INTRODUCCION

Los componentes celulares mayoritarios en el tejido sanguneo son los eritrocitos

(tambin llamados glbulos rojos o hemates) y los leucocitos (glbulos blancos). Los
primeros son clulas maduras especializadas en el transporte de oxgeno por medio de la
hemoglobina. Su citoplasma est ocupado totalmente por esta protena de transporte y por
ello son clulas que han perdido el ncleo y los orgnulos celulares. No presentan ncleo y
por tanto no contienen ADN nuclear. Sin embargo, la sangre resulta ser una fuente de ADN
por encontrarse en ella, aunque en menor nmero, otras clulas nucleadas, los leucocitos.
De este tipo celular es de dnde se lograr extraer el ADN de las muestras de sangre. La
cantidad estimada de ADN en sangre completa es de 30-60 gr/mL. El criterio de eleccin
de uno u otro mtodo de extraccin no depende slo del rendimiento en cuanto a cantidad
de ADN, sino de su xito en la reaccin de PCR (Kobilinsky, 1992; Comey y cols., 1994;).
La individualidad de una persona est definida por la informacin gentica que
hered de sus padres, la cual est contenida en 46 cromosomas. Durante el proceso de la
fertilizacin, el vulo y el espermatozoide que contienen slo 23 cromosomas diferentes, se
combinan para dar lugar a una clula con 23 pares de cromosomas (46 cromosomas), es
decir, una copia de cada par de cromosomas una derivada del padre y otra de la madre.
Durante la meiosis de los gametos llevan a cabo el proceso de recombinacin gentica, el
cual produce un nuevo genotipo a travs del intercambio de material gentico entre
secuencias homlogas de ADN de dos orgenes diferentes. Ambas copias de cada par de
cromosomas contienen la misma informacin gentica con pequeas variaciones que nos
hacen distintos unos de otros (Lewin, 2000)
El ADN es la molcula que contiene toda la informacin gentica del individuo. El
conjunto de esta informacin presente en las clulas se denomina genoma y, segn su
localizacin, podemos identificar un genoma complejo nuclear y un genoma mitocondrial
simple. Sabemos que la longitud del ADN humano es extensa y el nmero de pares de
bases o nucletidos que lo forman es de aproximadamente 3000 millones por clula

haploide. Sin embargo, no todos estos pares de bases tienen una funcin especfica. A
medida que los bilogos moleculares fueron investigando y descubriendo los secretos del
ADN, encontraron que a veces aparecan tramos cortos de ADN humano que variaban de
una persona a otra. Es decir, el ADN humano no era totalmente igual en todas las personas,
existan zonas que eran polimrficas pues variaban en la secuencia u orden de bases
nitrogenadas. (Jeffreys 1985).
Estas variaciones de secuencia se llaman polimorfismos genticos ya que permiten
distinguir a los individuos. Algunas de las diferencias descritas son significativas, pues
ocurren en genes (variaciones en ADN codificante). Sin embargo, muchas de las
variaciones parecan tener poco que ver con los genes y, su objetivo, si es que lo tienen, es
desconocido (variaciones en ADN no funcional). Por tanto, el ADN no codificante no est
sujeto a presin selectiva intensa, por lo que admite unos niveles de variacin muy grandes
convirtindose estas regiones en objeto de inters para anlisis de identificacin. (Jeffreys
1985).
Hace pocos aos los anlisis genticos estaban basados fundamentalmente en el
estudio de marcadores genticos convencionales (antgenos eritrocitarios y leucocitarios,
protenas sricas y enzimas eritrocitarias). En la dcada de los 80 se consigue un avance
espectacular en el campo de la gentica a raz del descubrimiento de las regiones
hipervariables del ADN A partir de este momento, la utilidad de los polimorfismos clsicos
va disminuyendo conforme se generaliza el estudio de estos nuevos marcadores, mucho
ms informativos, debido principalmente a la gran variabilidad y estabilidad qumica del
ADN, as como a la alta sensibilidad de las tcnicas que lo analizan. (Jeffreys 1985).
El anlisis detallado del genoma humano, ha revelado numerosas categoras de
secuencias de ADN no funcional, muchas de las cuales son diversas formas de ADN
repetitivo. Podemos clasificar al ADN segn su funcin, en tres tipos diferentes:

ADN codificante que se traduce en protenas. (30%) es el ADN responsable

directamente de la formacin de protenas, pues lleva la informacin necesaria para

formar la secuencia de aminocidos de cada protena. Este tipo de ADN es el que

forma los genes estructurales y tambin se le ha llamado ADN informativo. Del
total del genoma humano, se considera que tan solo el 1-2 % codifica para
protenas.Soporta gran presin selectiva, lo que se traduce en una variabilidad de
regiones limitada.

ADN auxiliar que participa en la formacin de protenas pero no es responsable

directo del orden de aminocidos de la protena. Suele tener diversas funciones: a)
reguladora de la transcripcin, es decir, contiene la informacin para que se forme
una protena (activacin) o para que se paralice su formacin (desactivacin). b)
mantenimiento de la integridad estructural del cromosoma. c) migracin de los
cromosomas durante la divisin celular.

ADN no funcional, que no se traduce a protenas. (70%) Se crea que careca de

funcin alguna y por eso se la ha llamado ADN basura, pero existen hiptesis que
postulan que tambin interviene en el mantenimiento de la arquitectura de los
cromosomas (Puertas, 1991). Comprende secuencias de ADN transcripcionalmente
inactivas de funciones diversas (como por ejemplo, promotores de genes) Este tipo
de ADN, por ser altamente polimrfico, tiene un gran inters de cara a la
identificacin de individuos. Lo podemos clasificar en :

ADN de copia nica: Est compuesto por secuencias que se encuentran

representadas una o muy pocas veces en el genoma. Se cree que puede actuar como
espaciador entre regiones codificantes de ADN.

