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Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Bioqumica Analtica

Isolamento, purificao e caracterizao


do citocromo c de uma estirpe de
Saccharomyces cerevisiae

Ana Pereira, n. 24112 (pereira.anacatarina@gmail.com)


Ana Duarte, n. 23512 (analuisa_17_pa@hotmail.com)
Cntia Carreira, n. 24097 (c_catarinacarreira@hotmail.com)
Cludia Caleiro, n. 23313 (cludia.caleiro@hotmail.com)
Dbora Melo, n. 25594 (princesa_canuca17@hotmail.com)
Turno P3, Grupo 1
Licenciatura em Bioqumica

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Resumo
No presente trabalho experimental procedeu-se ao isolamento,
purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe Saccharomyces
cerevisiae, tendo-se obtido 10,747 mg de citocromo c, de peso molecular
12,2 kDa. A quantidade total de protena obtida no ltimo passo de
purificao foi 20,865 mg. O rendimento do ltimo passo de purificao foi
14,7% e o coeficiente de pureza foi 0,9758. O nmero de hemos obtido foi
1,29.
De modo a proceder ao isolamento do citocromo c, foi necessrio lisar
as clulas atravs da suspenso de fermento de padeiro, previamente
desfeito, em acetato de etilo e cloreto de sdio. Posteriormente, de modo a
purificar o citocromo c, efectuou-se uma cromatografia em batch, adicionouse sulfato de amnio para precipitar as protenas contaminantes (salting
out) e, para finalizar, efectuou-se uma cromatografia HPLC. Aps a
cromatografia em batch, efectuou-se uma dilise e foi retirada uma
pequena amostra para anlise espectroscpica, assim como, aps a
precipitao com sulfato de amnio.
Posteriormente, recorreu-se ao mtodo de Lowry para determinar a
quantidade total de protena e foram efectuadas uma electroforese em gel
de poliacrilamida em condies desnaturantes, para determinar o peso
molecular do citocromo c, e uma electroforese em gel de poliacrilamida
corado para deteco de hemos. De modo a determinar o contedo em
hemos por molcula de protena, recorreu-se ao mtodo da piridina
hemocromo.

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Introduo
Os citocromos so hemoprotenas, ou seja, contm um grupo
prosttico designado por grupo hemo que consiste num tomo de ferro no
centro de um anel de porfirina. O tomo de ferro tem um nmero de
coordenao 6. Os quatro ligandos do plano equatorial so tomos de azoto
do anel de porfirina e as posies de coordenao axiais so asseguradas
por resduos laterais de aminocidos da cadeia polipeptdica da protena. A
quinta posio de coordenao ocupada por um resduo de histidina e a
sexta posio preenchida por uma metionina. O ferro hmico possui spin
baixo e o estado de oxidao do ferro varia entre o estado reduzido (Fe 2+) e
o estado oxidado (Fe3+).
Os citocromos distinguem-se pelo tipo de hemo, natureza da cadeia
polipeptdica e propriedades espectroscpicas. Das quatro classes distintas
de citocromos (a, b, c e d), apenas foi estudado o citocromo c.
O citocromo c distingue-se dos restantes por possuir um grupo hemo
ligado covalentemente cadeia polipeptdica atravs de uma ligao tioter
com dois resduos de cistena da sequncia de aminocidos e por ser uma
protena solvel.

Figura 1 Estrutura tridimensional do citocromo c.

Figura 2 Estado de spin do ferro hmico do citocromo c.

