ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

Bioinsecticidas: Bacillus sp. como

larvicida de Anopheles sp.
ASIGNATURA

:
Microbiologa Industrial

DOCENTE

:
MSc. Carmen Carreo Farfn

ALUMNO

:
Rmulo Aycachi Inga

CICLO

:
2007 - I

Lambayeque, setiembre de 2007.

INDICE
I.

Introduccin:..........................................................................................................2

II.

Generalidades sobre la produccin de bioinsecticidas............................3

a.

El problema: Enfermedades transmitidas por mosquitos al hombre..........3

b.

Las posibles soluciones.....................................................................................4

III.

i.

El control qumico...........................................................................................4

ii.

Control biolgico.............................................................................................5
Bacilos productores de bioinsecticidas: Bacillus thuringiensis var

israelensis......................................................................................................................6
a.

Generalidades.....................................................................................................6

b.

Ecologa de B. thuringiensis.............................................................................7

c.

Toxinas y mecanismos de accin de B. thuringiensis...................................7

IV.
a.

Aplicaciones y produccin industrial de B. thuringiensis....................8

B. thuringiensis como bioinsecticida................................................................8
Ventajas...................................................................................................................8
Desventajas............................................................................................................9

b.

B. thuringiensis como gen transgnico en plantas........................................9

c.

Produccin Industrial de B. thuringiensis var. israelensis para la

produccin de bioinsecticidas...................................................................................9
V.

Desarrollo de la parte prctica:......................................................................12

a.

Objetivos:..........................................................................................................12

b.

Procedimiento:................................................................................................12

c.

Resultados:......................................................................................................13

d. Conclusiones:.....................................................................................................15
VI.

Referencias:.....................................................................................................16

VII.

Anexos:.............................................................................................................17

Bioinsecticidas: Bacillus sp. como

larvicida de Anopheles sp.
I. Introduccin:
En culturas antiguas se conocan enfermedades que afectaban a los
insectos de inters econmico, como el gusano de seda (Bmbix mori L.), a la
abeja (Apis mellifera L.). Con el descubrimiento del microscopio se detectaron
algunas de las bacterias responsables.
La sintomatologa en los insectos enfermos indujo a pensar que los
agentes etiolgicos eran bacterias. Pasteur en 1870 describi una de esas
bacterias llamada Vibrion anoyac, luego reclasificada como Bacillus bombycus.
En 1902 Ishiwata aisl de larvas enfermas del mismo gusano una bacteria que
denomino Bacillus soto. Berliner en 1915 en Turingen, Alemania, aisl de
larvas enfermas de la palomilla del Mediterrneo Anagosta kuehniella L), hoy
conocido como Bacillus thuringiensis o Bt, que produce cristales con actividad
insecticida, desde 1954 se estableci la relacin entre la ingestin de los
cristales de la bacteria y la parlisis intestinal del insecto, porque stos no
tienen toxicidad por otra va en humanos y/o animales. Un anlisis de 161
aislados de Bt propusieron una clasificacin con base a sus antgenos
flagelares H, a pruebas bioqumicas para establecer 24 serotipos H y 33
variedades de la bacteria.
En 1977 en la regin de Neveg en Israel, se asil la variedad de Bt con
rpida actividad larvicida sobre mosquitos de los gneros Anopheles,
Uranotaenia, Culex y Aedes, los aislados de Bti tienen actividad toxica contra
larvas de mosquitos, en funcin del medio de cultivo, la condicin de
crecimiento, sin asociacin entre la cantidad de espora y la toxicidad de los
cristales, en la actualidad se busca mejorar la produccin y toxicidad de los
cristales de Bt.
Estos y otros descubrimientos llevaron al desarrollo y aplicacin de
diversos bioinsecticidas a base de estos tipos de microorganismos, para el
control de mosquitos vectores transmisores de enfermedades en el hombre. El
orden Diptera corresponde a los mosquitos de importancia mdica, porque
algunas de sus gneros y especies son vectores de enfermedades como:
paludismo, fiebre amarilla y dengue, adems son responsables del elevado
costo econmico de las campaas para su erradicacin, en zonas endmicas
del mundo (sobre todo en Sudamrica), as como por el valor econmico a
largo plazo del tratamiento mdico de los enfermos.
Desde 1950 se realizan campaas de control vectorial de estos insectos
en pases como Mxico, ya que con la aspersin de pesticidas: DDT,
metoxicloro, y organofosforados como: el abate, el malatin, el paratin,el
feniton etc., estos fueron al principio efectivos, pero su uso indiscriminado
provoca deterioro ambiental e inducen resistencia en insectos-plaga.
En la actualidad 500 especies de estos son resistentes a uno o ms
pesticidas, el nmero se duplica en un periodo de 6 aos, son imprescindibles,
aunque existe la tendencia a minimizarlos.
Una alternativa para el control de dpteros es el biolgico como: los peces
2

