InstitutoPolitcnicoNacional

UnidadProfesionalInterdisciplinariadeIngeniera
CampusGuanajuato

LaboratoriodeBiotecnologaMolecular

Grupo5BV1

Prctica#4y5
ExtraccindeRNAdeplantas:Especie
Capsicumannuum
L.
CuantificacindeRNAporespectrofotometrayvisualizacinengelde
agarosa

Equipo1:
LpezCastaedaMariana
LpezChacnEmmaKaren
PrezPrezKarinaDaniela

Docentes:
Dr.JuanFranciscoSnchezLpez
Dr.KarlaLizbethMacasSnchez
MiryamJhazminTorresGmez
MenC.SilviadazSandoval

SemestreEneroJunio2015

Silao,Guanajuato.19deFebrerodel2015.

I.

RESULTADOS

Deacuerdoalprotocoloestablecido,sellevacabolaextraccinypurificacindeRNA
de la especie
Capsicum annuum, comnmente conocido como chile serrano, del cul
seobtuvieron2 muestrasapartirdeaproximadamente1gdepericarpio,descartandola
placenta y, asegurndose de remover el exocarpio, es decir, lacapa externade color
verde intenso que recubreal chile, para prevenir contaminaciones ya quelas RNAsas
sonliberadasapartirdelasclulasyestnpresentesenlapiel.

EspectrofotometramedianteequipoNanoDrop.
Terminado el proceso de extraccin y purificacin se llev a cabo la cuantificacin y
visualizacin de RNA de Capsicum annuum
a travs de la espectrofotometra,
empleando un NanoDrop, elcual lee absorbanciasadistintas longitudes de ondapara
cuantificardistintosparmetroscomola concentracindeRNA o lapresencia deotros
agentes contaminantestalescomosolventes orgnicososalesdeguanidina.Losdatos
obtenidosapartirdelNanodropsemuestranenlasiguientetabla.

Tabla 1.
Parmetros de cuantificacin de RNA y relaciones de las absorbancias
registradasenelNanodropdelaespecie
Capsicumannum
.

De acuerdo a laTabla1se puede observarquedeacuerdo alaabsorbanciamedida a

260nmdela primera muestra de
Capsicumannuum
esde2.571nmlacualindicauna
concentracin de RNA de 102.9ng/ L, mientras que para la segunda muestra se
obtuvo una concentracin de 80 ng/ L,a laquele corresponde unalongitudde onda
de1.999, pero mediante latcnica de electroforesis en geldeagarosaal1%sepuede
comprobarlaintegridaddelRNA.

En la Figura 1 se observa la grfica de la absorbancia contra la longitud de onda

registrada en el Nanodrop para la primera muestra, en la cul se apreciaun mximo
entrelaabsorbancia260a275.

Figura 1.
Grfico de la Absorbancia Vs. Longitud de onda registrada en el NanoDrop para la
muestra1de
Capsicumannuum.

Yporltimo en lafigura2seobserva lagrficadelaabsorbanciacontralalongitudde

ondaregistradaenelNanodropparalasegundamuestrade
Capsicumannuum
.

Figura 2.
Grfico de la Absorbancia Vs. Longitud de onda registrada en el NanoDrop para la
muestra2de
Capsicumannuum.

Visualizacinengeldeagarosa
Posteriormente empleando la tcnica de electroforesis en gel deagarosaal 1%,(p/v)
se visualizan las muestras
Capsicum annuum,
para poder comprobar si la
concentracin que se obtuvo mediante el equipo NanoDrop es la correspondiente a
RNA.EnlaFigura3,seobservan10carriles,encontrndoseen elprimeryltimocarril
el marcador depesomolecularHyperLadderTM 1kb con sus 14bandas,debidoaque
al momento de colocarla muestradel marcadorhubo deficienciasenla tcnica, porlo
quesecreyconveniente aadir otra muestradel mismo.En elsegundo y tercercarril
se encuentra la muestra de inters. Mientras que en el carril 4, 5 y 6 las muestras
correspondientes al equipo 2 y por ltimo en el carril 7,8 y 9 se encuentran las
muestrascorrespondientesalequipo3.

Figura3
. Visualizacinde RNA de
Capsicum annuum corridoengeldeagarosaal1%
con los respectivos carriles. Carril
1 y 10
: marcador de peso molecular HyperLadder
1kb, 100 Lanes, Lot No. Hi211k
Carril
2 y 3: muestra de equipo 1 Carril
4, 5 y 6
:
muestradeequipo2Carril
7,8y9:
muestradeequipo3.

