aminoácidos pueden estar repartidos por el péptido y reunirse con el plegamiento para permitir el reconocimien- to. Este tipo de epítopos no puede ser reconocido por los anticuerpos cuando la pro- teína está desnaturalizada, ya que esté es reconocido como un motivo tridimensional.

Estas secuencias son muy ricas en ciertos aminoácidos como la lisina (K) y arginina (R), que según el tipo de epítopo se presentaran continuas o discontinuas, y en muchas ocasiones esta- rán ocultas hasta la llegada de una señal extracelular que modifique el factor de transcripción para que muestre la NLS.

Podemos ver varios ejemplos de secuencias NLS clásicas, no clásicas e incluso algunas especia- les de epítopo conformacional. Tal y como se observa en la secuencia M9, no siempre es tan fácil distinguir la señal de localización nuclear. Las señales se pueden localizar en cualquier punto de la proteína excepto en los extremos, ya que, la importina precisa de un cierto apoyo para transportar a la proteína, por ello generalmente las encontraremos internas en la secuen- cia de aminoácidos.

para transportar a la proteína, por ello generalmente las encontraremos internas en la secuen- cia de
para transportar a la proteína, por ello generalmente las encontraremos internas en la secuen- cia de
para transportar a la proteína, por ello generalmente las encontraremos internas en la secuen- cia de

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La existencia de estos dos tipos de NLS nos permite inferir que no es una condición estricta que la proteína se encuentre desplegada para ingresar al núcleo, como ocurre en la mitocon- dria. Además, como veremos posteriormente, esta secuencia se puede situar en cualquier punto de la cadena de aminoácidos, ya que no será cortada al llegar a su lugar de acción por la dinámica nuclear durante la mitosis celular.

Hoy sabemos que el tránsito de proteínas entre el citosol y el núcleo es bidireccional, es de- cir, ciertas proteínas ingresan y salen del núcleo en respuesta a factores hormonales gracias a la presencia de otra señal denominada señal de exportación nuclear (NES, Nuclear export sig- nal) que las proteínas pueden mostrar alternativamente según las condiciones celulares.

Para poder realizar este transporte la célula cuenta con una compleja batería de proteínas denominadas genéricamente como carioferinas (importinas, exportinas, Ran…) capaces de realizar el transporte a través del poro nuclear.

Las complejas interacciones que se producen entre las carioferinas, así como la gran cantidad de interrogantes planteados sobre el proceso ha llevado al desarrollo de hasta 6 hipótesis so- bre el transporte de proteínas entre el citosol y el núcleo.

Un hecho muy importante es que las proteínas de localización nuclear siempre van a mante- ner su secuencia de importación/exportación, a diferencia de lo que ocurre para las proteínas de localización mitocondrial o del retículo endoplasmático. Esto se debe a que durante la mito- sis se produce la desorganización de la membrana nuclear, liberándose todo el contenido al citosol. La conservación de la secuencia, permite el posterior regreso de las proteínas al núcleo tras la reorganización en las células hijas.

1.1. El poro nuclear

El poro nuclear es el complejo proteico que permite el tránsito a través de la membrana nu- clear. Su luz debe de ser lo suficientemente gran- de como para permitir el paso de polinucleótidos acompañados de proteínas y las heteronucleo- proteínas, así como las partículas preribosomales.

proteínas, así como las partículas preribosomales. El poro nuclear permite el paso libre de sustancias como

El poro nuclear permite el paso libre de sustancias como el agua, los iones y proteínas meno- res de 20 kDa a favor de gradiente de concentración. Para las proteínas que tienen un tamaño de 40-50 kDa también hay un cierto tránsito, pero se imponen resistencias a la difusión, y para proteínas de 60-70 kDa el poro es totalmente selectivo permitiendo el paso solo a través de la acción de las carioferinas que reconocen las NLS.

Las partículas preribosomales presentan del orden de megadaltones, por lo que las proteínas generadas en el núcleo van a precisar del acoplamiento con exportinas para salir al citosol. Existen muchas enfermedades derivadas del mal funcionamiento de los transportadores de determinadas proteínas nucleares.

Al núcleo pasan proteínas como las ribonucleoproteinas nucleares heterogéneas (hnRNPs), al citosol salen las partículas pre-ribosomales y los pre-mRNAs, en conjunto a una velocidad de

1500 proteínas por segundo y poro. Todo gracias a la presencia de NLS/NES y la ayuda de más de 20 carioferinas (importinas, exportinas y transportinas) con sitios de unión a dominios FG.

El número de poros nucleares en las células eucariotas ronda las 3.000 unidades, y hasta don- de se sabe hoy en día, todos están formados por las mismas proteínas. En el poro nuclear es un octámero de nucleoporinas (proteínas que componen el poro) en el que se pueden distin- guir tres partes:

- Un anillo externo situado en la membrana externa del que se proyectan al citosol 8 fi- lamentos.

- Un armazón o anillo central donde inserto entre las dos membranas.

- Un anillo interno situado en la membrana interna del que se proyectan otros 8 fila- mentos unidos en su parte distal formando la cesta nuclear del que penden unos fila- mentos intranucleares cortos.

del que penden unos fila- mentos intranucleares cortos. Las medidas de este poro son de unos

Las medidas de este poro son de unos 200-250 nm de diámetro por unos 80 nm de alto. Pero la luz útil para el paso de proteínas ronda los 20-25 nm considerando que la subunidad mayor del ribosoma tiene unos 18-20 nm.