ADN de copia mltiple: Las secuencias de este tipo de ADN, tambin denominado
ADN Repetitivo, pueden ser altamente repetitivas, moderadamente o poco
repetitivas. Podemos clasificarlas en base a sus dos caractersticas ms importantes:
su disposicin a lo largo del genoma y el tamao de la unidad de repeticin. Se
pueden reconocer dos grupos principales:

ADN Repetido en Tndem (10% del genoma). Una categora importante de ADN
repetitivo, est constituida por el ADN repetido en tndem. Est constituido por
bloques de ADN con una secuencia comn de nucletidos que se repiten uno a
continuacin de los otros un determinado nmero de veces. Estas secuencias estn
distribuidas a lo largo de todo el genoma y su polimorfismo es debido a cambios en
el n de veces que se repite una secuencia ncleo o core. Si dicho ncleo est
formado por 2-7 pb estaremos ante un microsatlite o POLIMORFISMO STR
(Short Tndem Repeat). Si est formado por ms de 7 pb estaremos ante un
minisatlite o POLIMORFISMO VNTR (Variable Number of Tandem Repeat).
Esta variacin se traduce en diferencias en la longitud de los fragmentos a estudiar.
(Weber y May, 1989).
Desde el punto de vista gentico es el ADN repetido en tndem y, dentro de l, el
ADN minisatlite y microsatlite (polimorfismos de repeticin), el ms interesante.
Los distintos componentes de este tipo de ADN repetitivo adoptan un patrn de
distribucin cromosmica diferente: el ADN satlite se sita en la regin
Centroamrica, el ADN minisatlite en los telmeros o en sus proximidades, y el
ADN microsatlite aparece disperso por todo el cromosoma, las secuencias de ADN
repetido en tndem se distribuyen por el genoma de dos maneras:
Tipo I: Grandes bloques formados por repeticiones de distintas unidades de
longitud variable. Se corresponde con los satlites clsicos I-IV y el satlite
alfoide.
Tipo II: Pequeos bloques distribuidos a lo largo de todo el genoma, con un
nmero variable de unidades de repeticin de secuencia similar. Pertenecen a
este tipo los minisatlites y los microsatlites.

ADN Satlite: Las secuencias repetitivas se disponen en grandes bloques de

diversas unidades de complejidad variable, con una longitud desde 100 Kb a varias
Mb. Este tipo de ADN no se transcribe y al organizarse de un modo tan complejo es
difcil su aplicacin. Para separar el ADN Satlite del resto del ADN genmico se
somete a centrifugacin en gradiente de densidad de Plata-Sulfato de Cesio,

obtenindose 2 bandas. La de menor densidad corresponde al ADN Satlite. Se

distinguen 4 tipos (I, II, III, IV) en funcin de su densidad, que est en relacin con
el mayor o menor contenido en GC (Singer 1982a). Representan en conjunto del 2
al 6% del genoma y tienen una secuencia consenso (unidad bsica de repeticin) de
5 a 170 pb (Prosser et al1986, Frommer et al 1982, Hollis y Hindley 1988, Waye y
Willard 1987).
Existen otros tipos de ADN satlite que no pueden distinguirse por centrifugacin
en gradiente de densidad, debido a que su densidad es semejante a la de los satlites
II y III. El satlite alfoide pertenece a esta categora, habindose comprobado que es
el nico satlite que est presente en todos los cromosomas, constituyendo la mayor
parte de la heterocromatina del centrmero. Su secuencia consenso contiene
aproximadamente 171 pb, con variaciones individuales (Choo et al. 1991).
ADN Minisatlite: El trmino ministelite se debe a Jeffreys, quien lo us para
designar loci de ADN repetitivo de un tamao menor que el de los satlites
clsicos. Los bloques de secuencias de este ADN poseen un tamao aproximado
entre 0.1 y 40 Kb y la unidad de repeticin es de 10-100 pb. Tienen un alto
grado de variabilidad, tanto en el nmero de repeticiones en tndem como en la
secuencia de la unidad de repeticin, por lo que ante tamaos idnticos podemos
estar frente a alelos diferentes. Denominaron a estos loci VNTRs (Variable
Number of Tandem Repeats) aludiendo a la variacin en el nmero de unidades
de repeticin. Se localizan preferentemente en las regiones subterminales de los
cromosomas que son las implicadas en los fenmenos de recombinacin, sobre
todo en lnea germinal masculina. (Nakamura et al 1987).
ADN Microsatlite: Los microsatlites fueron llamados as por su pequeo
tamao, hasta unos 400 pb, lo que los hace especialmente idneos para tcnicas
de PCR. Tambin se conocen como STRs (Short Tandem Repeats) pues la
unidad de repeticin oscila entre 2 y 7 pb (Edwards et al 1991). Se encuentran
ampliamente repartidos por todo el genoma Basndose en la longitud de la
unidad de repeticin y el nmero de veces que sta se repite, junto con las

posibles variaciones en su secuencia, Urquhart los clasifica en STRs simples,

compuestos y complejos. Posteriormente, Brinkmann propone una clasificacin
alternativa:

STRs

con

baja

microvariabilidad,

intermedia

alta

microvariabilidad (Weber y May 1989).