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
O citocromo c um componente essencial da cadeia respiratria
mitocondrial, actuando como transportador electrnico entre os complexos
III e IV. A sua estrutura tridimensional foi determinada por cristalografia de
raios-X, revelando a presena de uma regio rica em lisinas com carga
positiva a valores de pH fisiolgico. A protena pode ser facilmente obtida na
sua forma pura e mantm-se estvel em soluo, sendo resistente
desnaturao e a alteraes da sua estrutura tridimensional nativa em
condies adversas de pH, temperatura e fora inica.
O citocromo c encontra-se dividido em quatro classes[6]:

Classe I Inclui o citocromo c solvel e de spin baixo das


mitocndrias e bactrias. Possui o stio de ligao do grupo hemo
junto do N-terminal da histidina e o sexto ligando junto do C-terminal
de uma metionina.
Classe II Inclui o citocromo c de spin alto. Apresenta o stio de
ligao do grupo hemo fechado para o N-terminal da histidina.
Classe III Compreende os vrios citocromos com grupo hemo de
baixo potencial redox. Os grupos hmicos do tipo c no so estrutural
e funcionalmente equivalentes e apresentam potenciais redox
diferentes, variando entre 0 e -400 mV.
Classe IV Originalmente criada de modo a conter protenas
complexas que possuem grupos prostticos para alm do hemo c.

No presente trabalho experimental procedeu-se ao isolamento do


citocromo c de uma estirpe Saccharomyces cerevisiae. O citocromo c de
Sccharomyces cerevisiae constitudo por uma cadeia polipeptdica com
104 resduos de aminocidos e tem um peso molecular de cerca de 12,6
kDa[5].
Como referido anteriormente, o estado de oxidao do ferro hmico
varia entre o estado reduzido (Fe 2+) e o estado oxidado (Fe 3+). Atravs de
anlise espectroscpica, possvel verificar se o ferro se encontra no estado
reduzido ou oxidado. O citocromo c no estado oxidado apresenta uma banda
intensa de absoro no espectro de UV-Vis devido presena do grupo
hemo, denominada banda Soret e detectada a cerca de 410 nm, assim
como um conjunto de bandas menos intensas na regio 550-600 nm,
denominadas bandas Q. A reduo do citocromo c acompanhada pelo
desvio da banda Soret para 420 nm e pelo aumento de intensidade do pico
de absoro da forma reduzida do citocromo c a cerca de 550 nm. A banda
de absoro a 280 nm deve-se presena de protenas com cadeias laterais
aromticas.

Figura 3 Espectros de absoro do citocromo c no estado oxidado ( esquerda) e


do citocromo c no estado reduzido ( direita).

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Resultados
Os resultados obtidos permitem verificar a eficincia das diversas
tcnicas utilizadas no isolamento, purificao e caracterizao do citocromo
c. Como tal, aps cada passo de purificao foi retirada uma alquota para
posterior anlise espectroscpica da sua pureza. A alquota 1 corresponde
amostra retirada aps a cromatografia em batch, a alquota 2 corresponde
amostra retirada aps a precipitao com sulfato de amnio e a fraco B
corresponde fraco mais pura obtida aps a cromatografia HPLC.
Aps a cromatografia em batch e dilise do eludo, obteve-se uma
amostra de colorao avermelhada, com volume total de 34 ml e qual foi
retirada uma alquota de 1 ml para posterior estudo espectroscpico.

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Absorvncia das formas oxidada e reduzida - Alquota 1


4.000
3.000
Absorvncia (uA)

2.000
1.000
0.000
200.0

400.0

600.0

800.0

Comprimento de onda (nm)


Forma oxidada

Forma reduzida

Grfico 1 Anlise espectroscpica da alquota 1, correspondente amostra obtida


aps cromatografia em batch.

Da mesma forma, aps a precipitao das protenas contaminantes


com sulfato de amnio ((NH 4)2SO4), centrifugao e dilise do sobrenadante,
obteve-se uma amostra com volume total de 102 ml e qual foi retirada
uma alquota de 1 ml para posterior estudo espectroscpico.

Absorvncia das formas oxidada e reduzida - Alquota 2


4.000
3.000
Absorvncia (uA)

2.000
1.000
0.000
200.0

400.0

600.0

800.0

Comprimento de onda (nm)


Forma oxidada

Forma reduzida

Grfico 2 Anlise espectroscpica da alquota 2, correspondente amostra obtida


aps precipitao com sulfato de amnio.

