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- Microbiologa Sanitaria I

Laboratorio N1: Uso del microscopio y coloracin de bacterias

I. OBJETIVOS

1. Saber diferenciar a un microorganismo Gran positivo de uno Gram negativo por


los colores que se observan para el Gram positivo color azul para el Gram
negativo color rojo.
2. Conocer las enfermedades provenientes del suelo, aire y agua causantes por
estos microorganismos.
3. Conocer las tcnicas para observar microorganismos con el microscopio.

II. FUNDAMENTO TERICO

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MICROSCOPIO
El tamao de muchas de las estructuras biolgicas y muchos seres vivos estn fuera
del poder resolutivo del ojo humano (0.1 mm aproximadamente), y por lo tanto, hacen
falta una serie de instrumentos que permitan visualizarlos. Uno de estos instrumentos
es el

Microscopio ptico:
El microscopio, mediante dos sistemas de lentes, el ocular y el objetivo (por este
motivo, muchas veces recibe el nombre de Microscopio Compuesto), permite
visualizar con detalle, estructuras de dimensiones verdaderamente pequeas.
Est compuesto de diferentes partes: Mecnica, ptica y de iluminacin.
A. PARTE MECNICA:
1. Base o pie: Sirve de soporte al microscopio y suele tener el peso suficiente para
darle estabilidad al equipo.
2. Columna: Une la platina a la base y sostiene al condensador y al diafragma.
3. Tubo: Sostiene al ocular y al objetivo y los mantiene separados por la distancia de
trabajo correcta.
4. Brazo: Continuacin de la base o pie que permite movilizar al microscopio con la
mano.
5. Platina: Sostiene las preparaciones con la muestra colocadas sobre una perforacin
central que deja pasar la luz que viene del condensador o del espejo.
6. Pinzas: Sostienen a la lmina portaobjeto con firmeza sobre la platina.
7. Revolver: Permite colocar en posicin de trabajo, alternativamente, los objetivos
que posee el microscopio.
8. Tornillo macromtrico: Mueve la platina o el tubo hacia arriba o hacia abajo,
acercando o alejando rpidamente el objetivo a la distancia de trabajo aproximada con
respecto a la muestra.

9. Tornillo micromtrico: Permite mover lentamente y con precisin el tubo hacia la


platina o viceversa.
B. PARTE PTICA:
10. Oculares: Compuestos por lentes que multiplican el aumento del objetivo. Estn
ubicados en la parte superior del tubo. Un buen ocular (10x) puede permitir un
aumento total de 1000x.

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11. Objetivos: Estn montados en el revlver. La mayora de los microscopios actuales


son parafocales; es decir, cuando un objeto est enfocado con un determinado
objetivo, al cambiarse de objetivo no se pierde el enfoque.
Desde un punto de vista ms prctico, el poder resolutivo de un objetivo depende de
tres factores:
Apertura angular: Es el ngulo del cono de luz que entre en la lente frontal del
objetivo. El valor ptimo de este ngulo es el ngulo que produce un cono de luz
con un dimetro que coincide con el dimetro del lente frontal del objetivo.
Cuando este ngulo es muy pequeo, la resolucin es muy pobre. Una de las
funciones del condensador es producir un ngulo ideal del cono de luz.
ndice de refraccin: Del medio a travs del cual la luz va desde la preparacin o
muestra hasta la lente frontal del objetivo.
Longitud de la onda de luz: Cuanta ms pequea es la longitud de onda de la luz
utilizada, ms grande es el poder de resolucin el objetivo.
Siguiendo esta lnea, el poder de resolucin se puede determinar por la expresin:
Dnde:
R = Poder de resolucin
l= Longitud de onda de la luz utilizada
n= ndice de refraccin del medio entre el lente frontal
del objetivo y la preparacin
= apertura angular que incide en el lente frontal.
La expresin de la apertura numrica es la siguiente:
Se puede observar que cuanto ms grande es la apertura numrica
ms pequeo es el poder de resolucin y por lo tanto, mejor ser la
resolucin del objetivo.

12. Fuente de luz: Puede utilizarse luz artificial de una lmpara externa o una que se
inserta en la base o pie del microscopio. Cuando se utiliza la lmpara externa se
requiere de un espejo.
13. Espejo: Lo requieren los microscopios que trabajan con lmparas externas y
permite reflejar hacia arriba la luz que debe pasar a travs del diafragma, la platina, la
preparacin y el sistema ptico. El espejo plano se utiliza cuando hay bastante luz y el
cncavo cuando hay poca luz.
14. Condensador: concentra el haz luminoso en la preparacin.
15. Diafragma: regula la cantidad de luz que pasar a travs de la preparacin.