ADN Repetitivo Disperso (15-20% del genoma). Las unidades de repeticin no se

agrupan, sino que aparecen dispersas a lo largo del genoma. Est representado por 2
familias: SINEs y LINEs, que se diferencian en el nmero de nucletidos que
constituyen la unidad de repeticin. Algunos componentes de estas familias pueden
ser considerados como transposones (elementos genticos mviles), que son
fragmentos inestables de DNA con capacidad migratoria (Koremberg y Rykowski
1988).
SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements). Representan alrededor del
10% del genoma. Los constituyen repeticiones menores de 500 pb. La
familia ms representativa y mejor estudiada es la Alu, as llamada por
presentar un lugar de reconocimiento para el enzima de restriccin Alu I.
Las secuencias Aluson las ms abundantes en el genoma humano y tienen
una secuencia muy conservada de unos 300 pb relativamente rica en GC. Se
localizan en las regiones eucromatnicas, preferentemente en las llamadas
bandas R o bandas reversas (de replicacin precoz), que son las regiones
cromosmicas ms activas a nivel transcripcional.
LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements). Suponen del 2 al 5% del
genoma. Estn constituidos por secuencias repetitivas mayores de 500 pb. El
LINE-1o familia L1, llamada tambin Kpn, es el LINE ms abundante en
humanos, presentando un nmero elevado de repeticiones. Los elementos
L1se localizan principalmente en la eucromatina, en este caso a nivel de las
bandas G (de replicacin tarda) obtenidas al teir los cromosomas con
Giemsa. (Slagel et al 1987).

En general, las caractersticas que debe poseer un buen marcador gentico son las
siguientes:

Patrn de herencia bien establecido.

Elevado polimorfismo.
Alto grado de heterocigosidad.
Deteccin fiable de los alelos.
Datos poblacionales de frecuencias

establecidas.
Herencia independiente de los otros marcadores usados.
Tasa de mutacin baja.
Analizable mediante un mtodo simple, rpido y reproducible.
Precisar poco material para el anlisis. (Slagel et al 1987).

allicas,

fenotpicas

y/o

genotpicas

Una mutacin es una alteracin en la secuencia de ADN. Puede implicar desde un pequeo
evento como la alteracin de un solo par de bases nucleotdicas hasta la ganancia o prdida
de cromosomas enteros. Puede ser causada por daos producidos por qumicos, por
radiacin o por errores durante la replicacin y la reparacin del ADN. Una consecuencia
de las mutaciones puede ser una enfermdedad gentica, sin embargo, aunque en el corto
plazo puede aparecer como una algo perjudicial, a largo plazo las mutaciones son
esenciales para nuestra existencia. Sin mutacin no habra cambio y sin cambio la vida no
podra evolucionar.
Tipos de mutaciones:
Mutacin Puntual:
1. Errores en la Replicacin del ADN.
2. Dao en el ADN por Qumicos Mutagnicos o por Radiacin y Reparacin
Incorrecta del ADN.

1.
2.
3.
4.
5.

Deleciones o Inserciones Submicroscpicas

Recombinacin Desigual.
Incorrecta Alineacin Durante replicacin del ADN.
Insercin de Elementos Mviles.
Dao en el ADN por Qumicos Mutagnicos o por Radiacin y Reparacin.
Incorrecta del ADN.

 Deleciones, Translocaciones o Inversiones Visibles al Microscopio

1. Recombinacin Desigual.
2. Dao en el ADN por Qumicos mutagnicos o por radiacin y reparacin Incorrecta
del ADN.
Prdida de un Cromosoma Completo
1. Segregacin Incorrecta durante la Mitosis
(http://uvigen.fcien.edu.uy/utem/camgen/camgen.pdf)
POLIMORFISMOS DEL ADN
En 1980 Wyman y White dieron el primer paso en la identificacin gentica
por medio del ADN al descubrir un locus polimrfico caracterizado por un nmero de
fragmentos de restriccin de longitud variable, aunque el verdadero auge de los
polimorfismos de ADN se inicia con Jeffreys y colaboradores. Los primeros en
utilizarse con este fin fueron los denominados RFLPs Restriction Fragment Length
Polymorphism, polimorfismos en ADN minisatlite basados en la longitud de los
fragmentos de restriccin. Se identificaron mediante la digestin de ADN genmico
con enzimas de restriccin y posterior hibridacin con sondas. (Wong et al 1987,
Nakamura et al 1987).
En un primer momento se utilizaron las denominadas sondas multilocus
(MLPs, Multilocus Probes), que detectan mltiples loci minisatlites bajo
condiciones poco rigurosas de hibridacin, dando lugar a un complejo patrn de
bandas. Este patrn de bandas mltiples corresponde a distintos loci con secuencias
relacionadas entre s. Jeffreys y su equipo consideraron que estos patrones seran
prcticamente especficos para cada individuo y los denominaron huellas genticas
(DNA fingerprints). Poco tiempo despus se comienzan a utilizar sondas que
permiten detectar un nico locus (Wong et al 1987, Nakamura et al 1987)
Las denominadas sondas unilocus (SLPs, Single Locus Probes) que proporcionan una
o dos bandas segn el carcter homocigoto o heterocigoto del individuo para ese
locus. De esta manera se obtiene un perfil unilocus de ADN (DNA profiling). Un