larvvoros del gnero Gambusia affinis; los nemtodos del tipo Rabdtidos y
Mermtodos, as como los protozoarios parsitos de los gneros: Epystilis,
Vorticella y Terahymena; hongos entomapatgenos: Beauverya, Entomophora,
Metarrhizium y Coelelomyces spp; de los, virus parsitos de insectos como: la
poliedrosis nuclear, iridiscentes, etc. Entre las bacterias se report: Bacillus
popilliae B. sphaericus y B. thuringiensis (Bt), cada una controla plagas con
oportunidades de explotacin y uso depende de sus propiedades especficas,
por ejemplo B. popilliae requiere insectos vivos para su reproduccin. En
contraste Bacillus thuringiensis var israliensis (Bti) es especfico para dpteros
una alternativa en el control biolgico.
II. Generalidades sobre la produccin de bioinsecticidas.
a.

El problema: Enfermedades transmitidas por mosquitos al

hombre.

Paludismo: Enfermedad llamada tambin Malaria es una de las ms

antiguas de la humanidad, citada en documentos chinos y papiro
egipcios desde el siglo I A.C. Los romanos Marco Terencio Varrn y
Columela asociaron su propagacin con la existencia de mosquitos. En
1631 Juan de Vega us la infusin de la corteza de la quina para su
curacin. En 1880 Lavoran descubri que Plasmodium vivax como el
agente etiolgico. En 1897 Ross identific su vector, el dptero del
gnero Anopheles. Esta enfermedad fue introducida en Mxico en 1519
por los conquistadores espaoles, en la poca precolombina existan
anofelinos sin paludismo, no obstante P. vivax se adapt a estos y les
usa hoy como vectores para iniciar epidemias con elevada mortalidad en
los pobladores de este pas. En la actualidad el paludismo es un
problema grave de salud pblica; en los ltimos 10 aos ha sido una de
las principales causa de mortalidad a nivel nacional. En los 50 fue la
enfermedad ms extendida en el mundo, afect millones de personas, y
provoco la muerte de otros millones. El trasmisor del paludismo es la
hembra de mosquito del gnero Anopheles, con sus especies ms
comunes: A. quadramaculatus, A. pseudopunctipennnis y A. alimanus.
Para el control y erradicacin de los vectores de la enfermedad se
aplican: DDT (Diclaro-difenil-tricoloro etano), hexacloro-benceno,
clordano, dadas las consecuencias negativas al ambiente se propone
nuevas alternativas de control, como Bti para eliminar las larvas de estos
insectos vectores.
Dengue: Es una virosis humana causada por uno de los cuatro
serotipos de flavovirus, es endmico en reas tropicales y subtropicales
del mundo, su existencia esta condiciona a la del mosquito Aedes
aegypti, por lo cual la poblacin humana potencialmente afectada es de
1,500 millones en 61 pases sin incluir las reas donde se registra
dengue hemorrgico, con 350 millones. A. aegypti es un eficaz vector,
ya que con un solo mosquito entre 100 es suficiente para iniciar una
epidemia, este insecto es antropfilo estricto y su poca capacidad de
vuelo horizontal como vertical, favorece su adaptacin en zonas
urbanas, lo que explica el aumento del dengue en Amrica en los ltimos
25 aos, es el resultado del incremento de sus dispersin. La reciente

introduccin de Aedes albopictus en Amrica agrava esa situacin, pues

es un vector accesorio del dengue Asia, adems se le identifica en Brasil
y Estados Unidos. El dengue hemorrgico serotipo es la forma ms
patgena, alcanza un 40% de mortalidad infantil, en Mxico y el Caribe
en donde existen las condiciones ambientales para que aparezca en el
futuro. El control ms que la erradicacin de dengue se intenta con
campaas contra el vector o con nuevas vacunas, los intentos por
controlar a A. aegypti han tenido poco xito ya que lo que favorece su
propagacin es el desecho de cantidades ilimitadas de recipientes en la
formacin de incubadores para sus larvas, el alto costo de aspersin
de insecticidas, al igual que el impacto negativo en los ecosistemas. Lo
anterior apoya la nuevas alternativas de control, como el biolgico
como B. sphaericus y Bti para la solucin de este problema.
Fiebre amarilla: Esta enfermedad es causada por un serotipo de
flavivirus. La fiebre amarilla (FA) es una forma selvtica que existe entre
los primates de frica, Centro y Sudamrica, se trasmiti por mosquitos
de bosques o matorrales a la forma urbana. El vector es A. aegypti. Este
insecto trasmite el virus hasta 168 das despus de ingerido de sangre
de un enfermo con FA, se reporta un perodo de incubacin de 3 a 6
das con un inicio rpido de la enfermedad, los sntomas ligeros de una
semana, se manifiestan por fiebre, cefalea, dolor muscular, vmito y
fiebre alta con sntomas hemorrgicos; la FA se distribuye en los trpicos
hmedos de frica, Centro y Sudamrica.

b.

