PRACTICA N 4

CROMATOGRAFIA

Objetivos
1. Conocer la tcnica de cromatografa y los factores experimentales que la
afectan
2. Aplicar y comparar los mtodos cromatogrficos de capa fina y columna,
para separar, identificar y purificar compuestos orgnicos
3. Observar el efecto de diferentes faces mviles y estacionarias en la
separacin
4. Determinar los valores de Rf, como un parmetro en la identificacin de los
compuestos separados
Resultados
Una ves realizada la cromatografa en columna, del resultante se procedi a tomar
dos muestras de las mas significativas y una mas de los licopenos puros
(resultado de la practica de extraccin de licopenos), para asi poder realizar una
cromatografa en capa fina tomando como muestra las antes mencionadas, se
coloco en la cmara con la muestra de solutos que fue 1:1 de acetato de etilohexano pero como la polaridad fue muy grande se cambio a una mezcla de
solutos que fue 7:3 acetato de etilo-metano, pero la polaridad aun fue alta, por
falta de tiempo ya no se logro cambiar nuevamente la mezcla de solutos y por
tanto no se logro terminar la cromatografa en capa fina.

DISCUSION DE LOS RESULTADOS

En diversas tcnicas cromatograficas, la separacin de mezclas (algunas veces mezclas
muy complejas de multicomponentes) se logra por la exposicin de la mezcla a un
sistema bifsico que se deja llegar al equilibrio. Las dos fases que intervienen en la
separacin pueden ser dos lquidos inmiscibles (extraccin, cromatografa liquido-liquido),
un gas y una fase liquida (cromatografa gas-liquido), un gas y una fase solida
(cromatografa gas-solido) o un lquido y una fase solida (cromatografa liquido-solido). En
la cromatografa, una de las fases del sistema binario es casi siempre estacionaria con
respecto a la otra. Por consiguiente hablamos de una fase estacionaria y una fase mvil.
En el laboratorio se realizo una cromatografa en columna para la separacin de
carotenos o licopenos (EXPERIENCIA 1.SEPARACION DE CAROTENOS, EXPERIENCIA
2.SEPARACION DE LICOPENOS) segn la muestra y una cromatografa de capa fina
(EXPERIENCIA 3) para la separacin de colorantes. La cromatografa en columna y en
capa fina difiere el medio de soportar el adsorbente. La principal diferencia entre estas
cromatografas es que en columna el adsorbente se introduce en un tubo o columna y en
capa fina el adsorbente se deposita en forma de capa delgada sobre una placa de vidrio o
de plstico. En la cromatografa en columna la fase mvil se hace caer a travs de la
columna, la fuerza motriz es la gravedad, mientras que en CCF, la accin capilar del
adsorbente hace subir al disolvente desde un depsito situado en la parte inferior de la
placa. La separacin de dos o ms componentes se debe por un equilibrio relativamente
sutil de las fuerzas interesadas. En columna por ejemplo los distintos componentes de la
mezcla se adsorbern en la superficie del solido con afinidades diferentes (fuerzas de
unin). La fase mvil desplazara y disolver estos componentes de acuerdo con su
afinidad por la superficie solida y la solubilidad de la sustancia en ella. El ms importante
factor unitario es el establecimiento del equilibrio. El adsorbente que se utilizo fue slicegel, el cual efectuar la separacin principalmente por retencin de los componentes
sobre la superficie mediante una combinacin de fuerzas de acido de Lewis y base de
Lewis, estas fuerzas actan con diferente intensidad sobre las muestras. Cuanto mayor
sea la relacin de adsorbente con respecto al peso total de la mezcla problema, es decir,
cuanto mayor sea la longitud de la columna o de la placa, mejor ser la separacin; se
debe a las fuerzas que efectan la separacin tendrn ms oportunidad de actuar sobre
cada componente.