mtodo alternativo, y en determinados casos mucho ms recomendable que el empleo

de sondas, lo constituye la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Mullis et
Faloona 1987, Saiki et al 1988).
El trmino polimorfismo fue empleado por Ford (1940) para designar la aparicin
conjunta en un lugar de dos o ms formas discontinuas de una especie, de tal manera
que la ms rara de ellas no se puede mantener simplemente a travs de la mutacin
peridica. En la prctica, para que un locus sea considerado polimrfico, el alelo
ms comn para ese locus debe tener una frecuencia poblacional menor del 99% y, de
acuerdo con la ley de Hardy-Weinberg, al menos un 2% de la poblacin debe ser
heterocigota para ese locus. (Saiki et al 1988).
TIPOS DE POLIMORFISMOS
De todos los polimorfismos analizables por PCR, los de mayor inters mdico-legal
pertenecen a los tipos minisatlite y, sobre todo, microsatlite. Ambos son particularmente
adecuados por ser altamente polimrficos y presentar un alto grado de heterocigosidad.
Puesto que estos polimorfismos se deben a diferencias en el nmero de copias de las
unidades repetitivas que presentan los distintos alelos, pueden detectarse tras la PCR
mediante electroforesis, generalmente en geles de agarosa o poliacrilamida, como
polimorfismos de longitud. Estos polimorfismos pueden ser separados en clases discretas
de alelos y clasificados por el nmero de repeticiones, lo que no es posible con el empleo
de sondas. De este modo se facilita enormemente la estima de frecuencias, constituyendo
una ventaja desde el punto de vista estadstico. (Alford et al, Schmitt et al 1994)
Las diferentes formas alternativas en las que un marcador puede manifestarse se
denominan alelos. Cuantos ms alelos (posibilidades) tenga un marcador gentico, mejor
resultar a la hora de diferenciar entre unas personas y otras. En los polimorfismos de
repeticin los alelos se denominan segn el nmero de repeticiones. Por ejemplo, en el
sistema HUMTH01 la secuencia que se repite es (TCAT). Si dicha secuencia se repite siete

veces, el alelo se llama 7. En los polimorfismos de secuencia los alelos se denominan tanto
con nmeros como con letras. (Alford et al, Schmitt et al 1994).
Los polimorfismos de secuencia pueden ser de varios tipos pues las variaciones que
aparecen en los alelos pueden deberse a mltiples motivos como el cambio en una sola base
nitrogenada o la insercin o deleccin de una o ms bases. Pues tambin son tiles en
identificacin. Un polimorfismo de secuencia se produce cuando en una misma regin de
ADN puede aparecer una secuencia de bases u otra distinta, sin tener que ver con el nmero
de repeticiones. A cada una de estas regiones polimrficas que se estudian en gentica
mdica se les ha llamado MARCADOR GENTICO, SISTEMA O LOCUS
Podemos hacer una sencilla clasificacin atendiendo a estos criterios:

Sustituciones de una nica base o SNPs (single nucleotide polymorphism): se trata

de mutaciones puntuales dentro de la secuencia de ADN y suelen ser de tipo
biallico, es decir presentan nicamente dos alelos. Estas mutaciones se clasifican
en dos tipos:
Transiciones, consistentes en el cambio de una purina por otra purina o
una pirimidina por otra pirimidina.
Transversiones, consistentes en el cambio de una purina por una

pirimidina o una pirimidina por una purina.

Sustituciones de varias bases: Cuando se produce un acumulo de estas sustituciones
en una regin ms o menos corta de ADN nos encontraremos ante un polimorfismo
de secuencia clsico con alelos que se diferencian en su secuencia en varias
posiciones en vez de en un nico nucletido. Tal es el caso del 2 exn de DQA1

dentro del sistema HLA (Human Leucocite Antigen) en el cromosoma 6.

Inserciones y deleciones de bases puntuales: tambin son mutaciones puntuales

dentro de la secuencia de ADN pero implicando la suma o resta de algn nucletido.

Inserciones y deleciones de una secuencia completa: se trata de mutaciones dentro
de la secuencia de ADN que implican la suma o resta de un grupo de nucletidos.
(Erlich y cols 1986).
POLIMORFISMOS DE REPETICIN.

Se trata del polimorfismo que se observa ms frecuentemente en el ADN repetido en

tndem. Es el nmero de veces que se repite un fragmento de ADN unidad de repeticin
que determina la diferencia entre unos individuos y otros. Segn el nmero de nucletidos
que forman las unidades de repeticin de estos fragmentos se distinguen:

Polimorfismos minisatlite: los minisatlites son polimorfismos formados por

la repeticin en tndem un nmero variable de veces de una secuencia ncleo
mayor de 7 pb. El nmero de repeticiones puede ser distinto entre los
cromosomas homlogos y entre diferentes individuos. Los minisatlites no
estn formados por unidades de repeticin idnticas en cuanto a secuencia y
por ello, en realidad poseen dos tipos de variacin, una debida a la longitud
(que depende del nmero de repeticiones, VNTR) y otra debida a las
diferencias en la secuencia de la unidad de repeticin (minisatellite variant

repeat o MVR).
Polimorfismos microsatlite: la unidad de repeticin o core consta de 2-7
nucletidos y son ms pequeos que los minisatlites pues cuentan con alelos
de un tamao aproximado de 80-400 pb. As mismo, el nmero de
repeticiones puede ser diferente entre los dos cromosomas homlogos de un
mismo individuo. Segn el nmero de pares de bases que presenten en la
unidad repetitiva se clasifican en: dinucletidos, con dos pb en cada core (son
los

ms

abundantes), trinucletidos, con tres

pb en cada

core,

tetranucletidos, con cuatro pb en cada core, pentanucletidos, con cinco, etc.