Una de las características a destacar del poro nuclear es que las nucleoporinas que las compo- nen presentan agrupaciones periódicas de fenilalanina (F) y glicina (G), conocidas como domi- nios FG. Estos dominios actúan como carriles de entrada que permiten que las carioferinas salten de uno a otro mediante cambios de afinidad secuenciales. En la imagen de la izquierda podemos observar la nomenclatu- ra de las nucleoporinas de un octámero y el número de dominios FG que presentan cada una. Es importante considerar que el canal del poro es una vía aromática que proyecta sus aminoácidos hacia la luz, tapizando el poro, y por lo tanto el diámetro es inferior al que se observa y depende de la conforma- ción de los aminoácidos para permitir el paso o no de proteínas en función de la dis- ponibilidad y las condiciones.

en función de la dis- ponibilidad y las condiciones. La unidad recurrente del octámero del poro

La unidad recurrente del octámero del poro parece estar formada por unas 30 nucleoporinas diferentes y que además pueden estar repetidas por lo que la geometría octaédrica nos permi- te considerar que pueden estar repetidas 8, 12, 24 o 32 veces (siempre múltiplos de 8) dando lugar a unas 500-1000 proteínas por poro, que da lugar a un tamaño de unos 112 MDa en ver- tebrados con alrededor de 200 dominios FG.

Como veremos posteriormente, se necesita Ran (GTPasa), porque la dirección del transporte va a depender de Ran-GTP, cuya concentración es muy alta en el núcleo. También participará Ran-GEF como intercambiadora de GDP por GTP en la cromatina y Ran-GAP como activadora de la actividad GTPasa de Ran en el citoplasma.

En esta imagen, por ejemplo, podemos observar como las nucleoporinas penden hacia el cito- sol, y en una ampliación las asociaciones entre las carioferinas, Ran y sus proteínas asociadas. También se pueden observar los dominios FG discontinuos en azul.

se pueden observar los dominios FG discontinuos en azul. 1.2. La lámina nuclear El entorno en

1.2. La lámina nuclear

El entorno en el cual se sitúa el poro nuclear es la lámina nuclear. La proteína estructural que se sitúa bajo la doble membrana nuclear es la lamina (no confundir con laminina de la matriz extracelular) en forma de polímeros a modo de citoesqueleto nuclear a los que se van a anclar los demás componentes formando la denominada lámina nuclear.

demás componentes formando la denominada lámina nuclear . En la membrana nuclear podemos observar la continuidad

En la membrana nuclear podemos observar la continuidad del lumen con el retículo endo- plasmático, en el que muchas proteínas estarán siendo sintetizadas. Además en él se dispone, insertas en las membranas, las proteínas que anclan la lámina nuclear con el citoesqueleto, formando un continuo, como es el caso de la nesprina asociada a la actina. Esto supone que el núcleo se encuentra en una posición específica en la célula.

Las proteínas LAP son proteínas asociadas a la lámina nuclear y a ellas se asocian modificado- res de la cromatina (acetilasas, desacetilasas,…). También podemos observar emerina y algu- nos receptores de membrana.

Si analizamos el gen de la lamina, vemos que por splicing alternativo se da lugar a dos mensa- jeros (prelamina A y lamina C) que presentan una secuencias de localización nuclear y que por lo tanto es traducido por ribosomas libres en el citosol, y posteriormente entra en el núcleo.

libres en el citosol, y posteriormente entra en el núcleo. En cambio la emerina es una

En cambio la emerina es una proteína integral de la membrana nuclear interna, y es sintetizada en ribosomas asociados al retículo, donde se interna en la membrana y difunde hasta llegar a su localización final.

Muchas de las proteínas que yacen en la membrana nuclear van a ser sintetizadas en riboso- mas asociados al retículo y luego se desplazarán por movimientos laterales hasta alcanzar su sitio funcional.

1.3. Tráfico de proteínas a través del poro nuclear

En el transporte de proteínas a través del poro nuclear van a intervenir las proteínas Ran (pro- teína G monomérica con actividad GTPasa) y las carioferinas (importinas, exportinas y trans- portinas) que van a tener sitios de unión a los dominios FG de las nucleoporinas y van a ir sal- tando de uno al siguiente gracias al aporte de energía de la hidrólisis del GTP (asociado a Ran) e indirectamente del ATP (no se conoce su participación pero es necesario para que se pro- duzca el movimiento).

La dirección del transporte depende directamente de Ran-GTP (elevada concentración en el núcleo), cuya cantidad va a depender de la actividad GTPasa intrínseca, regulada por la proteí- na activadora Ran-GAP situada en el citosol. Además la proteína Ran-GEF intercambiará el GDP por GTP al producirse la reentrada de Ran al núcleo. A su vez, estas proteínas van a estar regu- ladas por diferentes cascadas que omitiremos.

La estructura tridimensional de Ran-GDP muestra una geometría muy compacta con tres bu- cles. Pero la conformación de Ran-GTP muestra un gran cambio conformacional donde la adi- ción de las cargas negativas provoca que el bucle C-terminal se despliegue y aleje de la proteí- na al presentar una gran cantidad de aspartato (D), que a pH fisiologíco presenta carga negati- va, lo que permite alojar la proteína a la que se une.

va, lo que permite alojar la proteína a la que se une. Todo esto da lugar

Todo esto da lugar a la existencia de múltiples hipótesis para el transporte de proteínas a tra- vés del poro nuclear.

1.3.1. Modelo de importación a través del poro nuclear La proteína (carga) que tiene que ingresar en el núcleo porta una secuencia NLS que va a ser reconocida por una importina, en este caso dimérica (α-β), que reconoce la secuencia de importación (1) y formará un complejo con la carga para pasar el poro nuclear (2). En este caso la subunidad α presenta una alta afinidad por la NLS, mientras que la subunidad β es la que tiene la capacidad de reconocer los dominios FG de las nucleoporinas.