Aps a cromatografia HPLC, foram obtidas 17 fraces. possvel


identificar a presena de citocromo c, nas diversas fraces, atravs da
colorao vermelha, caracterstica da protena.

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
Atravs dos valores de absorvncia a 550 nm, a 570 nm e a 280 nm,
possvel determinar o coeficiente de pureza(1) que corresponde, no fundo,
razo entre a quantidade de citocromo c e a quantidade total de protena.
O valor de absorvncia a 550 nm corresponde absorvncia do citocromo c
e o valor de absorvncia a 280 nm corresponde absorvncia de protenas
com cadeias laterais aromticas. O valor de absorvncia a 570 nm
utilizado como branco.

| 280nm|
|570 nm|
| 550nm|
(1)

Coeficiente de pureza=
Tabela 1 Valores de absorvncia dos tubos a 280 nm e 410 nm, no estado oxidado,
e a 550 nm e 570 nm, no estado reduzido, razo entre as absorvncias a 410 nm e
a 280 nm e coeficiente de pureza.

Forma Oxidada

Forma Reduzida

Tubo

Aborvnci
a280nm

Absorvnc
ia410nm

Absorvnc
ia550nm

Absorvnc
ia570nm

3
5
7
9
11
13
15
17

0,031
0,167
0,042
0,076
0,070
0,031
0,316
0,262

0,092
0,690
0,181
0,314
0,250
0,132
0,799
0,358

0,018
0,163
0,048
0,081
0,062
0,040
0,170
0,040

-0,003
0,002
0,004
0,005
0,003
0,006
-0,001
-0,006

| 280nm|
| 410nm|

2,985
4,142
4,270
4,129
3,559
4,206
2,530
1,365

Coefici
ente
de
pureza
0,675
0,968
1,019
1,002
0,845
1,086
0,543
0,178

A410/A280 e Coeficiente de pureza


4.5

1.2

3.5

1.0
0.8

2.5
A410/A280

1.5

0.6 Coeficiente de pureza


0.4

0.5

0.2

-0.5 0

10 20 0.0
Tubos

A410/A280

Coeficiente de pureza

Grfico 3 Representao grfica da razo entre as absorvncias a 410 nm e a 280


nm e do coeficiente de pureza, determinados para cada tubo.

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Saccharomyces cerevisiae
O clculo da razo de pureza tem como objectivo estimar a pureza
das vrias fraces obtidas e escolher as mais puras, ou seja, as fraces
que tm um coeficiente de pureza superior a 1.
Considerando os resultados obtidos, possvel considerar as fraces
7 a 13 puras, uma vez que apresentam um coeficiente de pureza superior a
1, excepo da fraco 11. Como tal, juntaram-se as fraces mais puras,
ou seja, as fraces 7 a 13, tal como referido anteriormente, e obteve-se a
fraco B com volume total de 34 ml.

Absorvncia das formas oxidada e reduzida - Fraco B


4.000
3.000
Absorvncia (uA)

2.000
1.000
0.000
200.0

400.0

600.0

800.0

Comprimento de onda (nm)


Forma oxidada

Forma reduzida

Grfico 4 Anlise espectroscpica da fraco B, correspondente amostra obtida


aps cromatografia HPLC.

Tabela 2 Banda Soret e bandas Q do citocromo c e respectivos valores de


absorvncia, no estado nativo e no estado reduzido.

