http://chemistry.armstrong.

edu/nivens/chem3801/SizeExclusionChromatogr
aphy.htm
a cromatografa de exclusin por tamao (filtracin en gel
Chromatography)
Para obtener ms informacin, consulte: Captulo 4 en Garett y Grisham o
Switzer y Garrity, Experimental Bioqumica, 3 ed WH Freeman and Co. 1999
Fondo:
SEC es una tcnica analtica preparativa, no destructivo que permite la
separacin de las molculas por su tamao. Esto es especialmente til en la
purificacin de protenas, porque si bien puede haber muchas protenas en una
muestra, sus pesos moleculares pueden variar ampliamente. Esto permite
separar una mezcla de protenas en base a esta distribucin de tamao
amplia. Tambin proporciona un procedimiento simple para la eliminacin de
sal (desalacin) a partir de una muestra de protena.
Molculas ms pequeas que el lmite de exclusin del material de gel se quedan
atrapados en las perlas de gel. Los de peso molecular mayor que no ser
atrapado pero fluir a travs del gel. Las molculas ms grandes son retrasados
slo por su forma y su facilidad de pasar por las perlas. De este modo, las
molculas ms grandes eluyen primero, mientras que las molculas ms pequeas
se mantienen ms tiempo en el interior de los granos y eluyen pasado.

Gel de seleccin es muy importante. Los geles se hacen tpicamente de dextrano

(Sephadex), agarosa (Sepharose) o poliacrilamida (Bio-Gel). Algunos geles,
tales como Spehadex G-10, retienen slo las molculas de 0-700 daltons,
mientras que otros, tales como Sephadex G-200 retienen molculas de 5000600000 daltons.
Adems de la separacin de una mezcla de protenas basado en el tamao,
cromatografa de filtracin en gel tambin permite estimar el peso molecular de
una protena globular desconocido. En primer lugar, la columna debe ser
calibrado. Para calibrar la columna, se mide el "volumen vaco" V o de la
columna, es decir, el volumen de lquido recogido desde el minuto que la muestra
se aplica a la columna hasta que una molcula no retenida se eluy de la columna

(tpicamente un gran, teidos azcar tal como azul de dextrano con un peso
molecular de 2x10 6 daltons). Esto representa el volumen de esa molcula no
retenida experiment en sus viajes a travs de la columna. Cada molcula
experimentar este volumen, ya sea retenido o no. Este valor debe medirse cada
vez que una columna de SEC se prepara y se usa porque es nica para cada
columna (basado en la densidad de empaquetamiento, composicin de gel,
longitud, etc.).
En segundo lugar, una serie de protenas estndar de peso molecular conocido se
aplica a la columna y el volumen al que se registra cada protena se eluye
estndar. Esto le da V r, el volumen de elucin. Una parcela de peso molecular de
la protena V vs. r / V o da una curva de calibracin para la columna. Esto lleva
tiempo y los datos para la curva de calibracin es nica para solamente esa
columna. Sin embargo, esta es la manera ms precisa para obtener los datos de su
columna de SEC.
Con el fin de comparar los datos entre las columnas, se utiliza un volumen de
elucin relativo. Recordemos que K d, la constante de distribucin se describe
cmo se distribuye la protena entre las dos fases:

En SEC, esta relacin se puede expresar como una relacin de tiempos de

retencin o volmenes de retencin (ver su libro de anlisis cuantitativo, captulo
sobre mtodos cromatogrficos para las derivaciones).
Donde V r es el volumen de retencin de la protena, o V es el volumen vaco y
V s es el volumen de la fase estacionaria. El volumen de la fase estacionaria es
difcil de calcular con precisin desde las partculas de gel varan en tamao y
volumen en cada lote y la columna. En lugar de ello, la constante de
distribucin media se utiliza:
donde V t es el volumen mximo de retencin experimentado por una molcula
pequea tal como un cido amino tinte etiquetado. Esta es una aproximacin del
volumen de la fase estacionaria en la columna. Valores de K avg se han
determinado por un nmero de geles y por un nmero de protenas. Esto permite
comparar valores de K avg a travs de diferentes columnas y diferentes
experimentos. Uno tambin puede grfico log MW vs. K d para obtener una
estimacin del peso molecular de una protena. Recuerde, esto no es tan preciso
como hacer una calibracin de la columna completa. Hay que tener cuidado en
la interpretacin de estos resultados. SEC separaciones estn influenciadas por
la forma protenas, as como la fuerza inica.

En este experimento, se determinar el volumen vaco (V o) y el volumen total

(V t) de su columna de SEC. A continuacin, ejecutar una curva de calibracin
de la columna de la SEC por la separacin de una mezcla de tres protenas patrn
de pesos moleculares conocidos. A partir de su volumen de elucin podr
determinar su K promedio. Por ltimo, tendr que ejecutar una muestra de protena
desconocida y determinar su K peso promedio y molecular.
Cmo sabemos que cuando una protena se eluye de la columna?
En el caso de azul de dextrano y el colorante marcado de aminocidos (cualquier
aminocido DNP), las molculas son de color azul o amarillo, respectivamente, y
uno puede verlos eluyen de la columna visualmente. Sin embargo, la mayora de
las protenas no presentan un color visual (protenas que contienen los hemos,
como -c citocromo o mioglobina ser rojo). En su lugar, que absorben a 280 nm
con un coeficiente de extincin que se relaciona con el nmero de aminocidos
aromticos en la protena (recordar sus tres aminocidos aromticos?). Como
recoja fracciones, tendr que supervisar cada fraccin en el UV-VIS a 280
nm. A continuacin, debe trazar Abs. vs. volumen para determinar dnde se
eluyen las protenas, sobre la base de un aumento en la absorbancia a 280 nm.
Procedimiento: Da 1

1.) Va a preparar su columna la semana antes del comienzo del laboratorio

como el gel necesita tiempo para asentarse.
2.) Obtener el gel SEC (G-100) de su instructor. Es ya estar empapando en
0,05 M pH 7 tampn Tris-HCl con 0,1 M NaCl. Esto permite que los
granos se hinchen a su tamao completo antes de verter.
3.) Obtener una columna de su instructor y el enchufe de la parte inferior con
lana de vidrio.
4.) Cierre la llave de paso. Agitar el gel en el erlenmeyer y se vierte por una
varilla de vidrio. Es MUY MUY MUY importante que no queden
burbujas de aire atrapadas en su ser la columna (por qu?). Si usted tiene
una burbuja de aire, coloque parafina en la parte superior de la columna,
eliminar la columna del soporte. Invierta la columna varias veces para
redispersar el gel y luego permitir a reasentar. Si la burbuja de aire est
en la parte superior de la columna, usted puede ser capaz de eliminar con
su varilla de vidrio.
5.) Vierta la columna de al menos 30-40 cm de altura.
6.) Abra la llave de paso y permitir que el tampn para tirar por la columna
hasta justo por encima del nivel del gel.
7.) Cierre la llave de paso. Cubra la parte superior con parrafilm y coloque
en el refrigerador hasta la semana siguiente.
Determinacin del volumen de hueco (V o) y el volumen total (V t). Dia 2
1.) Retire la columna de la nevera y fijarlo al soporte en una abrazadera
bureta.