Las posibles soluciones

i.

El control qumico.

Antes de la Segunda Guerra Mundial, los insecticidas disponibles

eran compuestos inorgnicos: arsenato de plomo, derivados del
petrleo e insecticidas naturales como los piretroides; durante los aos
30, se disearon los orgnicos sintticos, con la guerra al disminuir el
suministro de derris y el pelitre de los trpicos. La empresa suiza
Geigy descubri las propiedades del DDT en Alemania se descubrieron
los rgano-fosforados e hidrocarburos clorados, una fuente efectiva de
insecticidas, en los primeros aos de su empleo fueron ideales en el
control de plagas agrcolas y de salud pblica como el paludismo en el
mundo. Desde la dcada de los 50 y 60 surgieron problemas de tipo:
resistencia artrpodos en promedio de 200 especies lo hacen a uno o
ms, brotes secundarios de plagas distintas a las originales de
aquellas contra las que se dirigi el control inicial, el rpido
resurgimiento de las plagas tratadas en los 80 y finales de los 90, que
requieren mayor nmero de aplicaciones, con alta residualidad txica a
humanos, ganado y la vida silvestre, que causan la contaminacin del
agua, suelo, aire, riesgo en la manipulacin de insecticidas, y el costo
creciente en su produccin y aplicacin.
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) inici en 1951 en Mxico
un programa de erradicacin de paludismo, con el DDT como el
principal agente de control en las campaas antiaedes y antipaldicas,
en los sitios inaccesibles se aplic Dieldrin una vez al ao, desde

1959, se detect resistencia de

Anopheles albimanus y A.
pseudopunctipennis al Dieldrin, en 1963 la tolerancia de los anofelinos
al DDT, pero se declar erradicado A. aegypti de Mxico, regreso en la
dcada de los 70 por el sureste, con resistencia a organoclorados y
organofosforados. En la actualidad hay resistencia a por lo menos un
insecticida en 20 especies de Aedes, 15 de Culex y 5 de Culiseta. El
comit de expertos en resistencia de especies de anofelinos de la
OMS reconoce ms de 51 especies.
Por lo anterior se infiere que el control de insectos no debe basarse
solo en el uso de insecticidas qumicos, adems en 1991 se public la
prohibicin y restriccin
de 40 plaguicidas tipos distintos de
plaguicidas, la Asamblea Mundial de Salud, recomend un nuevo
mtodo de lucha antivectorial y el inters por el control biolgico, las
investigaciones sobre enemigos naturales de los vectores, los
candidatos se clasificaron en 5 grupos, en funcin de las
investigaciones de bajo, mediano, o alto potencial; con prioridad 1 y
posibilidad de aplicacin: el pez y larvvoro Gambusia affinis y Bti.
ii.

Control biolgico.

El uso de bioplaguicidas (bioinsecticidas) result como una

alternativa a las cada vez mas notorias desventajas del control qumico
empezado por varios pases alrededor de la dcada del 50. Los
descubrimientos realizados de bacterias tanto productoras de toxinas
como bacterias parsitas con elevado potencial para uso como
controladores biolgicos de insectos plaga a abierto una gran
expectativa tanto en el campo cientfico como industrial.
Las bacterias utilizadas como controladores biolgicos se dividen en
cuatro grupos con base en su efecto sobre el insecto-plaga:
Patgenos obligados: Bacillus popillae y B. larvae, este grupo es
especfico para un hospedero y no crecen en medio de cultivo artificial.
Bacillus formadores de esporas y cristales: como B. sphaericus y
B. thuringuiensis var. israelensis. Su principal caracterstica
es la
sntesis de toxinas de naturaleza proteica con accin txica intestinal
contra larvas de dpteros (mosquitos).
Patgenos facultativos: Pseudomonas aeruginosa, Achromobacter
spp y Serratina mercences. Tienen uno o varios hospederos de la
misma especie de insecto al que infectan. Su capacidad potencial
como patgeno en humanos los excluye como una alternativa segura.
La OMS desde 1984 seleccion B. sphaericus y B. thuringuiensis
var. israelensis (Bti H-14), por su eficacia en la eliminacin de larvas de
mosquitos, Bti es diferente a otros agentes de control por su alto
grado de especificidad, seguridad ambiental y compatibilidad con otras
formas qumicas o biolgicas de control, propiedad del mejor
bioinsecticida, su manejo exige un cuidado especial pues es un
producto biolgico, es necesario conocer la biologa de las especies de
insectos que se combaten al igual que reducen su eficacia;
actualmente existen productos en el mercado mundial elaborados con

base a otros microorganismos, aunque ninguna de las formulaciones

es efectiva en baja concentracin; se recomienda antes de usar
pruebas de susceptibilidad que determinen el grado de respuesta, se
sugieren anlisis locales, regionales e incluso nacionales, para el
seguimiento de estos productos.
III.