Ilustracin 1. QUIMICA DE LOS ALIMENTOS Por Owen R. Fennema, CAP.54, PAG,

303
El licopeno es un pigmento rojo del tomate, un carotenoide

C 40

formado por ocho

unidades de isopreno. El B- caroteno, es un pigmento amarillo, es un ismero del

licopeno, en el cual sus dobles enlaces se han sustituido por otros enlaces para formar
anillos. Los principales grupos de pigmentos vegetales son las clorofilas, de color verde, y
los carotenoides, con colores del amarillo a naranja. Los carotenoides tienen 40 tomos
de carbono y se dividen en carotenos, que solamente tienen carbono e hidrogeno y las
xantofilas, que adems de carbono e hidrogeno tienen tomos de oxigeno. El oxigeno se
encuentra en los extremos de la molcula como grupos hidroxilo que hacen que las
xantofilas tengan mayor afinidad por los solventes polares que los carotenos, facilitando
as su separacin. La polaridad de un solvente depende de su estructura. En la siguiente
tabla se muestra el orden en que incrementa la polaridad en los solventes ms utilizados
en cromatografa de columna y de capa fina.

Ilustracin 2 Manual de prcticas de Fotosntesis Por Rosa Rods Garca, CAP.3

Separacin de pigmentos por cromatografa, Pag.27
En general los carotenoides son pigmentos liposolubles que pueden ser aislados por
extraccin con un disolvente adecuado: benceno, ter de petrleo, etanol, cloroformo, etc.
La evaporacin del extracto da un material crudo que, en algunos casos cristaliza
directamente. As sucede con la extraccin de licopeno a partir de tomate. Los carotenos
son mucho menos polares que los carotenoides oxigenados y se disuelven mejor en ter,
ter de petrleo y benceno y peor en metanol. El metanol y etanol disuelven mejor los
carotenoides oxigenados.
La velocidad de desplazamiento de los pigmentos en la columna depende de su
solubilidad en los solventes utilizados, del empaque de columna y del vaco utilizado.

Ilustracin 3 Manual de prcticas de Fotosntesis Por Rosa Rods Garca,

separacin de pigmentos por cromatografa Pg. 30

La cromatografa en capa fina puede emplearse analticamente para determinar las

caractersticas de separacin de una mezcla antes de intentar una separacin
cromatograficas en gran escala.

Ilustracin 4 Qumica Orgnica Experimental Por H. Dupont Durst, George W. Gokel

Pag.86
Si el compuesto de estudio corre con el frente del disolvente, este es probablemente
demasiado polar para la muestra de estudio. Un disolvente acertado es aquel que mueve
la muestra a mitad de camino de la altura alcanzada por el frente de la placa. La
separacin ideal para una mezcla de dos componentes es la de un tercio y dos tercios del
recorrido hasta la parte superior de la placa.
Es conveniente tapar la vasija y agitarla hacindola girar durante unos segundos para
asegurarse que el disolvente ha saturado la atmosfera que cubre el lquido. Cuando se
hayan equilibrado el disolvente y la atmosfera se introduce la CCF en el recipiente,
asegurndose que la mancha de la muestra queda por encima del nivel del disolvente.

CONCLUSIONES
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los componentes a
desglosar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales constituye un estado
estacionario de gran desarrollo superficial y la otra es un fluido que pasa a travs o a lo
largo del lecho estacionario.
Por tanto podemos decir que es un proceso fsica que con permite separa los diferentes
componentes de una disolucion.