2.) Obtener 250 L de cada uno de azul de dextrano y cido DNP-amino en

tampn fosfato.
3.) Mezclar las dos muestras para dar un volumen total de 0,5 ml.
4.) No deje que el DRY RUN COLUMNA. Asegrese de que el nivel de la
memoria intermedia en la parte superior de la columna es muy cerca del
nivel superior del gel. Si no, drenar el tampn hasta que alcanza la parte
superior del gel.
5.) Utilizando una pipeta Pasteur de largo, aadir la muestra de 0,5 ml a la
parte superior del gel con la llave de paso cerrada. No molestar el gel en
la parte superior de la columna.
6.) Coloque un cilindro graduado debajo de la llave de paso. Abra la llave
de paso y dejar que la muestra se mueva en la columna. Cierre la llave de
paso.
7.) Aplicar 1 ml de tampn a la parte superior de la columna.
8.) Escurrir en el cilindro graduado.
9.) Aadir 5-10 ml de tampn a la parte superior de la columna y de drenaje
en el cilindro graduado.
10.) Continuar la recogida de volumen en un cilindro graduado hasta que la
primera aparicin del color azul (de azul de dextrano) se ve para eluir de la
columna. Anote este volumen total con la mayor precisin posible (V o).
11.) Recoge todo el azul de dextrano en el cilindro graduado. Recuerde que
debe mantener el llenado del bfer en la parte superior de la columna con
cuidado-no molestar el nivel de la columna)
12.) Despus de todo el azul de dextrano es pasado, registrar el volumen total
en este punto.
13.) En un nuevo cilindro graduado, recoger volumen desde el momento en
que el azul de dextrano se detiene hasta que el cido DNP-amino amarilla
eluye. Anote este volumen. Escurrir la columna hasta que se haya
eliminado todo dextrano amarilla. V t es el volumen total recaudado (azul
dextrano ms cido-DNP amino).
14.) Cierre la llave de paso.
Normas (Obtencin V r 's y K d' s):
1.) Obtener una mezcla de dos estndares de protena. Anote el nombre de
las normas y su peso molecular. (mioglobina en 16.500 y albmina de
suero bovino al 67 000)
2.) Su orden de elucin ser de mayor a menor. Las protenas fueron
elegidos para tratar de cubrir el rango de exclusin por tamao del gel que
estamos utilizando.
3.) Aplicar 1 ml de la norma a la parte superior de la columna, de nuevo,
teniendo cuidado de no alterar demasiado la parte superior de la columna.

4.) Permita que la muestra migre a la columna mediante la apertura de la

llave de paso. El volumen de elucin se puede recoger en un cilindro
graduado hasta hasta 1 ml antes de la V o determinado en la Parte 1.
5.) Aadir 1 ml de tampn y recoger el eluido.
6.) Aadir 5.10 ml a la vez a la parte superior de la columna, teniendo
cuidado de que no se seque!
7.) Recoger el eluido en 1 ml marc tubos de ensayo a partir del 1 ml antes
de la V o.
8.) Continuar recogiendo fracciones hasta que reacciona V t.
9.) Analice sus fracciones en el UV-VIS. Asegrese de ejecutar un espacio
en blanco de la memoria intermedia a 280 nm.
Ejecutar la protena desconocida:
Anlisis:
1.) Absorbancia vs. volumen y determinar el volumen donde cada una de
las tres protenas estndar eluy. Terreno absorbancia vs. volumen para la
protena desconocida para determinar dnde los eluye desconocidos.
2.) Trazar MW vs. V r / V o para cada protena (si lo desea, tambin puede
grfico dextrano azul y aminocidos DNP). Ajustar a una lnea lineal en
Excel y obtener la ecuacin de la recta.
3.) Calcular K promedio y trazar ingrese MW vs. promedio de K para las muestras de
protenas. Ajustar a una lnea lineal.
4.) Use las ecuaciones de cada parcela para determinar el peso molecular de
lo desconocido.

https://www.msu.edu/course/lbs/159h/Chromatography04.pdf
Materiales
1,5 ml tubos de microcentrfuga (alrededor de 12)
microcentrfuga bastidor de tubo de ensayo
tubos de ensayo para recoger el volumen vaco y ensayos de amilasa ejecutar
P1000 y consejos
P50-200 y consejos
soporte anillo y abrazadera
ramo de hielo
columna Sephacryl-100 preenvasados
tampn de columna
20 mM de fosfato de potasio, pH 7,0, EDTA 1 mM, 1 mM b mercapto-etanol100 ml una amilasa-cctel / normas. (tenga esto en hielo hasta su uso)
a-amilasa y normas cctel: 0,1 mg / ml de vitamina B-12, 0,1 mg / ml
citocromo C, 0,1 mg / ml de azul de dextrano en Tris HCl 20 mM, EDTA 1 mM,
pH 8
yodo cida
0.2% (w / v) de almidn
Tampn fosfato 200 mM, pH 7,0
Procedimiento
1. Uno de los miembros de cada equipo tendr que conseguir hielo.
2. Nmero sus tubos de microcentrfuga 1 a 12 y los puso en un estante. Estos
sern para
recogida de sus fracciones de la columna.
3. Retire con cuidado la tapa superior de la columna; asegrese de no perturbar el
lecho de gel.
Colocar la columna en una abrazadera a continuacin, comprobar que 1) la
columna es vertical, y 2) la prueba
bastidor de tubo libremente se puede mover en la columna de tal manera que los
tubos pueden coger los goteos
(eluyente) de la columna.
4. Retire la tapa inferior y deje que el tampn fluya a travs de la columna en un
vaso de precipitados
hasta que la superficie del lquido es de aproximadamente 1 cm por encima del
lecho de gel. Vuelva a colocar la tapa inferior para detener
el flujo de la memoria intermedia.

Nunca deje que el menisco toca la parte superior del lecho de resina! Es muy
importante que la
columna no se le permite llegar a ser seco, contaminado con bolsas de aire o
perturbado como este
interrumpir la migracin a travs del gel.
Cargando y ejecucin de la columna:
5. Muy lenta y suavemente puso la punta de su pipetteman travs del tampn de
columna y
cargar cuidadosamente 100 ml (toda la muestra) de a-amilasa / cctel de serie en
la parte superior de la
lecho de gel con cuidado de no perturbar el lecho de gel.
6. Coloque un tubo de ensayo en la columna y brevemente quitar la tapa inferior
slo el tiempo
suficiente para iniciar la migracin de la muestra (es decir, justo hasta que la
muestra tiene completamente
entrado en la columna). Vuelva a colocar el tapn inferior.
7. muy lentamente y suavemente aadir 3 ml de tampn de columna a la
columna. Esto se hace mejor
aadiendo lentamente la memoria intermedia (un ml a la vez con su pipetteman)
a lo largo del lado de
la columna justo en la parte superior del menisco. Ahora, retire la tapa inferior y
permitir que el
columna para "correr"
. Continuar para recoger el eluyente en el tubo de ensayo. Usted comenzar a ver
el color
normas separan. Use un pedazo de papel blanco como fondo para ayudar a
determinar
el color del eluyente gotas.
El colorante azul de dextrano no entra en las perlas de gel (es decir, se
excluye). Se utiliza para
medir el volumen vaco de la columna (V
0
), Que es el volumen del eluyente recogido
desde el principio de la carrera hasta que el azul de dextrano comienza a
eluir. Guarde este vaco
eluir y luego medir y registrar su volumen.
9. Como los eluye dextrano azul, empezar a recoger las fracciones de
aproximadamente 200 m l en
volumen (alrededor de 5 gotas) en los tubos de microcentrfuga.
Junto con la a-amilasa y azul de dextrano, el cctel contiene el siguiente peso
molecular