Bacilos productores de bioinsecticidas: Bacillus thuringiensis

var israelensis
a.

Generalidades.
Segn su ubicacin taxonmica (de acuerdo al manual de
Bacteriologa Sistemtica de Bergy), B. thuringuiensis se clasifica en:
Reino
Divisin II
Clase I
Orden
Familia
Gnero
Especie

:
:
:
:
:
:

Procariote
Firmicutes
Firmibacteria
Eubacterias
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus
thuringiensis
:
israelensis

var.

B. thuringiensis es una bacteria Gram positiva, aerbica,

esporgena, hetertrofa y con la propiedad distintiva de sintetizar uno o
ms cristales con actividad insecticida, su ciclo de vida tiene dos fases:
la vegetativa y la de resistencia (generan esporas). La primera es la
bacteria, tiene una forma bacilar con un tamao promedio de 2-5 micras
de largo por 1 micra de ancho, la divisin celular es por fisin binaria. La
fase de resistencia (esporulacin) se induce por condiciones adversas
del medio de cultivo como: baja concentracin de nutrientes, pH cido,
disminucin de la humedad, reduccin del nivel de O 2; la composicin
qumica de la cubierta de la espora le confiere termorresistencia, le
protege contra la desecacin. En un ambiente adecuado la espora
germina y da lugar a la fase vegetativa. Simultneamente a la formacin
de esporas, se producen cristales proteicos,
que varan en su
composicin, segn la variedad (poblacin de organismos de una misma
especie, que se pueden diferenciar por su comportamiento, pruebas
bioqumicas, etc.) y pueden alcanzar hasta el 30% del peso seco de la
clula vegetativa. Los cristales delta-endotoxina, tienen propiedades
insecticidas para larvas de lepidpteros, colepteros y dpteros. Los
genes responsables de la formacin de los cristales se encuentran
codificados en plsmidos. Los antgenos flagelares de Bti denominados
H y algunas pruebas bioqumicas como: hidrlisis de casena,
produccin de la catalasa, reduccin de nitratos, se emplean para su
determinacin taxmica y clasificacin.
En la actualidad se consideran 24 serotipos caracterizacin
6

bacteriana con base en la respuesta antgeno-anticuerpo y 33

variedades.
b.

Ecologa de B. thuringiensis
La bacteria es parte de diversos ecosistemas como: bosques,
selvas y sabanas y desiertos. La espora de B. thuringiensis supervive
por varios aos, germina se multiplica como clulas vegetativas en
ambientes naturales, su existencia est relacionada con lugares de
elevadas densidades de insectos, el nmero de esporas de la bacteria
en graneros es alta en relacin a otros hbitat de acuerdo con ciertas
condiciones ambientales: como la temperatura y la humedad constante,
mientras que la ausencia de radiacin solar permite que permanezcan
viables. En relacin a los hbitats naturales y los artificiales como los
graneros, existe controversia en su distribucin, investigacin en el
agrosistema del Bajo Guanajuatense (Guanajuato, Mxico para
determinar la existencia y supervivencia de esporas de Bt en algunas
malezas, en hojas de cultivos agrcolas como el frjol y mas, en insectos
saprobios y en el suelo, revelaron la existencia de esporas en el
filoplano de esas malezas y en el suelo cultivado con maz, pero no en
las hojas de las plantas cultivadas, ni en los insectos y/anlidos del suelo
con los que se asocian, las esporas viables de Bti, se detectaron hasta 4
das despus de su aplicacin (34 ), lo que explica porque solo en los
graneros se reportan epizootias con miles de insectos muertos por los
cristales de Bti.

c.