CUESTIONARIO
1.- INDICAR QUE PRECAUCIONES SE DEBEN DE TENER AL EMPACAR UNA
COLUMNA DE CROMATOGRAFIA.
R.- Que el tapn de algodn que se coloca al inicio no quede muy apretado, o muy flojo,
de lo contrario podra irse nuestra muestra en el caso de ser irreversible seria una
perdida.
2.- INDICAR QUE FRACCIONES SE SEPARARON POR CROMATOGRAFIA EN
COLUMNA, DE LOS EXTRACTOS DE ESPINACA, JITOMATE Y COMO SE
IDENTIFICARON.
R.- De los jitomates obtuvimos licopenos y de la espinaca carotenos. Por medio de la
CCF pudimos separar sus componentes al pasar el disolvente por el punto donde
colocamos nuestra muestra. En la cromatografa de columna obtuvimos fracciones
coloridas que se repartieron en diferentes tubos de ensayo, los cuales indicaban el grado
de separacin.
3.- ESCRIBA Qu conclusiones se obtienen de la cromatografa en capa fina y de
la cromatografa en columna?
R.- Se considera que la CCF es una tcnica ms simple que la de columna, el motivo de
ello es que en cromatografa plana tanto la fase mvil como la estacionaria no estn bien
definidas y se encuentran en un estado dinmico con la fase de vapor que rodea al
sistema cromatografico. Las condiciones experimentales ptimas para realizar la
separacin son difciles de controlar.

4.- DEFINIR LOS SIGUIENTES TERMINOS:

R.- a) ADSORCION: Es el resultado de la atraccin entre las molculas de la superficie
del slido (adsorbente) y las del fluido (adsorbato). Esta atraccin puede ser de dos tipos:
adsorcin fsica y qumica. La adsorcin fsica se debe a las fueras de atraccin de van
der Waals, como las interacciones dipolo, dipolo, y se asemeja a la condensacin de las
molculas de vapor sobre un liquido de la misma composicin. Tiene un gran inters en la
catlisis por slidos, pues proporciona un mtodo de medida de areas superficiales de
catalizadores y de determinacin de tamao de poros y de la distribucin de los mismos.
b) PARTICION: Fenmeno por el que si a un sistema heterogneo formado por dos fases
en equilibrio se adiciona un tercer componente, este se reparte entre ambas fases. Este
fenmeno de reparto o particin tiene lugar cuando la fase estacionaria es liquida. Cuando
la fase mvil es un gas, los componentes ms solubles en la fase estacionaria, es decir,
aquellos que presentan una polaridad similar, sern retenidos con mayor fuerza. En caso
de que la fase mvil ser otro liquido, el coeficiente de distribucin de un componente
vendr determinado por la solubilidad relativa del mismo en la fase mvil respecto a la
fase estacionaria.

c) ELUYENTE: En la cromatografa de elucin, a la fase mvil se le denomina eluyente y

al desplazamiento elucin. Cuando la fase mvil abandona la columna cromatografica
recibe el nombre de efluyente.
d) ELUATO: Efluente que sale del lecho cromatografico cuando se realiza la elucin.
e) DISOLVENTE: Componente mayoritario de una disolucin por oposicin al soluto. En el
caso de disolventes mixtos, por ejemplo en uno agua- alcohol, ambos se consideran como
disolventes a pesar de que no sea mayoritario.
f) FASE MOVIL: Denominamos fase mvil al fluido que utilizamos como portador de la
mezcla.
g) FASE ESTACIONARIA: Denominamos fase estacionaria a un slido o un lquido
colocado sobre un slido, que sirva como soporte a la prueba.
h) Rf : Se define como la relacin entre la velocidad de desplazamiento del soluto y la
velocidad de desplazamiento de la fase mvil:

Rf =

velocidad de la zona del soluto

velocidad de la fase movil

A un tiempo dado esta se transforma en una relacin de espacios:

Rf =

distanciarecorrida por la zona del soluto

distanciarecorrida por la fase movel

5.- ESPECIFICAR EN QUE PARTE DE LA PRCTICA TIENEN APLICACIN LOS

TERMINOS ANTERIORES
R.- Identificamos los trminos anteriores primero en la cromatografa de columna,
mientras corremos nuestra muestra de licopenos, identificamos la fase mvil, la
estacionaria y la particin. Despus en la cromatografa de capa fina identificamos el
eluyente y el eluato junto con el

Rf . El disolvente lo identificamos desde antes de

montar el equipo necesario.