II.DISCUSINDERESULTADOS
Apesarde que elDNA es elcido nuclicoquecontienelainformacinquedetermina
la estructura de las protenas, no puede actuar solo, por eso en los organismos
celulares el RNA es lamolculaque complemente alDNAyaqueseencargadedirigir
la sntesis de protenas para eldesarrollo y actividades delaclula.(Patio,2006)Por
esa razn la extraccin de RNA libre de contaminacin con DNA o protenas es
empleada para distintos procedimientos tales como Northern blot, Dot blot,
transcripcinreversa,ensayosdeproteccindeRNAsas,PCRyclonajemolecular.


Segn Jimnez (2002), la absorbancia de los cidos nucleicos es mxima a una
longitud de 260 nm. Por tal motivo para determinar la calidad del RNA, uno de los
parmetrosquese empleanesla relacin 260/280 nm,lacualdebepresentarunvalor
de2paraser consideradodebuenacalidad(Martnez2000),yaquefrecuentementeel
RNA viene mezclado con protenas, carbohidratos y diversas sales. Al observar este
parmetro en la Tabla 1 para las muestras 1 y 2,se puede observar que nocumplen
este requisito, ya quequedan por debajodelvalorestablecidoparaserconsideradode
calidad presentando valores de 1.6 y 1.55 respectivamente. Tambin se observa una
mayor concentracin deRNAen lamuestra1queenla2,sinembargo,alobservarlas
absorbancias ledas a 230 nm de ambas muestras, se demuestra una clara
contaminacin por agentes orgnicos como el isopropanol, ya que superan al valor
registrado de la absorbancialeda a 260nm,siendom la contaminacinen lamuestra
1.

A pesar de que las lecturas registradas en el NanoDrop, demuestran la presenciade

RNA, el mtodo no puede decir siel RNAseencuentrafragmentadooimpuro. Porlo
anterior, se emplea la tcnica de electroforesis en gel de agarosa al 1%, para poder
visualizarelRNAyobservarlacondicinenlaqueseencuentra.Dichavisualizacinse
muestraenla Figura 1,enla quelos carrilesde interssonel2y3conlamuestra1 y
2respectivamente.

El mtodode electroforesis,nospermitesepararlaspartculasdeacuerdoasutamao
en funcin de su carga neta al someterlas a un campo elctrico. La fuerza que se
encarga del movimiento de las partculas es el potencial elctrico (E), por lo que la
movilidadelectrofortica () deuna molcula estdada porlarazndelavelocidadde
la partcula(V)alpotencialelctrico,porloquealaumentarelvoltaje,aumentalacarga
del compuesto a estudiar, en este casoel RNA. (Garrido et al.,2006)Sinembargo lo
que se pretende no es que sea rpido el proceso de visualizacin en gel de
electroforesis, sino conservar la integridad estructural durante la corrida, razn por la
cul se corri elgel a unvoltajede70V,sinembargoeltiempodeexposicinalcampo
electrofortico se considera que para una mejor visualizacin tuvo que haber sido
mayor, ya que como se observa en la Figura 3 las muestras se encuentran muy
pegadas a laparte superior del gelyel marcadordepeso molecularse encuentracon
las 14 bandas muy poco espaciadasentre s. Poresta razn para laelectroforesisen
gel de agarosa para la separacinde ARN por tamaosHernndez (1994) propone el
uso de formaldehdo, un desnaturalizante que favorece la separacin del ARN por
tamaos, pero en su trabajo a pesar de la presencia de ese componente

desnaturalizante sugiere el empleo de voltajes bajos para cuidar la integridad de los

resultados.

El Trizol Reagentesunasolucinmonofsicadefenoleisotiocianatodeguanidinaque
solubiliza simultneamente el material biolgico y desnaturaliza la protena. Despus
de la solubilizacin,la adicin decloroformo provoca laseparacin defases,donde la
protena se extrajo a la fase orgnica, el ADN se resuelve en la interfaz, y el ARN
permanece en la fase acuosa. (Hannon, 2010) Este reactivo listo para usar est
diseado para aislar elARN totalde alta calidad,ascomoADNyprotenas,apartirde
muestrasdeclulas y tejidosde origenhumano, animal,vegetal,levadura,odeorigen
bacteriano. Este reactivo se emplea para mantener la integridad del RNA, ya que
durante la homogenizacin y lisis de la muestra inactiva a lasRNAsas,al tiempo que
rompelasclulasydisuelveloscomponentescelulares(McNamara,2006)