Toxinas y mecanismos de accin de B. thuringiensis

La investigacin sobre la bioqumica de B. thuringiensis reporta que
el cristal no es txico en su totalidad; est dividido en regiones o
subunidades de protena, las
cuales tienen actividad enzimtica
proteoltica similar a la tripsina del insecto. La ingestin de cristales y
esporas por el insecto revela una interaccin entre el cristal y el intestino
del hospedero. Cuando un insecto susceptible los ingiere sus enzimas
digestivas los hidrolizan en el ambiente alcalino de su intestino, lo que
se causa dao en las clulas epiteliales de la pared intestinal. Las
clulas expuestas no responden uniformemente, las de tipo cuboide o
columnas se deterioran en estructura en las microvellosidades y en la
membrana celular, dilatacin de la cisterna del retculo endoplsmico
rugoso y dispersin de los ribosomas, los ncleos no se afectan, sin
embargo las mitocondrias se hinchan, los cambios fisiolgicos son
insuficientes para el transporte de iones y permeabilidad, se agota el
ATP disponible, con cambios patolgicos como: vacuolizacin celular,
hinchamiento y lisis, as el insecto muere en menos de una hora o en
varios das, depende de la dosis ingerida. Cuando una larva consume
cristales sin espora ocurre una secuencia idntica de estos eventos, en
consecuencia la parlisis y muerte del insecto, en donde las esporas son
pasivas hasta que el pH disminuye a 7, lo que estimula su germinacin,
ya que las esporas superviven en casos especfico, como en graneros
lo cual provoca epizootia por la invasin masiva de Bt en el insecto.

IV.

Aplicaciones y produccin industrial de B. thuringiensis

a.

B. thuringiensis como bioinsecticida

Hasta 1978 no se haba producido ningn insecticida microbiano

para combatir plagas de insectos de valor mdico y veterinario, pero a
partir del descubrimiento de B. thuringiensis, se empezaron a elaborar
a escala industrial. La preparacin del bioinsecticida es una mezcla
de esporas y de cristales, que causan la muerte en poco tiempo de
que larvas de culcidos y simlidos que se intoxican y no por
septicemia. El modo de accin del complejo espora-cristal de B.
thuringiensis tiene semejanza con insecticidas convencionales, con la
diferencia de que en los qumicos se especifica el control de calidad
del ingrediente activo y sus propiedades fsicas y qumicas, mientras
que un insecticida de B. thuringiensis H-14 no especfica con precisin
la concentracin de ingredientes activos, en general se realiza un
bioensayo para comparar la toxicidad de una preparacin conocida de
B. thuringiensis var kurstaki, contra la formulacin de B. thuringiensis
H-14 de potencial conocido, la bacteria se maneja para evitar que
pierda toxicidad en el almacenamiento, de acuerdo con sus
propiedades se vende para suspensin acuosa, emulsin en polvo
humectable y grnulos, ya que los ingredientes espora/cristal son
insolubles, pero los cristales si, se aprovecha que las larvas de
mosquitos vectores de enfermedades infecciosas son insectos
filtradores cuando ingieren alimento en ambientes naturales.
El uso de un microorganismo o sus metabolitos en cantidades
industriales para eliminar un insecto blanco no debe tener riesgo para
el ambiente y/o humanos.
La OMS dise un esquema de 5 fases que evala la efectividad y la
seguridad de productos biolgicos aplicados en el control de plagas
agrcolas, forestales, urbanas, etc., el esquema considera lo siguiente:
1) No causar infeccin al hombre, mamferos y otros animales
2) No ser txico
3) No provocar alergias
4) Ningn tipo de caracinognesis
5) Ningn tipo de infecciones orales, respiratorias, parentales
Adems, B. thuringiensis H-14 no es txico para mamferos u otros
animales no blancos excepto el mosquito.
Entre las ventajas y desventajas del uso B. thuringiensis como
agente de control biolgico tenemos:
Ventajas.
Alta especificidad para controlar larvas de las
familias: Culicidae, Simulade y Psichodidae.
Seguridad ambiental, no daa mamferos u otros
organismos no blanco, a excepcin del culcido Toxorhynchites spp
depredador de larvas de mosquitos.
Alta virulencia solo para el insecto vectores, tiene un

efecto txico relativamente rpido contra mosquitos.

B. thuringiensis es compatible con otras formas de
control fsico, qumico y biolgico de mosquitos, sin evidencia de
que induzca inmunidad humoral o celular, tampoco heredabilidad
en el insecto-plaga.

Desventajas
- No tiene efecto residual, pero si alta especificidad por ello pocas
compaas se interesan en su manufactura, lo que limita su
espectro de control de insectos-plagas, exclusivamente a
mosquitos.
- Elevado costo produccin con lo que un mnimo de gobiernos se
interesan en su produccin masiva y la necesidad de investigacin
para reducir los costos de produccin.
- Formulaciones de eficacia variable contra mosquitos en ambientes
naturales, por que se trata de un ser vivo sujeto a las condiciones
en los que se cultiva.
b.