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16. Lentes: Las lentes son el componente ms importante del microscopio; se fabrican
de vidrio u otros materiales transparentes. Pueden ser convexas o cncavas en ambas
superficies, planas en una cara o tener cualquier combinacin de stas dos formas en
su superficie. Las lentes son de dos tipos: positivas y negativas.
Lentes Positivas: Hacen converger los rayos de
formar una imagen real.

luz, es decir, los concentra para

Lentes Negativas: Hacen divergir los rayos de luz, sin formar ninguna imagen
real.
El microscopio es el instrumento ms caracterstico de un laboratorio microbiolgico.
Esencial para la observacin de los microorganismos que permiten un amplio rango de
aumentos. Los microscopios son, de dos tipos: de luz y electrnicos, segn el principio
en que se basa su poder de magnificacin.
En los microscopios de luz, el aumento se obtiene por medio de un sistema de lentes
pticos; en los electrnicos se emplea un rayo de electrones, en vez de luz y campos
electromagnticos en lugar de lentes, para lograr la imagen aumentada.
TIPOS DE MICROSCOPIO
Microscopio ptico:
Seguramente es el ms conocido, ya sea por fotos, ilustraciones o porque es el que se
usa en el laboratorio de las escuelas. Est formado por numerosas lentes que pueden
aumentar la visualizacin de un objeto.
Algunos microscopios pticos puede agrandar la imagen por encima de las 2.000
veces. Con este tipo de instrumento se pueden ver tejidos vivos y observar los cambios
que ocurren en un perodo de tiempo.
Microscopio electrnico:
Funciona mediante el uso de ondas electrnicas. El "bombardeo" de electrones permite
obtener imgenes ampliadas de la muestra, las que se proyectan sobre una pantalla
como la del televisor. El microscopio electrnico puede aumentar la imagen de un
objeto entre 50.000 y 400.000 veces.
Microscopio de efecto tnel:
Este microscopio utiliza una especie de aguja cuya punta es tan fina que ocupa un slo
tomo. Esta punta se sita sobre el material y se acerca hasta una distancia
determinada. Luego se produce una dbil corriente elctrica.
Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la informacin atmica del
material de estudio en la pantalla de una computadora. Los materiales que pueden
observarse con este tipo de microscopio tienen sus limitaciones; deben, por ejemplo,
conducir la electricidad y ser elementos que no se oxiden: como el oro, el platino o el
grafito, entre otros.

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Microscopio de fuerza atmica:


Es similar al del efecto tnel. Usa una aguja muy fina situada al final de un soporte
flexible para entrar en contacto con la muestra y detectar los efectos de las fuerzas
atmicas. El resultado que se obtiene es parecido al del efecto tnel pero sirve para
materiales no conductores de la electricidad.

IMPORTANCIA DEL MICROSCOPIO


El microscopio es sin duda el elemento ms importante en cualquier laboratorio. Nos
permite, por ejemplo, ver clulas, microorganismos y bacterias, lo cual es imposible de
observar a simple vista.
Con el microscopio hemos descubierto infinidades de cosas que nos han ayudado a
evolucionar como por ejemplo se ha descubierto enfermedades que seran imposible
de detectar sin la ayuda del microscopio tambin se han descubierto las cura para esas
y muchas ms enfermedades.
El microscopio ayuda tambin a mirar y aprender de las estrellas y planetas que se han
observado gracias al microscopio, gracias al microscopio se descubri que no era el sol
el que giraba alrededor de la tierra sino la tierra alrededor del sol.
El microscopio ha sido una de las herramientas esenciales para el estudio de las
ciencias de la vida. Abri el ojo humano hacia una nueva dimensin. Tanto es as que
actualmente, el microscopio permite observar el "corazn" mismo de la materia: los
tomos.

TINCION DE GRAM
Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un mtodo de tincin que se usa
universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes grupos: se trata de la
Tincin de Gram. Es una tincin diferencial que basa su distincin en la estructura
diferente de la pared bacteriana de las bacteria Gram + (pared ms gruesa, y una sola
capa de peptidoglucano) y de las Gram- (pared ms delgada y dividida en dos partes).
El procedimiento y sustancias usadas son:
Colorante bsico Cristal Violeta o Violeta de Genciana: Es el primer
colorante que se echa sobre el frotis previamente preparado. Es un colorante
selectivo que tie a todos los microorganismos. Se deja actuar durante un
minuto y se lava con agua a continuacin.
Lugol: Producto compuesto de yodo y yoduro potsico. Es un mordiente, que
intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite. Se deja actuar un minuto y
se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se arrastre el colorante del todo.