Una vez en el interior del núcleo, la alta afinidad de la subunidad β por Ran-GTP provoca la disociación de la importina (3) que da lugar a un complejo Ran-GTP-β y a la subunidad α-carga que termina disociándose y liberando la carga dentro del núcleo.

Puesto que la subunidad β es la que interacciona con los dominios FG del poro nuclear, una vez unida a Ran-GTP, vuelve a atravesar el poro hacia el citosol, donde la proteína Ran-GAP activa a Ran provocando la hidrólisis del GTP en GDP y la disociación de la subunidad β (5).

Para que la subunidad α abandone el núcleo es necesario que se una a la proteína CAS y a Ran- GTP (5). Una vez fuera sufrirá la hidrolisis del GTP a GDP y todo el complejo se disociará, que- dando ambas subunidades listas para comenzar el ciclo.

Cerrado el ciclo de las importinas, es ahora Ran-GDP la que tiene que volver al núcleo. Para ello el factor de transporte nuclear 2 (NTF2) se une a Ran-GDP y la introduce a través del poro nuclear (6). Finalmente el intercambio de GDP por GTP realizado por Ran-GEF provoca la diso- ciación de NTF2 y Ran-GTP vuelve a entrar en el ciclo.

Según este modelo la proteína G Ran no es importante para la entrada de proteínas, pero es esencial para la salida de las importinas. Además el gradiente de Ran-GTP contribuye a la sali- da, mientras que el gradiente de Ran-GDP contribuye a la entrada.

Además el gradiente de Ran-GTP contribuye a la sali- da, mientras que el gradiente de Ran-GDP

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1.3.2.

Modelo de exportación a través del poro nuclear

Al igual que en el caso anterior, para la exportación de una proteína desde el núcleo hasta el

citosol será necesaria la participación de Ran-GTP.

El proceso comienza con la formación de un complejo ternario como consecuencia del recono- cimiento de la exportina, la NES de la pro- teína de carga y Ran-GTP. Este complejo ternario atraviesa el poro nuclear a favor de gradiente de concentración de Ran- GTP y su estabilidad se debe a la presen- cia del GTP.

Cuando el complejo llega al citosol la acti- vidad GTPasa de Ran es activada por Ran- GAP, lo que provoca la desestabilización del complejo ternario y la disociación de las unidades.

Ahora la exportina (mostrando la señal NLS) y Ran-GDP entran de nuevo al núcleo de la misma manera que antes.

entran de nuevo al núcleo de la misma manera que antes. 1.3.3. Modelo simplificado de importación/exportación

1.3.3. Modelo simplificado de importación/exportación de proteínas y mRNA

Una simplificación de la importación de proteínas propuesta en los anteriores apartados hace

referencia a la participación de un complejo binario y no ternario.

Según este una proteína con una NLS va a ser reconocida por una importina que la introducirá en el núcleo a través del poro nuclear. Pero no va a ser Ran-GTP quien provoque la desestabili- zación, sino que la propia importina va a ser capaz de unir GTP y liberar la proteína de carga.

Una vez formado el complejo importina-GTP, esta cambia de conformación y sale al citosol, donde Ran-GAP, provoca la actividad GTPasa de la importina y se libera el GDP.

Durante la síntesis del mRNA, estos van siendo reconocidos por multitud de proteínas que van formando un complejo alrededor del mensajero, sustituyéndose unos por otros y permitiendo la posterior salida al citosol donde la proteína Dbp5 permitirá el de ensamblaje de todo el con- junto y la traducción del mRNA por los ribosomas.

donde la proteína Dbp5 permitirá el de ensamblaje de todo el con- junto y la traducción
donde la proteína Dbp5 permitirá el de ensamblaje de todo el con- junto y la traducción

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1.4.

El transporte a través del poro en función del tamaño de la carga

El transporte de proteínas a través del poro nuclear presenta diferentes situaciones en fun- ción del tamaño de la proteína a transportar.

Cuando la carga son proteínas pequeñas, en un mismo poro nuclear se puede estar realizando un transporte bidireccional donde las cargas y las carioferinas van saltando de un dominio FG a otro.

Cuando la carga es de un complejo grande rodeado de carioferinas, esta precisa establecer numerosos contactos con los filamentos de la nucleoporinas para poder avanzar y además el transporte solo puede realizarse en una dirección.

el transporte solo puede realizarse en una dirección. Finalmente, quedan las ribonucleoproteinas muy largas (mRNA
el transporte solo puede realizarse en una dirección. Finalmente, quedan las ribonucleoproteinas muy largas (mRNA

Finalmente, quedan las ribonucleoproteinas muy largas (mRNA + proteínas) envueltas en ca- rioferinas a modo de cuentas de collar que atraviesan el poro gracias a factores accesorios.

collar que atraviesan el poro gracias a factores accesorios. 1.5. Diversidad de carioferinas La existencia de

1.5. Diversidad de carioferinas

La existencia de una increíble variedad de proteínas que entran y salen del núcleo, sin contar con los factores de transcripción podría precisar de una ingente cantidad de proteínas para realizar el transporte. Pero la célula ha desarrollado una estrategia intermedia en la que una serie de importinas y exportinas, junto con proteínas adaptadoras y colaboradoras pueden llevar a cabo el proceso aplicando el principio de redundancia.

Según el principio de redundancia una proteína va a poder ser transportada por distintas im- portinas, de manera que además de no saturarse el sistema, el fallo de una carioferina no va a provocar una deficiencia del sistema.