normas:
Hemoglobina
68.000 Daltons (D), marrn
GFP
26900 D emite fluorescencia verde bajo luz UV.
El citocromo C 12,400 D, marrn / xido,
La vitamina B-12
1350 D, rosa.
10. Una vez que el B-12 La vitamina ha eluido, puede dejar de recoger 200 ml
fracciones. Usar
su pipetteman para medir con precisin el volumen de sus fracciones y registrar
los
volmenes.
11. Continuar para ejecutar la columna hasta que el tampn de la columna es de
aproximadamente 1 cm por encima del lecho de gel.
Vuelva a colocar la tapa inferior y suavemente rematar su columna con 3 ml de
tampn de columna como
lo hizo anteriormente. Reemplazar suavemente la tapa superior con el fin de no
perturbar el lecho de gel. Etiquetar el
columna con un signo de la utilizacin de su Sharpie para que podamos saber que
se ha utilizado y retorno
a la parte delantera del laboratorio.
12. Utilice su pipetteman para medir el volumen de cada fraccin y luego
calcular la
volumen acumulativo (es decir, volumen de huecos (V
0
) Ms el volumen de elucin (Ve)) para cada fraccin.
Ms tarde se le trazar el peso molecular registro vs. volumen de elucin despus
de que el volumen de huecos
eluye (es decir, el volumen en el que la protena "viene off" de la columna
despus de que el azul de dextrano
ha comenzado a salir de la columna). Es decir, el volumen acumulado de todas
las fracciones
desde el principio del dextrano azul a travs de la fraccin que contiene el
particular,
marcador de peso molecular.
Usted tendr que examinar los tubos de fracciones ms de la caja de luz UV para
determinar qu
fraccin (s) contiene la GFP. Las otras normas deben ser visibles bajo luz normal.
Ensayo para la a-amilasa actividad

Etiquetar un tubo de ensayo de vidrio vaca para cada fraccin, tambin tendr un
tubo inicial ("I"
Tubo o control negativo) y un tubo de control positivo ("+").
Aadir 500 ml de 200 mM de tampn de fosfato (pH 7,0) a cada tubo.
Aadir 500 ml de 0,2% w / v de almidn a cada tubo.
Pgina 8

Repite lo siguiente para cada fraccin de la columna. Cada grupo se

proporcionar con tampn
que contiene amilasa como un control positivo y tampn solo como control
negativo.
Aadir 50 ml de la fraccin que est probando a uno de los tubos de ensayo.
Aadir 50 ml de agua al tubo (control negativo) "I"
Aadir 50 ml de tampn que contiene amilasa de al tubo "+" (control positivo)
Incubar los tubos durante cinco minutos
Aadir 500 ml de yodo cida a cada tubo.
Determinar las fracciones que contiene amilasa-visuales. No hay necesidad de
utilizar
espectrofotmetro (a menos que quiera). Los tubos que contiene amilasa-ser
oscuro o
azul claro?
Graba todos los datos en su cuaderno de prcticas, y el grfico del volumen
de elucin (Ve) vs.
peso molecular de los estndares. Grafique sus datos primero en papel
cuadriculado regulares
y luego en semi-log papel cuadriculado. A continuacin, utilice los grficos
para determinar la
peso molecular de la amilasa. Buena suerte
Limpiar
Enjuague su cristalera:
Tubos de ensayo: ensayos de almidn se puede verter por el desage. Retire
todas las etiquetas de la
tubos de ensayo de vidrio. Utilice EtOH en un Kimwipe para eliminar las marcas
Sharpie. Para lavar, llenar el
tubo hasta la mitad con agua del grifo, agitar y verter un par de veces. Luego
enjuague
el tubo de la misma manera con agua destilada dos veces. En este punto, el tubo
debe
estar libre de color, polvo, etc. Si no es as, consulte a su TA. Devolver los tubos
boca abajo
para drenar y secar en los bastidores en su estacin.

Vasos: Pour eluyente por el desage en las campanas de extraccin. Enjuague

con agua de la llave dos veces
y agua destilada dos veces.
Tubos de microcentrfuga, guantes: Coloque en un bote de basura. No son
residuos de riesgo biolgico.
Todo lo dems: dejar a su estacin

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/a8656bul.pdf
Descripcin del Producto
Cromatografa de filtracin en gel es un mtodo establecido
para la determinacin del tamao y la masa molecular de
protenas. El fraccionamiento se basa en la difusin de
molculas en los poros de la resina. Protenas ms grandes hacen
No entrar en los poros de la resina con la misma facilidad, pero pasar
a travs del volumen de lquido de la columna ms rpidamente que
protenas ms pequeas. Estas molculas de protenas eluyen de
la columna en orden decreciente de masa molecular.
La determinacin de la masa molecular de las protenas desconocidas
se hace mediante la comparacin de la relacin de Ve/ Vo
para la protenaen cuestin a la Ve/ Vo
de los estndares de protena de conocida
masa molecular (Ve es el volumen de elucin y Vo es el volumen vaco). La Vo
de una columna dada se basa en la
volumen de efluente requiere para la elucin de un gran
molcula tal como azul de dextrano (masa molecular de
~ 2000kDa,NmerodecatlogoD4772). Trazadodela
logaritmos de las masas moleculares conocidas de protena
normas frente a su respectiva Ve/ Vo valores
produce una curva de calibracin lineal.
Ve/ Vo
es esencialmente independiente del tamao de la columna y
concentracin de protena, pero puede ser la temperatura
dependiente para algunas protenas. No es fiable molecular
masas se pueden obtener si la protena forma un complejo
con el gel, contiene una gran cantidad de hidratos de carbono,
agregados a los complejos ms grandes, o disocia en
subunidades en las condiciones utilizadas.
1
El molecular
masa de una protena impura puede determinarse usando
este procedimiento si una prueba de deteccin especfica est disponible para
la protena
El procedimiento para determinar las masas moleculares utilizando
cromatografa de filtracin en gel como se describe en este boletn
es una modificacin de los mtodos publicados.
1,2
La protena

normas en este kit pueden ser adecuados para su uso en otra

sistemas cromatogrficos incluyendo HPLC, aunque
algunos sistemas tampn parecen alterar los volmenes de elucin
de albmina (Nmero de catlogo A8531) y carbnico
anhidrasa (nmero de catlogo C7025). Las protenas en
el Kit de MWGF200 tienen una gama de masas moleculares
12,4 a 200 kDa.
Reactivos
Aproximado
Masa molecular

Citocromo c de corazn de caballo,

Nmero de catlogo C7150, 10 mg / vial
12,4 kDa

Anhidrasa carbnica de bovino

eritrocitos, Nmero de catlogo
C7025, 15 mg / vial
29 kDa

Albmina, suero bovino, Catlogo

Nmero A8531, 50 mg / vial
(Contiene 0,3% ditiotreitol)
66 kDa

La alcohol deshidrogenasa de levadura,

Nmero de catlogo A8656, 25 mg / vial
150 kDa

amilasadelapatatadulce,
Nmero de catlogo A8781, 15 mg
protena / vial (Contiene 15% de NaCl,
4% de glucosa, 1% y ditiotreitol)
200 kDa

Blue Dextran, Nmero de catlogo

D4772, 50 mg / vial
2000 kDa
Precauciones y Descargo de responsabilidad
Este producto es para I + D slo uso, no para las drogas,
hogar, u otros usos. Por favor, consultar el material