B. thuringiensis como gen transgnico en plantas.

La ingeniera gentica se ha utilizado para la introduccin de genes
de B. thuringiensis en cultivos afn de conferir resistencia a insectosplaga. La primera planta-Bt se desarroll hacia 1987 con tabaco
(Nicotiana tabacum) para controlar larvas de primer instar de Manduca
sexta. Perlack en 1990 produjo algodn resistente a plagas de insectos
donde la secuencia codificante para las protenas Cry1Ab y Cry1Ac fue
modificada para aumentar los niveles de expresin hasta alcanzar
porcentajes entre 0.05 a 0.1% del total de protena soluble. Fujimoto
en 1993 transformaron arroz con el gen cry1Ab. Desde all las endotoxinas han sido transferidas y expresadas en por lo menos 26
diferentes especies de plantas.
Estos cultivos presentaron una disminucin importante en uso de
plaguicidas qumicos dejando ganancias promedio de 60 millones de
dlares para algodn, entre 19 y 190 millones para maz. Todas las
plantas transgnicas a base de Bt son comercializadas por el sector
privado. De las patentes con relacin a Bt, ms de la mitad son de
Norte Amrica, 30% de organizaciones europeas y rusas y el 18%
principalmente de compaas japonesas. El 57% de las patentes en
plantas transgnicas con Bt han sido registradas e implementadas por
unas pocas compaas siendo algunas de ellas Monsanto, Micogen,
Novartis, AgrEvo, Pioneer, Hi-Bred Internacional, DeKalb Genetics
Corporation. Los productos ms avanzados incluyen algodn, maz,
maz dulce, papa, tomate, aceite de semilla de canola (Cern, 2004).

c.

Produccin Industrial de B. thuringiensis var. israelensis para la

produccin de bioinsecticidas.
La seleccin de un aislado silvestre de B. thuringiensis var.
israelensis (Bti) y su capacidad efectiva para producir cristales txicos
y posible manipulacin gentica para mejorarla, al igual que sus

requerimientos nutricionales, son aspectos fundamentales en la

produccin del bioinsecticida a base de esta bacteria una etapa clave
en el proceso de escalonamiento masivo para la produccin de la
delta-endotoxina, y su posterior formulacin y aplicacin a nivel de
campo. Es necesario el diseo de un medio de cultivo (o de
fermentacin) adecuado, apto para el crecimiento, esporulacin y
formacin de los cristales de Bti, pues de ello depende la calidad txica
del cristal; en ese sentido el medio de fermentacin debe contener una
fuente de carbono, de nitrgeno orgnico y sales minerales que en
balance estimulen el crecimiento, la esporulacin y la produccin de
cristales altamente txicos. En trminos del tipo de constituyentes, las
fuentes de carbono ms empleadas son: la glucosa, el almidn y
sacarosa, reconocidas como esenciales para la sntesis de cristales,
aunque se pueden utilizar como fuente de carbono materias primas
baratas, como productos de maz hidrolizado (almidn y dextrinas), al
igual que jugo de agave y melaza de caa (fructosa), con excelentes
resultados sobre la esporulacin y calidad txica del cristal. Cabe
mencionar que la melaza de caa se considera una materia prima
adecuada como fuente de carbono, de bajo costo con efectos positivos
sobre la toxicidad de la delta-endotoxina. Es claro que la ausencia de
una fuente adecuada de C para Bti, causa una disminucin en la
produccin de esporas y en la formacin y calidad de la
deltaendotoxina.
En el caso de fuentes de Nitrgeno se ha reportado que Bti
requiere de aminocidos esenciales y otras formas orgnicas de
nitrgeno durante su fase de crecimiento y durante la esporulacin. En
general en los medios de cultivo comerciales se han empleado
protenas de semilla y/o agua de cocimiento de maz, otras alternativas
ms baratas han sido obtenidas de fuentes naturales como la harina
de pescado, de la semilla de algodn, o de leguminosas como la soya,
el garbanzo, la haba, el cacahuate y las lentejas, o bien de lquido de
remojo de maz; de residuos de levadura, de sangre de res, del suero
de queso y productos secundarios de la industria lctea, esta clase de
materia prima estimula la biosntesis de la delta-endotoxina con alta
actividad insecticida. Para los minerales se ha sealado al Mn +2, K+1,
Ca+2 y Zn+2 como elementos componentes necesarios en el medio de
fermentacin para la produccin de la delta-endotoxina. Tambin se
report el aislamiento de un Bti en un medio que contena dextrosa,
extracto de levadura K2HPO4 y KH2PO4 y present los mejores niveles
en la produccin de la delta-endotoxina y se recomend el uso de
substratos baratos como harina de semilla de algodn y harina de
soya. Se describi un medio de fermentacin con glucosa, peptona de
soya, extracto de levadura y lquido de remojo de maz y sales
minerales del tipo: KCl, (NH 4)2SO4, HPO4 , MgSO4 , CuCl2 , FeSO4,
ZnSO4 y MnSO4 , con el que se logr un alto rendimiento en la
esporulacin y cristales txicos de excelente calidad. Por lo tanto, los
medios de cultivo para Bti deben contener sales minerales para la
sntesis de energa, estimular el crecimiento y la esporulacin, y
factores de crecimiento como: extracto de levadura (como una fuente
de vitaminas del complejo B), pues su omisin retarda la esporulacin