Además las carioferinas humanas presentan ortólogos en levaduras, por lo que son un sistema bastante conservado.

1.6. Complejos protéicos asociados a la distrofina

Las distrofias musculares son enfermedades generalmente graves cuya base molecular radica en la extraordinaria fragilidad del sarcolema, la membrana celular de las células musculares que está sometida a un fuerte estrés mecánico por los ciclos de tensión relajación.

El sarcolema está fuertemente reforzado en sus dos caras mediante una lámina basal exter- na del músculo, y mediante la red del citoesqueleto en su parte interna, quedando apuntala- da por una gran diversidad de proteínas estructurales.

La matriz extracelular queda anclada al sarcolema a través de la laminina-2 que se une a los péptidoglicanos (distrogli- canos α/β) y estos a los sarco- glicanos (α/β/γ/δ). En la cara interna del sarcolema los pép- tidoglicanos mencionados se unen a la distrofina, desmina y sincoilinas, que anclan el sar- colema al citoesqueleto de la fibra muscular.

anclan el sar- colema al citoesqueleto de la fibra muscular. La deficiencia en cualquiera de los

La deficiencia en cualquiera de los elementos estructurales, ya sea por mutación o por falta de estos, provoca un estado patológico ya que todo el conjunto queda debilitado. Por ello se ha- bla de:

- Enfermedad de Duchenne para la deficiencia en la laminina-2.

- Sarcoglicanopatía si es una deficiencia de sarcoglicanos.

- Distroglicanopatía si es una deficiencia en los distranoglicanos.

Pero además tenemos que considerar las deficiencias en todo el espectro, ya que una mala glicosilación de las proteínas implicadas también dará lugar a un estado patológico.

El fallo de las proteínas provoca un aumento de la permeabilidad del sarcolema que permite la salida de los componentes al plasma sanguíneo, así como la entrada. Uno de los indicadores de lesión muscular más utilizados es la identificación de una alta concentración de creatinina en plasma.

Pero lo más preocupante desde el punto de vista de la célula muscular es la entrada de calcio, ya que los cambios en la concentración de calcio son un mensaje que va a activar a las calpai- nas, las proteasas de la actina y la miosina, destruyendo la masa muscular.

Hoy día se sabe que las mutaciones en la lamina A de la lámina nuclear también dan lugar a una distrofia muscular debido a que el citoesqueleto como conjunto falla, provocando la rup- tura del sarcolema. Por lo que, la deficiencia de cualquier proteína estructural del citoesque- leto puede afectar a la integridad del sarcolema.

2.

Tráfico citosol-mitocondria y cloroplastos

El proteoma mitocondrial está formando por unas 1000 proteínas de las cuales solo 13 están codificadas por el genoma mitocondrial. Las proteínas restantes son sintetizadas por el núcleo

e importadas a la mitocondria.

El motivo por el que estos genes no han sido transferidos al núcleo se desconocen, pero exis- ten dos posibilidades:

- No ha pasado suficiente tiempo para una transferencia completa.

- Las proteínas codificadas son demasiado hidrofóbicas como para poder ser sintetiza- das en el citosol.

En cualquier caso el mitDNA representa el 0,5% del DNA total de una célula y el número de copias varía mucho en función del número de mitocondrias. Si cada mitocondria tiene 2 o 3 copias estaríamos hablando de unas 80-100 copias del genoma mitocondrial.

La teoría endosimbiótica apoya que el genoma mitocondrial sea DNA circular de doble cadena desprovisto de histonas, que yace en la matriz mitocondrial y que está controlado por una herencia maternal.

La importancia de la mitocondria radica en su papel para la supervivencia de la célula partici- pando en el transporte de electrónico, la fosforilación oxidativa y la respiración celular. Tam- bién está muy relacionado con el metabolismo como en el caso del ciclo de los ácidos tricarbo- xilicos, el ciclo de la urea y en la liberación de citocromo C para determinar los procesos apop- tóticos durante la morfogénesis.

El hecho de que dos genomas codifiquen distintas subunidades de un complejo proteico obliga

a la existencia de una comunicación fluida entre la mitocondria y el núcleo, estableciéndose

lo que se conocen como señales retrógradas, de la mitocondria al núcleo, y las señales anteró-

gradas, del núcleo a la mitocondria.

El intercambio de señales decrece con la edad produciendo un deterioro de la función mitocondrial que va a favorecer trastornos neurodegenerativos ya que el sistema ner- vioso central consume mucho ATP.

En el momento en el que la mitocondria lanza una señal S.O.S al núcleo, como el aumento de los niveles de ROS, este responde mediante un aumento en la producción de SOD, peroxida- sas, glutatión reducido y afines.

2.1. El genoma mitocondrial

El genoma mitocondrial es circular y presenta un tamaño de 16 Kb que codifica:

- 7 subunidades del complejo respiratorio I

- 1 subunidad del complejo respiratorio III

- 3 subunidades del complejo respiratorio IV

- 2 subunidades de la ATP sintasa

- 22 tRNA

- 2 RNA ribosomales

Uno de los factores que más destacan es el hecho de que solo se sintetizan 22 tRNA para 21 aminoácidos existentes (solo él triplete de la serina está degenerado y puede ser codificado por dos tRNA). Esto se debe a que la síntesis de proteínas en la mitocondria se va a producir mediante apareamientos no canónicos en los que el reconocimiento del codón se realizará sobre dos bases, balanceándose la tercera.

En el citosol son necesarios al menos 30 tRNA para sintetizar una proteína ya que hay una preferencia por ciertos tripletes.