6.- HACER UNA COMPARACION ENTRE LA CRISTALIZACION, EXTRACCION,
DESTILACIONES Y CROMATOGRAFIA, EN CUANTO A LA EFICACIA COMO
METODOS DE SEPARACION Y PURIFICACION
R.- Una sustancia pura consta exclusivamente de molculas de la misma clase, por tanto,
no se puede continuar purificando mediante ninguna operacin. Los procesos qumicosorgnicos solo transcurren de forma cuantitativa; las distintas posibilidades de reaccin y
de los tiempos de reaccin ms largos van acompaados de reacciones secundarias, lo
que conduce a una disminucin del rendimiento en el producto principal. La Cristalizacion
es un mtodo de separacin que se basa en la diferente solubilidad de los compuestos
orgnicos slidos en distintos disolventes. Si las sustancias que acompaan al producto
principal son ms fcilmente solubles en un disolvente elegido, su aislamiento es rpido,

ya que cristaliza de la solucin saturada en caliente, mientras que las impurezas

permanecen disueltas en la disolucion enfriada. Como consecuencia de la distinta
velocidad de cristalizacin, se produce una casi completa separacin de sustancias puras
en horas o das. Se entiende por destilacin la vaporizacin de un lquido y la
condensacin del vapor destilado. Este mtodo se utiliza para separar un lquido de
impurezas o de sustancias que posee puntos de ebullicin esencialmente ms altos. La
cromatografa es una tcnica de separacin en la que los componentes que se han de
separar se distribuyen en dos fases inmiscibles; una fase mvil que se desplaza en una
direccin definida y otra fase fija o estacionaria. Mediante la cromatografa es posible
separar, identificar y posteriormente cuantificar los componentes de mezclas que de otra
manera solo pueden separarse con grandes dificultades o incluso no separarse, es una
tcnica utilizada tanto con fines analticos como preparativos. La extraccin es una tcnica
de transferencia de un soluto de un disolvente a otro. El soluto se extrae por un proceso
de distribucin.
7.ESTABLECER UNS DISCUSIN CLARA ENTRE CROMATOGRAFIA EN
COLUMNA Y CAPA FINA E INDICAR EN QUE CASOS SE PREFIERE ALGUNO DE
LOS DOS METODOS.
R.- La almina y el gel slice empleados en la tcnica de capa fina, son generalmente
mucho ms finos (menor tamao de partcula) que la clase de del de slice y almina
correspondientes a la cromatografa en columna. La mayor superficie del adsorbente de la
clase correspondiente a la cromatografa de capa fina, produce por lo general una
separacin mucho mejor que la que puede obtenerse por cromatografa en columna. Este
adsorbente de grado fino no se emplea generalmente en la cromatografa de columna
porque la velocidad de flujo sera demasiado lenta. Un medio de realizar separaciones
excelentes manteniendo un flujo razonable del disolvente, estriba en forzar el paso del
disolvente a travs de la columna de adsorbente fino bajo presin.
Las diferencias entre estas tcnicas cabe buscarlas en la distinta configuracin de ambos
sistemas cromatograficos ya que la cromatografa plana se realiza en un sistema de lecho
abierto, mientas que la cromatografa de columna en un sistema de lecho cerrado, las
diferencias serian las siguientes:
a) En la cromatografa CCF la separacin se realiza por distancias, mientras que en
columna se hace por tiempos (o volmenes).
b) En cromatografa CCF la velocidad de la fase mvil solo puede controlarse
indirectamente ya que esta gobernada por las fuerzas capilares que son las que
permiten el paso de dicha fase a travs del lecho cromatogrfico. Por el contrario,
en cromatografa en columna la velocidad de la fase mvil puede controlarse
fcilmente, dependiendo del gradiente de presin mantenido a travs de la
columna.
c) El tiempo que dura la separacin en cromatografa plana es el tiempo necesario
para que el frente del disolvente llegue a una zona determinada del lecho
cromatografico y es independiente del camino recorrido por los componentes de la
muestra. En cromatografa en columna, cada soluto debe atravesar
completamente la longitud de la columna, por lo que el tiempo que dura la
separacin est determinado por el tiempo que tarda componente ms lento en
llegar al detector.
d) En lo que se refiere a la forma de llevar a cabo el proceso de separacin, en
cromatografa en columna la separacin de varias muestras se realiza de forma
secuencial, es decir, cada una de ellas debe someterse individualmente al mismo