Los dinucletidos presentan el inconveniente de que cuando se analizan
aparecen artefactos de amplificacin minoritarios (llamados shadow bands
o picos sttuter) debidos al mecanismo de slippage (resbalamiento) de la
enzima polimerasa. Los STRs tetramricos presentan este problema de
manera mucho ms atenuada y los artefactos de amplificacin suelen ser
bandas que se identifican fcilmente y que presentan una unidad de repeticin
menos que el alelo real. (Stallings et al 1990).
Segn este tipo de variaciones podemos clasificar los STRs en:

 STRs simples o de baja microvariacin: son polimorfismos que

contienen repeticiones con unidades idnticas en longitud y secuencia.
Tal es el caso del locus HUMFES/FPS cuyo ncleo de repeticin es
(ATTT) 8-14 que contienen una unidad de repeticin tetranucleotdica.
STRs simples con alelos no consenso: se trata de STRs simples pero
alguno de sus alelos presenta alguna unidad de repeticin incompleta,
Entre los STRs simples ms usados est HUMTHO1 que presenta un
alelo con una de sus unidades de repeticin formada por tres pares de
bases en vez de cuatro. La designacin de alelos en este caso se realiza
contando el nmero de unidades de repeticin completas (nueve)
seguido de un punto y el nmero de pares de bases que forman la
repeticin incompleta.
STRs compuestos: son polimorfismos que comprenden dos o ms
tipos de unidades de repeticin adyacentes, con diferente secuencia. La
designacin de alelos en este tipo de STRs es ms complicada, pero en
este caso consiste en la suma del nmero de repeticiones de cada tipo
de ncleo, es decir, el nmero de repeticiones del tipo (NATM), pues
los tres tipos de unidades de repeticin poseen Adenina y Timina en
las posiciones centrales de la unidad.
STRs compuestos con alelos no consenso: son polimorfismos
compuestos pero con alelos que presentan alguna unidad de repeticin
incompleta como el locus HUMVWAFA31 que presenta dos
deleciones (de un residuo de Citosina y otro de Timina) en una de sus
unidades. La designacin de alelos en este caso se realiza contando las
unidades de repeticin del tipo (NTCT).
STRs complejos o de alta microvariacin: son polimorfismos que
presentan varios bloques de repeticin con unidades de longitud
variable con otras secuencias intercaladas ms o menos variables. Son
los STRs ms difciles de tipar y se acompaan tambin de una tasa de
mutacin ms alta. (Sharma y Litt 1992).

La nomenclatura aqu todava se complica ms pero se basa en el nmero de

unidades de repeticin del tipo (TCTN) incluyndose el hexanucletido final como si
se tratara de un dinucletido AT ms un tetranucletidos TCTA. Estas diferencias de
nomenclatura pueden dar lugar a errores por lo que se ha hecho un esfuerzo para
estandarizar adems de la nomenclatura de los alelos, tambin la descripcin de los
distintos loci. La sensibilidad de estos marcadores que permite el anlisis incluso en
muestras de ADN degradado, la estabilidad, la facilidad de la determinacin del
tamao de los alelos, la reproducibilidad y la posibilidad de realizar el anlisis de
varios marcadores en un solo tubo evitndose as un gasto excesivo de ADN molde,
de reactivos y de tiempo son algunos de los parmetros que han hecho que los STRs
sean los polimorfismos elegidos por los laboratorios de identificacin. (Br y cols.,
1997).
Actualmente parece que se estn acumulando evidencias a favor de que incluso los
microsatlites ms simples presentan algn grado de variabilidad interna en su estructura,
por lo que la clasificacin anterior sera cuestionable. Existen STRs relativamente simples y
extremadamente variables al mismo tiempo, como D12S391 y D1S1656 en los que la
asociacin directa entre variabilidad y complejidad no es sostenible. Las grandes ventajas
de los STRs son su estabilidad y la posibilidad de realizar PCR multiplex, amplificando
varios loci simultneamente Adems su anlisis se ha facilitado con el uso de fluorocromos
y secuenciadores automticos de ADN. Sus aplicaciones son muy diversas, como
construccin de mapas genticos, estudios poblacionales, anlisis de ligamiento en
enfermedades genticas, investigacin del cncer, estudios forenses, etc. (Kimpton et al
1993).

OTROS POLIMORFISMOS DE ADN

En el ADN mitocondrial (ADNmt), la zona ms variable se conoce como DLoop y se han analizado dos regiones de gran inters en Gentica de poblaciones

(HV1 y HV2). La dotacin mitocondrial es haploide y se hereda exclusivamente por

va materna, lo que facilita el anlisis de divergencias de secuencias, aunque esta
misma propiedad hace que este ADN no sea til para el estudio biolgico de la
paternidad.
Las clulas humanas contienen aproximadamente de 5 a 6 pgr de ADN, gran
parte del cual es ADN nuclear. Slo el 1% del total de ADN es ADN mitocondrial.
Por tanto, las mitocondrias son orgnulos celulares con su propio material hereditario.
Se trata de ADN circular de doble hebra con 16.569 pares de bases de longitud y
contiene informacin para 22 ARNts mitocondriales diferentes, para 2 ARNrs y para
13 protenas mitocondriales localizadas en la membrana interna, todas ellas
participantes en los procesos de fosforilacin oxidativa y 14 cadena respiratoria. Su
herencia es materna y no sufre recombinacin, es decir todos los individuos
emparentados va materna compartirn el mismo ADNmt. Esta es una caracterstica
que ha servido para la comparacin de miembros familiares no emparentados
directamente pero que comparten un ancestro materno comn. Por otro lado, la puesta
a punto de procedimientos automticos para la secuenciacin ha permitido que el
anlisis de secuencia sea una tcnica rutinaria en muchos laboratorios (Hunkapiller y
cols., 1991).
Se ha podido demostrar que en este tipo de ADN se acumula un n de
mutaciones superior a las que se acumulan en el ADN genmico. Este hecho se
explica por cuatro mecanismos distintos que intervienen paralelamente:

El material gentico mitocondrial est especialmente expuesto a la accin de

molculas reactivas en general (recordemos los procesos de oxidoreduccin
que acontecen en el interior de las mitocondrias).

El ADNmt carece del efecto protector que las histonas otorgan al ADN
nuclear.

Los mecanismos reparadores del ADN mitocondrial son menos efectivos

que los del ADN nuclear.