Amostra
Alquota 1
Alquota 2
Fraco B

Forma Nativa
Absorvncia
(nm)
414
0,503
520
0,063
549
0,100
411
0,629
520
0,075
549
0,098
411
0,305
521
0,038
549
0,052

Forma Reduzida
Absorvncia
(nm)
415
0,553
520
0,069
549
0,118
415
0,748
520
0,094
549
0,164
415
0,359
520
0,043
549
0,073

De modo anlogo ao efectuado para as diversas fraces obtidas


aps cromatografia HPLC, possvel determinar o coeficiente de pureza
para as amostras obtidas aps cada passo de isolamento e purificao do
citocromo c.
Tabela 3 Valores de absorvncia da alquota 1, da alquota 2 e da fraco B a 280
nm, no estado oxidado, e a 550 nm e 570 nm, no estado reduzido e coeficiente de
pureza.

Amostra

Forma

Forma Reduzida

Coeficiente

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
Oxidada
Aborvncia280
Alquota 1
Alquota 2
Fraco B

Aborvncia550

de pureza

Aborvncia570

nm

nm

nm

0,317
0,248
0,071

0,115
0,158
0,073

0,008
0,010
0,005

0,338
0,597
0,958

A relao entre os valores de absorvncia obtidos a 550 nm para cada


uma das fraces recolhidas e a concentrao de citocromo c dada pela

A=bc , em que

lei de Lambert-Beer. De acordo com a lei de Lambert-Beer,

representa o coeficiente de extino molar, b representa o percurso ptico


e c representa a concentrao.
A concentrao de citocromo c determinada considerando o
coeficiente de extino molar do citocromo c reduzido a 550 nm,
aproximadamente, 29,1 mM-1cm-1[1], o percurso ptico igual a 1 cm e o
respectivo factor de diluio.
A quantidade total de citocromo c, em mg, determinada
considerando o peso molecular do citocromo c, aproximadamente, 12,6
kDa[5].
Tabela 4 Quantidade de citocromo c e rendimento obtidos em cada uma das
fraces recolhidas ao longo da purificao.

Passo de
purifica
o
Cromato
grafia
CMC-52
Precipita
o com
(NH4)2SO

Volum
e (ml)

Quanti
dade
de
citocro
mo c
(mol)

Quanti
dade
de
citocro
mo c
(mg)

Rendim
ento
(%)

3,9521
0-5

34

1,344
10-6

16,930

100

1,0861
0-5

102

1,108
10-6

13,956

82,4

10

2,5091
0-5

34

8,529
10-7

10,747

63,5

Amost
ra

Factor
de
dilui
o

Concent
rao de
citocrom
o c (M)

Alquot
a1

10

Alquot
a2
Frac
oB

HPLC

Determinao da protena pelo mtodo de Lowry


Seguidamente, possvel determinar a concentrao total de
protena atravs do mtodo de Lowry e, deste modo, averiguar a eficincia
dos vrios passos de purificao. Para o efeito, traada uma recta padro
para uma soluo de citocromo c de corao de cavalo de concentrao
0,546 mg/ml.
Tabela 5 Valores de absorvncia a 680 nm (uA) e concentrao final de padro
(mg/ml) necessrios para construo da recta padro. Os valores assinalados a
vermelho no foram considerados para a construo da recta padro, de modo a
optimizar o valor de R e diminuir o erro associado.

Ensaio

Volume de
padro (l)

Volume de
H2O (l)

Absorvncia6
80 nm (uA)

Concentra
o final de

10

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

1
1
2
2
3
3
4
4
5
5

0
0
20
20
40
40
60
60
80
80

200
200
180
180
160
160
140
140
120
120

0,089
0,078
0,150
0,167
0,238
0,260
0,338
0,331
0,488
0,501

padro
(mg/ml)
0
0
0,0546
0,0546
0,1092
0,1092
0,1638
0,1638
0,2184
0,2184

Recta de calibrao - Mtodo de Lowry


0.700
0.600
0.500

f(x) = 1.78x + 0.07


R = 0.98

0.400
Absorvncia (uA) 0.300
0.200
0.100
0.000
0

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Concentrao (mg/ml)

Grfico 5 Recta padro para uma soluo de citocromo c de corao de cavalo de


concentrao 0,546 mg/ml traada para determinao da concentrao total de
protena pelo mtodo de Lowry. O ponto assinalado a vermelho no foi
considerado para a construo da recta padro, de modo a optimizar o valor de R e
diminuir o erro associado.