Hoja de datos de seguridad para obtener informacin sobre los peligros

y las prcticas de manejo seguro
lmacenamiento / Estabilidad
Almacene el kit a -20 C.
Procedimiento
El uso de MWGF200 Para Cromatografa de filtracin en gel
Se recomienda usar - 1. Buffer y Resina
50 mM Tris-HCl, pH 7,5, con KCl 100 mM como el
tampn de equilibrado con 90 cm cm
SephacrylS-200-HR (nmero de catlogo S200HR)
columna a 2-8 C. Para obtener informacin sobre la resina
preparacin, relleno de la columna, y el equilibrio
pngase en contacto con el Servicio Tcnico.
2. Volumen Void (Vo) Determinacin - Se disuelve el azul
dextrano en tampn de equilibrio que contiene 5%
glicerol a una concentracin de 2 mg / ml. Esta
concentracin de azul de dextrano dar una A
280 de ~ 1,0enlafraccinpico. Elglicerolseaadea
aumentar la densidad de la solucin, pero su uso es
opcional.
El volumen de muestra recomendado es de menos del 2%
del volumen total de lecho de gel. Aplicar con cuidado el azul
muestra de dextrano a la columna (evitar molestar a la
gel de superficie de la cama) para determinar Vo
y para comprobar relleno de la columna. Inmediatamente despus de aplicar el
muestra, comienza la recogida de fracciones de 0,5 a 1,5% de
el volumen total lecho de gel. La velocidad de flujo debe ser
~ 7%delvolumendecolumnaporhora. Sesgodel
banda de azul de dextrano representa un fallo en la columna,
aunque algunos tailing es normal. El pico que lleva
indica el volumen vaco. Determinar espectrometra
fotomtricamente el volumen de elucin de azul dextrano
(Vo para la columna) a 280 nm o 610 nm por
midiendo el volumen de efluente recogido de la
punto de aplicacin de ejemplo para el centro de la
pico de efluentes.
Notas: Mezcla de dextrano azul con las normas del kit o
protenas de la muestra, no se recomienda ya que muchos
protenas se unen a azul dextrano.
Preparar estndares de protenas y fresca azul dextrano.
3

Ocasionalmente puede aparecer un poco de protena agregada en el volumen

vaco.
. La elucin de volumen (V
e
) Determinacin de Protena
Normas - Disolver patrones de protenas individuales
en tampn de equilibrio que contena 5% de glicerol (Ver
Mesa 1). Si, despus de la reconstitucin, cualquiera de la protena
soluciones contienen material insoluble luego filtrado del
solucin de protena a travs de un filtro de 0,45 o 0,2 m. los
prdida de protena a partir de esta filtracin es insignificante. Para
90 x 1,6 cm columna, la aplicacin de 2,0 ml de
muestras individuales en el recomendado
concentracin (Tabla 1) da una A
280
de 1 en el
fraccin pico.
Mesa 1
Recomendado
Concentracin
Albmina, A8531
10 mg / ml
Alcohol deshidrogenasa, A8656
5 mg / ml
amilasa,A8781
4 mg / ml
Anhidrasa carbnica, C7025
3 mg / ml
El citocromo c, C7150
2 mg / ml
Las siguientes protenas pueden ser mixta y de ejecucin
juntos en las columnas:
El citocromo c y
Anhidrasa carbnica y alcohol
deshidrogenasa
Aplicar estndares de protena a la columna usando el
mismo volumen de la muestra y la tasa de flujo tal como se utiliza para la
muestra de dextrano azul. La elucin de la norma
las protenas pueden ser seguidos por lecturas de absorbancia
a 280 nm. Determinar la Ve
para la protenanormas midiendo el volumen de los efluentes

recogido desde el punto de aplicacin de la muestra a la

centro del pico de efluente
4. Curva Estndar - Parcela masa molecular vs. Ve/ Vo
Para cada respectivo estndar de la protena en papel semilogartmico
(vase la Figura 1
5. La elucin de volumen (Ve) Determinacin de una desconocida
Protena - Aplicar la muestra desconocida a la columna
a una concentracin apropiada usando el mismo volumen de la muestra, tamao
de la fraccin, y el caudal como se usa para el azul de dextrano y los estndares
de protena.
Determinar la Ve a lo desconocido con el mismo
mtodos aplicados a las normas. Calcular la Ve/ Vo
por lo desconocido y determinar su molecular
masa de la curva estndar

http://faculty.ksu.edu.sa/77632/Documents/Calibration gel filtration for

student.pdf
rocedimiento
1) Seleccin de columna de filtracin en gel
Seleccionar una columna con un intervalo de fraccionamiento de modo que la
esperada
peso molecular de la muestra cae aproximadamente en el centro
del rango para esa columna. Superdex 200 se puede utilizar para una
aproximacin preliminar, rpida de peso molecular de la muestra.
Una longitud de lecho de 30 a 60 cm es suficiente para la mayora de las
determinaciones.
2) La equilibracin de la columna
Si la columna se ha almacenado en 20% de etanol, se lava la columna primero
con 2 volmenes de columna de agua destilada. Equilibrar la columna con
2 volmenes de columna de tampn. Un tampn con un pH de 6-8 y un inica
Se sugiere fuerza 0,15 M. Un tampn de fosfato tpico es 50 mM
en NaCl 0,15 M, pH 7,2.
3) Eleccin de las protenas del kit de calibracin
Incluya protenas kit de calibracin de un peso molecular ms alto y
de un peso molecular menor que el de la muestra. Las protenas
listado en la Tabla 4 se pueden mezclar para dar picos resueltos.
Tabla 4. mezclas de protenas adecuados para picos resueltos.
Para la calibracin de
Mezcle una
Mix b
C Mix
Superdex 200
F + C + CA + R
Concejal + O + R + abril
Superdex 75
C + CA + R + abril
O + R + abril
Superose 6
T + Concejal + CA + abril
F+O+R
Superose 12
F+O+R
Concejal + CA + abril
Sephacryl 300
T + Concejal + CA
F + O + R + abril

Sephacryl 200
Concejal + CA + R + abril
C + CA + R
O + CA + R
Sephacryl 100
Concejal + CA + R + abril
C + CA + R
O + CA + R
Abr - La aprotinina, R - ribonucleasa A, CA - anhidrasa carbnica,
O - ovoalbmina, C - conalbmina, Concejal - aldolasa, F - ferritina,
T - tiroglobulina
Pgina 11

11
4) preparacin de protena individual
Le recomendamos que las protenas se disuelven en alta
concentracin (20 mg / ml) y se diluy con tampn antes de su uso.
Disolver el contenido del vial en un tampn con un pH de 6-8 y
una fuerza inica de 0,15 M (por ejemplo, fosfato 50 mM, NaCl 0,15 M,
pH 7,2). La ferritina y la aldolasa se suministran mezclados con sacarosa o
manitol para mantener la estabilidad y ayudar a su solubilidad. Para stos
dos protenas, es particularmente importante para disolver el contenido completo
del vial para obtener una solucin homognea. Es recomendado
que la anhidrasa carbnica se disuelve en agua destilada para evitar la
formacin de agregados durante la congelacin y descongelacin.
5) la preparacin de la mezcla de protenas
Diluir la combinacin apropiada de protenas en el kit de calibracin
amortiguador. Para obtener picos con alturas similares a 280 nm, utilice el
concentraciones en la Tabla 5. Se han calculado las concentraciones
con un volumen aplicado asumido de 0,5% de la columna geomtrica
volumen (V
c
). Ver apndice para una explicacin detallada de cmo
preparar una muestra tpica mezcla de protenas.
Nota: Si la precipitacin de las protenas se produce al mezclar nos
recomendar breve centrifugacin para clarificar la mezcla de protenas antes
aplicarlo a la columna.
4) preparacin de protena individual
Le recomendamos que las protenas se disuelven en alta
concentracin (20 mg / ml) y se diluy con tampn antes de su uso.
Disolver el contenido del vial en un tampn con un pH de 6-8 y
una fuerza inica de 0,15 M (por ejemplo, fosfato 50 mM, NaCl 0,15 M,