10

y reduce la formacin de cristales y en consecuencia la toxicidad del

complejo espora/cristal. Para Bti, la combinacin de factores
nutricionales orgnicos e inorgnicos es esencial en la sntesis de la
delta-endotoxina de alta toxicidad, as que el uso de materiales de bajo
costo como componentes del medio de cultivo, es bsico en la
optimizacin del proceso de produccin bioinsecticidas a base de Bti.
En consecuencia para el diseo de medios de cultivo o fermentacin
sugiere:
1) Que sus componentes sean fcil de manejar o que no requieran
pretratamiento
2) Que permitan optimizar el crecimiento de la bacteria sin afectar
negativamente la calidad de la delta-endotoxina
3) Que sean baratos y abundantes
4) Que sean de fcil adquisicin en la localidad.
Es importante sealar que una formula basada en la combinacin
de nutrientes para una variedad de Bti, no necesariamente es
adecuada para otra variedad, por lo que la calidad de la deltaendotoxina depende tanto del medio de cultivo como del aislado de Bti
utilizado. Aunque obviamente, el diseo del medio y la bacteria no son
los nicos aspectos involucrados en la produccin del bioinsecticida,
existen otras variables que deben considerarse en el proceso de la
fermentacin como: la temperatura ptima de crecimiento de Bti oscila
entre los 28 y 32C; la cantidad de oxigeno suministrado a la bacteria,
la velocidad de agitacin para asegurar un suministro de oxigeno
adecuado en el medio de cultivo y evitar la acumulacin del calor y
evitar la inhibicin o reduccin de la calidad txica de los cristales; as
como el pH inicial ptimo de entre 6.8-7.2, ya que al oxidar los
carbohidratos produce cidos orgnicos, lo que se soluciona con
neutralizacin con lcali.
Para la produccin del bioinsecticida a escala industrial es
necesario un proceso de escalonamiento. El escalonamiento se define
como el conjunto de tcnicas y mtodos empleados para transferir a
una escala mayor (escalamiento ascendente) o menor (escalamiento
descendente) un microorganismo o un producto biolgico como la
deltaendotoxina y, determinar su factibilidad econmica en un proceso
industrial. En el escalamiento se requiere el uso combinado e
integrado de mtodos y principios de ingeniera qumica, bioqumica,
microbiologa y gentica. Los estudios de laboratorio y de planta piloto
son tiles para definir las operaciones unitarias de mayor importancia
en el proceso de escalamiento, como en el caso del bioinsecticida a
base de Bti, en donde el diseo del medio de cultivo es esencial en la
optimizacin de la produccin del complejo espora-cristal, tambin es
necesario un diseo experimental a nivel de fermentador, el cual en
funcin de su capacidad, el equipo instalado y los recursos
disponibles, har posibles la obtencin de altamente cristales txicos
de Bti.

11

V.

Desarrollo de la parte prctica:

a. Objetivos:
-

Aislar Bacillus sp.

Seleccionar Bacillus sp. en base a su potencial
biocida a larvas de Anopheles sp.
Identificar la especie de Bacillus.
Conservar la cepa de Bacillus sp. controladoras de
Anopheles sp.

b. Procedimiento:

Muestra

10-1

10-2

Sembrar

10-3

Shock trmico
80 C/ enfriar

Agar Nutritivo
28C/48h

Tincin Gram
(Bacillus esporulados)

Repicar

12

Suspensin
N 06 Nefel.

Cepa Bacillus
10 ml

Control Qumico

Cepa Bacillus

Control Absoluto

c. Resultados:
Tabla 01: Nmero de larvas muertas y vivas de Anopheles sp. frente a aislamiento de
Bacillus sp., y control qumico (insecticida qumico)
HORAS
0h
24 h
48 h
72 h
TOTAL

Control
absoluto
Muertos
0
0
1
1
2

Cepa
Bacillus
Muertos
0
1
2
2
5

Control
qumico
Muertos
0
2
3
1
6

13

Tabla 02: Porcentaje de mortalidad de larvas de Anopheles sp. a las 24, 48 y 72 horas,
luego de aplicados los tratamientos.