Considerando a equao da recta obtida e os valores de absorvncia


obtidos para as alquotas e para a fraco B, possvel determinar a
quantidade total de protena, em mg/ml, em cada uma das fraces
recolhidas ao longo da purificao.
Tabela 6 Valores de absorvncia a 680 nm (uA) e concentrao total de protena na
alquota 1 (mg/ml). Volumes de alquota 1 a usar na determinao de protena
total atravs do mtodo de Lowry: 1 l, 2 l, 3 l e 4 l. Os valores assinalados a
vermelho no foram considerados para a determinao da concentrao total de
protena na alquota 1, de modo a optimizar os clculos e diminuir o erro
associado.

Volume de
alquota 1
(l)

Absorvncia6
80nm (uA)

Factor de
diluio

Concentra
o total de
protena na
alquota 1
(mg/ml)

Concentra
o total de
protena na
alquota 1
(mdia)
(mg/ml)

11

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
1
1
2
2
3
3
4
4

0,116
0,095
0,150
0,159
0,163
0,134
0,186
0,210

20
20
10
10
20:3
20:3
5
5

5,435
3,082
4,623
5,127
3,568
2,484
3,320
3,992

4,164

Tabela 7 Valores de absorvncia a 680 nm (uA) e concentrao total de protena na


alquota 2 (mg/ml). Volumes de alquota 2 a usar na determinao de protena
total atravs do mtodo de Lowry: 7 l, 14 l, 21 l e 28 l. Os valores assinalados
a vermelho no foram considerados para a determinao da concentrao total de
protena na alquota 2, de modo a optimizar os clculos e diminuir o erro
associado.

Volume de
alquota 1
(l)

Absorvncia6
80nm (uA)

Factor de
diluio

Concentra
o total de
protena na
alquota 2
(mg/ml)

7
7
14
14
21
21
28
28

0,104
0,076
0,138
0,125
0,185
0,183
0,229
0,219

100:7
100:7
100:7
100:7
200:21
200:21
50:7
50:7

0,292
0,068
0,564
0,460
0,627
0,616
0,646
0,606

Concentra
o total de
protena na
alquota 2
(mdia)
(mg/ml)

0,587

Tabela 8 Valores de absorvncia a 680 nm (uA) e concentrao total de protena na


fraco B (mg/ml). Volumes de fraco B a usar na determinao de protena total
atravs do mtodo de Lowry: 10 l, 20 l, 25 l e 30 l. Os valores assinalados a
vermelho no foram considerados para a determinao da concentrao total de
protena na fraco B, de modo a optimizar os clculos e diminuir o erro associado.

Volume de
alquota 1
(l)

Absorvncia6
80nm (uA)

Factor de
diluio

Concentra
o total de
protena na
fraco B
(mg/ml)

10
10
20
20
25
25
30
30

0,114
0,125
0,187
0,181
0,170
0,222
0,219
0,219

20
20
10
10
8
8
20:3
20:3

0,521
0,644
0,670
0,636
0,459
0,693
0,566
0,566

Concentra
o total de
protena na
fraco B
(mdia)
(mg/ml)

0,614

Tabela 9 Tabela de purificao. Quantidade total de protena, coeficiente de pureza


e rendimento, em cada uma das fraces recolhidas ao longo da purificao.

Passo de

Amostra

Concentr

Volume

Quantida

Coeficie

Rendime

12

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
ao de
protena
(mg/ml)

(ml)

de de
protena
(mg)

nte de
pureza

nto (%)

Alquota
1

4,164

34

141,574

0,338

100

Alquota
2

0,587

102

59,855

0,597

42,3

Fraco
B

0,614

34

20,865

0,9758

14,7

purifica
o
Cromato
grafia
CMC-52
Precipita
o com
(NH4)2SO
4

HPLC

Electroforese em gel de
desnaturantes (SDS-PAGE)

poliacrilamida

em

condies

Aps a electroforese em gel de poliacrilamida (15%) em condies


desnaturantes, corado com Coomassie Blue R-250, possvel determinar o
peso molecular do citocromo c.