pH 7,2). La ferritina y la aldolasa se suministran mezclados con sacarosa o

manitol para mantener la estabilidad y ayudar a su solubilidad. Para stos
dos protenas, es particularmente importante para disolver el contenido completo
del vial para obtener una solucin homognea. Es recomendado
que la anhidrasa carbnica se disuelve en agua destilada para evitar la
formacin de agregados durante la congelacin y descongelacin.
5) la preparacin de la mezcla de protenas
Diluir la combinacin apropiada de protenas en el kit de calibracin
amortiguador. Para obtener picos con alturas similares a 280 nm, utilice el
concentraciones en la Tabla 5. Se han calculado las concentraciones
con un volumen aplicado asumido de 0,5% de la columna geomtrica
volumen (V
c
). Ver apndice para una explicacin detallada de cmo
preparar una muestra tpica mezcla de protenas.
Nota: Si la precipitacin de las protenas se produce al mezclar nos
recomendar breve centrifugacin para clarificar la mezcla de protenas antes
aplicarlo a la columna
Tabla 5. sugerido concentraciones de protena para la produccin de picos de
altura similar.
Botiqun
Protena
Protena
concentracin
BPM
La aprotinina
3 mg / ml
BPM
Ribonucleasa A
3 mg / ml
BPM
Anhidrasa carbnica
3 mg / ml
BPM, HMW
Ovoalbmina
4 mg / ml
BPM, HMW
Conalbmina
3 mg / ml
HMW
Aldolasa *

4 mg / ml
HMW
Ferritina *
0,3 mg / ml
HMW
La tiroglobulina
5 mg / ml
* Nota: Estas protenas se suministran mezclados con sacarosa o manitol
para mantener la estabilidad.
6) Tamao del volumen de la muestra
Aplicar las protenas del kit de calibracin de la columna. Para obtener una buena
resolucin,
el tamao de la muestra no debe exceder de 2% de la columna geomtrica
volumen, Vc.(Vc= R2 l donde r es el radio y l es la longitud de la columna).
7) Determinacin del volumen de elucin (Ve)
A partir de la curva de UV, determinar los volmenes de elucin (Ve) para el
Protenas del kit de calibracin de la medicin del volumen del eluyente desde
el punto de inyeccin para el centro de la pico de elucin, vase la figura 1.
8) Determinacin del volumen de huecos (Vo)
El volumen de elucin de Blue Dextran 2.000 es igual a la columna
volumen vaco (Vo). Prepare una solucin fresca de azul dextrano 2000
(1,0 mg / ml) en el tampn. La velocidad de solubilizacin del azul
Dextran 2000 puede aumentarse calentando el tampn a 50 C antes
la adicin de azul de dextrano 2.000.
Aplicar una muestra a la columna (tamao de la muestra, 0,5% de la geomtrica
volumen de la columna) para determinar el volumen de huecos (Vo). La elucin
de Blue Dextran se puede monitorizar convenientemente a longitudes de onda de
254, 280 o 620 nm.
Se recomienda encarecidamente que el dextrano azul 2000 se ejecuta solo,
sin mezclar con el kit de calibracin o protenas de la muestra, como la fraccin
de azul dextrano es amplio y puede solapar los picos de protenas. Siempre
calcular el volumen vaco desde el primer pico eluido de azul
Columna:
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg
Volumen de la columna geomtrica (VC): 120 ml
Volumen de la muestra:
500 l
Amortiguador:
Fosfato 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2

Caudal:
1 ml / min
Sistema:
KTAexplorer 10
Deteccin 280 nm
9) Preparacin de curva de calibracin
Calcular la K
AV
valores de las protenas del kit de calibracin utilizando el
ecuacin:
donde V
o
= Columna volumen vaco, V
e
= Volumen de elucin, y V
c
=
volumen de la columna geomtrica.
Preparar una curva de calibracin de K
AV
frente a log peso molecular o bien
en papel semilogartmico o con un programa de clculo. Debera
ser posible ajustar una curva a los puntos de datos, ver Figuras 2 a 10.
10) Determinacin del peso molecular
Aplicar la muestra desconocida (volumen 0.1 a 2% de V
c
) Y determinar
el volumen de elucin (V
e
) Del compuesto de inters. Ajuste el
concentracin de la muestra teniendo en cuenta que una muestra
de 0,5% de V
c
se diluye 5 a 15 veces durante la carrera.
Calcular el correspondiente K
AV
para el componente de inters y
determinar su peso molecular a partir de la curva de calibracin preparada
utilizando las protenas del kit de calibracin.
Tenga en cuenta que las determinaciones de peso molecular utilizando el
molecular

los pesos de las glicoprotenas, lipoprotenas, protenas no globulares, o

otros polmeros pueden no correlacionarse bien con las curvas de calibracin
establecido para las protenas globulares de las protenas del kit de
calibracin. por
tales compuestos, la informacin til se pueden obtener mediante la relacin
sus datos de volumen de elucin a un parmetro de tamao molecular, tales como
Radio de Stokes (R
St
), En lugar de valores de peso molecular. Parcelas
de -log (K
AV
) Vs R
St
se han utilizado con xito para determinar la
Radio de Stokes de las protenas y de nuestras protenas del kit de calibracin
pueden ser
utilizado para estas parcelas tambin
La preparacin de la mezcla de protenas para la calibracin
HiLoad Superdex 200 pg 26/60
Volumen de la columna geomtrica (V
c
) = 320 ml
Volumen de la muestra recomendado = 1,6 ml (0,5% V
c
)
Preparacin de "Mezclar una" en la Tabla 4 (ferritina, conalbmina,
carbnico
Anhidrasa y Ribonucelase A) para Superdex 200
Prepare cada protena individual como se describe en la seccin 5.4 a un
concentracin de 20 mg / ml.
Las concentraciones de protenas recomendadas para las diferentes protenas
en una mezcla son de acuerdo a la Tabla 5:
Ferritina: 0,3 mg / ml
Conalbmina: 3 mg / ml
Anhidrasa carbnica: 3 mg / ml
Ribonucleasa A: 3 mg / ml
Para preparar una mezcla de protena de 2 ml, hacer los siguientes clculos:
Calcular el volumen (X) de cada protena necesaria desde el 20 mg / ml
solucin con el fin de conseguir la concentracin de protena deseada
Ferritina:
20 mg / ml * X ml = 2 ml * 0,3 mg / ml

X = 0,03 ml
Todas las dems protenas:
20 mg / ml * X ml = 2 ml * 3 mg / ml
X = 0,3 ml
Finalmente la mezcla 0,03 ml de ferritina, 0,3 ml conalbmina, 0,3 ml carbnica
Anhidrasa y 0,3 ml Ribonucelase y diluir con 1,07 ml de tampn de
conseguir volumen 2 ml final.
Inyectar 1,6 ml de la mezcla de protena en la columna.
Pgina 23

23
9. Producto informacin
Kits de filtracin en gel de calibracin
Cdigo no.
De bajo peso molecular
28-4038-41
De alto peso molecular
28-4038-42
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Cantidad
Cdigo no.
Superdex 75 10/300 GL
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Superdex 75 PC 3.2 / 30
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17-5175-01
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Superdex 200 PC 3.2 / 30
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HiLoad 16/60 Superdex 75 pg
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17-1068-01

HiLoad 26/60 Superdex 75 pg

1
17-1070-01
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg
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Precisin Holder Columna
1