Esta traducción tan laxa aporta un menor grado de fidelidad que facilita las mutaciones duran- te la síntesis de proteínas y además obliga a cambiar el significado de algunos tripletes de bases, existiendo una divergencia desde el endosimbionte.

En cuanto a los rRNA se codifica uno de 16 S y otro de 12 S que se modifican y ensamblan en la propia mitocondria, pero todas las proteínas accesorias son codificadas por el genoma nuclear, lo que obliga a la existencia de dos series de proteínas ribosomales, una de las cuales porta la secuencia de localización mitocondrial. La RNA-pol y la DNA-pol también son importadas.

Existen muchas enfermedades asocia- das a mutaciones en los genes mito- condriales que codifican para las subunidades de los complejos respira- torios ya que por ejemplo, cuando el complejo 1 no es funcional solo se pro- ducen 2 moléculas de ATP a través del complejo II, en vez de 3.

cuando el complejo 1 no es funcional solo se pro- ducen 2 moléculas de ATP a
cuando el complejo 1 no es funcional solo se pro- ducen 2 moléculas de ATP a

2.2. Destinos de las proteínas importadas a los orgánulos energéticos

La mitocondria es un orgánulo subcelular que presenta dos membranas y por lo tanto varias localizaciones:

- En las dos caras de la membrana mitocondrial externa.

- En el espacio intermembranoso.

- En las dos caras de la membrana mitocondrial interna.

- En la matriz mitocondrial.

Seis localizaciones mitocondriales diferentes entre las que se deben repartir más de 1000 proteínas que se amplían a nueve en el cloroplasto por la presencia de la membrana tilacoidal y el lumen dentro del estroma.

que se amplían a nueve en el cloroplasto por la presencia de la membrana tilacoidal y

2.3 Transporte a través de la membrana mitocondrial

El transporte de proteínas a la mitocondria se realiza a través de transportadores de membra- na, translocasas o translocones, un holocomplejo formado por varias subunidades accesorias y un núcleo que organiza el poro de entrada.

El holocomplejo translocon se denomina TOM (Translocase of the outer membrane) y su ho- mólogo en cloroplastos TOC (Translocase at the outer cloroplast membrane). Estos complejos pueden estar formados por unas 30-40 proteínas diferentes que van a guiar a la proteína que entra hasta el poro generado por el núcleo del translocon.

entra hasta el poro generado por el núcleo del translocon. El mecanismo básico es sencillo y

El mecanismo básico es sencillo y pueden participar chaperonas. Por ejemplo, una proteína sintetizada en ribosomas libres va a ser mantenida desplegada por las chaperonas HSP70 y HSP90 que van a ser reconocidas por una de las receptoras en TOM. A continuación la proteína va a pasar de una proteína a otra del complejo hasta introducirse por el canal del poro.

otra del complejo hasta introducirse por el canal del poro. 2.3.1. Señal de localización mitocondrial Muchas

2.3.1. Señal de localización mitocondrial Muchas de las proteínas que tienen como destino la mitocondria pasan, independientemente de su localización final, por la matriz mitocondrial. La señal de localización en la matriz mitocondrial presente en la secuencia de aminoácidos se sitúa en el extremo N-terminal y presenta un tamaño de entre unos 20-35 aminoá- cidos.

La secuencia señal presenta gran cantidad de aminoácidos car- gados positivamente (Lisina y arginina), que quedan distribuidos de tal manera que dan lugar a una α-hélice anfipática, es decir,

(Lisina y arginina), que quedan distribuidos de tal manera que dan lugar a una α -hélice

una hélice en la que todas las cargas positivas quedan a un lado generando una parte polar y otra no polar. Pero no todas las proteínas van a portar esta hélice, solo las que van o tienen que pasar por la matriz mitocondrial.

las que van o tienen que pasar por la matriz mitocondrial. Para poner de manifiesto esta

Para poner de manifiesto esta secuencia se generó una proteína DHFR (típica del citosol) qui- mérica que contenía una secuencia de localización mitocondrial de 61 aminoácidos procedente del citocromo B, cuya localización es el espacio intermembrana de la mitocondria.

localización es el espacio intermembrana de la mitocondria. El experimento reveló que la proteína DHFR quiméri-

El experimento reveló que la proteína DHFR quiméri- ca era transportada hasta el espacio intermembrana, pero si se eliminaba una parte de la secuencia, dejan- do solo 35 aminoácidos la proteína era transportada a la matriz mitocondrial.

Esto supone la existencia de dos señales en la se- cuencia de localización del citocromo b, una de ellas (1-35 aa) es la señal de importación a la matriz mito- condrial, y la otra (36-61 aa) es la señal de localización en el espacio intermembrana, a donde se dirige tras pasar por la matriz.

Una vez que la proteína entra en la matriz la secuencia de localización es cortada por protea- sas y se produce el plegamiento adecuado de la proteína, que ha tenido que permanecer des- plegada para poder atravesar el translocon TOM y el translocon TIM (Translocase of the inner membrane).

En la actualidad hay dos teorías sobre el motivo por el que las proteínas pasan por la matriz mitocondrial para alcanzar su destino final en otra localización:

- La teoría conservativa defiende que para que se produzcan los plegamientos definiti- vos y las modificaciones adecuadas, todas las proteínas tienen que pasar por la matriz mitocondrial ya que ahí es donde se sitúa la maquinaria específica de modificación.

- La teoría no conservativa defiende que este paso no es necesario.

La realidad es que unas 100 proteínas siguen el modelo conserva- tivo y las otras no. Un ejemplo son las proteínas que, una vez dentro de TIM, son incorporadas a la membrana mitocondrial interna sin tener que pasar por la matriz mitocondrial.