Para la visualizacin deRNAporel mtodo de electroforesis en gelde agarosa al1%

seemple elmarcadorHyperLadder1kb,dichomarcadordepesomoleculargeneraun
patrn de 14 bandas con un rangode200pb10,037bpcomosemuestraenlaFigura
4(HyperLadder, 2015)Ademscomoseobservaenlaimagen labandade100bpyla
banda de 10,037 bp tienenla mayorintensidadparasufcilidentificacinyorientacin
en la cuantificacin de RNA. El marcador de peso molecular tambin nos ayuda a
darnoscuenta si el gel fuepreparado adecuadamente,yaquesiestenoseencontrara
bienhechoelmarcadornoemigraraporelgel.

TM
Figura4.
PatrndebandasdelmarcadorHyperLadder
1kbcorrido engeldeagarosa
al1%visualizadoconbromurodeetidio.

Debido a que el RNA ribosomal es el ms abundante en las clulas, forma parte de

hasta el 80% del RNA celular segn Pea (2004). El ARNribosomaleucaritico est
formado por una subunidad 40s, conformado por una molcula de ARNr 18s y 32
molculas de protenasyla subunidad60s, lacualtienetres tipos deARNr 5s, 5.8sy
28s, con 46 protenas (Koolman, 2004) El cido ribonucleico aproximadamente de un
40% aun50%del ribosoma.(Barioglio,2001)mientrasqueeltamaodel ARNr28ses
de4.6 a 5.2kbsusubunidadpequeamientrasqueelde18svade1.7a1.9kb(Farrell,
2005). Es por eso quela visualizacindel RNAdelafiguraenelgeldeagarosanofue
la esperada, de acuerdo a Martnez, 2000, se debe observar un doblete de bandas
caractersticodelRNA,28Sy18ScomosemuestraenlaFigura5.

Figura 5. Visualizacin de extraccin de RNA en gel de agarosa con el doblete de

bandas caracterstico28S y18Spresenteentodosloscarriles,apartirdelacortezade
cidra.

Dichasbandas no se presentan en el carriles 2 delafigura3,debidoaqueelRNAse

encuentra degradado. Ladegradacin del RNA puedeocurrir por diversosfactores, ya
quesedegrada con mucha facilidad, sobre todo con lacontaminacindeRNAsas.Ya

que la molcula de RNA es sumamente lbil, la clave en la extraccin es evitar su

degradacinporaccinderibonucleasaspropiasdelaclula.Losprotocolosexistentes
se basan en una rpida inactivacin de RNAsas endgenas, muy estables y que no
requieren de cofactores para funcionar. Es muy importante tomar precauciones para
evitar lacontaminacinconRNAsas exgenas,porejemplo,tratarelaguaysoluciones
salinasconinhibidores deRNAsas,si es posible se recomiendael empleo de pipetas,
puntillas y soluciones exclusivas, puntillas y soluciones exclusivas para trabajar con
RNA. El material de vidrio debe esterilizarse por calor seco por 4 horas a 150C,
mientras que el material plsticodebe ser nuevo y estril, o bien debe enjuagarsecon
cloroformo, yaquela esterilizacinporautoclavenoinactivaporcompletolasARNsas.
(Armendariz,2011)

As mismo, deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso e intentartrabajarlo

ms rpido posible, con el fin de evitar la degradacin del RNA durante la
manipulacin. Con elfin de obtener los mejoresrendimientos,deben usarse muestras
frescas como material de partida (Sandoval, 2010). Durante la experimentacin, se
trabaj todo el tiempo con guantes para evitar lacontaminacin por lasRNAsas de la
piel, por lo quesedescartaesta forma decontaminacin,ascomoelhechodequese
trabajconuna muestra frescadeCapsicumannuum
.Sinembargo,ladegradacindel
RNA se le puede atribuir al proceso de maceracin, ya que no se realiz de forma
rpida, este proceso se realiza con la finalidad de que las clulas del tejido vegetal
estn ms expuestas a los reactivos y as asegurar la obtencin de RNA de forma
rpida, por lo que al no realizar este paso de forma rpida permiti que las RNAsas
endgenasliberadasseencontraranconelRNAylodegradara.