17-1455-01
Referencias bibliogrficas
Gua de seleccin:
Columnas de gel de filtracin y medios
18-1124-19
Manual:
Gel filtracin - Principios y Mtodos
18-1022-18

Protena La purificacin por cromatografa de filtracin en gel

Copy Right 2001 / Instituto de Molecular Development LLC

INTRODUCCIN
Cromatografa de filtracin en gel separa las protenas con el fin
de grandes a pequeas molculas. Mezclas de protenas se
aplicaron a una filtracin en gel (GF) columna que contiene una
matriz cromatogrfica de tamao de poro definido. Las protenas
se eluyeron con un tampn acuoso, recogidos como fracciones
cromatogrficas individuales, y se analizaron por separado. La
filtracin en gel se puede utilizar para separar las protenas en
base a diferencias en su tamao molecular, o para desalar
protenas (es decir, eliminan los contaminantes de bajo peso
molecular tales como sales, aminocidos y pptidos, etc.). Una
separacin de las diversas protenas en una muestra de las
diferencias resultados en sus capacidades para entrar en los
poros. En general, las protenas grandes no van a entrar en los
poros de gel y eluirn rpidamente de la columna en el volumen
vaco. Protenas ms pequeas varias veces entrar y salir de los
poros del gel y por lo tanto, permanecer ms tiempo en la
columna. Por lo tanto, las protenas se eluyen en orden
decreciente de tamao molecular.
http://www.molecularinfo.com/MTM/G/G3/G3-1/G3-1-1.html

MATERIALES Y SOLUCIONES
Comercialmente disponible de filtracin en gel (GF)
Matrix Gel

Tipo Gel

Intervalo de
fraccionamiento

(peso molecular)
Sephadex G-10

<700

Sephadex G-25

1.000-5.000

Bio-Gel P-60

3,000-60,000

Sephadex G-75

3,000-70,000

Sephadex G100

4,000-100,000

Bio-Gel P-100

5.000-100.000

Sephadex G200

5,000-250,000

Bio-Gel P-200

30,000-200,000

Sephacryl S300

10,000-1,500,000

Sepharose 2B

70,000-40,000,000

Filtracin en gel (GF) Buffer

Tampn Tris-HCl, tampn de fosfato de sodio, y el tampn de
acetato de sodio en diferentes valores de pH son los ms
utilizados. Se recomienda una fuerza inica de al menos 0,05 M
para reducir las interacciones no especficas entre las protenas
se separaron y la matriz cromatogrfica.

Filtracin en gel (GF) La columna de cromatografa

Extensin Columna nivel de carpintero o Gel Embalse
Bomba peristltica
Detector UV
Colector de fracciones

PROCEDIMIENTOS

Hinchazn del gel

1. Oleaje del GF (filtracin en gel) matriz de gel en un tampn
GF apropiado.
Permitir a hincharse por completo.
2. Despus de permitir que el gel se asiente, aspirar o decantar
las partculas de gel finas que no se han asentado en el lecho de
gel.
3. Resuspender el gel sedimentado en un volumen igual de
tampn de GF para formar una suspensin espesa, se vierte la
suspensin en un matraz de filtracin, desgasifique el gel con el
fin de eliminar el aire atrapado.
4. El volumen de tampn de la hinchazn y el tiempo de
hinchamiento requerida para un determinado gel depende del
tipo de gel. El gel seco se aadi gradualmente a la memoria
intermedia, mientras se agita suavemente la suspensin con
una varilla de vidrio.
Nota: No remover con un agitador magntico, ya que se
pulverizan las perlas de gel.
5. Suspender el gel en el doble del volumen del lecho
aproximada (es decir, los mililitros de gel hinchado).
Los geles pueden estar hinchados rpidamente por
calentamiento de la suspensin a 90 C durante 5 horas, usando un
bao de agua para controlar la temperatura. Hinchazn a
temperatura ambiente puede ser considerablemente ms lento,
especialmente para las grandes geles de poro.
6. Si una matriz de gel GF se compra prehinchada, se debe lavar
con exceso de tampn en un embudo Buchner para eliminar
agentes antimicrobianos contenidos en el tampn de
almacenamiento.Resuspender el gel asentado en tampn GF,
desgasificar la suspensin.

Llenado de la columna
7. Montar la columna vertical sobre un soporte de
laboratorio. Un nivel de carpintero debe utilizarse para
determinar que la columna es vertical.
8. Usando una jeringa, inyecte tampn GF en el tubo salida de la
columna hasta que la columna vaca se llena con tampn para
justo encima de la pantalla de soporte de lecho. Deje la jeringa
en su lugar para bloquear el extremo de la tubera de salida.
(Este procedimiento elimina el aire atrapado de debajo de la pantalla de
ayuda.)
9. Verter un volumen apropiado de la suspensin de gel con el fin de llenar
completamente la columna a la altura de lecho de la columna requerida. La
suspensin de gel debe ser vertida sobre una varilla de vidrio cuyo extremo
toca la pared de la columna interior. Esto dar lugar a un buen flujo de la
suspensin de gel sin turbulencia y la introduccin de aire innecesario.
10. Dado que el volumen de la suspensin generalmente excede el volumen de
lecho de la columna deseada, es conveniente utilizar una extensin de
depsito o columna de gel para mantener el exceso de suspensin.
11. Despus de que la columna se llena hasta la altura del lecho deseada,
pipetear cuidadosamente una capa de 1 cm de tampn sobre la parte superior
del gel. Despus de llenar por completo el tubo de entrada y al final ajustada
con tampn, conecte el final apropiado para la columna.

Embalaje y lavar la columna

12. Antes de retirar la jeringa del tubo de salida, ajuste el depsito tampn
para proporcionar una presin de funcionamiento apropiado o usar una bomba
peristltica para controlar la velocidad de flujo.
Para geles no rgidos (por ejemplo, Sephadex G-75, G-100 y G-200 o
Sepharose), presiones de trabajo no deben exceder de los lmites definidos por
el fabricante.

 Para gel rgido (por ejemplo, Sephadex G-10 a G-50 o Sephacryl), el

embalaje puede llevarse a cabo a velocidades de flujo ms altas usando una
bomba peristltica.
13. Retire la jeringa del tubo de salida de la columna e iniciar el flujo. Lavar la
columna con 2 a 3 volmenes de lecho de tampn con el fin de empacar la
cama y para equilibrar la columna con tampn. Un caudal ligeramente superior
se puede utilizar para el embalaje que pueda ser utilizado para la separacin
cromatogrfica.
14. Cierre el tubo de salida. Inspeccionar el lecho empaquetado, iluminando
por detrs por una linterna para detectar grietas o aire atrapado en el lecho de
la columna.

La determinacin de la Columna volumen de hueco

15. Cierre el tubo de salida y retire la mayor parte de la memoria intermedia de
sobre el lecho de la columna por aspiracin. Abra el tubo de salida y deje que
el tampn restante penetre en el gel, pero tenga cuidado de no dejar que el
centro del gel se seque. Cierre el tubo de salida.
16. El uso de una pipeta pasteur, aplicar una muestra de protena (0.2 a 0.5 mg
/ ml), cuyo peso molecular es conocido por ser mayor que el volumen de
huecos de la matriz GF que se utiliza para la separacin, en un volumen de
tampn igual a 1 % del volumen total del lecho de la columna es en capas en
la parte superior del gel.
17. Abrir el tubo de salida de la columna y dejar que la muestra penetre en la
cama.
18. Lavar la muestra restante de la pared de la columna mediante la aplicacin
de pequeas cantidades de tampn a partir de una pipeta Pasteur.
19. Despus de aplicar la muestra, pipeta cuidadosamente una capa de 1 cm
de tampn sobre la parte superior del gel, y despus de llenar por completo el
tubo de entrada y final apropiado con tampn, conecte el extremo apropiado a
la columna.
20. Permitir la elucin de proceder a una presin hidrosttica apropiado o tasa
de flujo.
21. Recoger el efluente de la columna utilizando un colector de fracciones
automtico. Es conveniente para recoger las fracciones que contienen cada
uno 100 un volumen equivalente a aproximadamente el 1% del volumen total
del lecho.