proceso de introduccin en la columna, separacin y deteccin, adems de

proceder reequilibrar la columna antes de introducir la siguiente muestra. En
cromatografa plana, por el contrario, la separacin de varias muestras ser la
suma de los tiempos parciales necesarios para cada separacin individual.
e) La eleccin de la fase mvil en cromatografa plana se realiza de forma que de la
separacin requerida, no importando que algunos componentes de la muestra
queden en el origen, ya que las placas se desechan despus de cada separacin.
En cromatografa en columna, la fase mvil debe elegirse de forma que eluya
todos los componentes de la muestra para que no se produzca el
envenenamiento de la columna. Este envenenamiento puede suponer una
prdida de tiempo considerable hasta que se logra eluir completamente aquellos
componentes que hayan podido quedar acumulados al comienzo de la columna. Si
es irreversible, el aspecto econmico puede ser de gran importancia.
f) Otra diferencia bsica entre ambas tcnicas se encuentra en la forma de llevar a
cabo la detencin. Mientras que en cromatografa en columna este es un proceso
dinmico, pasando cada soluto eluido a travs del detector ( sistema on-line), en
cromatografa plana es un proceso esttico (sistema off-line) esta diferencia da
lugar a que la detencin en cromatografa plana sea mas difcil de automatizar que
en columna, pero tambin, que sea un proceso ms flexible y variable. As, en lo
que se refiere a los disolventes utilizados como fase mvil, la pureza o
propiedades (absorbentes, aciso-base, etc.) de los mismos no son tan criticas
como en columna, ya que estos se evaporan completamente entre el desarrollo y
la medida. Por ejemplo, si en columna se utiliza un detector UV, la fase mvil no
debe contener disolventes o impurezas que absorban en esta zona del espectro,
mientras que esto no supone un problema en cromatografa plana. Por parte en
esta tcnica, es posible aumentar la sensibilidad del proceso de deteccin
mediante una seleccin adecuada de las reacciones utilizadas para mejorar la
seal medida. El sistema de deteccin estadstico permite, por ejemplo, registrar
espectros de cada soluto por separado y seleccionar la longitud de onda de
mxima respuesta de cada uno de ellos.
g) En general, los solutos mas retenidos en CCF forman manchas compactas, por lo
que se detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los solutos mas retenidos
en la columna son los que dan los picos y menos resueltos y sensibles.

Bibliografa

QUIMICA ORGANICA EXPERIMENTAL

H.DUPONT DURST, GEORGE W. GOKEL
REVERTE, 1985 PAG. 79, 80
QUIMICA ORGANICA BASICA Y APLICADA: de la molcula a la industria
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MANUAL DE PRACTICAS DE FOTOSINTESIS
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QUIMICA DE LOS ALIMENTOS: experimentos de qumica orgnica

OWEN R. FENNEMA
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ANALISIS QUIMICO CUANTITATIVO/ QUANTATIVE CGEMISTRY ANALUSIS
DANIEL C. HARRIS
REVERTE, JAN 1, 2007
BIOQUIMICA CLINICA Y PATOLOGIA MOLECULAR, volumen 1
X. FUENTES ARDERIU
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Tcnicas Analticas de Separacin
Miguel Valcrcel Cases, A. Gmez Hens