Figura 4 Gel de poliacrilamida (15%) em condies desnaturantes, corado com


Coomassie Blue R-250. Lane 1: citocromo c padro; lane 2: protenas padro; lane
3: alquota 1; lane 4: amostra pura (fraco B).

A observao do gel obtido por electroforese em gel de poliacrilamida


permite inferir sobre a mobilidade relativa (Rf) das protenas padro; a
mobilidade relativa define-se como sendo a razo entre a distncia
percorrida pela protena e a distncia percorrida pela frente do solvente. O
valor de Rf permite identificar protenas por comparao com padres.
A percentagem de acrilamida no gel 15%, ou seja, a gama de
massas moleculares que o gel permite resolver em SDS-PAGE 5-70 kDa.
Consequentemente, no foram considerados os valores de R f e do logaritmo
da massa molecular da protena de maior massa molecular.

13

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
Tabela 10 Mobilidade relativa e logaritmo da massa molecular das protenas
padro. A distncia percorrida pela frente do solvente 5,2 cm. Os valores
assinalados a vermelho no foram considerados para a construo da recta
padro.

Protenas
padro
Myosin
Galactosidas
e
BSA
Ovalbumin
Carbonic
Anhydrase
Soybean
Trypsin
Inhibitor
Lysozyme
Aprotinin

Distncia
percorrida
(cm)
0,3

0,058

Massa
molecular
(Da)
198844

Logaritmo da
massa
molecular
5,299

0,7

0,135

115700

5,063

1,35
2,05

0,260
0,394

96743
53541

4,986
4,729

2,6

0,500

37134

4,570

0,577

29134

4,464

3,5
4,5

0,673
0,865

19540
6905

4,291
3,839

Mobilidade
relativa (Rf)

possvel verificar que existe uma relao linear entre o logaritmo da


massa molecular e a mobilidade relativa. Esta relao usada para
determinar a massa molecular do citocromo c utilizando uma recta de
calibrao construda a partir de um conjunto de protenas padro de massa
molecular conhecida.

Logaritmo da massa molecular em funo da mobilidade relativa (Rf) para as protenas padro - Colorao com Azul Coomassie
5.5
5

Log MM

f(x) = - 1.68x + 5.38


R = 0.98

4.5
4
3.5
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Rf

Grfico 6 Recta de calibrao construda a partir de um conjunto de protenas


padro de massa molecular conhecida. Logaritmo da massa molecular em funo
da mobilidade relativa. O ponto assinalado a vermelho no foi considerado para a
construo da recta padro.

Tabela 11 Determinao da massa molecular do citocromo c.

Fraco

Distncia
percorrida

Mobilidade
relativa (Rf)

Massa
molecular

Logaritmo da
massa

14

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
(cm)
Impura
(Alquota 1)
Pura (Fraco
B)

(Da)

molecular

3,95

0,760

12679,9

4,103

0,769

12214,8

4,087

Electroforese em gel de poliacrilamida corado para deteco


de hemos

Figura 5 Gel de poliacrilamida corado para deteco de hemos. Lane 1: citocromo c


padro; lane 2: protenas padro; lane 3: alquota 1; lane 4: amostra pura (fraco
B).

Determinao do contedo em hemos


De modo a determinar o contedo em hemos por molcula de
protena, recorreu-se ao mtodo da piridina hemocromo.
O nmero de hemos por molcula de protena determinado com
base na absorvncia a 550 nm de uma soluo, reduzida com ditionito de
sdio, contendo citocromo c, NaOH e piridina e no coeficiente de extino
molar para o hemo do tipo c (29,1 mM-1cm-1).
Tabela 12 Valores de absorvncia a 550 nm de uma soluo, reduzida com ditionito
de sdio, contendo citocromo c, NaOH e piridina e concentrao de hemos (mg/ml).