La baja fidelidad de la ADN polimerasa mitocondrial. Esta elevada

mutabilidad ha permitido la diferenciacin entre especies muy relacionadas
as como la comparacin entre poblaciones dentro de la misma especie
Como hemos visto, dentro de toda la molcula de ADN mitocondrial, las
mutaciones se acumulan en el D-Loop, y por eso esta regin es la ms
polimrfica. (Budowle y cols., 1999).

POLIMORFISMOS DEL CROMOSOMA Y.

El cromosoma Y Tras la fecundacin, la mitad del ADN del cigoto procede de la
madre y la otra mitad del padre. La mujer cede a su descendencia obligatoriamente un
cromosoma X, el varn en cambio puede contribuir con un cromosoma X o Y
determinando, por tanto, el sexo de su. Descendencia. Es uno de los cromosomas ms
pequeos del genoma humano, con un tamao aproximado de 60 Mb y en la especie
humana slo est presente en los varones, por lo que su herencia es paterna. (Morton
1991)
Desde el punto de vista citolgico, el cromosoma Y est formado por regiones
de heterocromatina y eucromatina. La regin heterocromatnica se sita sobre el
brazo largo (Yq) en posicin distal. Vara considerablemente en tamao entre
individuos. Se compone de secuencias altamente repetitivas, como por ejemplo
DYZ1 y DYZ2, presentando polimorfismos de longitud. La regin de eucromatina se
localiza en el brazo corto (Yp), centrmero y en la zona proximal del brazo largo. Su
tamao es bastante constante en varones normales (alrededor de 30 Mb). Es la regin
de mayor inters gentico. Aqu se encuentran algunos genes, as como secuencias
que muestran homologas con el cromosoma X y los autosomas, y tambin
secuencias repetitivas especficas del cromosoma Y (DYZ3, DYZ4, DYZ5). (Graves,
1995).

A pesar de que mucha bibliografa describe a este cromosoma como haploide,

es decir, que no recombina con ningn otro durante la meiosis, esto no es del todo
cierto. Los extremos finales del cromosoma Y tienen regiones que recombinan
normalmente con el cromosoma X; a estas regiones se les denomina
pseudoautosmicas y ocupan unas 2.7 Mb. Incluso existen hiptesis que apoyan que
el cromosoma Y puede ser considerado como un cromosoma X degradado durante la
evolucin Por tanto, de forma parecida a lo que ocurre con el ADNmt, la parte no
recombinante de los cromosomas "Ys es transmitida de padres a hijos sin ningn
cambio, a excepcin de la acumulacin gradual de mutaciones. Los haplotipos estn
confinados dentro de linajes, es decir, los hombres emparentados por va paterna
comparten el cromosoma Y. Esto permite reconstruir el historial de los linajes
paternos mediante la comparacin con los cromosomas Ys modernos, usando los
polimorfismos. As se pueden construir rboles filogenticos que pueden aportar
datos complementarios a los aportados por el ADNmt y los autosomas sobre la
evolucin humana (Jobling y Tyler-Smith, 1995).
El cromosoma Y contiene muchos polimorfismos y de muy diferentes tipos
detectables por mtodos basados en PCR muchos de ellos, que incluyen entre otros:

Duplicaciones/deleciones (Casanova et al 1985, Jobling et al 1996).

Reordenamientos complejos (Lucotte y Ngo 1985).
Mutaciones puntuales de cambios de base (Underhill et al 1996, 1997).
Inserciones Alu (Hammer 1994).
Polimorfismo en ADN repetido en tndem (Roewer et al 1992b, Jobling et al
1994b).

El cromosoma Y presenta una compleja secuencia, con grandes fragmentos de ADN no

codificante y numerosas familias de secuencias repetitivas dispersas o en tndem. El hecho
de que el cromosoma Y sea extraordinariamente pobre en genes hace pensar en una baja
presin selectiva en las zonas no codificantes del cromosoma, por lo que podra acumular
ms mutaciones y secuencias junk que los otros cromosomas. Adems, el que permanezca
ms tiempo en la lnea germinal, y que la formacin de esperma conlleve un alto nmero de

divisiones celulares, tambin podra favorecer la aparicin de mutaciones (Weber y Wong

1993, Brinkmann et al 1998).
Paradjicamente, la frecuencia de polimorfismos en regiones no codificantes del
cromosoma Y es mucho menor que en el resto del genoma nuclear. Hay varias posibles
explicaciones que intentan justificar este bajo nivel de polimorfismo observado en el
cromosoma Y respecto a otros cromosomas. Una de las proposiciones se basa en una razn
aritmtica, ya que la poblacin efectiva de cromosomas Y (nmero de cromosomas que
pasan a la descendencia) en un momento determinado es claramente inferior a la de otros
cromosomas (por cada cromosoma Y estn presentes 3 cromosomas X y 4 de cada
autosoma), lo que refleja el hecho de que existe correlacin entre diversidad y tamao de la
poblacin cromosmica (Kimura 1983). Adems, actividades histricamente ligadas al
gnero masculino como guerras y otras expansiones, as como ciertas estructuras sociales o
religiosas habituales en el pasado, todava reducen ms el nmero efectivo de cromosomas
Y. Todo esto hace que procesos como la deriva gentica hayan tenido un efecto mucho ms
patente sobre el cromosoma Y que sobre cualquier otro, lo que acrecienta su inters para
estudios de evolucin humana (Roewer et al 1996a, Underhill et al 1996).
El anlisis de las primeras secuencias de ADNmttuvo una gran repercusin en el estudio de
las relaciones filogenticas entre los diferentes grupos humanos actuales. El hecho de que
una molcula se herede exclusivamente por va materna y sin sufrir recombinacin, permite
preservar la informacin de los sucesos mutacionales que han surgido en un linaje
mitocondrial determinado en las generaciones pasadas. Pero el ADNmt no es la nica
molcula que tiene un gran potencial filogentico. El cromosoma Y, portador de los genes
determinantes del sexo masculino, tambin se hereda uniparentalmente (en este caso por
va paterna) y no padece fenmenos de recombinacin en prcticamente toda su extensin
(Wolf et al 1992).
MARCADOR - STRs DEL CROMOSOMA Y.