Otra de las conclusiones que se obtuvieron del experimento an- terior era la necesidad de que la proteína estuviera desplegada (parcial o completamente) para atravesar los translocones. Si se adiciona metotrexato, un potente inhibidor de DHFR por su gran afinidad, esta se pliega y no entra en la mitocondria a pesar de portar la secuencia de localización mitocondrial.

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2.3.2. Modelo general de transporte a la matriz mitocondrial Según lo explicado para la entrada de proteínas en la matriz mitocondrial van a intervenir cha- peronas (necesidad de ATP), la secuencia de localización, el receptor de importación en la membrana externa mitocondrial y los complejos TOM y TIM.

Cuando una proteína es sintetizada por los ribosomas libres y lleva una secuencia de localización mitocon- drial, las chaperonas citosólicas (Hsc70) mantienen el péptido des- plegado mediante la hidrólisis de ATP y lo guían hasta un receptor de importación en la membrana mito- condrial externa.

Detectada la secuencia de importa- ción el receptor se une al complejo TOM, situando la proteína para entrar a través del poro (Tom40). Puesto que la proteína se dirige a la matriz mitocondrial el complejo Tim reconoce la secuencia de importa- ción y en una zona de contacto entre ambas membranas esta es transferida a través del poro de TIM.

membranas esta es transferida a través del poro de TIM. El tránsito de la proteína a

El tránsito de la proteína a través de los poros se produce gracias a la existencia de un poten- cial de membrana generado por la gran concentración de protones en el espacio intermem- brana. Puesto que la secuencia señal está carga positivamente entra a favor de gradiente por el poro de TIM, pero para que la proteína completa pase es necesaria la actuación de otro gru- po de chaperonas de la matriz mitocondrial y motores moleculares (PAM) que tiran de ella.

Este mecanismo de tirón molecular es análogo al que se produce en el transporte post-traduccional (no confundir con co-traduccional) al lumen del retículo endoplas- mático.

Una vez dentro de la matriz, la secuencia de localización es cortada por proteasas y se produce el plegamiento para obtener la proteína nativa.

Al igual que en el citosol, si el plegamiento no se produce de manera adecuada intervendrán las chaperonas mitocondriales o la proteína será derivada a la degradación por el proteoso- ma (también presente en la mitocondria).

Este modelo general se vuelve más complejo si consideramos la cantidad de destinos que po- demos encontrar para una proteína en la mitocondria. Veamos en los siguientes apartados modelos generales para que la proteína alcance diferentes posiciones.

2.3.4. Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial interna Las proteínas que se dirigen a la membrana mitocondrial interna pueden disponerse de tres formas diferentes en función de si se internan en la membrana o quedan mirando a alguna de sus caras. Para ello deben de portar regiones hidrofóbicas capaces de permanecer en el en- torno de la membrana, pero estas regiones no pueden atravesar de manera adecuada el poro de los translocones TIM y provocan la detención del pépti- do, por ello se denominan secuencias de parada de la transferencia.

Una proteína precursora que presenta en su extremo N- Terminal una secuencia de localización en la matriz mito- condrial (con hélice anfipática) y a continuación una se- cuencia de parada de la transferencia, muy hidrofóbica, va a ser reconocida por Tom20 y transferida a Tom22 para atra- vesar el poro de Tom40.

A continuación la proteína es guiada hasta ser reconocida por el complejo TIM (poro en Tim23/17) y comienza a en- trar en la matriz hasta el dominio hidrofóbico, que no pue- de avanzar por el poro. Ahora la secuencia de localización en la matriz es cortada y la proteína sufre un desplazamien- to lateral en el poro que produce la internalización de la región hidrofóbica en la membrana mitocondrial interna.

la región hidrofóbica en la membrana mitocondrial interna. El complejo del poro es un entorno en

El complejo del poro es un entorno en continuo movimiento, flexible en diferentes confor- maciones que permiten el movimiento lateral de proteínas además del tránsito de esta a través de su luz.

En función de la situación de la señal de parada de la transferencia puede que el péptido que- de mirando hacia la matriz o hacia el espacio intermembrana, pero integrado en la membrana mediante una hélice hidrofóbica.

integrado en la membrana mediante una hélice hidrofóbica. En un segundo caso vemos que una proteína

En un segundo caso vemos que una proteína puede llevar la secuencia de localización en la matriz mitocondrial además de un sitio de recono- cimiento para la proteína Oxa1 y una secuencia hidrofóbica.

En este caso la proteína pasa por Tom y Tim, pero la secuencia no es lo suficientemente hidrofóbica como para detener el paso y se internaliza en la matriz con la ayuda de las chaperonas mitocondriales donde la secuencia de localización es cortada. Ahora sufre un plegamiento par- cial y es reconocida por Oxa1 que facilita la internalización en la mem- brana mitocondrial interna.

En función del número de sitios de reconocimiento para Oxa1 y de las regiones hidrofóbicas, la proteína entrará más o menos veces en la membrana.

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Finalmente una proteína en la que se alternan regiones hidro- fóbicas e hidrofílicas, que no

Finalmente una proteína en la que se alternan regiones hidro- fóbicas e hidrofílicas, que no porta una secuencia de localiza- ción mitocondrial también puede introducirse en la mitocon- dria mediante el reconocimiento por Tom70, que la introduce en el poro de Tom40.

Ahora Tim9/10, unas chaperonas del espacio intermembrana guían la proteína hasta un complejo de Tim22 y Tim54 que permiten la internalización de las regiones hidrofóbicas en la membrana mitocondrial interna sin pasar por la matriz mito- condrial.