Forma
Reduzida
Leitura
1
2
3

Aborvnci
a550nm (uA)
0,040
0,050
0,047

Factor de
diluio

Concentra
o de
hemos
(mM)

Concentra
o de
hemos
(mdia)
(mM)

Concentra
o de
hemos
(mg/ml)

40
40
40

0,055
0,069
0,065

0,063

0,791

Determinao do nmero de hemos por molcula de protena, usando


uma amostra da fraco mais pura de citocromo:

15

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Nmero de hemos por molcula de protena=

Concentrao de hemos
Concentrao de protena

Nmero de hemos por molcula de protena=

0,791
0,614

Nmero de hemos por molcula de protena=1,29

Discusso
O grfico de espectroscopia UV/Vis permite verificar os diferentes
comprimentos de onda a que a amostra absorve, quer na forma oxidada
quer na forma reduzida. Em todos os espectros obtidos possvel observar
elevada absorvncia a 280 nm, caracterstica de anis aromticos de
protenas, um pico a 420 nm, referente ao grupo hemo (banda de Soret) e
um outro a 550 nm, especfico de uma banda menos intensa denominada
banda Q. A banda de Soret apresenta um mximo de absorvncia a 410 nm
na forma oxidada, que deslocada para 420 nm na forma reduzida.

16

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
Analisando o grfico 1 e a tabela 2, referentes primeira alquota,
possvel verificar que os comprimentos de onda em estudo so
praticamente os mesmos para a forma oxidada e para a forma reduzida e
que o espectro de ambas as formas se encontra parcialmente sobreposto, o
que permite concluir que, provavelmente, a alquota 1 na forma nativa se
encontra relativamente reduzida, uma vez que no foram verificadas
alteraes significativas na presena de ditionito de sdio.
Relativamente tabela 2 e aos espectros da alquota 2 (grfico 2) e
da fraco B (grfico 4) possvel inferir quanto presena de citocromo c
no estado oxidado e consequente passagem ao estado reduzido, uma vez
que a banda de Soret na forma nativa apresenta um mximo de absorvncia
a 411 nm e quando reduzido sofre um desvio para valores de
comprimento de onda superiores, 415nm.
Quando o citocromo c se encontra na forma reduzida possvel
observar duas bandas Q, uma a 550 nm (caracterstica das formas oxidada
e reduzida) e outra a 520 nm (caracterstica da forma reduzida). Assim, por
anlise conjunta de grficos 1, 2 e 4 e da tabela 2, possvel verificar que
as absorvncias a 520 nm no estado nativo e na forma reduzida no
apresentam alteraes significativas, sendo possvel concluir que a forma
nativa no se encontra totalmente oxidada.
Por comparao entre ambas as alquotas e a fraco B, verifica-se
que a fraco B apresenta um deslocamento da banda Soret entre a forma
nativa e a forma reduzida e que a 520 nm a forma oxidada apresenta uma
absorvncia muito inferior de ambas as alquotas, resultado indicador de
que a fraco B na forma nativa apresenta uma maior quantidade de
citocromo c.
Analisando o gel de poliacrilamida (SDS) na presena de mercaptoetanol (figura 5), pode observar-se, relativamente ao poo 3, uma
banda com arrastamento que corresponde alquota 1 e, no poo 4, uma
banda sem arrastamento que corresponde fraco B. O arrastamento
verificado na alquota 1 deve-se presena de contaminantes,
nomeadamente, outras protenas. Os resultados obtidos indicam que
ocorreu purificao da alquota 1 para a amostra B.
Atravs da equao da recta obtida no grfico 6, possvel calcular
os pesos moleculares das bandas observadas. Para a alquota 1, foi obtida
uma massa molecular de 12679,9 Da, enquanto que para a fraco B foi
obtida uma massa molecular de 12214,8 Da, sendo esperado para o
citocromo c puro um peso molecular de 12,6 kDa, para o caso da espcie
Saccharomyces cerevisiae.
Analisando os resultados obtidos aps os diversos passos de
purificao efectuados, possvel concluir que a fraco B a mais pura, no
entanto, no a que apresenta uma massa molecular mais prxima da
esperada, uma vez que o poo no se encontra direito, influenciando, deste
modo, a determinao do peso molecular. Atravs destes resultados,
verifica-se uma grande proximidade entre os resultados obtidos e os
esperados, sendo possvel concluir que se conseguiu purificar o citocromo c
de uma maneira eficaz.
A partir do gel corado para hemos podemos ver uma banda com um
grande arrastamento no poo 3 e duas bandas no poo 4. Uma vez que o
citocromo c na ausncia de b-mercaptoetanol tem tendncia a originar
dmeros, podemos verificar essa formao com as duas bandas presentes
no poo 4. Quanto larga no poo 3 pode ser explicada
Analisando a tabela de purificao (tabela 9), verifica-se que a
concentrao de protena e, consequentemente, a quantidade de protena,