Los marcadores moleculares del cromosoma-Y son importantes en la identificacin humana

por su diversidad o polimorfismo (gran variabilidad entre individuos), resultante de
variaciones en la secuencia del genoma (alelos) en regiones no codificantes, determinadas
por el nmero de veces que se presenta un alelo con respecto al nmero total de alelos en
una poblacin para un locus en particular (frecuencia gnica), lo que refleja el grado de
heterogeneidad y su poder de discriminacin. El cromosoma-Y, por no recombinarse,
transmite los polimorfismos en forma ligada de generacin en generacin en individuos de
sexo masculino como un haplotipo (combinacin de estados allicos de secuencias
polimrficas localizadas en el cromosoma-Y humano), y traza la evolucin del linaje
paterno, adems refleja las migraciones humanas y permite el uso en identificacin humana
Los STRs del cromosoma Y descritos presentan unidades de repeticin que comprenden de
dos a cinco nucletidos (dinucletidos, trinucletidos, tetranucletidos y pentanucletidos).
(Mathias et al 1994).
Entre ellos se encuentran:

DYS288: Este microsatlite de cromosoma Y posee como unidad de repeticin el

dinucletido CA y presenta un nico locus polimrfico.

YCAI: Su unidad de repeticin es el dinucletido CA Se detectan dos loci

polimrficos.

YCAII: Tambin presenta el repeat CA y dos loci polimrficos.

YCAIII: Comparte con los anteriores la misma unidad de repeticin, siendo dos los
loci polimrficos detectados para el cromosoma Y.

DYS388: Este STR tiene como unidad de repeticin el trinucletido ATA. Tiene un
slo locus polimrfico.

DYS392: Se caracteriza por el repeat ATT y es poseedor de un nico locus

polimrfico

DYS19: Este STR, primeramente denominado polimorfismo Y27H39, fue el

primero que descrito en el cromosoma Y. La unidad de repeticin es el
tetranucletido GATA. Presenta un locus polimrfico.

DYS390: La unidad de repeticin es CTAT y tiene solo un locus polimrfico.

DYS391: Este sistema tiene como motivo de repeticin el tetrmero CTAT y un

nico locus polimrfico.

DYS393: La unidad repetitiva bsica es el tetranucletido GATA. Existe un slo

locus polimrfico.

DYS389I/II: La unidad de repeticin es tetranucleotdica (CTG/AT) y presenta 2

loci polimrficos.

DYS385: En este sistema estn implicados dos loci. La unidad de repeticin es

GAAA. (Mathias et al 1994).

El marcador STR Y DYS447 es pentanucleotidio y el DYS448 hexanucletido.<DYS447 y

DYS448 fueron recientemente descubiertos como parte de un esfuerzo en curso en la
Universidad de Arizona para caracterizar marcadores polimrficos STR Y. El preliminar
alelo rangos de DYS447 y DYS448 se determinaron experimentalmente mediante el panel
de YCC . Dado que el tamao vara de DYS447 y DYS448 no estaban disponibles en la
literatura, el rango de tamao se determin empricamente mediante la ejecucin de las
muestras YCC.DYS447: alelos intermedios y 1 alelo duplicado en DYS447 se ha
descubierto y caracterizado alelos atpicos.Alelos nulos en DYS448 con delecin parcial
AZFc. (Redd et al.)
Las relativamente altas frecuencias del alelo nulo DYS448 en los asiticos sugerir que
consideren cuidadosamente el uso de DYS448 para genotipado comercial y ms de la

construccin de bases de datos en los asiticos. Disposicin de anlisis de sitios de

secuencia etiquetados demostr que la patrones de delecin en DYS448 se asociaron con
arreglos del gen AZFc y aparece la supresin DYS448 relativamente frecuente en los
asiticos, La estimacin de las frecuencias allicas y haplotpicas se defini como la
proporcin en la que se encuentra cada alelo o haplotipo dentro de la poblacin de estudio y
la frecuencia de los haplotipos. (Falconer et al.,1989).
Gran parte de los modelos tericos de la gentica de poblaciones est basado en la
panmixia de las poblaciones; sin embargo, la realidad de las poblaciones, principalmente de
las poblaciones humanas, es muy diferente. Una poblacin no constituye generalmente una
unidad panmtica, sino que, por el contrario, se encuentra subdividida por barreras de
distinta naturaleza ya sea geogrfica, social, religiosa, lingstica y econmica, entre otros.
El concepto de estructura de una poblacin, desde el punto de vista gentico, se ha definido
como el resultado de todos los mecanismos que afectan a las frecuencias gnicas o
genotpicas de una poblacin, de tal manera que incluye los efectos de consanguinidad,
deriva gnica, migracin, seleccin y mutacin. As mismo, toma en cuenta factores como
el tamao y distribucin de las subpoblaciones (Falconer et al., 1989).