22. Medir el A280 de cada fraccin. Calcular el volumen vaco multiplicando el

volumen recogido en las fracciones individuales por nmero de troquel de la
fraccin que contiene la protena de absorcin de UV mxima. El volumen vaco
debe ser de aproximadamente 1/3 del volumen total del lecho.

Disolucin y aplicacin de la muestra

23. Disolver la muestra que contiene una mezcla de protenas en el tampn
utilizado en la columna de filtracin en gel. Para conseguir la mxima
resolucin, el volumen de la muestra debe ser de 1-5% del volumen de lecho
de la columna.
24. Con el fin de optimizar la forma del pico cromatogrfico, es necesario que
la viscosidad de la solucin de muestra no sea mayor del doble que la del
tampn de elucin.

Recopilacin de las fracciones de la columna

25. Medir la A 280 de las fracciones cromatogrficas individuales o el efluente de
la columna con el fin de detectar las protenas. Las protenas que contienen
tirosina y triptfano residuos absorben a 280 nm.

NOTAS

La resolucin de dos bandas de protenas durante la filtracin en gel est

relacionado con la raz cuadrada de la longitud de la columna, tamao de
partculas de gel, velocidad de flujo de tampn, y el rango de fraccionamiento
de gel. A la separacin de protenas se lleva a cabo mejor en una columna
larga (por ejemplo,> 50 cm) con un dimetro interno entre 1 y 2,5 cm.

Para la mayora de las separaciones de protenas, bien de tamao de

partculas se deben usar, ya que tanto la resolucin cromatogrfica y el caudal
se mantendr alto.
Por mismas separaciones de protenas a gran escala, se recomiendan las
partculas de tamao medio.
Para la resolucin ms alta, la velocidad de flujo lineal debe mantenerse entre

2 y 10 cm / hora. La tasa de flujo de la columna correspondiente en ml / hora

se puede calcular multiplicando velocidad de flujo lineal por el rea de la
seccin transversal de la columna (2 cm).

La eleccin de una matriz de filtracin en gel depende del tamao

molecular de la protena de ser purificado, as como los tamaos moleculares
de los contaminantes. Es importante que el tamao molecular de la protena
est separada se encuentran dentro de la mitad del intervalo de
fraccionamiento de la matriz de la columna usada para la separacin.

La fuerza inica de los tampones utilizados para la filtracin en gel debera

ser 0,05 M o mayor, y el pH de la memoria intermedia no deben exceder el
rango de pH operativo prescrito por el fabricante para una matriz
cromatogrfica.

La protena debe ser soluble en el tampn elegido. Si es necesario, la

protena se puede disolver en tampones que contienen agentes caotrpicos
(por ejemplo, 6 M de guanidina-HCl y 8 M urea), disolventes orgnicos a bajas
concentraciones, y detergentes, y la separacin puede llevarse a cabo en tales
tampones si el gel elegido matriz es estable bajo estas condiciones.

Protena Peso molecular estndar.

Protena

Peso
molecular

El citocromo c

11700

La mioglobina

16800

Tripsingeno

24000

Anhidrasa carbnica

29000

Ovoalbmina

45000

Hemoglobina

64500

Albmina de suero bovino

66000

Transferrina

74000

Inmunoglobulina G

158000

El fibringeno

341000

La ferritina

470000

La tiroglobulina

670000

INFORMACIN KIT

REFERENCIAS

Andrews, P. 1970. Estimacin del tamao molecular y pesos moleculares de

compuestos biolgicos mediante filtracin en gel. En los mtodos de anlisis
bioqumico (Glikc, D., ed.). Vol. 18, pp.1-53.Interscience, Nueva York.

Fischer, L. 1980. Gel-filtracin cromatografa. Elsevier, Amsterdam.

Porath. J. y Flodin, P. 1959. Gel de filtracin: Un mtodo para la

desalinizacin y la separacin de grupo. Naturaleza 183: 1657/59.

Por favor enve sus comentarios sobre este protocolo

para"editor@MolecularInfo.com".

http://www.chem.iitkgp.ernet.in/faculty/SDG/Protein isolation
chromatography.pdf

TCNICAS EXPERIMENTALES
CROMATOGRAFA LQUIDA DE BAJA PRESIN
06/21/2006
Antes de que una protena u otra macromolcula biolgica pueden ser estudiados
rigurosamente de una base estructural y funcional, que debe ser purificada. Los
problemas que pueden surgir durante la purificacin de protenas se vuelven claros
cuando se considera que una sola protena tiene que ser purificado a partir de una
mezcla de hasta 10.000 protenas, cada uno de los cuales se componen de los
mismos aminocidos constituyentes. Las protenas difieren en tamao (cuntos
aminocidos), la carga (la cantidad de carga positiva y negativamente
aminocidos), y en secuencia y la presencia de sitios de unin especficos en las
protenas. Cualquier tcnica que se podra utilizar para purificar la protena debe
basarse en estas diferencias inherentes. Tres principales tcnicas de cromatografa
de columna utilizados para las protenas separadas (u otras macromolculas) se
discuten a continuacin.
TIPOS DE CROMATOGRAFA

1. Separacin sobre la base de la cromatografa de filtracin en

gel tamao-:
Las protenas de diferentes tamaos se separan en una columna en la que la fase
estacionaria es una agarosa o acrilamida grano polimerizado, que contienen poros
de diversos tamaos.Una protena ms pequea en la fase mvil (solucin acuosa
tamponada) puede entrar en los poros en el cordn, mientras que una protena
ms grande no puede, debido a la restriccin de tamao. El resultado es que una
fraccin mayor del volumen total de la columna est disponible para la protena

ms pequea, que por lo tanto pasa un tiempo ms largo en la columna y se eluye

por el disolvente mvil despus de la protena ms grande. La forma de la protena
(no slo su tamao) tambin determina si la protena entrar en los poros. Se
utiliz esta tcnica para separar colorante encapsulado en liposomas de colorante
libre en la prctica 1.
Vamos a considerar con mayor profundidad la teora de la cromatografa de
filtracin en gel. Varios diferentes volmenes de columna se pueden definir como
se muestra a continuacin.

Si tenemos en cuenta la masa de las perlas para ofrecer una cantidad

insignificante del volumen de la perla, el volumen real en el cordn de solucin
atrapado y representa la fase de "estacionaria". El volumen alrededor de la cuenta
se llama el volumen vaco, V

o.

Tambin, Vi = V t - V

o.

Un soluto eluye de la columna en un pico ancho. Si el volumen de la muestra

aplicada a la columna es muy pequeo en comparacin con V
que un soluto se eluye, V
es cierto

cuando

e,

t,

el volumen en el

se considera que es el centro del pico de elucin. Esto

la muestra V << V

e.