Soluciones
aplicadas por
su orden

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Reaccin y apariencia de las bacterias


GRAM +

GRAM -

Cristal
Violeta

La bacterias se tien en violeta

La bacterias se tien en
violeta

Lugol

Complejo CV I se forma dentro de las


bacterias

Complejo CV I se forma
dentro de las bacterias

Alcohol

Las paredes celulares se deshidratan, hay


retraccin de los poros, la permeabilidad
disminuye, el complejo CV I no puede salir
de la bacteria, permanece violeta

Extraccin de lpidos de las


paredes celulares, aumento
de porosidad, CV I sale de
la bacteria

Safranina

La bacterias no afectadas permanecen


violetas

Las bacterias toman este


colorante y se tien de rojo

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas


Cocos Gram-positivos

Racimos: forma tpica de Staphylococcus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus

Tetradas: forma tpica de Micrococcus

Bacilos Gram-positivos

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Gruesos: forma tpica de Clostridium

Finos: forma tpica de Listeria

Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y


Nocardia

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas:


Cocos Gram-negativos

Diplococos: forma usual de Neiseria. Tambin


Moraxella y Acinetobacter

Cocobacilos: forma usual de Acinobacter

Bacilos Gram-negativos

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Bacilos finos: forma usual de


enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de


Haemophilus

Curvados: forma usual de Vibrio y


Campylobacter

Forma de aguja fina: forma usual de


Fusobacterium

BACTERIAS
Se considera que las bacterias son los organismos ms pequeos de vida libre
existentes en la naturaleza, ya que son capaces de crecer y reproducirse utilizando
nutrientes del ambiente donde se encuentran. Las bacterias son organismos
extremadamente pequeos.
TIPOS MORFOLGICOS DE LA BACTERIA

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Cocos:
Bacilos:
Espirilos:

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


USO DEL MICROSCOPIO
1. Reconocer todas las partes importantes del microscopio.
2. Busque el objetivo de menor aumento, 10 X y pngalo en el tope del revolver; el
objetivo har su ruido caracterstico al estar en posicin correcta.
3. Acomode la cara del espejo (plana para luz natural y cncava para luz artificial),
a fin de iluminar la totalidad del campo que se observa por el ocular.
4. Prepare el objeto que va observar (lamina de clulas de cebolla y algas).
5. Ponga la lmina sobre la abertura de la platina y centre el objeto que va a mirar
6. Mirando por el costado baje el objetivo utilizando el tornillo macromtrico hasta
que est muy cerca de la lmina.
7. Mire a travs del microscopio y levante el objetivo usando siempre el tornillo
macromtrico hasta ver la imagen.

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8. Use el tornillo micromtrico para enfocar con ms nitidez.


9. Abra o cierre el diafragma para mejorar la calidad de la imagen.
10.Para cambiar de aumento: centrar cuidadosamente la parte que va a ser
examinada. Levante el tubo porta lentes por medio del tornillo macromtrico,
cambie el objetivo y luego es el mismo procedimiento anterior.
PARA OBSERVAR CON EL OBJETIVO DE INMERSION:
1. Centre la preparacin y levante el tubo porta lentes por medio del tornillo
macromtrico y gire el revlver para colocar el objetivo de inmersin(97x)
2. Coloque una gota de aceite de cedro sobre la preparacin.
3. Mirando por el costado haga descender el objetivo con el tornillo macromtrico
hasta que toque la gota de aceite.

COLORACIN DE BACTERIAS
1. Preparacin de lminas utilizando
el mtodo Gram para la coloracin:
2. Usar laminas limpias y pasarlas
varias veces cortando la llama del
mechero Bunsen.
3. Dejar enfriar la lmina y colocar
sobre ella una gotita de suero
fisiolgico con el inoculador.
4. Esterilizar el
enfriar.

inoculador y dejarlo

5. Con el inoculador estril tocar el


cultivo que ha de ser examinado y
transferir un poquito de l sobre la
gotita de suero fisiolgico.
6. Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo sobre la parte central de la
porta objeto, cuidando de que se forme una pelcula muy delgada.

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7. Dejar que la pelcula seque al


aire.
8. Fijar la preparacin sobre el
porta objeto pasndolo por la
llama del mechero tres veces,
manteniendo la pelcula hacia
arriba de la llama.
9. Dejar enfriar.
10.Cubrir
la
pelcula
con
el
colorante cristal violeta (Gram
#1) y dejar as cubierto por
espacio de 20s. Lavar la lmina
con agua 2s.