HORAS
0h
24 h
48 h
72 h
TOTAL

Control
absoluto
% Muertos
0
0
50
50
100

Cepa
Bacillus
% Muertos
0
20
40
40
100

Control
qumico
% Muertos
0
33
50
17
100

Porcentaje de mortalidad corregida para cepa de Bacillus sp.

% Corregido

% Corregido

71
100

29
29

100

59.15 %

Porcentaje de mortalidad corregida para control qumico

% Corregido

% Corregido

86
100
=

29
29

100

80.28 %

d. jsjaksja

14

d. Conclusiones:
-

A partir de la suelo se obtuvo dos aislamientos de Bacillus sp.

De los dos aislamientos de Bacillus sp. evaluados, se mostr un efecto
biocida de 59.15% sobre las larvas de Anopheles sp. hasta las 72 horas
de iniciado el bioensayo.
La mortalidad corregida a las 72 horas del control qumico fue de
80.28%.
La cepa aislada de Bacillus sp. mostr una efectividad biocida
moderada, muy parecida a la del control qumico.

15

VI.

Referencias:
-

E. LEUCONA, Roberto (2002) Situacin actual y perspectivas de uso

de bioplaguicidas en Latinoamrica. Conferencia Produccin y uso
de agentes microbianos para el control de plagas. Buenos Aires.
SOBERON, M. y A., BRAVO (2003) Bacillus thuringiensis y sus
toxinas. Deparatamento de Microbiologa Molecular. Universidad
Autnoma de Mxico. Mexico D.F.
FERNANDEZ, C. y R. JUNCOSA (2002) Biopesticidas: la
agricultura del futuro? FuturEco SL. Barcelona.
E. FLORES, A. y colbs. (2001). Resistencia a insecticidas en insectos
vectores de enfermedades con nfasis en mosquitos. Laboratorio de
Entomologa Mdica. Universidad Autnoma de Nuevo Len.
Espaa.
SANCHEZ YAEZ, Juan M. (2001). Produccin de bioinsecticida a
base de Bacillus thuringiensis: Minirevisin.
Instituto de
Investigaciones Qumico-Biolgicas. Universidad Michoacana de San
Nicols de Hidalgo. Mxico.

16

VII.

Anexos:

17

Lista de serotipos de Bacillus thuringiensis usados en el control biolgico de

plagas agrcolas urbanas y forestales.
No.

Serotipo

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33

H1
H2
H 3
H 3a, 3b
H 4a, 4b
H 4a, 4b
H 4a, 4c
H 5a, 5b
H 5a, 5c
H6
H6
H7
H 8a, 8b
H 8a, 8c
H 8b,8d
H9
H 10
H 11a, 11b
H 11a, 11c
H 12
H 13
H 14
H 15
H 16
H 17
H 18
H 19
H 20a, 20b
H 20a, 20C
H 21
H 22
H 23
H 24

Variedad
thuringiensis
finitimus
alesti
kurstaki
sotto
dendrolimus
kenyae
galleriae
canadensis
subtoxicus
entomocidus
aizawai
morrizoni
ostrinidae
nigeriensis
tolworthi
darmstadiensis
toumanoffi
kyussshuensis
thompsoni
pakistani
israelensis
dakota
indiara
tohokuensis
kumanotoensis
tochigiensis
yunnanensis
pondicheriensis
colmeri
shandongiensis
leonensis
japonensis

18

Insecticidas microbianos y virales para el control de mosquitos vectores de

enfermedades humanas, disponibles en el mercado.

Grupo

Virus

Bacterias

Organismo

Producto

Pas

Elcar
Gypchek
Manestrin
Monisarmio-virua
TM-Buocontrol
Virox
Menestrin*
Spodeterin*
VPN 80

E.U
E.U
Bulgaria
Finlandia
E.U
Inglaterra
Francia
Francia
Guatemala

VPN 82

Guatemala

Virus de la
Poliedrosis
Citoplasmtica

Hifantrin

Bulgaria

VPC

Japn

Bacillus popillae

Doon
Japademic
Milky Spore
ABG-6185
2362*
Dipel
Javelin
Thuricide
Bactospeine
Bathurin
Bacillan
Thuridn
Thurindhgin
Kturintoks
Biotrol
Backtutal
M-1
Foil
Larvo-Bt.
Biobit
Bactimos
Teknar
Vectobac

E.U
E.U
E.U
E.U
Blgica
E.U
E.U
E.U
Blgica
Checoslovaquia
Polonia
Polonia
Rumania
Rumania
E.U
Bosinia
E.U
E.U
E.U
Dinamarca
E.U
E.U
E.U
Republica
Checa

Virus de la
Poliedrosis Nuclear

Bacillus spahericus

Bacillus thuringiensis

Moskitur

19