17

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae
diminui medida que a purificao decorre, o que j era esperado, uma vez
que a purificao utilizada de modo a excluir todas as protenas
excedentes. O coeficiente de pureza vai aumentando, o que significa que se
est a conseguir purificar a protena pretendida, neste caso, o citocromo c.
O coeficiente de pureza obtido foi 0,9758, significado de que a protena
pode no estar totalmente pura. No entanto, s possvel ter a certeza se o
citocromo c est puro ou no, ao ser realizada uma electroforese. A
electroforese efectuada permite inferir quanto pureza e concluir que a
amostra se encontra praticamente pura, pois o arrastamento diminui
bastante face aos resultados obtidos para as primeiras alquotas. Quanto ao
rendimento, possvel verificar que este diminui significativamente, o que
absolutamente espectvel, devido presena de uma grande quantidade de
outras protenas inicialmente (o rendimento inicial foi 42,3% e no ltimo
passo de purificao foi 14,7%). Grande parte dessas protenas foram
eliminadas e provvel que se tenha perdido algum citocromo c ao longo
da purificao, de modo garantir que se obteria a protena pura no final.
O coeficiente de pureza permite, tambm, avaliar qual o passo de
purificao mais eficiente ao longo da purificao, e, neste caso, possvel
verificar que foi a cromatografia por HPLC, pois foi onde houve maior taxa
de purificao em melhor rendimento.
Em relao ao nmero de hemos, calculado atravs da razo entre a
concentrao de hemos e a concentrao de protena, verifica-se que se
obteve 1,29 hemos, ou seja, 1 hemo por molcula de citocromo c.

18

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Concluso

19

Isolamento, purificao e caracterizao do citocromo c de uma estirpe de


Saccharomyces cerevisiae

Bibliografia
[1] Moura I., Pereira A.; Isolamento, purificao e caracterizao do
citocromo c de uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae; Bioqumica
Analtica I, Ano lectivo 2009/2010
[2] Moura I., Pereira A.; Acetatos de Bioqumica Analtica; Faculdade de
Cincias e Tecnologia Universidade Nova de Lisboa
[3] Berg, J. M., Tymoczko, J. L. e Stryer, L.; Biochemistry, 5 th. Ed. International
Edition. W. H. Freeman and Company. New York. 2002
[4] Wilson, K., Walker, J.; Principles and Techniques of Biochemistry and
Molecular Biology, 5th Ed. 2005
[5]
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzymeexplorer/learning-center/cytochrome-c.html
[6] http://metallo.scripps.edu/PROMISE/CYTC.html
[7] http://www3.bio-rad.com Protein Standards for Blotting