Proteínas accesorias aparte, solo se ha identificado un complejo de poro de Tom (Tom40). En cambio sí que se conocen varios tipos de Tim que dan lugar a diferentes tipos de incorporaciones proteicas en la mitocondria.

2.3.5. Modelo general de transporte al espacio intermembrana El tránsito de proteínas hacia el espacio intermembrana de la mitocondria se puede realizar de dos formas, pasando por la matriz mitocondrial o no.

Una proteína precursora con una secuen- cia de localización mitocondrial y una se- cuencia de localización en el espacio in- termembrana puede ser reconocida por las proteína accesorias de Tom e introdu- cirse hasta Tim23/17 donde la secuencia de localización en el espacio intermenbra- na impedirá que cruce.

Ahora al igual que en los casos anteriores, sufrirá un desplazamiento lateral en la membrana mitocondrial interna, y la se- cuencia de localización en la matriz será cortada. Finalmente una proteasa de la membrana mitocondrial interna cortará la proteína definitiva que quedará libre al espacio intermembrana donde adquirirá su conformación y se le añadirán diferen- tes grupos prostéticos hasta alcanzar el estado nativo.

tes grupos prostéticos hasta alcanzar el estado nativo. La conformación final de una proteína no solo

La conformación final de una proteína no solo queda definida por su secuencia, sino por esta y el conjunto de modificaciones y de grupos prostéticos que se la añadan.

La segunda forma de entrar al espacio intermembrana es la que se produce cuando la proteína no porta una secuencia de localización en la matriz, solo la secuencia de localización en el es- pacio intermembrana.

En este caso la proteína atraviesa el poro de Tom hasta alcanzar el espacio intermembrana, donde adquiere su conformación definitiva.

intermembrana, donde adquiere su conformación definitiva. 2.3.6. Modelo general de transporte a la membrana

2.3.6. Modelo general de transporte a la membrana mitocondrial externa En la membrana mitocondrial externa podemos encontrar, además del complejo TOM, otro complejo denominado SAM (Sorting and assembly machinery) que interactúa con las proteínas precursoras de los barriles β, transportadas por las chaperonas TIM del espacio intermembra- na, introduciéndolas en la membrana mitocondrial externa para formar los oligomeros que dan lugar a los transportadores.

formar los oligomeros que dan lugar a los transportadores. * Anexo I: Funcionamiento de complejo TIM

* Anexo I: Funcionamiento de complejo TIM

* Anexo II: Señales de localización mitocondrial

2.4. Transporte citosol-cloroplasto

El cloroplasto vegetal presenta una cámara extra formada por la membrana tilacoidal que da lugar a la existencia de otras tantas localizaciones subcelulares.

Se conoce poco sobre las secuencias que determinan la localización de las proteínas que son transportadas al cloroplasto, pero se ha detectado la existencia de una secuencia de localiza- ción en el estroma que puede ir seguida de otra secuencia diferente de localización en los tila- coides.

La plastocianina, una proteína de localización en el lumen tilacoidal porta, en su precursor, las dos secuencias de localización. Atraviesa los complejos TOC y TIC (homólogos a TOM y TIM) para alcanzar el estroma y una vez dentro, el precursor de la plastocianina sufre un corte pro- teolítico que retira la secuencia de localización en el estroma, para que ahora la secuencia de localización en el tilacoide sea reconocida por la proteína SRP cloroplastica (Signal recognition particle).

SRP interacciona con un receptor en la membrana del tilacoide e introduce el precursor a tra- vés de otra proteína poro hasta el lumen tilacoidal, donde se le corta la secuencia de localiza- ción y adquiere la conformación final.

En el caso de una proteína que liga metales, esta porta la secuencia de localización en el es- troma y una secuencia de localiza- ción en el tilacoide que comienza con dos argininas (R). Cuando atra- viesa TOC y TIC se le retira la se- cuencia de importación al estroma dejando a la vista las argininas y comienza a unir los metales co- rrespondientes plegándose y atra- vesando un complejo en la mem- brana tilacoidal.

Finalmente el péptido con las argi- ninas es cortado y la proteína ad- quiere su estructura final en lumen tilacoidal.

Es importante considerar que las proteínas no entran a través de los complejos poro completamen- te desplegadas ya que eso cuesta mucha energía y cómo podemos observar hay casos en los que la proteína pasa casi completamente plegada.

eso cuesta mucha energía y cómo podemos observar hay casos en los que la proteína pasa

3. Tráfico de proteínas al peroxisoma

La entrada de proteínas al peroxisoma varía en cierta

medida con respecto a las anteriores.

La señal de localización de transporte al peroxisoma (PTS) se localiza en el extremo C-Terminal de una pro- teína que va a ser reconocida por un receptor Pex5.

---Ser-Lys-Leu-COO - (--SKL)

A continuación la proteína es transportada hacia el

peroxisoma donde otra Pex interacciona con el comple-

jo y lo transporta hasta el translocon a través del que

pasa la proteína y se libera el Pex5.

a través del que pasa la proteína y se libera el Pex5. 4. Tráfico de proteínas

4. Tráfico de proteínas a los plastidios

La señal para el tráfico de proteínas a los plastidios se sitúa en el extremo N-terminal de la

proteína presentando gran cantidad de serinas que alternativamente pueden aparecer en do-

bletes.