Los kali'na o kari'a (antiguamente Galibis o Caribes) son una etnia amerindia del norte de
Sudamrica, se dividen en diferentes tribus o grupos independientes que comparte la lengua
y ciertas tradiciones. Son tradicionalmente nmadas y actualmente viven un proceso de
transicin a la vida sedentaria debido al avance de la explotacin minera y agrcola
moderna sobre su territorio tradicional. Su actual organizacin comunitaria est compuesta
de un capitn electo por cada comunidad, un capitn general electo por los capitanes
comunales. Los Karia forman parte de la organizacin regional llamada Federacin
Indgena del Estado Bolvar (FIB).
Los karia, que hoy habitan en los Estados Anzotegui, Bolvar, Monagas y Sucre en el
territorio venezolano, as como en el Esequibo, Repblicas de Gurana, Surinam y la
Guyana Francesa, son los descendientes de los famosos caribes que opusieron una larga y

bastante exitosa resistencia a la conquista europea. El, nombre antiguo de este grupo tnico
se utiliza adems para denominar al tronco lingstico que agrupa varios idiomas, entre
ellos, el de los karia: el tronco caribe. Los karia comparten con otros grupos caribehablantes elementos de un modelo de estructura social basado en la familia extendida,
formada por un hombre casado, su esposa, sus hijos solteros y sus hijas casadas, ms los
maridos de stas y sus respectivos hijos. En lo poltico, destacan la descentralizacin, ya
que cada aldea o comunidades autnoma, y la figura del dopooto o "gobernador', cuyo
liderazgo se fundamenta en el prestigio personal; en la extensin de su red de parentesco y
en su capacidad de persuasin, puesto que sus decisiones no son coercitivas sino fruto de un
amplio consenso. (Bior y Amodio)

En Zacatecas, Mxico, se realizo un estudio gentico poblacional de frecuencias allicas

para 15 marcadores STR presentes en dicha poblacin, aplicado a la prctica forense, con el
objetivo de crear una base de datos de la poblacin Zacatecana, obtener el perfil gentico y
con ello obtener las frecuencias allicas y genotpicas para ser utilizadas en casos forenses.
Donde se obtuvieron las frecuencias allicas de la poblacin encontrando alelos que no se
haban reportado en estudios con poblaciones similares, empleando estos datos en casos
forenses de manera exitosa y con resultados ms exactos.
En Colombia se realizo un estudio de Polimorfismos de 17 marcadores STR del
cromosoma-Y en una muestra poblacional, se determinaron 71 haplotipos con 17
marcadores STR-Y, de los que 68 eran nicos y 3 fueron observados en 2 individuos con un
haplotipo compartido para los dos departamentos del altiplano cundiboyacense. La
diversidad haplotpica para la muestra poblacional fue de 99.9% con un poder de
discriminacin de 95.9% y probabilidad de coincidencia al azar de 1.5%. La comparacin
de las dos poblaciones entre s no present diferencias estadsticas significativas, es decir,
no hubo variaciones de las frecuencias allicas entre Cundinamarca y Boyac.

En Maracaibo, Zulia, se determinaron marcadores polimrficos del cromosoma-y en grupos

indgenas de este estado. Cuyo objetivo consisti en caracterizar la estructura gentica de
tres grupos indgenas zulianos a travs del anlisis de DYS385a/b, DYS389I, DYS389II,
DYS287 y DYS199 del cromosoma Y, mediante la tcnica de PCR en una muestra de 71
individuos pertenecientes a 3 grupos indgenas zulianos: Wayu, Bar y Yukpa. Treinta y
dos haplotipos diferentes fueron observados, veintisiete en Wayu y cinco en Bar, los
Yukpa presentaron un nico haplotipo que se repiti en los Wayu. Para cada locus, los
niveles de diversidad gnica por poblacin variaron entre 0 y 0,72 y los de diversidad
haplotpica entre 0 y 0,96. Existen diferencias marcadas desde el punto de vista gentico e
histrico entre los 3 grupos indgenas estudiado. Los haplotipos Y-STRs y marcadores
biallicos permiten conocer la composicin gentica y origen ancestral de las mismas.

JUSTIFICACIN
El estudio de los marcadores de ADN ha tenido un gran impacto en campos como la
medicina clnica, el diagnstico de enfermedades genticas, la biologa evolutiva y la
biologa forense ya que estos presentan un contenido polimrfico sin precedentes en
relacin con los polimorfismos de marcadores proteicos que se solan utilizar en los
estudios de identificacin.
Los polimorfismos de cromosoma Y son indudablemente de un gran intersforense
y permiten arrojar luz sobre problemas de identificacin o casos depaternidad de difcil
solucin con polimorfismos de ADN de cromosomas autosmicos, pero sobre todo,
permiten el anlisis de vestigios de inters criminal.
.
La facultad de detectar y discriminar ADN de varn hace de los STRs del
cromosoma Y un eficaz complemento de los establecidos sistemas autosmicos basados
tambin en PCR.

Estos STRs no estn secuenciados y de ellos no disponemos de escaleras allicas

secuenciadas. Sin embargo sus aplicaciones son muy diversas, como construccin de mapas
genticos, estudios poblacionales, anlisis de ligamiento en enfermedades genticas,
investigacin del cncer, estudios forenses, etc.
En el presente trabajo nos propusimos construir escaleras allicas secuenciadas para su
disposicin por toda la comunidad cientfica, as como tambin la realizacin de un estudio
gentico poblacional obteniendo datos importantes para todas las diferentes aplicaciones
que puedan derivarse

OBJETIVOS

Determinar la frecuencia allicas y haplotpicas de los polimorfismos STRs

DYS447 y DYS448 ubicados en el cromosoma Y, en la poblacin Karia

OBJETIVOS ESPECFICOS:

Estandarizar la metodologa para el anlisis de los loci STR DYS447 Y DYS448,

para trabajos gentico-poblacionales.

Identificar los alelos pertenecientes a los polimorfismos de los loci STR DYS447 y
DYS448 del cromosoma Y en la poblacin Karia.

Determinar la frecuencia allicas de los loci STR DYS447 Y DYS448 del

cromosoma Y en la poblacin Karia

Determinar la frecuencia haplotpica de los individuos masculinos de la poblacin

Karia, que incluyen los marcadores STR DYS447 y DYS448