Si ver el cromatografa tiene una particin de soluto entre las fases mvil y
estacionaria, podramos estar interesados en qu fraccin de la fase estacionaria,
V

i,

un soluto podra repartirse en. Tal relacin estara dada por:

K=

donde V

(V

e -V

o)

/ V t -V

o)

-V t (= Vinside) representa el 100% de la fase estacionaria, donde K es

un coeficiente de distribucin. Consideremos dos casos:

1. Una muy grande de soluto en comparacin con el tamao de poro: En este
caso V

-V

o=

0 puesto que V

cualquiera de los V

i.)

sera igual a V

o.

(El soluto no vera

En este caso, K = 0. El soluto sera eluir en el volumen

vaco de la columna ya que no puede particionar en cualquiera de el

volumen dentro de las perlas. Todos los solutos de peso molecular mayor
que o igual que el soluto ms pequeo que no puede entrar en las perlas de
gel har todo eluyen en el volumen vaco. Por lo tanto solutos mayor que
este tamao mnimo ser co-eluyen de la columna y no se pueden
separar. V

es habitualmente de aproximadamente 30-40% de la V

t.

2. Una muy pequea soluto en comparacin con el tamao de poro. En este

caso V

-V

o=

t -.

o,

ya que V

sera igual a V

t (El

soluto vera todo el

disolvente) En este caso, K = 1.Similar al anterior, todos los solutos de MW

igual o menor que el ms grande de soluto que puede particionar en todo el
volumen dentro de un grano de co-eluyen a un volumen de cerca de V

t.

Por lo tanto K es un coeficiente de particin, que vara de 0 - 1, y representa la

fraccin del V i en la que un soluto podra particin. Esta K no es exactamente un
coeficiente de particin, sin embargo, ya que el volumen real de la matriz de gel se
supone que es cero por encima. El siguiente grfico muestra tpica
fraccin de V

t para

solutos de diferente tamao (eje x es V

e/

V como una

t).

Tamao y forma relaciones:

K depende del tamao y la forma del soluto. El tamao y la forma de un objeto
determina es propiedades de flujo en un fluido. Resistencia de rozamiento (una
fuerza que tiene la direccin opuesta a la velocidad, otra cantidad vectorial, puede
demostrarse que es proporcional a la velocidad.
F

v o F f = - fv

donde f es el coeficiente de friccin, que depende de la forma. Es evidente que,

cuanto ms grande sea el objeto, ms resistencia por friccin al movimiento. Para
una esfera se puede demostrar que:
f = 6 R

 h es la viscosidad (medida de la resistencia al flujo de un lquido - agua tiene

una baja viscosidad, arce real jarabe una alta viscosidad), y (radio de Stokes)
R

es el radio de la esfera hidratado (cuanto mayor R

s,

cuanto mayor sea el

coeficiente de friccin, mayor ser el F f que resiste el movimiento). Para un objeto

de forma irregular, el radio de Stokes es el radio de una esfera que tiene el mismo
coeficiente de friccin que el objeto. Por lo tanto el R

para una molcula de

protena que no era de forma esfrica sera mucho mayor que el R

para otra

molcula de protena de peso molecular idntico que era esfrica. De ah la

e y el

valor de K para un soluto en una columna de filtracin en gel mejor estaran

relacionadas con el radio de Stokes, ya que los valores de I

tiene en cuenta tanto

el tamao y forma.
Se puede demostrar que:
Rs erf

-1

(1-K) o Rs = A + B erf

Cmo sera una parcela de Rs vs erf

-1

-1

(1-K)

(1-K) parece?

Para las protenas globulares, tambin se puede demostrar que

K = log -A (MW) + B o mayor rigor

'Log R + B' K = -A

log log Rs MW de la protena, y que, ms prcticamente,

una parcela de log MW vs K o Ve es lineal con una pendiente negativa.

Por lo tanto la filtracin en gel se puede utilizar para determinar el MW de un

desconocido protenas globulares esfricas () cuando se compara con una curva
estndar generada utilizarse otras protenas globulares de MW conocida. En la
prctica 1 nos separamos tinte liposomas-encapsulados de colorante libre. Esa

separacin fue trivial ya que era equivalente en difcil separar los elefantes de los
mosquitos. Es mucho ms difcil a las protenas separadas de tamao similar, un
problema a menudo se enfrentan en el laboratorio.

animacin de filtracin en gel Cromatografa de GE Healthcare

animacin de filtracin en gel La cromatografa de Voet

2. Separacin sobre la base de cargo- intercambio inico y

cromatografa de cromatoenfoque:
La resina de cromatografa en este tipo de cromatografa se componen de una,
acrilamida, resina de celulosa o agarosa o perla que est derivatizado para
contener unidos covalentemente grupos cargados positiva o negativamente. Las
protenas en la fase mvil se unen a travs de interacciones electrostticas con el
grupo cargado en la columna. En una mezcla de protenas, las protenas cargadas
positivamente se unen a una resina que contiene grupos cargados negativamente,
como el grupo carboximetilo, CM (-OCH
OCH

CH2 CH

SO

-),

COO

-) o

de sulfopropilo, SP, (-

mientras las protenas cargadas negativamente pasarn a

travs de la columna. Las protenas cargadas positivamente se pueden eluir de la

columna con una fase mvil que contiene o bien un gradiente de concentracin
creciente de sal o una sola concentracin de sal ms alta (elucin isocrtica). La
protena ms carga positiva se eluye pasado, a la mayor concentracin de sal. Del
mismo modo, las protenas cargadas negativamente se unirn a una resina que
contiene grupos cargados positivamente, como el grupo dietilaminoetilo, DEAE (OCH

CH

NH (C

5) 2

+)

o un grupo amino cuaternario de etilo, QAE, y se puede

separar de una manera anloga. En cromatoenfoque, la fase mvil contiene un

gradiente de pH, y las protenas unidas se eluyen cuando el pH alcanza el punto de
la protena, en la que las protenas no tienen carga neta isoelctrico. En este
laboratorio, utilizar QAE y SP Sephadex intercambiadores de iones.

animacin de la cromatografa de intercambio inico de GE

Healthcare

animacin de la cromatografa de intercambio inico de Voet

3. Separacin sobre la base de sitios de unin especficos en la

cromatografa de afinidad a protenas:
En esta tcnica, la resina de cromatografa est derivatizado con un grupo que se
unir a un sitio especfico en una determinada protena de inters. Puede ser un
grupo que se une al sitio activo de una enzima (por ejemplo, benzamidina-agarosa
que se utiliza para la purificacin de la tripsina) o un anticuerpo que reconoce una
secuencia especfica de aminocidos en una protena. Por ejemplo, un anticuerpo
se puede hacer para un pptido especfico de la albmina, el anticuerpo unido
covalentemente a agarosa, y la columna de anticuerpo-agarosa entonces utilizarse
para purificar la albmina especficamente. Esta es una tcnica de gran alcance, ya
que los anticuerpos tericamente se pueden hacer que se unir selectivamente a
cualquier protena dada. Sabiendo slo la secuencia de ADN de una protena que
nunca ha sido aislado previamente, el siguiente esquema se podra utilizar para
purificar la protena desconocida. La secuencia de aminocidos de la protena
desconocida se puede derivar de la secuencia de ADN. Un pptido amino cido 10
a 12 a partir de que la protena se puede sintetizar en el laboratorio, y un
anticuerpo generado contra el pptido. El anticuerpo se unir ms probable que la
protena desconocida, as como al pptido, y por lo tanto se podra utilizar para
purificar la protena.

animacin de la cromatografa de afinidad de GE Healthcare

4. Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC)

animacin de la cromatografa de interaccin hidrofbica de GE

Healthcare

5. Cromatografa de Fase Inversa

cromatografa en fase inversa de GE Healthcare

6. TLC

animacin

http://nptel.ac.in/courses/102103047/23