En caso del tercer carril, de la figura 3, no se observan bandas ya sean borrosas o

extendidas,lo cualsedebe a unacolocacindeficienteenelpocillodelgeldeagarosa
o en dado caso se debea la prdida de material gentico en alguna de lasetapasde
extraccin durante la decantacin de la fase acuosa, ya que a partir de la fase de
separacin,despus de la primeracentrifugacin se observ prdida de lapastilla,sin
embargo se continu con el procedimiento hasta el final obteniendo una lectura de
concentracin de RNA de
80 ng/ L, sin embargo se presentaron datos de
contaminacin por solventes orgnicos y salesde guanidinapor lo que se descarta la
posibilidaddehaberobtenidoRNAdelasegundamuestra.

III.CONCLUSIONES

A travs de la experimentacin noselogr elprocesode extraccin y purificacin del

RNA de la especie
Capsicum annuum
, comnmente conocido como chile serrano. A
pesar deque seregistraronconcentracionesdeRNAde102.9ng/Ly80ng/Lparala
muestra1y2respectivamente,sedetectmediantelarelacin230/260queelRNAse
encuentra contaminado por agentes orgnicos as como la relacin 260/280 no
alcanz el valor esperado de 2, para poder calificar el RNA como libre de sales o
agentesorgnicos,porloquedemuestraunmalprocesodepurificacin.

La visualizacin de RNA engel de agarosaal 1% demostr queel RNA se encuentra

fragmentado, por loquefueimposible observarel dobletede bandascaractersticodel
RNA, siendo una causa posible laprimera partedel procesodeextraccin, ya queno
semacerdeformaadecuada,lograndoaslafragmentacin.

IV.CUESTIONARIO

1.SobreelDEPC,enelprotocolodeextraccindeRNA,investigue:
a.NombreIUPACdelcompuesto
Dietilpolicarbonato,confrmulamolecularlinealO(COOC
H
)
2
5
2
b.Estructuraqumica

c.Mecanismodeaccin
Es un potente qumico que Inactivalas RNAsaspor unin covalenteen su sitioactivo
inhibiendo suactividad cataltica,a travs dela modificacin de residuos dehistidinay
tiroxina.(Farrell,2005)

2.Expliqueculeslafuncindelaformamidaenelbufferdecarga.
Lafuncin quecumplelaformamidaesdebilitarlasunionesdehidrgenodelosduplex
ADNADNyADNARN,permitiendo de estamaneraque se puedabajarlatemperatura
deanillamientoalincrementarelniveldeastringencia
.

3.ExpliquelafuncindelaRNAsaout.
Esuninhibidornocompetitivoderibonucleasaspancreticas,talescomolaRNAsaA,
elculesutilizadoparaevitarladegradacindelRNA.

4.Apartirdelsiguienteproblema,respondalosincisosa,byc:

Lassiguientesimgenes muestranlos productosde RNAmde tejidode flordeplantas

de chile (carril 2, 3 y 4) por un mtodo basado en perlas magnticas (Dynabeads
mRNA Purification Kit Dynal Biotech, Brown Deer, WI), a partir de RNAt (carril 8). El
panel Acorrespondeauna corrida despusde2minutosdeiniciadalaelectroforesisa
100VyelpanelBalamismacorridadespusde30minutos.

a)Analicelaintegridaddelasmuestras2,3y4.
Para el caso de las muestras 2 y 3 se observa la presencia de ARN al estar ms
alejadade lospocillos iniciales,ya que elARN es menos pesadoque elADN,tambin
sepuede observarque lamuestrano esta100%purayaquepresentatrazasborrosas
que implican la contaminacin, con lo cual se podran hacer ms procesos de
purificacinparalaobtencindeARNnicamente.
Enel casodelamuestra4noseobservannibandasdeARNodegradacindelmismo
yaqueno se ve nadael carril4lo cualse podradeberaunainsercindemuestraen
elpocilloounaprdidadecidosnucleicosenalgunaetapadelaextraccin.

b) Estime de modo visualla concentracinquetendra labanda inferior de lamuestra

delcarril3.
Suponiendo que el marcador es Hyperladder, la concentracin es de 750 pb,
considerandoquelabandasuperiordelmarcadoresde800pbylainferiorde600pb.

c) Por qufue necesariotomardosimgenesendiferentestiemposdecorridaparala

estimacinvisualdelaconcentracindeRNAmengeldeagarosa?
Porque en la primera corrida debido al corto tiempo de contacto de voltaje en el gel
impidila migracin de lasbandas a unadistancia adecuada paraverlapresenciade
ARN.

V.BIBLIOGRAFA
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