V. TABLAS DE RESULTADOS Y OBSERVACIONES


Uso del Microscopio:
Grupos

Ocular

N1 : CELULA
10x
LAMINA

Objetivo Aument
s
os
10x
100x
43x
LAMINA:
CELULA DE430x
LA CEBOLLA

OBJETIVO:10X
OCULAR:10X
AUMENTO:100XN2
10x
DESCRIPCION DE LO OBSERVADO:

97x

970x

10x

100x

43x

430x

97x

970x

ncleo de la cebolla

10x

100x

10x
retcula N3
endoplasmtica

43x

430x

97x

970x

LAMINA : CEL LAMINA: CELULA DE LA CEBOLLA

10x

100x

N4
OBJETIVO:43X

43x

430x

OCULAR:10X
97x
AUMENTO:430X
10x
DESCRIPCION DE LO OBSERVADO:

970x

N5

10x

16x

43x

688x

97x

1552x

ncleo de la cebolla con una


mayor nitidez

160x

retcula endoplasmtica

pigmentacin de la cebolla
(color violeta)

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OBSERVACIONES A LA CEBOLLA:

Coloracin de Bacterias:
GRUP
O

AMBIENTE
Laboratorio de
Microbiologa

N 1
Huella Digital

CARCTERES DE LAS
COLONIAS

FORM
A

AGRUPACIO
N

GRAM

Tamao: 1mm
Borde: Liso
Elevacin: Plana
Carcter ptico: Opaco
Pigmentacin: Crema

Cocos

Estreptococos

Positivo

Tamao:
Borde: Risoide
Elevacin: Convexa
Carcter ptico:

Cocos

Estafilococos

Positivo

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Trslucido
Pigmentacin: Crema

Tubo N 2
N 2

Cantidad de
crecimiento:
Abundante
Distribucin de
crecimiento: Distante

Tubo N3

Fotocopiadora
N 3
Placa 4
No estril

Tubo N 2
Tubo estril +
Pipeta no estril
N4

Tubo N 3
Tubo no estril
+ Pipeta estril

Pelo
N5
Huella Digital

Cocos

Estreptococos
Diplococos

Cocos
Bacilo
s

Estreptococos
Bacilos
Simples

Positivo

Positivo

Tamao:10mm
Borde: Liso
Elevacin: Convexo
Carac. pticos: Opaco
Pigmentacin: Crema

Cocos

Estreptococos

Negativ
o

Tamao:2mm
Borde: Liso
Elevacin: Plana
Caract. pticos: Opaco
Pigmentacin: Crema
oscuro

Bacilo
s

Estreptobacil
os

Negativ
o

Cocos
Bacilo
s

Estreptococos
Diplococos
Estreptobacil
os

Cocos
Bacilo
s

Estreptococos
Bacilo Simple

Cocos

Estafilococos

Bacilo
s

Diplobacilos

Cantidad de
crecimiento:
Abundante
Distribucin de
crecimiento:
uniformemente
distribuido.
Olor: Ptrido
Cantidad de
crecimiento:
Abundante
Distribucin de
crecimiento: Pelcula
Olor: Ptrido fuerte
Tamao: 1 mm
Borde: Liso
Elevacion: Convexa
Carcter ptico: Opaca
Pigmentacion: Amarillo

Tamao: 3 mm
Borde: Ondulante
Elevacion: Plana
Carcter ptico: Opaca
Pigmentacion: Crema

Positivo

Positivo

Negativ
o

Positivo

IV. DISCUSIONES

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La ubicacin de la luz en la parte inferior del microscopio ayuda a la resolucin


del mismo, como la abertura. Gracias a estos se pudieron observar las muestras
con gran nitidez.
Para obtener una imagen de mayor aumento, ms ntida y con mayor poder de
resolucin en el microscopio debemos:
-

Disponer de oculares de gran aumento


Utilizar aceite de inmersin de buena calidad.

Vemos en el cuadro que en pocos casos se forman estructuras sostenibles. Como


los estafilococos, estreptococos, estreptobacilos. La razn de su desarrollo se
debe a la presencia de los nutrientes del agar y la exposicin al ambiente.
El alcohol disuelve las grasas, para que el otro colorante de contraste.

V.

V. CONCLUSIONES
Aprendimos que el microscopio es muy importante para el estudio del
microscopio y til as como tambin muy delicado y su manipulacin requiere
mucho cuidado.
Con el mtodo de la coloracin de Gram que fue explicado ya podemos observar
las caractersticas de las bacterias como la forma y la agrupacin.
Ahora sabemos que y un microorganismo Gram positivo aparecer teido de
color azul y un organismo Gram negativo tendr el color rojo.

VI. RECOMENDACIONES
Sostener de manera adecuada el microscopio. Y seguir las instrucciones de las
hojas sobre el manejo del mismo.

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Tratar, en lo posible, que el cultivo no sea viejo; pues eso podra ocasionar que al
hacer la coloracin, las Gram positivas se decoloren.

Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin


prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general
de los mismos.

Seleccionar la colonia menos viscosa.


Alejar del mechero sustancias orgnicas que se utilizaran en la tincin ya que
son combustibles.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS


1. http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.%20Cultivo%20de
%20microorganismos.pdf
2. PELCZAR. Microbiologa. 4ta edicin
3. BACTERIAShttp://es.scribd.com/doc/17102236/4-LABORATORIO-DEMICROBIOLOGIA-I
4. http://imaging.arl.arizona.edu
5. http://www.arrakis.es/lluengo/biologa1.html

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