+ H 3 N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Ser-Asn-

-Ser-Phe-Leu-Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu-Gln-Gly---

Anexo I: Dinámica del complejo TIM

El complejo TIM23 está formado por muchas proteínas que puede adquirir diversos estados de asociación y de conformación. El núcleo principal está formado por las proteínas Tim23, Tim17, Tim21 y Tim50, a las que pueden acoplarse las chaperonas del motor molecular (PAM) que tiran del péptido en tránsito.

motor molecular (PAM) que tiran del péptido en tránsito. La dinámica del translocon está muy relacionada

La dinámica del translocon está muy relacionada con la interacción de TOM que provoca la variación entre estados abiertos y cerrados que permiten o no el paso de proteínas a la matriz mitocondrial.

Inicialmente el complejo TIM 23 se encuentra cerrado gracias a la interacción de las subunida- des Tim50 y Tim21. Pero cuando comienza a entrar una proteína a través del TOM, la interac- ción provoca la separación de las subunidades y la apertura del poro facilitada por interaciones entre Tim21 y TOM.

La proteína comienza el tránsito facilitado por el gradiente de potencial eléctrico, pero even- tualmente la proteína Cox favorece la entrada, y en función de cual sea el destino de la proteí- na se podrán dar dos posibilidades:

- Cuando la proteína tiene como destino la membrana mitocondrial externa, su tránsito se detiene y se integra en ella por difusión lateral.

- Cuando la proteína tiene como destino la matriz, el motor molecular con las chapero- nas (PAM) se acoplan a TIM23 y comienzan a tirar del péptido hasta introducirlo me- diante la hidrólisis de ATP.

nas (PAM) se acoplan a TIM23 y comienzan a tirar del péptido hasta introducirlo me- diante

Anexo II: Señales de localización mitocondrial

Anexo II: Señales de localización mitocondrial 48
Anexo II: Señales de localización mitocondrial 48

Anexo III: Genes y Parkinson

El Parkinson (PD) es una enfermedad que afecta al 1% de las personas mayores de 60 años, caracterizada por la pérdida de neuronas que fabrican dopamina (DA) en los núcleos cerebra- les y la aparición de cuerpos de Lewy (CL, no en todas las variantes de PD). El tratamiento más utilizado, pero que pierde eficacia a largo plazo, es suministrar L-DOPA, un análogo de la do- pamina capaz de atravesar la membrana hematoencefálica.

Las regiones cerebrales afectadas son las que controlan el movimiento y la coordinación por lo que los enfermos de PD muestran hipocinesia, tremor, bradicinesia, acinesia, rigidez en rueda dentada e hipertonía muscular.

Conforme avanzan los estudios sobre PD se han establecido ciertos factores ambientales como la exposición a plaguicidas, disolventes, metales y campos magnéticos, pero hoy día se sabe que existen ciertos componentes genéticos:

- La α-sinucleína (ASN) es una proteína de 140 aminoácidos, muy importante en la sín- tesis de dopamina que actúa como inhibidor de la tyr-hidroxilasas clave en la síntesis de catecolaminas convirtiendo la tirosina en DOPA y ésta a dopamina que puede con- vertirse en noradrenalina para posteriormente pasar a adrenalina. También interviene en la transducción de señales, en la dinámica del citoesqueleto, en la plasticidad neu- ronal, en el aprendizaje, en la memoria,… Las mutaciones en el gen ASN provocan la formación de fibras y agregados fribrilares (efecto potenciado por ROS) que dan lugar a la formación de placas que en personas jóvenes y sanas son elminadas por el sistema ubiquitina-proteosoma (UPS). Pero con el paso del tiempo el sistema comienza a fallar dando lugar a la aparición de PD, demencia,… o el exceso de ROS y neurotoxinas natu- rales provocan la pérdida de las neuronas DA.

- La parkina es una E3-ligasa del sistema UPS encargada de la degradación de ASN, por lo que mutaciones en este gen (hasta 57 en casos de PD temprano en menores de 45 años) derivan en la aparición de PD.

- El oncogen DJ1 es una chaperona de la matriz mitocondrial inducido por estrés oxida- tivo y que previene la producción de ROS. Mutaciones en este gen provocan el aumen- to de ROS que desencadena la agregación de ASN derivando en PD.

- La quinasa PINK1 o quinasa 1 inducida por PTEN, es otra proteína de acción protectora frente al estrés oxidativo cuya mutación ha sido relacionada con la aparición de PD.

Considerando el aumento de los niveles de ROS como un factor determinante en la aparición de ROS, muchos de los tratamientos actuales han dado gran importancia al uso de terpenoi- des, aceites esenciales y demás, como agentes inhibidores de la cadena de transporte de elec- trones.

El correcto funcionamiento de la mitocondria depende de un equilibrio entre los inductores de ROS (ROS inducers) y los sumideros de ROS (ROS quenchers). Durante la juventud, las células funcionan normalmente y controlan los niveles de ROS que son necesarios en cierta cantidad como señales de transducción o segundos mensajeros.

Recordemos que las ROS son capaces de formar peróxidos con los dobles enlaces de los ácidos grasos insaturados (esenciales como el araquidónico) y pueden dañar el DNA rompiendo las

dos hebras. Otro de los efectos negativos es la oxidación de proteínas en restos de cisteína, arginina y lisina, que provoca un cambio en la estructura tridimensional.

A medida que envejecemos, la capacidad de la célula para manejar los niveles de ROS disminu- ye, bien por la sobreproducción o porque la comunicación núcleo-mitocondria ya no es eficien- te, y con esa premisa se está estudiando la relación de ROS con PD, transtornos cardíacos, cáncer,…

La degeneración mitocondrial y la sobreproducción de ROS conducen en última instancia a la neurodegenración causante del PD, ya que el sistema nervioso (SN) precisa de grandes aportes de ATP.

Por ello tanto la mutación de los co